ảnh hưởng của quá trình lên men đến tính chất chống oxi hóa của ngũ cốcSự ảnh hưởng của quá trình lên men do hai loại vi sinh vật (vi khuẩn lactic acid Lactobacillus rhamnosus, và nấm men Saccharomyces cerevisiae) lên hoạt tính chống oxy hóa và tổng hàm lượng phenol của 4 loại ngũ cốc, cụ thể là kiều mạch, lúa mì, lúa mạch và lúa mạch đen, đã được xác định và so sánh với các hoạt động chống oxy hóa và tổng hàm lượng phenol của 4 loại ngũ cốc trên mà không lên men. Tổng hàm lượng phenol (TPC), được xác định theo phương pháp FolinCiocalteu, tăng khi lên men. Hoạt tính chống oxy hóa (AOA) được đánh giá bằng các phương pháp như khả năng khử 2,2diphenyl1picrylhydrazyl (DPPH), năng lực chống oxy hóa bằng phương pháp khử ion Fe3+(FRAP), và phương pháp thiobarbituric acid (TBA). Sự có mặt của những vi sinh vật là quan trọng ít hay nhiều đến mức độ tăng lên của hoạt tính chống oxy hóa. Như vậy quá trình lên men lá một phương pháp làm tăng khả năng hoạt tính sinh học của các sản phẩm ngũ cốc.
Trang 1Ảnh hưởng của quá trình lên men lên tính chất chống oxy hóa của một số loại ngũ cốc và các
loại giả ngũ cốc Tóm tắt (Abstract)
Sự ảnh hưởng của quá trình lên men do hai loại vi sinh vật (vi khuẩn lactic acid Lactobacillus rhamnosus, và nấm men Saccharomyces cerevisiae) lên hoạt tính chống oxy hóa và tổng hàm lượng
phenol của 4 loại ngũ cốc, cụ thể là kiều mạch, lúa mì, lúa mạch và lúa mạch đen, đã được xác định và
so sánh với các hoạt động chống oxy hóa và tổng hàm lượng phenol của 4 loại ngũ cốc trên mà không lên men Tổng hàm lượng phenol (TPC), được xác định theo phương pháp Folin-Ciocalteu, tăng khi lên men Hoạt tính chống oxy hóa (AOA) được đánh giá bằng các phương pháp như khả năng khử 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), năng lực chống oxy hóa bằng phương pháp khử ion Fe3+(FRAP),
và phương pháp thiobarbituric acid (TBA) Sự có mặt của những vi sinh vật là quan trọng ít hay nhiều đến mức độ tăng lên của hoạt tính chống oxy hóa Như vậy quá trình lên men lá một phương pháp làm tăng khả năng hoạt tính sinh học của các sản phẩm ngũ cốc
1 Giới thiệu (Introduction)
Mặc dù chất chống oxy hóa tổng hợp như butylated hydroxytoluene (BHT), butylated hydroxyanisole (BHA) và tert-butylhydroquinone (TBHQ), cũng như propyl gallate (PG), đã được sử dụng rộng rãi trong việc làm chậm quá trình oxy hóa lipid, nhưng gần đây tính an toàn của chúng đã được đặt nghi vấn do độc tính và có thể gây ung thư (Shahidi, 2000) Như vậy, việc phát triển của chất chống oxy hóa tự nhiên, an toàn hơn, từ chiết xuất của các loại thực vật có thể thay thế chất chống oxy hóa tổng hợp, đã được quan tâm (Branen, 1975) Chất chống oxy hóa thực phẩm như acid amin, peptide, protein, chất flavonoid và các hợp chất phenol khác có thể đóng một vai trò quan trọng như là chất chống oxy hóa sinh lý và dinh dưỡng, do đó làm tăng sức đề kháng tự nhiên của cơ thể để giảm đi tác hại của oxy hóa (Shahidi, 2000)
Mức độ quan trọng của các chất chống oxy hóa đã được phát hiện trong các loại ngũ cốc và các sản phẩm của các ngũ cốc trên (Baublis, Decker, & Clydesdale, 2000; Emmons, Peterson, & Paul, 1999) Ngũ cốc và các loại giả ngũ cốc là một nguồn quan trọng của chất dinh dưỡng Hạt ngũ cốc cung cấp một lượng lớn năng lượng, protein và vi chất dinh dưỡng thiết yếu trong chế độ ăn uống của động vật và con người Thành phần hóa học và sinh khả dụng của các chất dinh dưỡng thì khác nhau giữa các loài và giống cây ngũ cốc, và cũng có thể bị ảnh hưởng bởi các hình thức chế biến làm ra thức ăn
và thực phẩm (Senter, Horvat, & Forbus, 1983) Ngũ cốc cũng chứa một loạt các chất hóa học với hoạt tính chống oxy hóa (Adom & Liu, 2002) Ngũ cốc rất giàu axit phenolic và saponins, trong khi phy-toestrogens và flavonoids có mặt với số lượng nhỏ (Senter et al., 1983) Chiết xuất từ lúa mì như là các phenol lúa mì đã thể hiện tiềm năng chống oxy hóa như một chất chống oxy hóa mạnh mẽ, thông qua việc khử triệt để hay đào thải ion kim loại (LiyanaPathirana, Dexter, & Shahidi, 2006; Liyana-Pathirana
& Shahidi, 2006), trong khi lúa mạch có chứa một lượng đáng kể các hợp chất phenol chống oxy hóa, khử hiệu quả các peroxyl, DPPH, và các gốc hydroxyl, và kiểm soát hiệu quả quá trình oxy hóa của LDL cholesterol, do đó có một tiềm năng rất lớn trong sự phát triển của các chất dinh dưỡng giàu chất
Trang 2chống oxy hóa (Madhujith & Shahidi, 2006, 2007) Chất chống oxy hóa từ thực phẩm ngữ cốc được xem như có lợi cho sức khỏe do giảm tỷ lệ mắc các bệnh mãn tính liên quan đến lão hóa bao gồm cả bệnh tim và một số loại ung thư (Miller, Rigelhof, Marquart, Prakash, & Kanter, 2000)
Mặt khác, các loại ngũ cốc được biết đến có chứa một lượng nhất định các thành phần phi dinh dưỡng, như muối của axit phytic (hexakisphosphates myoinositol, phytates),mà chúng khó tiêu hóa và không dễ hòa tan (Guenter, 1997), cũng như chứa các hemicellulose được liên kết với cellulose và các chất pectic, và bao gồm nhiều polysaccharides không phải tinh bột, cellulose, như xylans (arabinoxylans
và glucuronoxylans 4-0-methyl), galactomannans, glucomannans, ß-D-glucans (3 và 4 liên kết), ß-D- glucan-callose (3 liên kết ), và xyloglucans (4-liên kết ß-D-glucans với mạch phân nhánh) (Chesson, 1987) Các ß-glucans và arabinoxylans đã được công nhận là yếu tố phi dinh dưỡng trong ngũ cốc (Bedford, 1995)
Trong suốt lịch sử, quá trình lên men đã được sử dụng để cải thiện tính chất sản phẩm Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng các vi sinh vật bắt đầu thay đổi thành phần thực vật trong quá trình lên men (Katina, Liukkonen et al., 2007) Nhiều thay đổi sinh hóa xảy ra trong quá trình lên men, dẫn đến thay đổi tỉ lệ của các thành phần dinh dưỡng và phi dinh dưỡng của thực vật, làm ảnh hưởng đến đặc tính sản phẩm như hoạt tính sinh học và khả năng tiêu hóa (Heiniö et al 2003,; Katina, Laitila et
al, 2007) Vì vậy mục tiêu của đề tài này là để thử nghiệm ảnh hưởng của các quá trình lên men khác nhau (lên men nấm men và lên men axit lactic) vào hoạt tính chống oxy hóa và tổng hàm lượng hợp chất trong ngũ cốc được lựa chọn
2 Vật liệu và phương pháp
2.1 Vật liệu
Các mẫu ngũ cốc được sử dụng trong nghiên cứu này bao gồm lúa mạch(Fagopyrum esculentum) được sản xuất bởi Organic Biopharm, Trung Quốc và lúa mì chưa xát vỏ (Triticum aestivum), lúa mạch đen(Secale cereale) và lúa mạch(Hordeum vulgare) được sản xuất từ KLAS, Sarajevo Các hợp chất 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), acid thiobarbituric (TBA) và axit gallic được mua từ Sigma– Aldrich Chemie GmbH (Taufkirchen, Đức), thuốc thử Folin-Ciocalteu đã được mua từ Merck & Co., Inc (New York, Mỹ), tất cả các hóa chất và dung môi khác có chất lượng cao nhất mua từ Lachema Ltd (Brno, Cộng hòa Séc) và Fluka Chemie GmbH (Buchs, Thụy Sĩ) và sử dụng ngay không cần tinh chế
thêm Vi sinh vật được sử dụng trong nghiên cứu này (Lactobacillus rhamnosus A71 và Saccharomyces cerevisiae) đến từ một bộ sưu tập của Phòng thí nghiệm Vi sinh của Khoa Công nghệ và Luyện kim,
Belgrade Môi trường nuôi cấy MRS và Tryptic soy được mua từ Merck & Co., Inc (New York, Mỹ) 2.2 Tách chiết và chuẩn bị mẫu
2.2.1 Chuẩn bị giống nuôi cấy vi sinh
Giống nuôi cấy vi sinh Lactobacillus rhamnosus A71 đã được giữ ở dạng đông khô và kích hoạt trong 10 ml MRS 1% và giống vi sinh vật Saccharomyces cerevisiae nuôi trong thạch agar ở 4oC và
Trang 3kích hoạt ở 10ml Tryptic soy 1% Ủ trong 24 giờ được thực hiện 37oC cho L.rhamnosus và 30oC cho
S.cerevisiae Sau 3 bước, giống vi sinh vật mới thu được sử dụng để cấy vào mẫu ngũ cốc xay
2.2.2 Chuẩn bị chiết xuất ngũ cốc
750 nm (25 ° C)
Mẫu khô được lưu giữ trong các đĩa được bịt kín trong tủ lạnh cho đến khi phân tích thêm 2.2.3 Xác định tổng hàm lượng phenol
Hàm lượng tổng phenol thông qua chiết xuất được xác định bằng phương pháp Folin-Ciocalteu
đã được chỉnh sửa (Singleton & Rossi, 1956) Một cách ngắn gọn, 100µl của từng dịch trích được lắc trong 1 phút với 500 µl thuốc thử Folin-Ciocalteu và 6 µl nước cất Sau khi hỗn hợp được lắc, 2 ml 15% Na2CO3 được thêm vào và hỗn hợp được lắc một lần nữa trong 0,5 phút Sau cùng, dung dịch được thêm nước cất lên đến 10 ml Sau 2 giờ, độ hấp thu đo được bằng máy quang phổ UV/nhìn thấy (Ultrospec 3300 pro, Amersham Bioscience, Thụy Điển) tại bước sóng 750 nm (25oC) sử dụng cuvettes chống khoảng trắng (100 µl nước cất thay cho mẫu thử nghiệm) Chuẩn TPC được thẩm định bằng cách
vẽ các đường chuẩn axit gallic (1-1500 lg / ml) và diễn tả như miligam tương đương axit gallic (GAE) mỗi gram chiết xuất khô Các phương trình cho đường cong hiệu chuẩn axit gallic là Y = 1,34577×X 0,07823 (trong đó X = nồng độ tương đương axit gallic (GAE) diễn tả như milligram GAE mỗi gram của chiết xuất khô; Y = hấp thụ đo được) và hệ số tương quan là R2 = 0,9897
2.2.4 Xác định hoạt động loại bỏ gốc tự do DPPH
Hoạt động chống oxy hóa của các chiết xuất bằng ethanol khô(ethanol không có nước) được đo trên cơ sở hoạt động loại bỏ của sự ổn định gốc 1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl (DPPH) (Cuendet, Hostettmann, & Potterat, 1997) Trong một đĩa thí nghiệm chứa 50 µl mẫu thử ở các nồng độ khác nhau được thêm vào: 3,95 ml methanol và 1 ml 0,2 mM dung dịch DPPH methanol Sau 30 phút ủ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng, độ hấp thụ đo được trừ đi mẫu trắng (methanol) tại bước sóng 517 nm bằng cách sử dụng máy quang phổ UV/nhìn thấy(Ultrospec 3300 pro, Amersham Bioscience, Thụy Điển)
Sự ức chế gốc DPPH được tính toán là một tỷ lệ phần trăm (%) bằng công thức:
Tỷ lệ ức chế(%) = [(Acontrol – Asample)/Acontrol]×100 Trong đó, Acontrol là độ hấp thụ của các phản ứng điều khiển (có chứa tất cả các chất phản ứng trừ hợp chất thử nghiệm), Asample là độ hấp thụ của hợp chất thử nghiệm Giá trị IC50 (nồng độ của mẫu cần thiết để loại bỏ 50% của các gốc tự do) được tính toán từ phương trình hồi quy, chuẩn bị từ nồng
độ mẫu và tỷ lệ ức chế sự hình thành các gốc tự do (tỷ lệ ức chế DPPH được khảo nghiệm) Acid L-ascorbic tổng hợp được có hoạt tính chống oxy hóa sử dụng kiểm soát tốt và tất cả các thử nghiệm đã được tiến hành ba lần
2.2.5 Phương pháp FRAP
Trong phương pháp FRAP màu vàng của phức hợp Fe3+ -TPTZ giảm xuống thay bằng màu xanh của phức hợp Fe2+ -TPTZ bởi các chất nhường điện tử (electron-donating substances) trong điều kiện
có tính acid Bất kỳ chất nhường điện tử với một nữa phản ứng của thế oxi hóa khử thấp hơn so với
Trang 4Fe3+/Fe2+ -TPTZ sẽ điều khiển phản ứng và sự hình thành của các phức hợp chuyển tiếp màu xanh Để chuẩn bị thuốc thử FRAP, một hỗn hợp của 300mmol/l dung dịch đệm acetate pH 3.6 (bao gồm 6,4 ml dung dịch 2M Natri acetate và 93,6 ml 2M dung dịch acid acetic pha loãng trong bình định mức 1 lít),
10 mmol/lít TPTZ (trong 40 mmol/lít HCl) và 20 mmol/lít sắt clorua (10: 1: 1, v: v: v) được làm trước 150µl dịch chiết thực vật được pha trộn với 4.5ml thuốc thử FRAP Việc đọc độ hấp thu được bắt đầu sau 5 phút và chúng được thực hiện ở bước sóng 593nm bằng máy quang phổ UV/nhìn thấy (Ultrospec
3300 pro, Amersham Bioscience, Thụy Điển) Mẫu trắng gồm thuốc thử FRAP Độ hấp thu chính thức của từng mẫu được so sánh với đường cong tiêu chuẩn thu được từ sắt sunfat(FeSO4×7H2O) (200-1000µmol/l) Kết quả được thể hiện trong nmol Fe2+/mg chiết xuất khô
2.2.6 Kiểm tra acid Thiobarbituric (TBA)
Xét nghiệm axit Thiobarbituric được thực hiện theo phương pháp của Afanas'ev, Dorozhko, Brodskii, Kostyuk, và Potapovitch (1989) để xác định các chất phản ứng TBA (TBARS) từ lipid peroxy Lipid peroxy được đo trong liposome rimifon Lipotech 10 (0,3 g lecithin/ml) Hỗn hợp chứa 20µl FeSO4 (0,075 M), 50µl liposome, 10µl mẫu thử nồng độ khác nhau (1-10% w/v), 20µl axit L-ascorbic (0,1 M) và 3,9 ml đệm phosphate pH 7.4 (chứa 5 ml 0,2 mol/l dung dịch KH2PO4 và 3,91 ml 0,2 mol/l dung dịch NaOH pha loãng trong bình định mức (20 ml)) Hỗn hợp này được duy trì ở mức 37oC trong
1 giờ ở máy điều nhiệt và sau đó trộn với 0.2ml acid axit ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (0,1 M)
và 1.5ml thuốc thử TBA(3g axit thiobarbituric, 120g axit trichloroacetic và 10,4 ml axit pecloric trong
800 ml nước đã khử khoáng) Sau khi làm nóng ở 100oC trong 15 phút và ly tâm ở 1107g (3000 rpm) trong 10 phút bằng máy ly tâm SIGMA 2-16 Versatile (MBI, Dorval, Canada), độ hấp thụ của bề mặt được đo ở bước sóng 532 nm so với mẫu trắng (nước cất) bằng cách sử dụng máy quang phổ UV/nhìn thấy (Ultrospec 3300 pro, Amersham Bioscience, Thụy Điển) Sự ức chế peroxy lipid đã được tính toán bằng phần trăm (%) theo công thức:
Tỷ lệ ức chế(%) = [(Acontrol – Asample)/Acontrol]×100 Trong đó, Acontrol là độ hấp thụ của các phản ứng điều khiển (có chứa tất cả các chất phản ứng trừ hợp chất thử nghiệm), Asample là độ hấp thụ của hợp chất thử nghiệm
2.2.7 Phân tích thống kê
Tất cả các phân tích để xác định các hoạt động chống oxy hóa và thử nghiệm để xác định tổng hàm lượng phenol (TPC) đã được thực hiện trong ba lần Các giá trị trung bình và độ lệch chuẩn được tính toán bằng phần mềm Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA) Phân tích phương sai (ANOVA) được sử dụng để đánh giá sự khác biệt đáng kể giữa các phương pháp xử lý khác nhau với các tiêu chí P <0,05
3 Kết quả và thảo luận
3.1 Tổng lượng phenol và hoạt tính chống oxy hóa của các thực vật
Hoạt tính chống oxy hóa và tổng phenol của 4 loại ngũ cốc tự nhiên được kiểm tra trình bày trong bảng 1
Trang 5Bảng 1: Tổng số phenol và hoạt tính chống oxy hóa của nguyên liệu thực vật tự nhiên và được lên men
(mg GAE/g dried extract) *
DPP
H B (IC5 0) (lg/
ml) *
FRAP C (nmol Fe2+/m
g dried extract)
*
TBARS inhibiti
on D (%) * Kiều
mạch
(Fagopyr
um
esculentu
m)
Tự nhiên 50.7 ± 0.04a 76.7 49.43 ±
0.49a
45.6 ± 0.55a
Lên men với L
rhamnosus
59.4 ± 0.06b 63.4 51.54 ±
0.65a
50.2 ± 0.45b
Lên men với S
cerevisiae
53.2 ± 0.02c 66.3 49.76 ±
0.62a
49.1 ± 0.85a Lúa
mạch
(Hordeu
m
vulgare)
Tự nhiên 16.4 ± 0.04a >200 15.56 ±
0.67a
50.8 ± 0.75a
Lên men với
L
rhamnosus
20.1 ± 0.08b >200 20.0 ±
0.54b
60.9 ± 0.75b
Lên men với S
cerevisiae
18.5 ± 0.09c >200 19.83 ±
0.51b
52.4 ± 0.50a Lúa mì
(Triticu
m
durum)
Tự nhiên 16.2 ± 0.07a >200 12.15 ±
0.60a
55.2 ± 0.35a
Được lên men với L
rhamnosus
20.7 ± 0.06b >200 15.11 ±
0.57a
61.7 ± 0.75b
Được lên men với S
cerevisiae
18.4 ± 0.08c >200 12.25 ±
0.62a
56.5 ± 0.70a Lúa mạch
(Secale
cereale)
Tự nhiên 13.2 ± 0.06a >200 8.94 ±
0.86a
57.6 ± 0.45a
Được lên men với L
rhamnosus
18.4 ± 0.06b 196.3 13.94 ±
0.91a
62.4 ± 0.60a
Được lên men với S
cerevisiae
16.2 ± 0.04c >200 10.68 ±
0.83a
60.0 ± 0.65a
A Tổng số hàm lượng phenol (TPC) theo phương pháp Folin-Ciocalteu
B Hoạt tính loại bỏ gốc tự do DPPH
C Khả năng khử sắt của plasma (FRAP)
D Phương pháp Thiobarbituric (TAB)
* Những giá trị có những chữ cái viết ở trên khác nhau (a,b,c) thì bên trong mỗi loại ngũ cốc riêng thì khác nhau đáng kể ( P =0.05)
Tất cả thực vật cho thấy tổng lượng phenol đáng kể và hoạt tính chống oxy hóa hiệu quả (Bảng 1) Bột kiều mạch có lượng phenol cao nhất với hoạt tính loại bỏ gốc tự do DPPH và khả năng khử Fe3+
Trang 6cao nhất, nhưng khả năng ức chế quá trình peroxide lipid thấp nhất Những số liệu thí nghiệm này cho thấy trong việc làm chậm quá trình peroxide lipid thì nó ngăn chặn giai đoạn bắt đầu của các chuỗi phản ứng gốc tự do hơn là chấm dứt hay di chuyển gốc tự do sinh ra trong chuỗi truyền phản ứng của gốc tự do (Yu, Haley, Perret, & Harris, 2002) Những thực vật khác thì tương tự TPC và AOA
Quá trình lên men dẫn đến tăng hàm lượng phenol, được đo bằng phương pháp TPC, và hoạt tính chống oxy hóa cao hơn hay thấp hơn , được đo bằng 3 phương pháp Hoạt tính chống oxy hóa
được nghiên cưú trong mẫu được lên men với L rhamnosus cao hơn so với mẫu được lên men với
S.cerevisiae ( Bảng 1) Phenol liên kết- sự quan trọng của nó trong tổng thành phần phenol (TPC) được công nhận bởi một trong những nghiên cứu rất sớm của Naczk và Shahidi (1989)- có lẽ bị thất thoát bởi alkali, acid hay cách xử lí enzyme của mẫu trước khi trích ly (Krygier, Sosulski, & Hodge, 1982a,b; Bartolome & Gomez- Cordoves ,1999), điều này có thể được sử dụng để giải thích bằng quá trình lên men tự phát làm tăng TPC dẫn đến khả năng chống oxy hóa của dịch chiết ngũ cốc được lên men cao hơn
3.2 Tổng hàm lượng phenol
Như được trình bày ở bảng 1, tổng hàm lượng phenol trong ngũ cốc và giả ngũ cốc thì cao nhất
là ở trong bột kiều mạch, 50.7 mg GAE/g dịch chiết khô Hàm lượng phenol của bột kiều mạch tương
tự được báo cáo bởi Velioglu, Mazza, Gao, và Oomah (1998) Tổng hàm lượng phenol thấp hơn có trong lúa mì và lúa mạch ( tương ứng với 16.2 và 16.4 mg GAE/g dịch chiết khô) và thấp nhất là trong lúa mạch đen 13.2 mg GAE/g dịch chiết khô Những số liệu thí nghiệm được báo cáo bởi Zhou và Yu (2004) cho thấy tổng hàm lượng phenol trong hạt lúa mì và lúa mạch bị tác động bởi dung môi trích ly theo thứ tự giảm dần như sau: acetone > ethanol > methanol , điều này có thể được giải thích bởi lượng phenol thấp hơn có ở những thực vật này (Bảng 1) Thông qua Zielinski và Troszynska ( 2000), thời gian trích ly và phương pháp trích ly làm ảnh hưởng đến TPC trong lúa mạch đen, vì vậy thật khó có thể so sánh kết quả của chúng tôi với những người khác Thông thường, khó có thể so sánh số liệu thí nghiệm của chúng tôi với các văn bản thí nghiệm khác bởi vì phương pháp dùng để trích ly khác nhau, cách xác định AOA khác nhau và cách giải thích số liệu khác nhau bởi các tác giả khác nhau
Quá trình lên men ảnh hưởng đến thành phần có hoạt tính sinh học (Bảng1) Trong bột kiều mạch, TPC tăng từ 50.7 mg GAE/g dịch chiết khô trong mẫu không lên men đến 53.2 mg GAE/g dịch chiết khô trong mẫu lên men với S.cerevisiae và 59.4 mg GAE/g dịch chiết khô với mẫu được lên men
với L.rhamnosus Trong lúa mì, TCP biến đổi từ 16.2 mg GAE/g dịch chiết khô đến 18.4 và 20.7 mg
GAE/g dịch chiết khô, tương ứng với 3 mẫu như trên; trong lúa mạch tương ứng giá trị 16.4, 18.5, 20.1mg GAE/g dịch chiết khô Lúa mạch đen cho thấy TPC thấp nhất của 13.3 mg GAE/g dịch chiết khô trong mẫu không lên men, 16.2 mg GAE/g dịch chiết khô trong mẫu được lên men với S.cerevisiae
và 18.4 mg GAE/g dịch chiết khô trong mẫu được lên men với L.rhamnosus Những kết quả này có thể
được giải thích rằng lượng hợp chất có hoạt tính sinh học có thể bị biến đổi trong suốt quá trình lên men do hoạt động trao đổi chất của các vi khuẩn Ngoài ra, thành tế bào hạt ngũ cốc bị phá vỡ cấu trúc trong quá trình lên men, dẫn đến sự phân giải và/ hay tổng hợp các hợp chất có hoạt tính sinh học đa
Trang 7dạng (Katina, Liukkonen et al., 2007) Trong suốt quá trình lên men, enzymes như amylase, xylanases
và proteases từ hạt và vi khuẩn sẽ đóng góp vào sự biến đổi các thành phần của hạt (Katina, Laitila et al.2007; Loponen, Mikola, Katina, Sontag-Strohm, &Salovaara,2004), và như được đề cập, phenol liên kết có lẽ bị thất thoát trong cách xử lí enzyme của mẫu trước khi trích ly (Bartolome & Gomez-Cordoves, 1999; Krygier et al., 1982a,b) Loại lên men xác định mức độ biến đổi các hợp chất có hoạt tính sinh học trong các ngũ cốc thí nghiệm Điều này là do sự khác nhau về pH của các quá trình lên men khác nhau, pH tối ưu tác động đến sự phá hủy thành tế bào sẽ làm giảm sự hình thành enzyme từ hạt ngũ cốc (Boskov-Hansen et al.,2002) Những tác giả khác cũng đã chứng minh rằng quá trình lên men có tác động xác thực vào TPC và hoạt tính chống oxy hóa của ngũ cốc, nhưng mức độ tác động phụ thuộc vào loại vi sinh vật (Kariluoto et al 2006) Nhiều nghiên cứu chi tiết về sự thay đổi số lượng
vi khuẩn và hoạt động của enzyme thích hợp trong suốt quá trình lên men của ngũ cốc thì được yêu cầu phải xác định được cơ chế chính xác gây ra sự cải thiện giá trị dinh dưỡng của các ngũ cốc được lên men, đặc biệt được biết đến là phương pháp Folin-Ciocalteu (được sử dụng để xác định tổng lượng phenol) thì không có nguyên nhân rõ ràng và còn hạn chế khi được nghiên cứu lên men Được biết là các hợp chất hữu cơ không phải phenol , phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteu bao gồm adenine, adenosine, alanine, aniline, aminobenzoic acid, ascorbic acid, benzaldehyde, creatinine, cysteine, cytidine, cyto- sine, dimethyaniline, diphenylamine, EDTA, fructose, guanine, gua- nosine, glycine, histamine, histidine, indole, methylamine, nitrilo- acetic acid, oleic acid, phenylthiourea, proteins, pyridoxine, sucrose, sulfanilic acid, thiourea, thymine, thymidine, trimethyla- mine, tryptophan, uracil, uric acid, and xanthinethe, lượng amino acids và acids hữu cơ được hình thành trong suốt quá trình lên men có thể tăng hàm lượng phenol biểu kiến (Prior, Xianli, & Schaich, 2005)
3.3 Hoạt tính loại bỏ gốc tự do DPPH
Gốc tự do DPPH được sử dụng nhiều để đánh giá hoạt động loại bỏ gốc tự do bởi sự dễ dàng và thuận tiện của phương pháp Hiệu quả loại bỏ của dịch chiết từ thực vật được sử dụng với hàm lượng mẫu cao nhất thì thấp cho dịch chiết từ lúa mì , với chỉ 31% sự ức chế gốc tự do DPPH (200 µg/ml) (như được trình bày ở bảng 2)
Bảng 2
Hoạt động loại bỏ gốc DPPH cho thực vật tự nhiên và được lên men
Tên mâu4
Sự ức chế gốc DPPH(%)*
s c.A 10 lg/ml
s c 20 lg/ml
s c 50 lg/ml
s c 100 lg/ml
s c 200 lg/ml
Tự nhiên 11.6 ±
0.55a
21.6 ± 0.50a
34.8 ± 0.65a
63.3 ± 0.50a
82.5 ± 0.45a
Được lên men với L rhamnosus
14.7 ± 0.65a
23.5 ± 0.70a
42.4 ± 0.55b
70.1 ± 0.95b
86.0 ± 0.45b
Trang 8A Nồng độ mẫu
* Các giá trị có các chữ khác nhau (a, b) trong mỗi loài ngũ cốc riêng lẻ là sự khác biệt đáng kể (P = 0,05)
Kiều
mạch(Fagopyrum
esculentum)
Được lên men với S cerevisiae
12.6 ± 0.95a
22.0 ± 0.85a
42.4 ± 0.55b
65.4 ± 0.65a
85.3 ± 0.55a
Lúa mạch
(Hordeum
vulgare)
Tự nhiên 6.5 ±
0.45a
12.5 ± 0.65a
17.9 ± 0.75a
28.0 ± 0.75a
36.6 ± 0.95a
Được lên men với L rhamnosus
15.5 ± 0.80b
16.1 ± 0.75a
23.2 ± 0.45b
35.4 ± 0.65b
42.9 ± 0.90b
Được lên men với S cerevisiae
12.5 ± 0.55b
14.3 ± 0.65a
22.0 ± 0.80a
28.0 ± 0.95a
41.7 ± 0.65a
Lúa mì (Triticum
durum)
Tự nhiên 6.7 ±
0.55a
12.2 ± 0.60a
15.6 ± 0.55a
23.4 ± 0.50a
31.0 ± 0.65a
Được lên men với L rhamnosus
10.1 ± 0.60a
15.9 ± 0.85a
18.5 ± 0.65a
28.2 ± 0.55b
35.9 ± 0.55b
Được lên men với S cerevisiae
8.2 ± 0.70a
13.4 ± 0.60a
16.9 ± 0.65a
27.4 ± 0.55b
34.3 ± 0.45a
Lúa mì (Secale
cereale)
Tự nhiên 10.6 ±
0.65a
18.9 ± 0.65a
25.8 ± 0.55a
32.7 ± 0.60a
45.0 ± 0.80a
Được lên men với L rhamnosus
15.1 ± 0.65b
24.6 ± 0.50b
31.5 ± 0.55b
39.2 ± 0.65b
50.4 ± 0.65b
Được lên men với S cerevisiae
13.6 ± 0.65a
22.2 ± 0.65a
30.0 ± 0.95b
35.2 ± 0.55a
48.8 ± 0.65a
Trang 9Trong các nghiên cứu khác, những dich chiết lúa mì cũng đã chứng minh hoạt tính loại bỏ gốc
tự do DPPH yếu trong hàm lượng mẫu này (Yu, Perret, Davy, Wilson & Melby, 2002) Hiệu quả loại
bỏ gốc tự do DPPH mạnh hơn được tìm thấy trong lúa mạch và lúa mạch đen (tương ứng với 36.6% và 45%)(Bảng 2) Những kết quả của việc cho thấy khả năng ức chế đáng kể gốc tự do DPPH của lúa mạch thì phù hợp với số liệu thí nghiệm được báo cáo bởi các người khác, ngoại trừ sự khác nhau về việc giải thích số liệu thí nghiệm Madhujith và Shahidi (2006) đã chứng minh rằng lúa mạch chứa lượng lớn những chất chống oxy hóa phenol có hiệu quả loại bỏ các gốc tự do đặc biệt là peroxyl, DPPH, và những gốc tự do hydroxyl Hiệu quả loại bỏ gốc tự do DPPH mạnh nhất được tìm thấy trong dịch chiết bột kiều mạch (82.5%)(Bảng 2) Hiệu quả loại bỏ gốc tự do DPPH được nghiên cứu và báo cáo số liệu thí nghiệm bởi Sun và Ho (2005)
Quá trình lên men với L.rhamnosus có một tác động xác thực vào hiệu quả ức chế DPPH trong
mỗi loại ngũ cốc (Bảng 2) Về bột kiều mạch, hiệu quả loại bỏ gốc tự do tăng từ 82.5% trong mẫu
không được lên men đến 86% trong mẫu được lên men với L.rhamnosus, dẫn đến IC50 tương ứng giá
trị của 76.7 và 63.4 µg/ml (Bảng 1, bảng 2) Tương tự tăng sự loại bỏ gốc tự do DPPH sau khi lên men
với L.hramnosus thì cũng được báo cáo trong lúa mạch đen (tương ứng 45% và 50.4%), lúa mạch
(36.6% và 42.9%), lúa mì (31% và 35.9%).Sự lên men với S.cerevisiae không có tác động đáng kể vào hiệu quả ức chế DPPH trong loại ngũ cốc được thí nghiệm (Bảng 2) Phần trăm ức chế trong mẫu được lên men với S.cerevisiae là 85.3% cho bột kiều mạch (với IC50 giá trị 66.3 µg/ml), 48.8% cho lúa mạch đen, 41,7% cho lúa mạch và 34.3% cho lúa mì Những kết quả này thì phù hợp với số liệu thí nghiệm được báo cáo bởi Moore et al (2007) - ông là người báo cáo một vài sự tăng hoạt động loại bỏ gốc tự
do DPPH của lúa mì sau khi lên men nấm men với nhiều loại nấm men , trái lại khả năng này giảm với các loại nấm men khác , điều này cho thấy nấm men có lẽ có năng lực loại bỏ DPPH khác nhau Không
có sự tương quan tồn tại giữa TPC và hoạt động loại bỏ gốc tự do DPPH trong ngũ cốc (Bảng 1) Những ngũ cốc có giá trị TPC cao hơn thì chưa chắc ức chế DPPH tốt hơn Thông qua Brand-Williams, Cuvelier, và Berset (1995), acid ferulic (loại acid phenolic chính có trong hạt ngũ cốc) cho thấy hiệu quả chống gốc tự do yếu trong những thí nghiệm với gốc tự do DPPH, điều này có thể giải thích sự không thống nhất này Bên cạnh đó, mặc dù phương pháp Folin-Ciocalteu thì được sử dụng phổ biến
để xác định tổng thành phần phenol trong các mẫu thực vật học và sinh vật học nhưng nó vẫn có những mặt hạn chế Các tác nhân khử khác như acid L-ascorbic và sulphur dioxide có lẽ cũng phản ứng với thuốc thử Folin –Ciocalteu và đóng góp vào tổng năng suất hấp thụ theo phổ, điều này thường dẫn đến kết quả tổng lượng phenol được đánh giá quá cao Ngoài ra, các thành phần phenol riêng có lẽ có phản ứng với thuốc thử Folin- Ciocalteu khác nhau, điều này có thể dẫn đến sự sai sót trong sự đo lường tổng thành phẩn phenol (Yu, Perret et al, 2002)
Thường có một vài sự giải thích về mối quan hệ mơ hồ giữa hoạt tính chống oxy hóa và tổng phenol: (1) Tổng thành phần phenol không bao gồm tất cả các chất chống oxy hóa như acid ascorbic, carotenoid và tocopherols ; (2) Sự kết hợp giữa các chất chống oxy hóa trong hỗn hợp làm hoạt tính
Trang 10chống oxy hóa không chỉ phụ thuộc vào hàm lượng chất chống oxy hóa, cấu trúc mà còn phụ thuộc vào
sự tương tác lẫn nhau giữa các chất chống oxy hóa Đó là tại sao mà các mẫu có hàm lượng tổng phenol tương tự nhau mà lại có hoạt tính chống oxy hóa khác nhau rõ rệt ; (3) Những phương pháp khác nhau được sử dụng để đo lường hoạt tính chống oxy hóa dựa vào các cơ chế khác nhau có lẽ dẫn đến những lời nhận xét khác nhau (Sun & Ho, 2005)
3.4 Phương pháp FRAP
Khả năng chống oxy hóa bằng cách khử sắt của ngũ cốc được khảo sát trong bảng 1,có liên quan đến tổng thành phần phenolic.Giá trị FRAP cao nhất,thể hiện trong nmol của Fe2+/mg chiết suất khô,được tìm thấy trong kiều mạch (49.43nmol Fe2+ / mg chiết suất khô), tiếp theo FRAP giá trị thấp nhất trong lúa mạch và lúa mì (lần lượt là 15.56 và 12.15).Và khả năng chống oxy hóa bằng cách khử sắt được tìm thấy trong lúa mạch đen (8.94)
Sự khó khăn trong giải thích về sự so sánh của dữ liệu thì thậm chí còn rõ ràng hơn với phương pháp FRAP.Trong công việc của chúng ta,những kết quả được thể hiện trong nmol của Fe2+/mg chiết suất khô,tuy nhiên những tác giả khác báo cáo rằng những kết quả trong nmol hoặc mmol Fe2+ trong
mg hoặc g của ngũ cốc hay bột mì (Xand và Chang năm 2007).Bên cạnh đó,dung môi chiết xuất và những phương pháp của sự chuẩn bị mẫu sử dụng trong những nghiên cứu khác thì khác nhau,và cả hai đều cho thấy là có ảnh hưởng lên FRAP (Xand và Chang năm 2007)
Thật ấn tượng là trong lúa mạch đen, có vai trò đáng kể trong hoạt đông ức chế gốc tự do DPPH, cho thấy khả năng khử sắt thấp nhất (bảng 1) Phải thận trọng trong việc thu nhận khi sử dụng những gốc tự do như là cơ sở cho những thử nghiệm hoạt tính chống oxy hóa bởi vì hoạt tính chống oxy hóa được đo của mẩu sinh học phụ thuộc vào gốc tự do và chất oxy hóa đươc sử dụng trong phân tích (Cao,Sofic,& Prior năm 1996) Những gốc tự do khác nhau được sử dụng và mức độ chất chống oxy hóa được tính toán hoàn thành bởi Cao et al.(1996) hoặc tốt nhất bằng phương pháp phân tích FRAP,đây chỉ là một phân tích về đo chất oxy hóa và chất khử một cách trực tiếp trong 1 mẫu được thực hiện bởi Halvorsen et al (2002)
Lên men bằng vi sinh vật được sử dụng trong nghiên cứu của chúng tôi thì không tìm thấy có bất kỳ ảnh hưởng đáng kể nào đến chất khả năng oxy hóa khử sắt III của các loại ngũ cốc đã kiểm tra (Bảng 1) Chỉ có trong lúa mạch, các mẫu lên men với L rhamnosus cho thấy một sự gia tăng trong FRAP cao hơn so với mẫu chưa lên men (20,00 nmol Fe2+/chiết xuất mg khô so với 15,56 nmol Fe2+/mg chiết xuất khô), trong khi sự khác biệt là không đáng kể trong lúa mì, lúa mạch đen và kiều mạch (Bảng 1) Sự khác biệt trong giá trị FRAP giữa các mẫu lên men với S cerevisiae và mẫu chưa lên men cũng không đáng kể (Bảng 1) Có những dữ liệu khoa học không đủ để so sánh ảnh hưởng của quá trình lên men trên FRAP nhưng, như thí nghiệm của chúng tôi sử dụng một thời gian ủ 24 h, các dữ liệu thu được là tương thích với những báo cáo của Hubert, Berger, Nepveu, Paul, và Daydé (2008), họ chỉ ra rằng khả năng giữ sắt III ban đầu ,được duy trì cho đến 6 giờ, tiếp theo là sự sụt giảm đáng kể cho đến
48 giờ trong thời gian ủ Nghiên cứu thêm là cần thiết để chứng minh ảnh hưởng của thời gian ủ lên khả năng khử sắt III cho các nhà máy kiểm tra
