PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN TÀI NGUYÊN MỘT SỐ LOÀI CÂY DƯỢC LIỆU Ở VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ ADN

Cây quan hệ di truyền giữa các mẫu Sâm Việt Nam ký hiệu S, Sâm Vũ Diệp ký hiệu V, dạng trung gian của Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang ký hiệu VT và Tam thất hoang ký hiệu T trong nghiên cứ

Nguyễn Cẩm Dương

PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN NGUỒN TÀI NGUYÊN MỘT SỐ LOÀI CÂY DƯỢC LIỆU

Ở VIỆT NAM BẰNG CHỈ THỊ ADN

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2010

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Đinh Đoàn Long

Hà Nội - 2010

Để có thể hoàn thành luận văn này, trước tiên tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới TS Đinh Đoàn Long, Chủ nhiệm bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tôi trong công tác nghiên cứu khoa học Đồng thời, tôi cũng muốn trân trọng cảm ơn các cán bộ thuộc Khoa tài nguyên dược liệu, Viện Dược liệu (Bộ Y tế), đã cung cấp và giúp tôi phân loại mẫu thực vật sử dụng trong nghiên cứu này

Qua đây tôi muốn được bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất tới các thầy, cô giáo của bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học trong đó đặc biệt là Th.S Trần Thị Thùy Anh đã tạo điều kiện thuận lợi và động viên tôi trong suốt quá trình học tập tại bộ môn Tôi xin được gửi lời cảm ơn tới Ban giám độc PTNTĐ Công nghệ Enzyme và Protein thuộc Khoa Sinh học đã luôn tạo điều kiện thuận lợi cho tôi về trang thiết bị và cơ sở vật chất trong quá trình học tập và nghiên cứu Đề tài nghiên cứu của tôi được hỗ trợ một phần tài chính từ đề tài Klept.09.05 thuộc PTNTĐ Công nghệ Enzym và Protein

Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô cùng sâu sắc tới bố mẹ, các bác và đặc biệt là anh chị tôi, những người đã luôn hỗ trợ tôi về mọi mặt trong suốt quá trình học tập tại Trường Đại học Khoa học Tự nhiên (ĐHQG Hà Nội) Nhân dịp này, tôi trân trọng gửi lời cảm ơn tới các anh chị khóa trên, bạn bè thân thiết luôn

cổ vũ, động viên và sát cánh bên tôi trong suốt quá trình học tập vừa qua

Hà Nội, tháng 12 năm 2010

Học viên

Nguyễn Cẩm Dương

i

Từ viết tắt Nghĩa tiếng Việt Nghĩa tiếng Anh

ADN Axit deoxyribonucleic Deoxyribonucleic acid

ASSOCHAM Hiệp hội thương mại và công nghiệp

Ấn Độ

The Associated Chambers of Commerce and Industry of India

CTAB Cetyltrimethylammonium bromide Cetyltrimethylammonium bromide

ddH 2 O Nước cất khử trùng hai lần Double distilled water

DDT Thuốc trừ sâu

NTSYS Phần mềm hệ thống phân loại số Numerical Taxonomy System

OD Mật độ quang phổ hấp thụ Optical Density

OPA,OPC Các mồi oligonucleotit

PCR Phản ứng chuỗi trùng hợp ADN Polymerase Chain Reaction

RAPD Đa hình phân đoạn ADN nhân bản

The ginsenoside Rb1 group

RFLP Đa hình độ dài các đoạn giới hạn Restriction fragment length

polymorphism

ii

protopanaxatriol) STR/SSR Trình tự vi vệ tinh Microsatellite/simple tandem repeats TBE Đệm gồm Tris, Borate và EDTA Tris/Borate/EDTA buffer

v/v Tỉ lệ pha theo thể tích/thể tích Volume/volume

WHO Tổ chức Y tế thế giới World Health Organization

iii

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TỔNG QUAN VỀ CÂY DƯỢC LIỆU 3

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 7

1.3 LÝ DO THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 12

1.3.1 Thực trạng nghiên cứu về cây dược liệu ở Việt Nam hiện nay 12

1.3.1.1 Nghiên cứu về chi Acanthopanax 12

1.3.1.2 Nghiên cứu về chi Illicium 14

1.3.1.3 Nghiên cứu về chi Morinda 15

1.3.1.4 Nghiên cứu về chi Panax L. 16

1.3.2 Chỉ thị ADN – Chỉ thị RAPD-PCR 19

1.3.3 Mục tiêu của đề tài 22

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 VẬT LIỆU THỰC VẬT 24

2.1.1 Chi Acanthopanax 24

2.1.2 Chi Illicium 26

2.1.3 Chi Morinda 27

2.1.4 Chi Panax L 28

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.2.1 Tách chiết ADN tổng số bằng phương pháp Mini-CTAB cải tiến 31

2.2.2 Phân tích di truyền bằng kỹ thuật RAPD-PCR 33

2.2.3 Điện di ADN trên gel agarose 34

2.2.4 Dựng cây quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYSpc 2.02h 35

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 38

3.1 KẾT QUẢ TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ 38

iv

3.1.1 Kết quả tách chiết ADNts từ các mẫu thực vật thuộc chi Acanthopanax 38

3.1.2 Kết quả tách chiết ADNts từ các mẫu thực vật thuộc chi Illicium 38

3.1.3 Kết quả tách chiết ADNts từ cây Ba kích (Morinda officinalis How) 39

3.1.4 Kết quả tách chiết ADNts các mẫu thực vật thuộc chi Panax L 39

3.2 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA CÁC LOÀI CÂY THUỐC TRONG NGHIÊN CỨU 41

3.2.1 Sự đa dạng di truyền giữa các loài cây thuốc thuộc chi Acanthopanax 42

3.2.1.1 Phân tích đa hình loài ngũ gia bì gai (A trifoliatus) 43

3.2.1.2 Phân tích đa hình loài ngũ gia bì hương (A gracilistylus) 46

3.2.2 Sự đa dạng di truyền giữa loài cây thuốc thuộc chi Illicium 48

3.2.2.1 Phân tích đa dạng di truyền loài hồi hương 48

3.2.2.2 Phân tích đa dạng di truyền của các loài hồi núi 51

3.2.3 Sự đa dạng di truyền của loài cây thuốc Ba kích 53

3.2.4 Sự đa dạng di truyền của loài cây thuốc thuộc chi Panax L 56

3.2.5 Bước đầu xác định tập hợp một số chỉ thị RAPD-PCR giúp phân biệt nhanh nguồn nguyên liệu từ các loài thực vật trong nghiên cứu 61

3.2.5.1 Chỉ thị ADN giúp phân biệt nguồn dược liệu từ các loài dược liệu Ngũ gia bì gai và Ngũ gia bì hương 61

3.2.5.2 Chỉ thị ADN (RAPD-PCR) giúp phân biệt nguồn dược liệu từ loài hồi hương với các loài hồi núi 63

3.2.5.3 Chỉ thị ADN (RAPD-PCR) giúp phân biệt các dạng hình thái khác nhau của loài Ba kích 64

3.2.5.4 Chỉ thị ADN (RAPD-PCR) giúp phân biệt các loài Sâm Việt Nam, Sam Vũ Diệp và Tam thất hoang 66

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68

KẾT LUẬN 68

KIẾN NGHỊ 69

TÀI LIỆU THAM KHẢO 70

Bảng 6 Số băng RAPD đa hình thu được từ các mẫu quần thể loài Acanthopanax

trifoliatus và A gracilistylus phân tích với 16 mồi ngẫu nhiên 42

Bảng 7 Số băng ADN đa hình thu được từ các mẫu quần thể loài Ngũ gia bì gai (A

trifoliatus) (ký hiệu G) thu tại Lào Cai, Cao Bằng và Lạng Sơn được phân tích theo từng

Bảng 8 Số băng RAPD đa hình thu được từ các mẫu quần thể loài Illicium verum và các

Bảng 9 Số băng RAPD đa hình thu được từ các mẫu quần thể loài Ba kích (Morinda

officinalis) với các dạng hình thái khác nhau: dạng thân có lông (L); dạng thân không có

Bảng 10 Số băng RAPD đa hình thu được từ các mẫu thuộc ba loài Sâm Việt Nam

Bảng 11 Tập hợp các chỉ thị ADN (chỉ thị RAPD-PCR) đặc trưng có thể giúp phân biệt

vi

Hình 1 Ảnh các loài thực vật thuộc chi Acanthopanax trong nghiên cứu: a-b) Bụi cây, lá và

hoa cây Ngũ gia bì gai; c-d) Bụi cây, lá và hoa cây Ngũ gia bì hương. 26

Hình 2 a-b) Hình thái lá và quả cây Hồi hương (Illicium verum Hook.f); c-d) hình thái lái

và quả của cây hồi núi (I anasitum) 27

Hình 3 Hình thái các loại kiểu hình của cây Ba kích sử dụng trong nghiên cứu: a) quả tụ;

Hình 4 Các loài thực vật thuộc chi Panax L trong nghiên cứu: a) Sâm Việt Nam (P

vietnamensis); b) Sâm Vũ Diệp (P bipinnatididus); c) dạng trung gian giữa Sâm Vũ

Diệp-Tam thất hoang; d) Diệp-Tam thất hoang (P stipulenatus) 29

Hình 5 Bản đồ các địa phương thu mẫu dược liệu trong nghiên cứu 30

Hình 6 ADNts tách chiết từ các phần mô khác nhau: hình bên trái - ADNts từ các mẫu cây

Hồi hương (I); hình bên phải - ADNts từ các phần mô khác nhau ở cây sâm (V) M: thang

ADN chuẩn Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu nêu ở Bảng 4 40

Hình 7 Ảnh điện di ADN tổng số các mẫu dược liệu được thu thập trong nghiên cứu:

a) mẫu các loài Ngũ gia bì gai (G) và Ngũ gia bì hương (H); b) mẫu các loài Hồi

hương (I) và Hồi núi (N); c) mẫu các loài Ba kích (K); d) mẫu các loài Sâm Việt Nam

(S), Sâm Vũ Diệp (V), Tam thất hoang (T) và dạng trung gian Sâm Vũ Diệp-Tam thất

hoang (VT) M: thang ADN chuẩn Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu nêu ở Bảng 4 40

Hình 8 Hình ảnh điện di một số sản phẩm RAPD-PCR ở các mẫu Ngũ gia bì gai (G) và

Ngũ gia bì hương (H) trong nghiên cứu: a) Sản phẩm điện di với mồi OPC9; b) Sản phẩm

điện di với mồi OPA5 M: thang ADN chuẩn Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu nêu ở Bảng

Hình 9. Sơ đồ hình cây về quan hệ di truyền giữa các mẫu thuộc hai loài cây thuốc Ngũ gia

bì gai (Acanthopanax trifoliatus – ký hiệu G) và Ngũ gia bì hương (A gracilistylus – ký

hiệu H) thu thập được ở Việt Nam trên cơ sở phân tích chỉ thị RAPD-PCR Nguồn gốc và

Hình 10 Sơ đồ cây quan hệ di truyền của 39 mẫu Hồi hương với 11 mẫu Hồi núi trong

nghiên cứu Nguồn gốc và đặc điểm của các mẫu được nêu tại Bảng 4 52

Hình 11 Sơ đồ hình cây phản ánh mối quan hệ di truyền giữa 25 dòng Ba kích trong

nghiên cứu Nguồn gốc và đặc điểm của các mẫu được trình bày tại Bảng 4 54

vii

Hình 13. Cây quan hệ di truyền giữa các mẫu Sâm Việt Nam (ký hiệu S), Sâm Vũ Diệp (ký hiệu V), dạng trung gian của Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang (ký hiệu VT) và Tam thất hoang (ký hiệu T) trong nghiên cứu lập bởi số liệu thu được từ phân tích RAPD-PCR Nguồn gốc và đặc điểm của các mẫu được nêu ở Bảng 4 59

Hình 14 Băng đồng hình (chỉ ra bởi hình mũi tên) của các mẫu ngũ gia bì gai (G) và ngũ

gia bì hương (H) trong nghiên cứu với mồi OPA10 Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu được

Hình 15 Băng đặc trưng phân biệt (chỉ ra bởi hình mũi tên) của các mẫu Ngũ gia bì gai

(G) và Ngũ gia bì hương (H) trong nghiên cứu với mồi OPA12 (hình bên trái) và mồi OPA1 (hình bên phải) M: thang ADN chuẩn Trong đó, chỉ thị OPA12 750 và OPA1 500 đặc trưng cho các mẫu thuộc loài Ngũ gia bì gai; chỉ thị OPA12 950 và OPA1 300 đặc trưng cho

các mẫu thuộc loài Ngũ gia bì hương Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu được nêu ở Bảng 4 62

Hình 16 Băng đồng hình (chỉ ra bởi hình mũi tên) của các mẫu thuộc nhóm loài Hồi

hương (I) (hình bên phải) và các loài Hồi núi (N) trong nghiên cứu với mồi OPA7 (hình

bên trái) M: thang ADN chuẩn Băng đặc trưng phân biệt của hồi núi là băng có kích

thước 1800 bp Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu được nêu ở Bảng 4 63

Hình 17 Băng đồng hình (chỉ ra bởi hình mũi tên) ở tất cả 25 mẫu Ba kích trong nghiên

cứu với chỉ thị OPA17 Dạng hình thái thân có lông (L), không có lông (K), dạng hình thái quả tụ (T) và hình thái quả rời (R) Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu được nêu ở Bảng 4 M:

Hình 18 Hình ảnh điện di các mẫu Ba kích với mồi OPA1 Băng đồng hình giữa hai dạng

hình thái thân có lông (L) và không có lông (K) có kích thước 600 bp và 300 bp (chỉ ra bởi hình mũi tên) Băng đặc trưng phân biệt của kiểu hình thái thân không có lông có kích

thước 1100 bp Nguồn gốc và đặc điểm các mẫu được nêu ở Bảng 4 M: thang ADN chuẩn 65

Hình 19 Ảnh điện di các mẫu Sâm Việt Nam (S), Sâm vũ diệp (V), dạng trung gian (VT) và

Tam thất hoang (T) với mồi OPA14 và OPC16, hình mũi tên chỉ ra các băng đặc hiệu phân biệt còn hình đầu mũi tên chỉ ra các băng chung M: thang ADN chuẩn (1kb marker) Nguồn gốc và

1

MỞ ĐẦU

Theo ước tính hơn 80% dân số trên toàn thế giới hiện nay vẫn phụ thuộc vào các loại thuốc có nguồn gốc thảo dược trong việc chăm sóc sức khỏe Các liệu pháp chữa bệnh dựa vào thảo dược được đánh giá thông qua tính khả dụng và dựa vào kinh nghiệm lưu truyền từ thế hệ này sang thế hệ khác Phần lớn các loài cây thuốc hiện nay chủ yếu được thu hái từ tự nhiên Việc thu hái như vậy nếu không có sự kiểm soát chặt chẽ dễ gây nên sự suy kiệt tài nguyên di truyền của các loài cây thuốc nói riêng cũng như của nguồn tài nguyên thực vật nói chung Đây cũng là nguyên nhân có thể dẫn tới chất lượng sản phẩm kém ổn định Bên cạnh đó, nhiều loài dược liệu quý hiếm có thể bị làm giả hoặc thay thế bằng các dạng dược liệu có hình thái tương tự, dẫn tới những tác dụng không mong muốn khi sử dụng

Việt Nam có gần 4.000 loài cây thuốc Với thế mạnh về tài nguyên dược liệu dồi dào như vậy, chúng ta có thể hy vọng phát hiện và phát triển được thuốc mới từ nguồn tài nguyên tự nhiên phong phú này Tuy vậy, hiện nay công tác bảo tồn, gìn giữ, chọn tạo giống và phát triển nguồn gen cây thuốc vẫn chưa phát huy hết tiềm năng Nhiều loài cây thuốc quý hiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng do bị khai thác ồ

ạt và thiếu kế hoạch

Những vấn đề trên đặt ra một yêu cầu cấp thiết là cần có các biện pháp bảo tồn

và phát triển nguồn tài nguyên dược liệu của nước ta, cũng như cần phát triển công tác kiểm định dược liệu nhằm đánh giá hiệu quả nguồn nguyên liệu ban đầu bảo đảm chất lượng sản phẩm phục vụ ngành công nghiệp dược trong nước về lâu dài Trên thế giới, việc sử dụng các chỉ thị ADN (RAPD-PCR, RFLP-PCR, AFLP, SSR, ) ngày càng được dùng rộng rãi trong các nghiên cứu phân loại, phân tích đa dạng sinh học, xác định khoảng cách di truyền và đặc trưng cá thể và quần thể thực vật nhằm mục đích bảo tồn và chọn giống So với các chỉ thị truyền thống (chỉ thị hình thái và chỉ thị hóa học), thì chỉ thị ADN mang những ưu điểm nổi bật: dễ thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm, không phụ thuộc vào các yếu tố môi trường

và hiện tượng tương tác gen, có thể xác định được các biến dị ADN trong các giai đoạn khác nhau và ở các cơ quan khác nhau ở thực vật Việc phân tích các chỉ thị

2

ADN cho phép đánh giá một cách chính xác mức độ đa dạng di truyền của một loài cây thuốc nào đó nhằm định hướng bảo tồn, chọn, tạo và nhân giống phù hợp, đáp ứng yêu cầu của quá trình phát triển một nền công nghiệp chế biến dược liệu bền vững

Trên cơ sở đó, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu phân tích tính đa dạng di truyền của một số loài cây thuốc quý ở nước ta hoặc đang bị đe dọa cần được ưu tiên bảo tồn, hoặc có đặc điểm hình thái giống nhau cần có sự hỗ trợ của các kỹ thuật sinh học phân tử trong công tác phân loại

Luận văn này trình bày kết quả phân tích chỉ thị ADN (chủ yếu dựa trên kỹ thuật RAPD-PCR) của 4 nhóm loài cây thuốc được thu thập ở nước ta, đó là: 1) chi

Acanthopanax (họ Araliaceae) gồm 2 loài là Ngũ gia bì gai (Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr.) và Ngũ gia bì hương (A gracilistylus W.W Smith); 2) chi Illicium gồm loài Hồi hương (Illicium verum Hook.f) và một số loài Hồi núi

(Illicium spp.); 3) một số dạng hình thái khác nhau về đặc điểm thân và quả của loài

Ba kích (Morinda officinalis How.); 4) chi Nhân sâm (Panax; họ Ngũ gia bì Araliaceae) gồm 3 loài là Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv), Sâm

Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus

H.T Tsai et K.M Feng)

cổ xưa nhất về cây dược liệu của người Ai Cập được tổng hợp trong 2 cuốn sách là

Ước tính có khoảng 25% các loại thuốc được sử dụng hiện nay trên thế giới có nguồn gốc từ thực vật và có khoảng 121 hợp chất có hoạt tính đang được sử dụng Trong tổng số 252 loại thuốc thiết yếu mà WHO đã liệt kê thì có tới 11% có nguồn gốc từ thực vật [68] Gần như 80% dân số Châu Phi và Châu Á phụ thuộc vào các loại thuốc cổ truyền để chăm sóc sức khỏe [56, 81, 92]

Khoảng 3 thập kỷ trước đây, theo Lipp (1996) chỉ có một lượng nhỏ các sản phẩm có nguồn gốc từ cây thảo mộc được kiểm nghiệm trên một số bệnh cụ thể [59] Tính đến nay, trên thế giới hiện vẫn còn nhiều người ưa dùng các sản phẩm có nguồn gốc từ thiên nhiên để điều trị một số loại bệnh tật (theo Nazma và cộng sự, 2010) Các sản phẩm được chế biến từ cây dược liệu thường được sử dụng ở các bệnh nhân mắc một số bệnh mạn tính, bao gồm ung thư vú (12%; Burstein, 1999), các bệnh về phổi (21%; Strader, 2002), virut gây suy giảm miễn dịch ở người (HIV) (22%; Kassler, 1991), bệnh hen suyễn (24%; Blanc, 2001) và rối loạn thấp khớp (26%; Rao, 1999)

Khoảng 960 loài thực vật đã được sử dụng bởi ngành công nghiệp thảo dược ở

Ấn Độ thì có tới 178 loài thực vật vượt qua sản lượng 100 tấn mỗi năm [41] Thị trường dược liệu tại Ấn Độ đang biểu lộ một sự tăng trưởng đặc biệt có thể đạt

4

doanh thu là 145.000 triệu rubi (tương đương khoảng 3,1 tỉ đôla Mỹ) vào năm 2010 Đồng thời việc xuất khẩu dược liệu của quốc gia này có thể đạt doanh thu là 90.000 triệu rubi (tương đương 2 tỉ đô la Mỹ) (theo thống kê của tổ chức ASSOCHAM,

2008 [59])

Ảnh hưởng của cây dược liệu tới sức khỏe con người

Thông thường mọi người thường tin rằng nguy cơ gây hại của các loại thảo dược là rất ít, tuy nhiên trong thực tế nhiều báo cáo đã chỉ ra rằng sản phẩm từ cây dược liệu có thể dẫn tới những hậu quả nghiêm trọng Việc dùng sai các loại dược liệu hay các sản phẩm dược liệu giả mạo đã đặt ra một vấn đề vô cùng quan trọng

về độ an toàn cũng như tính hiệu quả của các sản phẩm dược liệu Nhiều loại dược phẩm phổ biến thậm chí có giá thành đắt hiện nay thực chất là những sản phẩm thay thế kém chất lượng hoặc là các sản phẩm dược liệu thô đã được làm giả [19] Việc làm giả các sản phẩm từ dược liệu cũng như việc dùng sai chúng có thể dẫn tới nhiều bệnh như suy thận, tim mạch, … đã được ghi nhận tại nhiều nơi trên thế giới như Anh quốc [19, 59], Mỹ [59, 97], Ấn Độ [59], Việt Nam [2]…

Một vấn đề khác trong việc sử dụng các loài dược liệu đó chính là sự có mặt của kim loại nặng (thủy ngân, chì , arsen, …) có khả năng gây độc [19, 26, 54, 72] Việc nhiễm độc đã được ghi nhận ở tất cả các bước từ bước khởi đầu là thu thập dược liệu thô cho tới công đoạn sản xuất [19, 54] Ghi nhận đầu tiên về trường hợp nhiễm độc kim loại nặng vào năm 1978 tại Anh Sau đó đã có hơn 50 trường hợp nhiễm độc kim loại nặng từ nhiều vùng khác nhau trên thế giới bao gồm trong đó có lục địa Ấn Độ, Bắc Mỹ, Trung Đông, Tây Âu và Australia [26, 72] Sự lắng đọng cặn thuốc diệt cỏ trong các cây dược liệu cũng là một vấn đề gây ảnh hưởng nghiêm trọng trong quá trình phát triển và đẩy mạnh việc quốc tế hóa các sản phẩm dược liệu truyền thống Sự nhiễm độc từ các cây dược liệu thô cũng như các sản phẩm hay chế phẩm của nó (sự pha chế, sắc thuốc,…) được ghi nhận là ngày càng tăng Một nghiên cứu gần đây với 280 mẫu có nguồn gốc từ 30 loài dược liệu Trung Quốc về độ lắng đọng cặn thuốc trừ sâu cho thấy có tới 78,5% mẫu có chứa tối thiểu một loại thuốc trừ sâu organochlorine như PCNB, aldrin, BHC hay DDT [94],

5

đều là những chất có nguy cơ ảnh hưởng tới sức khỏe người sử dụng [92] Các loài cây dược liệu thường có thành phần các chất rất phức tạp chính là nguyên nhân dẫn tới khó khăn trong việc tìm ra phương pháp loại bỏ triệt để các chất lắng đọng bất lợi mà không làm mất di các thành phần có hoạt tính có trong các loài cây này [59] Bên cạnh đó, đã có những báo cáo tổng hợp lại vấn đề nhiễm nấm trong quá trình thu hái, bảo quản, sản xuất và phân phối các sản phẩm dược liệu trên thế giới [59] Việc thu hái trên quy mô rộng và không có tính kiểm soát các loài thực vật là nguyên nhân dẫn tới việc làm suy kiệt nguồn tài nguyên di truyền, bao gồm trong

đó là các loài cây dược liệu [59] Ví dụ như, loài anh đào Châu Phi (Pygeum hay

tuyến, đang phải đứng trước nguy cơ cạn kiệt nguồn tài nguyên, dẫn tới hệ sinh thái

bị ảnh hưởng nghiêm trọng do việc khai thác quá mức loài cây này ở châu Phi Chính vì lẽ đó, kể từ năm 1995, trong Công ước Thương mại về động vật và thực vật hoang dã - CITES (Convention of International Trade in Endangered Species), loài thực vật này đã được thêm vào phần phụ lục dành cho các loài cần được bảo vệ [59, 79] Theo sau đó Tổ chức IUCN cũng đưa loài dược liệu này vào trong danh

sách các loài có nguy cơ tiệt chủng (Sách Đỏ) Loài đàn hương (Santalum spp.)

phân bố ở Nam Á, Indonesia, Australia và Nam Thái Bình Dương dùng để sản xuất các sản phẩm gỗ và dầu thơm, cũng gặp trường hợp tương tự

Từ những nghiên cứu trên, chúng ta nhận thấy việc phát triển một hệ thống đánh giá hiệu quả các loài cây dược liệu và các thành phần của nó là một việc làm thiết yếu Những phương pháp đảm bảo chất lượng cũng như độ an toàn của các sản phẩm này đã và đang được phát triển trên toàn thế giới, thông qua đó đẩy mạnh việc tiêu chuẩn hóa sản phẩm đầu ra, góp phần toàn cầu hóa các sản phẩm có nguồn gốc

từ dược liệu Bên cạnh đó việc tiêu chuẩn hóa nguồn dược liệu đang được phát triển rộng khắp trên phạm vi toàn thế giới Đây là một việc làm có tính khả thi, nhưng lại rất khó để thực hiện Vì rằng, quá trình kiểm định các loại dược liệu không được thực hiện một cách đồng bộ trên toàn bộ các quốc gia Do đó, hiện nay trên thế giới

6

có rất nhiều phương pháp được áp dụng để kiểm định nguồn dược liệu và các sản phẩm của chúng [59]

Tiêu chuẩn hóa dược liệu

Tính phức tạp của quá trình tiêu chuẩn hóa dược liệu

Cây dược liệu có rất nhiều đặc tính riêng, chính điều này làm cho các sản phẩm từ cây dược liệu khác với các loại thuốc tổng hợp [59] Chúng thường chứa đồng thời nhiều hợp Ví dụ như dược phẩm Huang-qin (Scutellaria baicalensis) có tới hơn 2000 hợp chất [73] Những đặc điểm về mặt hóa học của các loài cây dược liệu bị ảnh hưởng bởi các điều kiện về thu hái, qui trình sản xuất và phân bố Những đặc điểm về mặt sinh lý, di truyền cũng như những biến đổi về môi trường (quang chu kỳ, khí hậu, điều kiện đất, dinh dưỡng) đều có thể gây ảnh huởng tới các đặc điểm hóa sinh và khả năng tích lũy các hợp chất thứ cấp ở thực vật Thành phần các hợp chất thức cấp trong dược liệu còn phụ thuộc vào thời gian thu hái, các phương pháp bảo quản, sấy khô, tách chiết để thu được sản phẩm đóng gói cuối cùng [59] Tính ổn định ở tất cả các giai đoạn của quy trình sản xuất có ý nghĩa quan trọng để đảm bảo hiệu quả chữa bệnh và độ an toàn cho người sử dụng

Có rất nhiều loại chỉ thị như chỉ thị hình thái, hóa học, chỉ thị liên quan tới hệ gen (ADN), chỉ thị liên quan tới các protein (izozym), đều là những công cụ có thể dùng để xác định các thành phần có trong cây dược liệu [59, 76]

Dược điển Trung Quốc (ấn bản năm 2005) thống kê có tất cả 282 chỉ thị hóa học được sử dụng cho các loài cây thuốc [59] Đây là một công cụ hữu ích dùng để xác định sự làm giả cũng như sự khác biệt của các sản phẩm dược liệu có nguồn gốc khác nhau, kiểm tra tính ổn định của các sản phẩm có tính chất độc quyền [59] Các thành phần có độc tính có thể sử dụng như là các chỉ thị hóa học trong các phương pháp sàng lọc [49] Tính cho tới thời điểm hiện tại, vẫn còn có rất nhiều loài dược liệu không có chỉ thị hóa học phù hợp để kiểm định chất lượng Theo cuốn Dược điển Trung Quốc, chỉ có 282 trong tổng số 551 loài dược liệu có 1 hoặc 2 chỉ thị hóa học để kiểm định chất lượng Thiếu những chỉ thị hóa học, mức độ tinh sạch

dụng thành công trong việc đánh giá sự khác biệt giữa các loài Taxus wallichiana Neem, Juniperus communis L., Codonopsis pilosula, Allium schoenoprasum L., A

Eastern blotting sử dụng 2 kháng thể đơn dòng ginsenoside Rb1 và Rgl đã được áp

dụng thành công trong viêc xác định 3 loài sâm là: Panax notoginseng, P

biệt các loài Panax spp với nhau Sau đó bằng kỹ thuật Eastern Blot xác định sự có

hay không có mặt chất ginsenoide Rc trong các sản phẩm tách chiết để định loại tên

loài P notoginseng trong phân tích Eastern blotting [76]

Mức độ an toàn và hiệu quả sử dụng của các loài dược liệu được hình thành thông qua quá trình sử dụng lâu dài của chúng Mặc dù đã có những phép thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên trên một số loài dược liệu, nhưng để có thể kiểm định một cách triệt để thì cần phải có những nghiên cứu lâm sàng đầy đủ cùng với các nghiên cứu về mặt độc tính học trên các loài dược liệu này [59]

1.2 TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Những tiến bộ gần đây trong lĩnh vực sinh học phân tử đã cung cấp những công cụ mới áp dụng vào việc làm sáng tỏ những nghi vấn còn tồn tại trong các nghiên cứu về tiến hóa, hình thái học và phân loại học Những chỉ thị ADN có nhiều

ưu điểm so với các chỉ thị hình thái vì chúng gắn liền với vật chất di truyền, tương đối dễ phân tích trong phòng thí nghiệm và ít bị ảnh hưởng bởi các yếu tố môi trường [24]

8

Trong hai thập kỉ gần đây, một số kỹ thuật chỉ thị phân tử đã được phát triển

để phân tích về các hệ gen, phần lớn là để xác định những khác biệt giữa các cá thể trong cùng một loài (đa hình di truyền) hoặc để tìm mối tương quan giữa đa hình di truyền với các tính trạng nhất định Tuy nhiên, vì giá thành tương đối cao tăng lên cùng với sự phát triển của các chỉ thị phân tử, cho nên những phương pháp này mới chỉ được áp dụng trên một số lượng hữu hạn các loài, và đa số là mới chỉ được tiến hành ở các nước phát triển Việc ứng dụng các chỉ thị phân tử còn có xu hướng khu trú vào một lượng nhỏ các tính trạng hoặc một số vùng của hệ gen Việc kết hợp các phương pháp và sự phát triển của việc lập bản đồ đã đưa ra triển vọng áp dụng các chỉ thị phân tử trên quy mô rộng, với số lượng lớn, qua đó làm giảm chi phí đầu tư [24]

Theo Maheswaran (2004) tổng kết, sự phát triển của các chỉ thị ADN có thể chia làm 3 thế hệ: (i) thế hệ chỉ thị ADN đầu tiên bắt đầu từ năm 1975 tới năm 1989; (ii) thế hệ chỉ thị ADN thứ hai bắt đầu từ năm 1990 đến năm 1993; (iii) thế hệ chỉ thị ADN hiện nay bắt đầu từ năm 1994 cho tới nay Việc ra đời của kỹ thuật đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP; Grodzicker và cs, 1974) đã đánh dấu khởi điểm của thế hệ chỉ thị ADN đầu tiên Ban đầu, chỉ thị RFLP được thu từ các loài virut [31], sau đó đã được kiểm chứng khi phân tích nhóm gen globin ở người [36] Tiếp theo chỉ thị RFLP, một loạt các chỉ thị ADN được phát triển như: VNTR- Variable Number Tandem Repeats (Các mảnh lặp lại có thứ tự với một tần số khác nhau; Jeffreys, 1985); ASO-Allele Specific Oligonucleotides (xác định một trong hai dạng sơi đơn của một phân tử ADN sợi kép bằng các oligonucleotide; Saiki và

cs, 1985); … Bảng 1 liệt kê một số chỉ thị ADN được phát triển trong thế hệ chỉ thị ADN đầu tiên

Cuộc cách mạng trong lĩnh vực nghiên cứu về di truyền học phân tử trên các

vi vệ tinh – dãy trình tự ADN lặp lại của 2-, 3-, 4- và 5 nucleotide xuất hiện rải rác suốt hệ gen của các sinh vật nhân chuẩn đã đánh dấu sự ra đời của thế hệ chỉ thị ADN thứ hai Các trình tự lặp lại đơn giản (SSR) này gần đây đã được xác định là những chỉ thị phân tử được dùng trong việc lập bản đồ hệ gen của một quần xã và

9

được ưa dùng trong các nghiên cứu trên đối tượng thực vật Một số chỉ thị khác được phát triển trong giai đoạn này được liệt kê tại Bảng 2

Bảng 1 Thế hệ chỉ thị ADN đầu tiên

Năm Ký hiệu Tên đầy đủ (tiếng Anh) Tài liệu tham khảo

Bảng 2 Thế hệ chỉ thị ADN thứ hai

Năm Ký hiệu Tên đầy đủ (tiếng Anh) Tài liệu tham khảo

(1993)

Với sự phát triển gần đây của sinh học phân tử mở ra triển vọng áp dụng nhiều loại kỹ thuật phân tử để xác định cũng như dùng để cải tiến hệ gen của nhiều loài sinh vật khác nhau Thông tin liên quan tới nền tảng của những kỹ thuật này cũng như ứng dụng của chúng đều có nguồn gốc từ việc áp dụng công nghệ lên những dự

án hệ gen Khoảng 10 năm gần đây khoa học đã chứng kiến sự hình thành của một dãy các chỉ thị phân tử với khả năng thực hiện cao được kết hợp với sự thay đổi từ phương thức thủ công cho tới sự tự động hóa một cách hoàn chỉnh Theo đó thế hệ chỉ thị này sẽ có khả năng tiềm tàng vô cùng to lớn trong sự tìm hiểu những biến dị

ở mức độ ADN Trong thế hệ chỉ thị ADN mới này có thể kể đến các chỉ thị như

10

ISSR, là chỉ thị được phát triển trên nền tảng thế hệ chỉ thị SSR; hay SNP (đa hình các đơn nucleotide)… là các chỉ thị có hiệu quả cao trong việc phân tích đa hình di truyền

Bảng 3 Thế hệ chỉ thị ADN mới

Năm Ký hiệu Tên đầy đủ (tiếng Anh) Tài liệu tham khảo

Đặc điểm của các chỉ thị phân tử nói chung và chỉ thị ADN nói riêng

Mức độ đa hình

Kỹ thuật sử dụng chính xác chỉ thị di truyền có mức độ đa hình cao nên được

áp dụng trong việc lập bản đồ hệ gen Mức độ đa hình trong số các chỉ thị di truyền phụ thuộc vào loại chỉ thị và phương pháp được sử dụng để xác định ra nó

đồ hệ gen trong khi đó các chỉ thị liên quan tới đa locus được áp dụng cho các nghiên cứu xây dựng tàng thư ADN hoặc phân tích đa dạng di truyền chung

Bản chất của các alen

11

Bản chất của các chỉ thị liên quan tới 2 alen được xác định là đồng trội khi mà

cả hai alen này đều được quan sát thấy ở con lai Nếu chỉ có một trong hai alen được quan sát thấy thì chỉ thị tương ứng với alen đó được xác định là trội Các chỉ thị đồng trội sẽ mang nhiều tính thông tin hơn so với các chỉ thị trội bởi vì các chỉ thị đồng trội có thể phân biệt được các kiểu gen dị hợp tử với các kiểu gen đồng hợp

tử Chính điều này cho phép sự xác định các kiểu gen và tần số alen ở các locus một cách chuẩn xác Do đó, những chỉ thị đồng trội được ưa dùng hơn so với các chỉ thị trội trong nghiên cứu lập bản đồ gen và phân tích đa dạng di truyền

Ngoài những đặc điểm trên, khi nghiên cứu về các chỉ thị ADN, các nhà nghiên cứu còn chú ý tới các đặc điểm về mặt kỹ thuật (các phương pháp kèm theo); yêu cầu về mặt chất lượng của ADN; khả năng tự động hóa; các chi phí hoạt động (tiền lương, các thiết bị phòng thí nghiệm, máy móc, hóa chất, …); chí phí phát triển

Những đặc điểm cần có của một chỉ thị ADN lý tưởng

Một chỉ thị ADN lý tưởng là một chỉ thị hội tụ những đặc điểm cần có như sau:

- Có thể tạo ra được một cách dễ dàng

- Phân tích đơn giản và nhanh

- Có tính đa dạng và tính lặp lại cao

- Di truyền đồng trội và có sự tái xuất hiện ở trên toàn hệ gen

- Chọn lọc một cách trung tính với những điều kiện của môi trường hoặc điều kiện thực hiện

- Số liệu có thể được thay đổi giữa các phòng thí nghiệm khác nhau

Việc chọn ra được một chỉ thị phân tử mang đầy đủ tất cả các tiêu chuẩn trên

là một điều hết sức khó khăn Như vậy, mục tiêu đặt ra là cần phải phát triển được một loại chỉ thị phân tử hội đủ các đặc điểm kể trên Nhiều chỉ thị phân tử đã được

sử dụng để đánh giá đa hình ADN Chúng đã được phân loại thành các chỉ thị dựa vào các phép lai và các chỉ thị dựa trên phản ứng PCR Những đặc điểm của các chỉ thị dựa vào phép lai được thực hiện bởi phép lai giữa phân đoạn ADN đã được cắt

12

bởi enzym giới hạn endonuclease, với một đầu dò được đánh dấu Trong kỹ thuật

PCR, các phân đoạn ADN được nhân bản trong điều kiện in vitro với sự trợ giúp

của các trình tự oligonucleotit đặc hiệu hoặc tương đồng (còn được gọi là mồi) và các enzym ADN polymerase chịu nhiệt Các phân đoạn ADN được nhân bản này được phân chia nhờ điện di và các băng được xác định bởi nhiều phương pháp như nhuộm băng (sử dụng thuốc nhuộm ethidium bromide) và phương pháp phóng xạ tự ghi

Cùng với những tiến bộ của enzym ADN polymerase chịu nhiệt, việc sử dụng PCR trong các nghiên cứu và các phòng thí nghiệm lâm sàng đang tăng lên một cách nhanh chóng PCR có độ nhạy cao và vận hành ở một tốc độ rất nhanh Những ứng dụng của nó trên các mục đích phân tích sự đa dạng đã mở ra vô số những khả năng mới trong lĩnh vực sinh học phân tử

1.3 LÝ DO THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

1.3.1 Thực trạng nghiên cứu về cây dược liệu ở Việt Nam hiện nay

Theo thống kê của tổ chức IUCN, hiện Việt Nam có hơn 10.000 loài thực vật

có vai trò cung cấp nguồn thức ăn, thuốc Theo điều tra của Viện Dược liệu, nước

ta có gần 4000 loài cây thuốc Với thế mạnh về tài nguyên dược liệu dồi dào như vậy, chúng ta có thể hy vọng phát hiện và phát triển được thuốc mới từ nguồn tài nguyên tự nhiên phong phú này Tuy vậy, hiện nay công tác bảo tồn, gìn giữ, chọn tạo giống và phát triển nguồn gen cây thuốc vẫn chưa phát huy hết tiềm năng Nhiều loài cây thuốc quý hiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng do bị khai thác ồ ạt và thiếu

kế hoạch Theo số liệu của các cơ quan chức năng thì có tới 50% nguyên liệu dược liệu của nước ta là nhập về từ nước ngoài Trong hoàn cảnh đó, một chiến lược khai thác, bảo tồn cũng như gây giống hợp lý nguồn tài nguyên dược liệu nói chung và tài nguyên cây thuốc nói riêng là vấn đề mang tính cấp thiết và có ý nghĩa thực tiễn

1.3.1.1 Nghiên cứu về chi Acanthopanax

Trên thế giới, chi Acanthopanax có khoảng 35 loài, hầu hết phân bố ở vùng

Đông Á, ít loài có ở Đông Nam, phía Nam và Đông Bắc châu Á Trong đó, Trung

13

Quốc có tới 26 loài, Hàn Quốc có 17 loài, Nhật Bản có 9 loài Theo Đỗ Huy Bích, ở

Việt Nam chỉ có 3 loài thuộc chi Acanthopanax đó là Acanthopanax trifoliatus (L.) Merr., A gracilistylus W.W Smith và A senticosus Harms [1, 2, 45, 50]

Ngũ gia bì hương, Ngũ gia bì gai nói riêng và các loài thuộc chi Acanthopanax

nói chung và thường được xem có công dụng gần giống nhau trong y học cổ truyền

Ở nước ta, chúng là thành phần được bổ sung trong các vị thuốc bổ gan, bổ thận, làm mạnh gân cốt, chữa thấp khớp, lưng gối mỏi đau, trẻ em chậm biết đi, phù thũng, kích thích tình dục, [2, 58, 64]

Các nghiên cứu về hóa học và dược lý học

Người ta bắt đầu chú ý nghiên cứu về các loài thuộc chi Acanthopanax từ

khoảng năm 1965, với việc tìm ra các glycosit eleuthrosid A, B, C, D và E từ vỏ rễ

của A senticosus Từ đó đến nay, đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về các hợp chất tự nhiên của chi Acanthopanax bao gồm: triterpenoid, triterpen glycosid,

diterpenoid, diterpen glycosid, lignan, phytosteroid, flavonoid, phenolic, curmrin và các axit béo [1, 2, 43] Những nghiên cứu về tác dụng dược lý của dịch chiết Ngũ gia bì hương có tác dụng long đờm, chữa ho (Du Jianh và cs, 1992); ngăn cản và giải phóng các yếu tố đông máu và làm tắc mạch máu (Chen và cs, 1996); điều hòa miễn dịch, điều trị các bệnh tự miễn hay dị ứng [22, 65, 74]

Hiện nay, loài Ngũ gia bì hương ở Việt Nam chỉ còn lại một vài tập hợp cá thể

ở tỉnh Hà Giang và Lào Cai, trong đó một số cá thể Ngũ gia bì hương ở Lào Cai có nguồn gốc được đưa từ Hà Giang về trồng Số lượng và khu phân bố của Ngũ gia bì gai gần đây bị thu hẹp nhiều so với trước đây Theo điều tra vào các năm 1973-1987

ở Lạng Sơn, Cao Bằng và Lai Châu, nguồn Ngũ gia bì gai ở Việt Nam tương đối phong phú và xác định được trữ lượng đến vài trăm tấn dược liệu Đáng tiếc, hiện nay cả Ngũ gia bì hương và Ngũ gia bì gai chỉ còn một số lượng ít ỏi mọc tự nhiên

và còn lại là được trồng ở một số hàng rào xung quanh nhà người dân [2]

Trên thị trường hiện nay có bày bán một số dạng dược liệu khô gọi chung là

“Ngũ gia bì” nhưng không phân biệt đây là dược liệu của loài cây thuốc nào Như

đã trình bày ở phần trên, thuật ngữ “Ngũ gia bì” được nhiều người sử dụng để gọi

1.3.1.2 Nghiên cứu về chi Illicium ở Việt Nam

Cây Hồi hương (Illicium verum Hook.f) được biết đến từ lâu trong nền y học

cổ truyền của nhiều quốc gia trên thế giới như một loại thảo dược có vị cay, mùi thơm, tính ấm Tại Việt Nam Hồi hương được biết đến trong các bài thuốc gây kích thích trung tiện, tăng cường tiêu hóa, lợi sữa, lợi tiểu, chữa ngộ độc thịt cá, rắn cắn,

… Hiện nay, Hồi hương còn được biết tới là nguồn nguyên liệu ưa thích để bào chế axit shikimic, là tiền chất của thuốc Tamiflu® - loại thuốc được đánh giá là có hiệu quả nhất trong việc điều trị bệnh cúm gia cầm H5N1 Hồi hương lại có vùng phân

bố tương đối hẹp, hiện nay Hồi hương chỉ phân bố ở các tỉnh phía bắc Việt Nam (Cao Bằng, Bắc Kạn, Lạng Sơn và Quảng Ninh) và một số tỉnh miền nam Trung Quốc Trước nhu cầu sử dụng thuốc Tamiflu ngày một tăng trên toàn thế giới (WHO, 2005), nếu không có chiến lược khai thác hợp lý thì rất có khả năng dẫn đến suy kiệt nguồn tài nguyên dược liệu này

Các nghiên cứu về hóa học và dược lý học

Quả của cây Hồi hương có chứa cathechin, protocatechin, tinh dầu và một số hợp chất vô cơ khác [2, 83] Xuất phát từ những ứng dụng của Hồi hương trong nền

y học cổ truyền hiện nay, những nghiên cứu về thành phần hóa học của Hồi hương chủ yếu tập trung vào tinh dầu hồi [2, 27, 88, 96] Các nghiên cứu về dược lý của

tinh dầu hồi đã được thử nghiệm trên các chủng vi khuẩn Candida albicans,

Tinh dầu hồi đã được chứng minh có khả năng: ức chế quá trình hình thành ấu trúng cũng như quá trình nở trứng của nhiều loài sâu bọ gây ảnh hưởng đến mùa màng (Muskesh Kumar Chaubey, 2008); đối vận với histamine và acetylcholine, làm

15

giảm độ co thắt cơ trơn ruột [2]; ngăn ngừa ức chế và hình thành các chất sinh ung thư gan (Amit Singh Yadar, 2007)

Bên cạnh loài Hồi hương (Illicium verum Hook.f) vốn có giá trị y - dược học

thì tại Việt Nam còn tồn tại một số loài khác thuộc họ hồi (Illiciaceae) thường được

gọi chung là hồi núi, như I griffithii, I majus, … (Phan Kế Lộc, 2003) vốn ít có giá

trị y dược học hơn, thậm chí một số loài được xác định là có độc tố Theo mô tả của

Đỗ Huy Bích và cộng sự (2003), sự tương đồng về mặt hình thái của cây Hồi hương với các loài hồi núi là khá cao, chính là nguyên nhân chính gây khó khăn trong việc thu hái đúng dược liệu từ cây Hồi hương, thậm chí có thể dẫn đến việc dùng sai dược liệu do thu hái nhầm

1.3.1.3 Nghiên cứu về chi Morinda

Ba kích (Morinda officinalis How) là loài cây nhiệt đới đặc hữu của Việt Nam

Theo điều tra của Viện Dược Liệu (Bộ Y tế), cây Ba kích chỉ thấy phân bố ở một số tỉnh trung du và miền núi thấp phía bắc, bao gồm Quảng Ninh, Lạng Sơn, Bắc Giang, Thái Nguyên, Phú Thọ, Hòa Bình và Hà Tây Một vài địa phương khác cũng phát hiện thấy nhưng không đáng kể Ba kích thường được sử dụng phổ biến làm thuốc bổ thần kinh, bổ gân cốt, chữa thấp khớp, giảm xơ cứng động mạch Ba kích

có tác dụng tăng cường khả năng sinh lý đối với nam giới có hoạt động sinh dục yếu [2] Ba kích còn được sử dụng để cải thiện sức khỏe, giúp ăn ngủ tốt hơn và giảm đau mỏi khớp ở người cao tuổi

Các nghiên cứu về mặt hóa học và dược lý học

Hợp chất được nghiên cứu nhiều nhất ở rễ cây Ba kích chính là nhóm hợp chất anthraglucosid [2] Bằng phương pháp nghiên cứu phổ huỳnh quang và UV, nhóm nghiên cứu Yao H và cs (2004) đã chứng minh hàm lượng của các anthraquinon có mối liên quan với cấu trúc rễ của Ba kích: có mạch phloem phát triển và xylem nhỏ Theo tài liệu y học Trung Quốc, Ba kích có tác dụng chống lại các tác động bất lợi của hydrocortisone đối với sự teo tuyến giáp, teo vỏ tuyến thượng thận [2] Thêm vào đó, Ba kích có thể được sử dụng chữa bệnh đau lưng, giảm vết thâm, đau mắt

và thậm chí cả đau răng, tác dụng tăng lực (theo nghiên cứu của Cui C và cs

16

(1995), giảm đau chống viêm (nghiên cứu của Choi J và cs, 2005), kháng viêm (các nghiên cứu của Kim I.T và cs, (2005) và Soon Y.Y và Tan B.K (2002)), tác dụng chống stress (nghiên cứu của Li Y.H và cs, 2001)

Ở nước ta, theo ghi nhận của Viện Dược Liệu, do sự khai thác quá mức trong một thời gian dài từ trước năm 1975 cùng với việc rừng bị tàn phá nhiều làm cho số lượng của cây Ba kích trong tự nhiên bị suy giảm nghiêm trọng và ngày càng khan hiếm Hiện nay, cây Ba kích đã được đưa vào trồng xen trong một số mô hình trang trại nhỏ ở trung du và miền núi thấp phía Bắc như tại Phú Thọ, Thái Nguyên, Hòa Bình, Tam Đảo

1.3.1.4 Nghiên cứu một số loài cây thuộc chi Panax

Các loài cây thuốc thuộc chi Panax vốn là những dược liệu quý được sử dụng

từ lâu đời Ở Việt Nam, theo Nguyễn Tập (2005) hiện có năm loài cây thuốc thuộc

chi Panax , ba trong số đó là những loài bản địa mọc tự nhiên, gồm Sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) và Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T Tsai et K.M Feng) Đặc biệt, Sâm Việt

Nam còn là loài đặc hữu hẹp của nước ta, hiện chỉ phân bố ở vùng núi Ngọc Linh thuộc địa phận hai tỉnh Quảng Nam và Kon tum (vì vậy loài này còn có tên gọi là Sâm Ngọc Linh) (Đỗ Huy Bích, 2003) Trên thế giới, Sâm Vũ Diệp được tìm thấy

ở Trung Quốc, bắc Mianma, đông-bắc Ấn Độ và Nêpal Ở nước ta, Sâm Vũ Diệp phân bố hẹp ở vùng núi Hoàng Liên Sơn (thuộc địa phận Sapa, Bát Xát, Lào Cai)

và huyện Than Uyên (Lai Châu) Sapa chính là điểm cực nam của bản đồ phân

bố Sâm Vũ Diệp trên thế giới (khoảng 23˚ vĩ Bắc) (Đỗ Huy Bích, 2003)

Khả năng bồi bổ sức khoẻ và chữa bệnh độc đáo của các loài dược liệu này đã khiến trong một thời gian dài chúng bị khai thác mạnh mẽ và thiếu quy hoạch Hiện nay, cả số lượng và vùng phân bố của ba loài dược liệu trên ở Việt Nam đã suy giảm nghiêm trọng, Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang thậm chí còn đứng trước nguy

cơ tuyệt chủng Hiện trạng này đặt ra cho chúng ta một yêu cầu cần nhanh chóng có các chiến lược bảo tồn, chọn tạo giống, phát triển nguồn tài nguyên dược liệu quý giá nêu trên

17

Các nghiên cứu về mặt hóa học và dược lý học

Dược liệu từ Sâm Việt Nam, Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang đều là thân rễ

và rễ củ Hợp chất sinh học được quan tâm nhất của các loài sâm là các saponin triterpen (gọi chung là ginsenoside) Các nghiên cứu dược học đã chỉ ra rằng hoạt tính sinh học khác nhau của các saponin là do cấu trúc sapogenin và thành phần đường quyết định [4, 86, 87] Các nghiên cứu về dược lý học chỉ ra rằng Sâm Việt Nam có tác dụng: ngăn chặn ung thư gây bởi các tác nhân hoá học (Takao

Konoshima và cộng sự, 1999); tác dụng bảo vệ gan in vitro ở chuột; tác dụng giảm

thời gian ngủ do thuốc pentobarbital và giảm tổn thương dạ dày ở chuột nhắt chịu stress tâm lý (Nguyen T.T., 1996), cũng như có khả năng chống stress (Huong N.T.T., 2005)… So với Sâm Việt Nam, các nghiên cứu về tác dụng dược lý của Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang còn tương đối ít và mới mẻ [2]

Một vấn đề gặp phải đối với hai loài cây thuốc Tam thất hoang và Sâm Vũ Diệp là trong tự nhiên, ngoài hai dạng hình thái điển hình (lá xẻ sâu của Sâm Vũ Diệp và lá không xẻ của Tam thất hoang) còn tồn tại một số dạng hình thái trung gian giữa hai dạng điển hình là lá xẻ nông Hiện tượng này dẫn đến sự nhầm lẫn

và khó phân biệt hai loài dược liệu trên trong quá trình thu hái, chế biến và sử dụng Về mặt hình thái, việc xếp dạng trung gian này vào nhóm Sâm Vũ Diệp hay Tam thất hoang vẫn chưa được thống nhất, tồn tại hai nhóm ý kiến trái ngược là nên xếp những cá thể này vào loài Sâm Vũ Diệp hay Tam thất hoang Hiện tượng này gây khó khăn cho công tác kiểm định nguồn nguyên liệu làm thuốc ban đầu (vốn chủ yếu dựa vào các chỉ thị cảm quan), dẫn đến chất lượng sản phẩm kém ổn định

Những dẫn liệu trên đây cho thấy rằng việc khai thác, sử dụng và phát triển nguồn tài nguyên cây thuốc ở nước ta hiện nay tồn tại nhiều hạn chế và khó khăn Phần lớn các loài cây thuốc hiện nay được thu hái chủ yếu từ các nguồn tự nhiên, thường không rõ về bản chất di truyền, thành phần hóa học cũng như các hoạt tính sinh học Phương pháp thu hái trên cho thấy một số nhược điểm như: (i) việc thu hái không có quy hoạch các loài cây thuốc từ tự nhiên dễ gây suy kiệt nguồn tài nguyên

18

di truyền, do đó nhiều loài cây thuốc quý hiếm càng có nhiều nguy cơ bị tuyệt chủng; (ii) việc thu hái này không đáp ứng được yêu cầu của công nghiệp sản xuất dược phẩm do: nguồn nguyên liệu đầu vào không ổn định về mặt hóa học, hoạt chất sinh học mong muốn, có thể nhầm lẫn với các loài cây có hình thái tương tự nhưng lại không có hoạt tính mong muốn, thậm chí là có độc tính; (iii) các dạng nguyên liệu tự nhiên có nguy cơ nhiễm độc cao (nhiễm chất diệt cỏ, thuốc trừ sâu, kim loại nặng, vi sinh vật )

Vì vậy, công tác tiêu chuẩn hóa và kiểm định dược liệu là một việc làm cấp thiết Để đảm bảo cho công tác bảo tồn và phát triển đa dạng di truyền các loài dược liệu quý hiện nay ở Việt Nam, cần có sự đánh Cho đến nay, nước ta vẫn chưa có sự quan tâm đúng mức đối với công tác phát triển các vùng nguyên liệu cây thuốc Thêm vào đó, công tác chọn tạo giống cây dược liệu và tiêu chuẩn hóa nguồn dược liệu ban đầu cũng hạn chế, do đó chưa đáp ứng được nhu cầu của thị trường trong nước Nhiều công ty dược phẩm của Việt Nam hiện nay chủ yếu đều sử dụng nguồn nguyên liệu nhập khẩu để phục vụ cho quá trình sản xuất của mình (phần lớn được nhập về từ thị trường Trung Quốc do họ có thể đáp ứng nhanh chóng nguyên liệu cho sản xuất với giá cả hợp lý, đạt chất lượng tốt và phong phú về chủng loại)

Riêng đối với các loài cây thuốc, một trong những yêu cầu hàng đầu hiện nay của nền công nghiệp dược phẩm dựa trên dược liệu tự nhiên là yêu cầu tiêu chuẩn hóa nguồn nguyên liệu ban đầu Trong đó, việc xác định thành phần các hợp chất có hoạt tính sinh học, hoạt lực sinh học và độc tính, cũng như công tác chọn tạo giống các loài cây thuốc có vai trò hết sức quan trọng Trong quá trình

đó, việc phân tích các chỉ thị ADN cho phép đánh giá một cách chính xác mức

độ đa dạng di truyền của một loài cây thuốc nào đó nhằm định hướng bảo tồn, chọn, tạo và nhân giống phù hợp, đáp ứng yêu cầu của quá trình phát triển một nền công nghiệp chế biến dược liệu bền vững (Kalpana et al., 2004) Ngoài ra, gần đây một số nghiên cứu còn cho thấy chỉ thị ADN ở các loài cây thuốc còn có thể sử dụng như một công cụ hiệu quả giúp phân loại các dạng dược liệu có đặc

19

điểm hình thái giống nhau, hoặc giúp phát hiện các dạng dược liệu sai nguồn gốc

và dược liệu giả

1.3.2 Chỉ thị ADN – Chỉ thị RAPD-PCR

Các phương pháp kiểm định dược liệu đang sử dụng hiện nay có nhiều hạn chế Các chỉ thị cảm quan về hình thái, mầu sắc, mùi, vị đã được sử dụng từ lâu theo kinh nghiệm dân gian để kiểm định dược liệu, song phương pháp này lại phụ thuộc nhiều vào tính chủ quan của từng người nên dễ gây nhầm lẫn Vì thế mà trên thị trường, nhiều loại dược liệu quý hiếm hoặc có giá trị kinh tế cao có thể bị làm giả hoặc được thay bằng các dược liệu có hình thái tương tự Việc phân tích dược liệu bằng các phương pháp hóa phân tích (như kỹ thuật sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng cao áp, sắc ký cột, phương pháp khối phổ ) lại phụ thuộc nhiều vào các điều kiện ngoại cảnh (thời điểm thu hái, điều kiện canh tác ), có chi phí cao và đòi hỏi điều kiện phân tích nghiêm ngặt nên chỉ phù hợp trong các phòng thí nghiệm Với

sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghệ sinh học, đặc biệt là lĩnh vực sinh học phân tử, trên thế giới cũng như ở Việt Nam, các chỉ thị phân tử - trong đó có các chỉ thị ADN - ngày càng được áp dụng rộng rãi trong các nghiên cứu phân loại, phân tích đa dạng sinh học, xác định đặc trưng cá thể và khoảng cách di truyền giữa các cá thể hoặc quần thể thực vật nhằm mục đích định hướng bảo tồn và chọn tạo giống cây trồng

Chỉ thị phân tử ADN là những chỉ thị dựa trên bản chất đa hình ADN, được

sử dụng để xác định mối quan hệ giữa các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các loài, phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hoá giữa các loài (Ahn và cs, 1995; Zhang và cs, 1995)

Trong đó chỉ thị RAPD-PCR đã được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu về

tính đa dạng di truyền nhiều loài khác nhau trên thế giới như: Yu-ping-feng san (Cheng và cs, 1998), Taxusbrevifolia (Gocmen và cs, 1996), Scutellaria (Hosokawa và cs, 2000), Pelargonium graveolens (Shasany và cs, 2002)

RAPD là một kỹ thuật dựa trên phản ứng PCR Phương pháp này dựa trên sự nhân bản những phân đoạn ADN đích hoặc ngẫu nhiên với các mồi ngẫu nhiên

20

Vào năm 1991, Welsh và McClellan đã phát triển nên một phép phân tích di truyền dựa trên phản ứng PCR đặt tên là đa hình các đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên (RAPD) Quy trình này sẽ tìm ra sự đa hình trình tự nucleotide trong phân tử ADN bằng việc sử dụng một mồi đơn có trình tự nucleotide ngẫu nhiên Trong phản ứng này, một mồi đơn sẽ gắn với ADN hệ gen ở hai vị trí khác nhau nằm trên các chuỗi bổ sung của ADN mẫu Nếu như những vị trí bắt cặp với nhau nằm trong khoảng có thể nhân bản với từng vị trí, thì sẽ có một đoạn ADN riêng biệt được tạo thành thông qua sự nhân bản của chu trình nhiệt Trung bình, mỗi một mồi sẽ xác định sự nhân bản ở một vài vị trí khác nhau trong hệ gen, qua đó làm cho các phân tích trở nên có ích trong việc sàng lọc hiệu quả sự đa hình trong trình tự nucleotide giữa các cá thể với nhau (William và cs 1993) Tuy nhiên, dựa vào tính chất ngẫu nhiên trong sự nhân bản ADN với các mồi có trình tự ngẫu nhiên, cho nên điều quan trọng là cần phải tối ưu hóa và duy trì các điều kiện phản ứng một cách nhất quán để đảm bảo sự nhân bản ADN Những trình tự oligonucleotide này đóng vai trò vừa là mồi xuôi vừa là mồi ngược, đồng thời chúng thường có khả năng nhân bản các phân mảnh từ 1 - 10 vị trí của hệ gen một cách đồng thời Các sản phẩm được nhân bản (thường có kích thước nằm trong khoảng từ 0,5 - 5 kb) phân tách được trên gel agarose với sự có mặt của ethidium bromide và quan sát được dưới ánh sáng cực tím (Jones và cs, 1997) và sự có hay không có mặt của băng sẽ có thể quan sát thấy Những băng đa hình này được xác định đầu tiên thông qua những khác biệt ở các vị trí gắn mồi, tuy nhiêu chúng cũng có thể được hình thành từ sự khác biệt về chiều dài trong các trình tự được nhân bản giữa các vị trí gắn mồi Mỗi một sản phẩm thu được từ một vùng của hệ gen đều chứa hai phân đoạn ngắn có trình tự có hướng ngược nhau, nằm trên các chuỗi đối diện bổ sung với mồi Keseli và cs (1994) đã so sánh mức độ đa hình của 2 loại chỉ thị phân tử, đó là chỉ thị RFLP và RAPD, bằng việc xác định giữa hai giống cây rau diếp trong cấu trúc của bản đồ liên kết gen Chỉ thị RFLP và RAPD chỉ ra sự phân bố giống nhau dọc theo hệ gen, và chúng thể hiện sự tương đồng cả về mức độ đa hình Tuy nhiên, các locus RAPD được xác định nhanh hơn

đã được khắc phục để có thể mở rộng hơn bằng cách lựa chọn những chỉ thị này được liên kết thành cặp với nhau (Williams và cs, 1993)

Tóm lại so với các chỉ thị truyền thống (chỉ thị hình thái, chỉ thị hóa học, ) các chỉ thị RAPD-PCR có các ưu điểm nổi bật như sau:

- Dễ thực hiện trong điều kiện phòng thí nghiệm (phép phân tích nhanh, đơn giản) với chi phí tương đối thấp

- Có phạm vi đánh giá toàn bộ hệ gen của đối tượng nghiên cứu

- Không phụ thuộc vào các yếu tố môi trường (các yếu tố môi trường ít nhiều có ảnh hưởng đến sự biểu hiện của gen)

- Không phụ thuộc vào hiện tượng tương tác giữa các gen

- Không phụ thuộc hiệu quả biểu hiện kiểu hình của các gen (chẳng hạn như các gen đột biến, gen gây chết, gen lặn thường không được biểu hiện kiểu hình trong tự nhiên)

- Có thể phát hiện các dạng biến dị ADN trong các giai đoạn khác nhau hoặc giữa các bộ phận khác nhau ở thực vật

Hạn chế của kỹ thuật RAPD-PCR

Khó khăn chính của chỉ thị RAPD chính là khả năng lặp lại thấp (Schierwater và Ender, 1993), và do quy trình về mặt thí nghiệm rất cần thiết phải

có độ tiêu chuẩn hóa cao, bởi vì độ nhạy của chỉ thị RAPD đối với các điều kiện phản ứng Để hạn chế nhược điểm này, ta cần tuân thủ nghiêm ngặt các điều kiện thí nghiệm, tiến hành đồng bộ giữa các lần thí nghiệm, hoặc sử dụng số lượng mồi RAPD-PCR đủ lớn trong nghiên cứu để giảm sai số thí nghiệm

22

Phân tích RAPD thường cần được tinh sạch, phân tử ADN có trọng lượng phân tử cao, và cần có sự phòng ngừa khả năng lây nhiễm của các mẫu ADN Nhìn chung, với những tồn tại vốn có về khả năng lặp lại của mình, chỉ thị RAPD không phải là chỉ thị phù hợp đối với việc chuyển giao hay so sánh các kết quả giữa các nhóm nghiên cứu ở cùng một loài hoặc một đối tượng nào đó Cũng giống như hầu hết các kỹ thuật đa locus khác, chỉ thị RAPD không phải là một chỉ thị đặc hiệu locus, các thông tin thu được từ các băng không thể làm sáng tỏ định nghĩa về các locus và alen (sự đồng trội của các chỉ thị) đồng thời những phân đoạn có kích thước giống nhau có thể không phải là đồng hợp Chỉ thị RAPD được cho rằng dễ dàng để tiến hành bởi nhiều phòng thí nghiệm khác nhau, tuy nhiên tính lặp lại không đạt được ở mức độ như ý (Jones và cs 1997)

Với những đặc điểm như trên, kỹ thuật RAPD -PCR có triển vọng lớnkhông những có thể áp dụng hiệu quả để đánh giá đa dạng di truyền, mà còn là công cụ hữu hiệu giúp bảo tồn, phát triển nguồn gen cây dược liệu và kiểm định nhanh dược liệu, đặc biệt là các dược liệu dễ nhầm lẫn trong quá trình thu hái hoặc sau khi sơ chế, từ các loài thảo dược ở Việt Nam trong tương lai

1.3.3 Mục tiêu của đề tài

Với những ưu điểm nổi bật của chỉ thị ADN (cụ thể là chỉ thị RAPD-PCR) kể

trên đã gợi ý cho chúng tôi thực hiện đề tài “Phân tích đa dạng di truyền nguồn tài

tiễn của các loài dược liệu trong nền y học cổ truyền và hiện đại, cùng với thực trạng phân bố, khai thác chúng hiện nay chính là nguyên nhân gợi ý chúng tôi đã lựa chọn các loài dược liệu dưới đây làm đối tượng trong nghiên cứu này:

- 2 loài là Ngũ gia bì gai (Acanthopanax trifoliatus) và Ngũ gia bì hương (A

- Loài cây thuốc Hồi hương (Illicium verum Hook.f) và một số loài hồi núi;

- Cây Ba kích (Morinda officinalis How) với các kiểu hình thái phổ biến hiện

nay;

- Đánh giá mức độ đa dạng di truyền một số loài cây thuốc: các mẫu hai loài

Ngũ gia bì gai (Acanthopanax trifoliatus) và Ngũ gia bì hương (A gracilistylus); các mẫu thuộc tập hợp đầy đủ nhất về cây Hồi hương (Illicium verum) với một số

loài hồi núi; các dạng hình thái khác nhau của cây Ba kích; và các mẫu thuộc loài

Sâm Việt Nam, Sâm Vũ Diệp và Tam thất hoang nhằm định hướng bảo tồn và phát

triển nguồn gen của các loài cây thuốc này

- Bên cạnh đó, sử dụng phương pháp RAPD-PCR, chúng tôi hi vọng bước đầu

có thể xác định được một số tập hợp chỉ thị ADN giúp phân biệt nhanh các loài cây thuốc có hình thái tương tự như đã trình bày ở trên Từ đó, cung cấp một công cụ bổ sung cho công tác kiểm định dược liệu ở Việt Nam trong tương lai

rễ Các phần mô dập nát hoặc có biểu hiện nhiễm bệnh được cắt bỏ Sau đó, các mẫu được lau sạch bằng ethanol 70%; rồi nghiền trong nitơ lỏng bằng chày và cối được khử trùng từ trước thành dạng bột mịn có kích thước hạt nhỏ hơn 1 mm Mẫu nghiền được bảo quản trong ống Falcon ở điều kiện nhiệt độ -80оC để làm nguyên liệu tách chiết ADN tổng số

2.1.1 Chi Acanthopanax

Các mẫu thực vật thuộc chi Acanthopanax được sử dụng trong nghiên cứu là

hai loài cây thuốc Acanthopanax trifoliatus (ký hiệu chữ cái đầu tiên là G) và A

Hà Giang, Cao Bằng và Lạng Sơn (Hình 1)

Ngũ gia bì gai

Ngũ gia bì gai là loài cây bụi nhỡ, cao 1 - 7 m, mọc dựa, cành vươn dài, có gai (hình 1a) Lá kép chân vịt, mọc so le, gồm 3 - 5 lá chét, thường là 3, hình bầu dục hoặc thuôn, gốc tròn, đầu nhọn, dài 5 - 8 cm, rộng 2 - 4 cm, lá chét giữa lớn hơn, mép khía răng to, gân lá có gai, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng Cuống lá kép dài 4 - 7 cm, có gai Cụm hoa mọc ở đầu cành, gồm 3 - 10 tán, có cuống dài 3 -4

cm Hoa nhỏ, mẫu 5, màu trắng lục, lá đài không rõ, cánh hoa hình tam giác, nhị 5, chỉ nhị mảnh, bầu hạ, 2 ô (Hình 1b) Quả mọng, hình cầu dẹt, khi chín có màu đen,

có 2 hạt Toàn cây có tinh dầu thơm [2]

25

Bảng 4 Danh sách mẫu cây dược liệu được thu thập và phân tích trong nghiên cứu (các mẫu được

cung cấp và phân loại bởi các cán bộ của Phòng Tài nguyên, Viện Dược liệu, Bộ Y tế)

Ngũ gia bì hương

Thị trấn Sapa, Lào Cai 3 H LC 1-H LC 3 Bản Khoang, Sapa, Lào Cai 5 H LC 4-H LC 8 Phó Bảng, Hà Giang 4 H HG 1-H HG 4

Hoàng Liên Sơn, Lào Cai 7 N10 – N16

Ba Kích (loại thân có lông, quả rời) Chân Mộng, Đoan Hùng, Phú Thọ 4 BLR 1-B LR 4

Ba Kích (loại thân không lông, quả tụ)

Chân Mộng, Đoan Hùng, Phú Thọ 3 B KT 1-B KT 3 Lâm trường Tân Lạc, Hòa Bình 2 B KT 4-B KT 5

Ba Kích (loại thân không lông, quả rời)

Chân Mộng, Đoan Hùng, Phú Thọ 3 B KR 1-B KR 3 Lâm trường Tân Lạc, Hòa Bình 2 B KR 5-B KR 6 Quân Chu, Đại Từ, Thái Nguyên 4 B KR 7-B KR 10

Ba Kích (loại thân có lông, đồng thời có cả

quả tụ và quả rời) Chân Mộng, Đoan Hùng, Phú Thọ 2 BL1-BL2

Ba Kích (loại thân không lông, đồng thời

có cả quả tụ và quả rời) Chân Mộng, Đoan Hùng, Phú Thọ 1 BK1

Sâm Việt Nam

Trà Linh, Nam Trà My, Quảng Nam 9 S1 – S9 Ngọc Lây, Tumơrông, Kon tum 3 S10 – S12 Bản Khoang, Sapa, Lào Cai 2 S13 – S14 Sâm Vũ Diệp Bản Khoang, Sapa, Lào Cai 8 V1 – V8 Dạng trung gian của Sâm Vũ

Diệp và Tam thất hoang Bản Khoang, Sapa, Lào Cai 4 VT1 – VT4 Tam thất hoang Bản Khoang, Sapa, Lào Cai 8 T1 – T8

Ngũ gia bì hương

Ngũ gia bì hương là loài cây bụi, mọc dựa, cao vài mét (hình 1c) Vỏ thân và cành có màu xám nhạt, có gai thưa Lá kép chân vịt, mọc so le hoặc tụ tập thành 2 - 3

26

lá, gồm 5 lá chét hình trứng hoặc thuôn, dài 2 - 6 cm, rộng 1 - 3 cm, lá chét giữa to, những lá chét bên nhỏ dần về phía cuống, mép có răng cưa và lông cứng, hai mặt nhẵn, sẫm bóng ở mặt trên Cuống lá dài 2 - 6 cm, nhẵn Cụm hoa thường mọc đơn độc ở kẽ lá thành tán, cuống tán dài 2 - 3,5 cm, hoa nhỏ màu vàng lục (hình 1d) Quả hình cầu dẹt, khi chín màu đen, chứa hai hạt

Hình 1 Ảnh các loài thực vật thuộc chi Acanthopanax trong nghiên cứu: a-b) Bụi cây, lá và hoa cây

Ngũ gia bì gai; c-d) Bụi cây, lá và hoa cây Ngũ gia bì hương

2.1.2 Chi Illicium

Để phục vụ cho nghiên cứu chúng tôi tiến hành điều tra và thu thập các mẫu

thực vật thuộc loài Hồi hương (Illicium verum Hook.f) cùng với các loài Hồi núi tại

một số tỉnh miền bắc Việt Nam như Bắc Kạn, Cao Bằng, Lạng Sơn và Quảng Ninh (các mẫu Hồi hương) và tại Lào Cai (với các mẫu Hồi núi)

Cây Hồi hương (Illicium verum Hook.f)

Cây Hồi hương là loài cây thân gỗ, thường xanh, cao trung bình từ 6 - 8 m Cành thẳng, nhẵn, lúc non màu lục nhạt, sau chuyển sang nâu xám Lá mọc so le, nhưng thường tụ ở những mấu trông như mọc vòng, hình mác hoặc trứng thuôn [2, 28] Hoa hồi mọc riêng lẻ hoặc 2 - 3 cái ở kẽ lá, dài 5 răng, dễ rụng, mép là viền hồng, cánh hoa 5 - 6 đều nhau, màu hồng sẫm dần về phía giữa; nhị thụt, nhẵn, chỉ nhị rộng mập, trung đới dày Hoa hồi thuộc loại hoa lưỡng tính [28]

Quả cấu tạo bởi 8 đại đều và rời nhau Các đại hình thoi xếp tỏa tròn thành hình sao hay hình nan hoa xung quanh một trục, khi non màu xanh lục sau chuyển màu nâu sẫm, phần đính cuống rộng bản và dẹt, đầu có mũi nhọn ngắn, thẳng, khi chín nứt ở mặt trên Mỗi một đại mang một hạt Hạt hồi thường có hình trứng nhẵn bóng, màu nâu hoặc đỏ nhạt [2, 28]

27

Hồi núi

Theo Đỗ Huy Bích và cộng sự (2003), Hồi núi ở Việt Nam là những cây thân

gỗ nhỡ hoặc to, cao trung bình từ 7 - 14 m, tán lá tròn Cây Hồi núi có cành non mềm có vỉ màu lục nhạt cành khi già có màu xám tro Hoa Hồi núi thường mọc đơn

độc ở kẽ lá, màu hồng đỏ như I griffithii [2], hay vàng nhạt như I anasitum, có

cuống thường dài hơn cuống lá Quả Hồi núi thường có nhiều cánh khoảng từ 10 đến 13 cánh mọc tỏa tròn, thường mỏng và không đều nhau Lá Hồi núi thường mọc

so le, thường tụ tập 4 - 5 cái, hình mác, dai và nhẵn, đầu nhọn

Hình 2 a-b) Hình thái lá và quả cây Hồi hương (Illicium verum Hook.f); c-d) Hình thái lá và quả

của cây Hồi núi (I anasitum)

2.1.3 Chi Morinda

Cây Ba kích có đặc điểm hình thái cơ bản như sau (Đỗ Huy Bích và cs, 2003): dạng cây thảo, sống lâu năm, thân leo dài hàng mét, đường kính thân từ 3 - 5 mm và

có nhiều lóng Lá mọc đối hình mác hoặc bầu dục, thuôn nhọn, dày và cứng, dài

6 - 14 cm, rộng 2,5 - 6 cm, cuống ngắn, lúc non có lông dày ở mặt dưới, thường tập trung ở các gân lá và mép lá, mầu xanh lục, sau già ít lông hơn mầu trắng mốc; lá kèm mỏng, ôm sát vào thân

Tập hợp mẫu cây Ba kích được thu thập tại các tỉnh Phú Thọ, Thái Nguyên, Hòa Bình và được phân loại dựa trên 2 đặc điểm hình thái chính (hình thái thân có lông và thân không có lông; hình thái ba kích quả tụ và quả rời) do các chuyên gia của Viện Dược Liệu xác định Kí hiệu các mẫu bao gồm hai chữ cái thể hiện hai đặc điểm hình thái thân có (không có) lông (L hoặc K) và quả tụ (rời) (T hoặc R) kèm theo số thứ tự của mẫu (kí hiệu cụ thể ở Bảng 4) Trong số các mẫu thu thập được

có những mẫu có cả đặc điểm hình thái quả tụ và quả rời trên cùng một chùm quả

Để tiện theo dõi, chúng tôi kí hiệu là L và K (Bảng 4)

28

Hình 3 Hình thái các loại kiểu hình của cây ba kích sử dụng trong nghiên cứu: a) quả tụ; b) quả

rời; c) thân có lông; d) thân không có lông.

2.1.4 Chi Panax

Tổng cộng 34 mẫu thực vật đã được thu thập hoặc từ các điểm trồng bảo tồn hoặc mọc tự nhiên ở vùng Sapa thuộc tỉnh Lào Cai và Ngọc Linh thuộc địa phận hai tỉnh Quảng Nam và Kon tum (Bảng 4) Đặc biệt, trong số các mẫu cây thuốc thu thập được có một số cây có kiểu hình lá xẻ nông, hiện tại về mặt hình thái chưa thống nhất xếp vào loài Sâm Vũ Diệp (có kiểu hình thái lá xẻ sâu điển hình) hay loài Tam thất hoang (có kiểu hình thái lá không xẻ) Trong nghiên cứu này, chúng tôi tạm gọi những mẫu thực vật đó là Dạng trung gian (TG) Sâm Vũ Diệp – Tam thất hoang

Sâm Việt Nam (Sâm Ngọc Linh, Panax vietnamensis Ha et Grushv.)

Về mặt hình thái, Sâm Việt Nam là loài cây thân thảo, cao từ 40 đến 80 cm, có thân rễ nạc mọc bò ngang Thân rễ phân thành nhiều đốt nhưng không phân nhánh, dài chừng 30 đến 40 cm, trên bề mặt có nhiều vết sẹo do thân khí sinh lụi hàng năm

để lại, mặt ngoài màu nâu nhạt, ruột trắng ngà, phía cuối đôi khi có củ hình cầu Thân khí sinh của cây Sâm Việt Nam mảnh, mọc thẳng, lụi hàng năm, mang

từ 2 đến 4 lá kép chân vịt mọc vòng Mỗi lá kép có 5 lá chét hình mác với mép có khía răng nhỏ, dài khoảng 10 đến 14 cm, rộng từ 3 đến 5 cm Ngọn thân có cụm hoa mọc thành tán đơn, cuống dài màu lục vàng Quả Sâm Việt Nam hình trứng, màu đỏ sau đen, hạt màu trắng hình thận, có vân (Đỗ Huy Bích, 2003)

Sâm Vũ Diệp (Panax bipinnatifidus Seem.)

Về hình thái, Sâm Vũ Diệp là cây thân thảo, cao từ 30 đến 50 cm, có thân rễ dài và vặn vẹo, phân nhiều đốt, đầu rễ có hình con quay Thân khí sinh mảnh, có

29

vạch dọc, thường đơn độc, mọc thẳng và rỗng giữa Lá kép chân vịt gồm 2 đến 3 lá mọc vòng Lá chét từ 5 đến 7, thuôn, dài từ 2,5 đến 14 cm, rộng từ 1,5 đến 4 cm, mặt trên có lông Lá chét xẻ thùy hình lông chim rõ rệt, mép khía răng Cụm hoa mọc ở ngọn thân thành tán đơn, hoa màu trắng lục có 5 cánh, 5 nhị, bầu 2 đến 3 ô Quả mọng, hình cầu hơi dẹt, màu đỏ, có chấm đen ở đầu, chứa từ 2 đến 3 hạt hình cầu

Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T Tsai et K.M Feng)

Về đặc điểm hình thái, Tam thất hoang là cây thân thảo, cao từ 25 đến 75 cm Thân rễ mập, nằm ngang, ít khi phân nhánh, đường kính từ 1,5 đến 3 cm, có nhiều u lồi dính kết nhau Bề mặt thân rễ có nhiều sẹo lõm do các vết thân lụi để lại Thân khí sinh mọc thẳng, nhẵn, mang từ 1 đến 3 lá kép chân vịt mọc vòng ở ngọn, cuống

lá từ 5 đến 10 cm Lá chét có 5 cái, cuống ngắn, gốc cuống đôi khi có phần phụ hình tai hoặc hình chỉ, phiến lá chét hình thuôn hay mác, không xẻ thuỳ, dài từ 5 đến 13

cm, rộng từ 2 đến 4 cm Mép lá chét có răng cưa, thường có lông ở gân lá mặt trên Một số cây non có thể có lá chét xẻ thuỳ nông hình lông chim Cụm hoa là tán đơn, mọc ở ngọn, hoa màu vàng xanh, 5 lá đài, 5 cánh hoa, 5 nhị, bầu 2 ô Quả mọng, hình cầu dẹt, đường kính từ 0,6 đến 1,2 cm, khi chín có màu đỏ Hạt lớn, dài từ 5 đến 6 mm, hình gần giống hạt đậu tròn, màu xám trắng, vỏ cứng, có rốn hạt (Nguyễn Tập, 2005)

30

Hình 5 Bản đồ các địa phương thu mẫu dược liệu trong nghiên cứu (theo điều tra của các cán bộ

Phòng tài nguyên, Viện Dược liệu, Bộ Y tế).

Trà Linh, Trà My,Quảng Nam

Ngok Lây, Tumorong, Kon Tum

Bản Khoang, Sapa, Lào Cai

Thị trấn Sapa, Lào Cai

Đại Từ, Thái Nguyên

SƠ ĐỒ THU MẪU

Địa điểm thu mẫu chi Acanthopanax

Địa điểm thu mẫu chi Illicium

Địa điểm thu mẫu chi Morinda

Địa điểm thu mẫu chi Panax

Thái Nguyên Phú Thọ

Quảng Ninh

HÀ NỘI Lào Cai