nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn lan hồ điệp ở việt nam

ở Việt Nam, Hồ Điệp cũng chính là loại hoa đợc các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu với nhiều góc độ khác nhau, tuy nhiên những nghiên cứu về đặc tính di truyền, biến dị ở các mức độ khá

1 Mở đầu1.1 Đặt vấn đề

Hoa là một sản phẩm đặc biệt, vẻ đẹp của hoa luôn là nguồn cảm xúc, món

ăn tinh thần không thể thiếu trong cuộc sống của con ngời và làm đẹp thêm cuộc sống Cùng với sự phát triển của văn minh nhân loại, nhu cầu thởng thức hoa ngày càng đợc nâng cao; do vậy ngành trồng hoa đã và đang trên đà phát triển mang lại lợi nhuận kinh tế cao Theo ITC (Trung tâm phát triển xuất khẩu của Liên Hợp Quốc) thì tổng kim ngạch xuất khẩu hoa tơi trên thế giới hàng năm khoảng 25 tỷ USD, dự kiến vào những năm đầu thế kỷ XXI sẽ đạt 40 tỷ USD

Hoa lan (Orchird) là một loại hoa cao cấp có giá trị kinh tế cao vì nó lá “chúa tể” của các loài hoa Vẻ đẹp kiều diễm, hơng thơm quyến rũ của loài hoa này đã làm say đắm bao ngời trên hành tinh Hoa lan hấp dẫn ngời tiêu dùng bởi sự đa dạng về màu sắc và đặc biệt thu hút các nhà sản xuất kinh doanh bởi tính bền lâu của hoa Vì vậy, từ lâu đã đợc con ngời đã thuần hoá, su tầm, nhập nội, thuần dỡng các giống ngoại và lai tạo để tạo ra hàng nghìn thứ có màu sắc và hơng thơm nh ý muốn khiến chủng loại, màu sắc của hoa lan ngày càng đa dạng và đặc sắc phục vụ cho nhu cầu thởng thức của con ngời Đến nay, đã phát hiện hơn 800 chi với 35.000 loài lan bao gồm các loài lan tự nhiên và loài lan do kết quả chọn lọc và lai tạo (Averyanov và

cs, 2003)

Trong họ Lan (Orchidacae), lan Hồ Điệp (Phalaenopsis) là một trong những

hoa phong lan đợc trồng phổ biến trên thế giới Hoa lan Hồ Điệp đợc nuôi trồng nhiều, rất đa dạng về thành phần, chủng loại và tính thích nghi với nhiều vùng khí hậu khác nhau và đợc mệnh danh là hoàng hậu của các loài phong lan Mấy năm gần đây, thị trờng hoa lan Hồ Điệp có sức tiêu thụ lớn hơn bất kì một loại hoa nào khác và đợc bán với giá rất cao nhng cũng không đáp ứng đợc nhu cầu thị trờng Không chỉ ở Trung Quốc mà ở Hà Lan, Mỹ và nhiều nớc khác trên thế giới nhu cầu tiêu thụ hoa lan Hồ Điệp cũng rất lớn Nhu cầu của thị trờng quốc tế cũng tăng

không ngừng Năm 2002 trong bảng xếp hạng của Hà Lan, Hồ Điệp đứng thứ 2 trên

16 loại hoa đợc xếp hạng [21]

Trong tiến trình hội nhập vào nền kinh tế thế giới, chúng ta phải có những mặt hàng đặc trng riêng của Việt Nam trớc bạn bè quốc tế Đó không chỉ là những món ăn đặc sản, phong cảnh đẹp mà còn cần đến những loài hoa vơng giả chỉ có ở Việt Nam mà cha ông chúng ta đã thởng thức và lu giữ Muốn vậy, các loài lan này cần đợc điều tra, su tầm để làm vật liệu nhân giống và lai tạo giống sau này ở Việt Nam, Hồ Điệp cũng chính là loại hoa đợc các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu với nhiều góc độ khác nhau, tuy nhiên những nghiên cứu về đặc tính di truyền, biến

dị ở các mức độ khác nhau ở mức hình thái và đặc biệt là ở mức độ phân tử hầu nhcha đợc đề cập Bên cạnh đó việc bảo tồn và duy trì các loại lan rừng để cung cấp nguồn vật liệu là cần thiết Xuất phát từ những lí do trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn lan Hồ Điệp

(Phalaenopsis) ở Việt Nam”

1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

1.2.1 Mục tiêu

Đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn lan Hồ Điệp ở Việt Nam và nhập nội, nhằm xác định mối quan hệ về mặt di truyền của chúng, góp phần bảo tồn và khai thác nguồn gen quý này vào việc chọn tạo giống lan Hồ Điệp quý phục vụ cho sản xuất và tiêu dùng

1.2.2 Nội dung nghiên cứu

- Nghiên cứu sự đa dạng về các đặc điểm về hình thái của tập đoàn lan Hồ

Điệp ở Việt Nam và nhập nội

- Nghiên cứu đa dạng di truyền của tập đoàn lan Hồ Điệp ở mức độ phân tử ADN bằng kỹ thuật PCR-RAPD

- Dựa vào sự đa dạng di truyền ở mức phân tử kết hợp với đa dạng về các đặc

điểm hình thái để phân tích mối quan hệ chủng loại, nguồn gốc, mối tơng quan di truyền của các loài lan Hồ Điệp phục vụ công tác lai tạo giống mới

- Tiến hành lai tạo để tạo con lai dựa trên kết quả phân tích đa dạng hình thái

và đa dạng di truyền ở mức phân tử

2 Tổng quan tài liệu2.1 Một số đặc điểm của lan

Họ lan (Orchidaceae) ở trong lớp đơn từ diệp một lá mầm Monocotyledonea

thuộc ngành Ngọc lan - thực vật hạt kín Magnoliophyta, phân lớp hành tỏi Lilidae,

bộ lan Orchidales [53] Họ Orchideceae là một trong những họ lớn nhất của thực

vật và có các thành viên phân bố trên toàn thế giới, ngoại trừ châu Nam Cực Họ lan rất đa dạng: có cây sống dới mặt đất và chỉ nở hoa trên mặt đất cũng nh có cây sống tại vùng cao nguyên của dãy Himalaya; hoa lan có thể tìm thấy tại các vùng có khí hậu nhiệt đới nh trong rừng già của Brazil đến các vùng có tuyết phủ trong mùa

đông nh tại bình nguyên của Manitoba, Canada; hoa lan có loại mọc trên đất (terrestrial), có loại mọc trên cao (epiphyte) và có loại mọc trên đá (lithophyte) [27]

Hoa lan đợc ngời tiêu dùng a chuộng vì vẻ đẹp đặc sắc và các hình thức đa dạng của chúng Hoa lan hầu nh có tất cả các màu trong cầu vồng và những kết hợp của các màu đó Hoa lan nhỏ nhất chỉ bằng hạt gạo trong khi lớn nhất có đờng kính khoảng 1m [27] Tuy đa số các loại hoa lan tìm trên thị trờng không có hơng thơm,

có rất nhiều loại hoa lan có mùi Vanilla là một loại hoa lan mà hơng thơm đợc dùng trong các loại ẩm thực của thế giới và có nguồn gốc từ Mexico; trong khi đó còn có các loại hoa lan toả ra mùi nh thịt bị hỏng để hấp dẫn các côn trùng

2.1.1 Nguồn gốc, vị trí phân loại

Cây hoa lan đợc biết đến đầu tiên là ở Phơng Đông Theo tác giả Bretchacidor thì từ đời vua Thần Nông 2800 trớc công nguyên ở Trung Quốc, loài lan rừng đã đợc dùng làm thuốc chữa bệnh Sau đó cùng với vẻ đẹp và hơng thơm của nó kết hợp với công dụng chữa bệnh nên loài hoa này đã có mặt ở châu Âu, nơi những loài lan đã đợc cấy trồng từ thời văn minh cổ Địa Trung Hải [3] Tại đây, ng-

ời ta đã tiến hành nghiên cứu khá công phu và tỉ mỉ, những nhà sáng lập ngành lan học đáng kể là triết gia ngời Hy Lạp Theophrastus (372 – 287 trớc Công nguyên)

đợc coi là cha đẻ của ngành lan học, vì ông là ngời đầu tiên dùng từ Orchis để chỉ một loài lan có củ tròn Sau đó nhà thực vật học ngời Thụy Điển Linnaeus (1707 -

1778) và Robiet Bron (1773-1858) là những ngời đầu tiên phân biệt rõ ràng họ lan với các họ thực vật khác Còn ngời đặt nền tảng cho môn học về hoa lan chính là Joanlind Năm 1836 ông công bố tài liệu (A Tabuler View of the Tribes of Orchidar) để sắp xếp cây và chi thuộc họ lan Tên của họ lan do ông đa ra đợc dùng cho đến tận ngày nay [3].

ở Việt Nam, cha ông ta đã biết trồng lan từ rất sớm, từ thế kỉ XIII, vua Trần Nhân Tông đã lập đợc một vờn lan gồm 500 chậu (Ngũ Bách Lan Viên) trên đồi Long Đỗ (công viên Bách Thảo ngày nay )[19] Dấu vết nghiên cứu về lan ở buổi

đầu không rõ rệt lắm, có lẽ ngời đầu tiên có khảo sát lan ở Việt Nam là Gioalas Noureiro – một nhà truyền giáo Bồ Đào Nha đã mô tả đầu tiên vào năm 1789 trong

“Flota co-chinchinensis” gọi tên là các cây lan trong cuộc hành trình đến Việt Nam phân là aerides, phaius và sarcopodium mà đã đ… ợc Ben Tham và Hooker ghi lại trong cuốn “Genera planterum” (1862-1883) [8]

* Phân loại họ phong lan Orchidaceae:

Theo các tác giả Phạm Hoàng Hộ (1973) và Trần Hợp (1990) thì sự phân chia

họ lan khá phức tạp Theo truyền thống cổ điển, các nhà khoa học trớc đây chia họ lan làm 3 họ phụ khá minh bạch Gần đây do phân tích một cách đầy đủ hơn và đi sâu vào các đặc tính di truyền, các nhà khoa học đã chia họ lan thành 6 họ phụ: 1

Apostasioideae 2 Cypripedioideae 3 Neottioideae 4 Orchidioideae 5 Epidendroideae 6 Vandoideae

Họ lan Orchidaceae của Việt Nam khá phong phú, theo Nguyễn Tiến Hiệp,

Phan Kế Lộc, Avernov và cs (2000 – 2003) có 120 chi và 897 loài Trong đó, Việt Nam có khoảng 7 loài Hồ Điệp trong tổng số 70 loài lan Hồ Điệp đợc phát hiện trên thế giới [20]

Phân loại hoa lan Hồ Điệp có thể chia ra nh sau:

- Căn cứ vào màu sắc hoa: Lan Hồ Điệp có màu sắc hoa rất phong phú, nếu căn cứ vào màu sắc hoa để phân loại có thể chia ra thành các giống [21] :

+ Giống hoa màu đỏ

Lan Hồ Điệp lớn: Đờng kính bông hoa >10cm

Lan Hồ Điệp trung bình: Đờng kính bông hoa 7,5 – 10 cm

Lan Hồ Điệp nhỏ: Đờng kính bông hoa <7,5cm

Cho đến nay việc phân loại cây trồng hết sức phức tạp, cha có các khoá phân loại cho các đơn vị dới loài trong khi đó việc phân loại cho các đơn vị dới loài lại hết sức quan trọng, nhất là trong công tác chọn giống cây trồng [22], đối với họ lan cũng gặp những khó khăn này

2.1.2 Đặc điểm hình thái của lan Hồ Điệp

Lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp) đợc nhà thực vật học ngời Đức Carl Ludwig

Blume đặt tên giống chính thức là Phalaenopsis vào năm 1985 Tên Phalaenopsis

có nguồn gốc từ tiếng Latin, Phalaina nghĩa là “cánh bớm” và opis nghĩa là “tựa

nh-”, Phalaenopsis mang ý nghĩa là bông hoa có hình cánh bớm

Theo tác giả Nguyễn Quang Thạch (2005) cây lan Hồ Điệp đợc mô tả nh sau:

Rễ lan

Hệ rễ lan Hồ Điệp không phân chia thành rễ chính, rễ phụ, rễ nhánh, lông hút

rõ ràng mà rễ của lan Hồ Điệp thờng có dạng hình tròn to mập, có nhánh hoặc không phân nhánh Rễ thờng có màu trắng, đầu rễ có màu xanh, màu vàng trắng hoặc màu đỏ tối Rễ của lan Hồ Điệp thờng mọc ra ngoài chậu, buông lơ lửng ra không khí, có lợi cho việc hút ôxy và nớc Có những nghiên cứu cho thấy rễ cây thuộc nhóm phong lan cũng có khả năng quang hợp

Phần rễ trên thờng sống cộng sinh với nấm do hạt của hoa lan nói chung đều không có nội nhũ, không đợc cung cấp đủ dinh dỡng khi nảy mầm, trong điều kiện nảy mầm tự nhiên, cần dựa vào các mầm sống cộng sinh để hút chất dinh dỡng Trong quá trinh sinh trởng của cây, các loài nấm này sống cộng sinh tại rễ lan để t-

ơng trợ cho nhau, vì thế rễ của hoa lan còn gọi là rễ nấm Việc tới và bón phân cho hoa lan phải yêu cầu bón thật loãng, chính là vì trên rễ cây có nấm sống cộng sinh

Thân

Lan Hồ Điệp thuộc vào loại lan đơn thân, tức là thân của chúng rất ngắn không hề có giả hành, cũng không có thời kỳ ngủ nghỉ rõ rệt Lan đơn thân sinh tr -ởng rất chậm chạp, thân chính của nó trong môi trờng thuận lợi hàng năm lại mọc ra các lá mới, chúng mọc theo hớng cao hơn theo phơng thẳng đứng, còn cành hoa thì mọc ở rìa thân hoặc nảy ra từ nách lá, lá mọc xếp thành hai hàng xen kẽ với nhau Theo sự sinh trởng của cây, các lá già ở dới gốc dần dần già héo và rụng đi, đến khi

có chồi nách mọc ra nhng thờng không mọc dài ra đợc Vì cây lan rất khó ra chồi nhánh, nên không dùng phơng pháp tách cây để nhân giống Thân của Lan Hồ Điệp, ngoài tác dụng giữ cho cây đứng thẳng, còn có chức năng tích trữ chất dinh dỡng và nớc cho cây

Lá

Lá của lan Hồ Điệp to, dày, đầy đặn, lá mọc đối xứng, ôm thân cây Số lá trên cây thờng không nhiều, thông thờng cây lan trởng thành có từ 4 lá trở lên Trong nách lá có 2 chồi phụ, chồi phụ trên to hơn là chồi hoa sơ cấp, bên dới là chồi dinh dỡng sơ cấp Các chồi sơ cấp sinh trởng đến một mức độ nào đó thì bắt đầu đi vào giai đoạn ngủ nghỉ Màu sắc của lá gồm 3 loại: lá màu xanh; mặt trên lá và mặt dới lá màu đỏ; mặt trên của lá đốm và mặt dới lá màu đỏ Căn cứ vào màu sắc của lá

có thể phân biệt màu sắc hoa của chính nó, lá màu xanh thờng ra hoa màu trắng hoặc màu vàng nhạt, lá màu khác thờng cho hoa màu đỏ

Hoa

Cành hoa của lan Hồ Điệp mọc ra từ nách lá, thông thờng đếm theo thứ tự từ trên xuống, thì cành hoa bắt đầu mọc từ lá thứ 3 hoặc thứ 4 Các cành hoa có thể phân nhánh hoặc không phân nhánh Lan hoa to thờng ít phân nhánh còn lan hoa nhỏ phân nhánh rất rõ thậm chí một số giống hoa lan nhỏ có thể nở đến 200 bông hoa [21] Cành hoa khi cha phân hoá các đốt hoa, thờng ở dạng tiền chồi nách hoặc tiền chồi hoa, ở nhiệt độ dới 150C và khi bấm ngọn có thể nảy thành chồi hoa, nhng nếu nhiệt độ cao qúa 280C thì chỉ có thể nảy thành chồi nách

Đa số các giống hoa lan đơn cây chỉ ra một cành hoa, có một số giống khác hoặc trong điều kiện tốt thì chồi hoa phân hoá thành 2 – 3 cành hoa Nói chung, lan

Hồ Điệp đơn cây nếu phân hoá ra số cành hoa càng nhiều hoặc số cành nhánh càng nhiều thì hoa càng nhỏ Để trồng đợc lan có hoa to, đẹp, cần phải khống chế số bông hoa trên một cành hoặc cắt bớt đi một số cành nhánh

2.2 Tình hình nghiên cứu lan trên thế giới và ở Việt Nam

2.2.1 Tình hình nghiên cứu lan trên thế giới

2.2.1.1 Tình hình nghiên cứu chung

Qua lịch sử hơn 200 năm phân loại họ lan đến nay, ngời ta đã xác định đợc

họ lan Orchidaceae ở trong lớp một lá mầm Monocotyledonea thuộc ngành Ngọc

lan - thực vật hạt kín Magnoliophyta, phân lớp hành tỏi Lilidae, bộ lan Orchidaceae

Theo Takhtajan – nhà phân loại học hàng đầu thế giới năm 1987 thì họ lan có 25.000 loài với 750 chi Tuy nhiên đến nay các nhà phân loại học của thế giới khi

nghiên cứu về họ lan đã công bố tới 35.000 loài, 800 chi Các họ lan đợc đánh giá là một trong những loài hoa cao cấp trong vơng quốc thảo mộc Từ hàng ngàn năm nay, ở mọi lục địa đã trực tiếp gần gũi với các giống thảo mộc này, họ bị quyến rũ bởi vẻ đẹp của các bông hoa cũng nh mùi hơng hoặc bị cuốn hút ngầm bởi những tinh dầu có thể trích ra từ chúng ở Châu Âu, nơi những loài lan đã đựơc cấy trồng

từ thời văn minh cổ Địa Trung Hải, những nhà sáng lập ngành lan học đáng kể là triết gia ngời Hy Lạp Theophrastus (372 – 278 trớc Công nguyên) và sau này là nhà thực vật học ngời Thuỵ Điển Linnaeus (1707 – 1778) Chính Theophrastus là ngời đầu tiên sử dụng từ Hy Lạp (Orchid) để chỉ nhóm thảo mộc này [7]

Trải qua nhiều năm cây hoa lan chỉ sinh sản bằng hình thức sinh sản hữu tính Những hạt lan rơi trên vỏ cây và nảy mầm trong điều kiện tự nhiên nhng tỷ lệ nảy mầm thấp Năm 1904, Noel Bernard đã sử dụng phơng pháp cộng sinh nấm để gây sự nẩy mầm của hạt lan ngoài tự nhiên Ngành trồng lan thực sự có những chuyển biến rõ rệt khi Knudson nghiên cứu phơng pháp gieo hạt trên môi trờng nhân tạo trong phòng thí nghiệm vào năm 1922 Môi trờng nhân tạo để hạt lan nảy mầm gồm đờng đơn và một số muối khoáng Sau đó, môi trờng nhân tạo đợc cải tiến làm cho phù hợp với nhu cầu của những nhóm lan khác nhau Cả hai phần này đều đợc các nhà thực vật khác đảm nhiệm Tiếp đó, phơng pháp nuôi cấy mô lan đa thân tạo

ra hy vọng mới cho cho các nhà trồng lan trên thế giới [26], [36]

Năm 1946 Knudson đã công bố công trình nghiên cứu khả năng nảy mầm của hạt lan trong môi trờng dinh dỡng, từ đó mở ra công nghệ nhân giống lan bằng hạt Năm 1960 Morel khám phá ra phơng pháp nuôi cấy mô lan đa thân từ một tế bào với cách nhân nhân tạo có thể hình thành một cơ thể hoàn chỉnh Phơng pháp này nhân giống với tốc độ nhanh chóng 4 triệu cây con/năm Năm 1965, Morel cũng công bố phơng pháp nhân giống lan bằng nuôi cấy mô phân sinh Đến năm

1970, M Vajrabhaya và T Vajrabhaya cấy mô thành công loài lan đơn thân đầu tiên Sau đó, năm 1971 hai nhà khoa học Richard J Smith và Wesloyp Hacken đã nghiên cứu cấy mô chồi bất định trên mắt của trục phát hoa Phalaenopsis Khi hoa

gần tàn hai ông lấy mắt ở trục phát hoa đa vào môi trờng có thành phần dinh dỡng cơ bản của MS, Knudson C Sau 6 – 8 tuần có thể quan sát thấy các chồi bất định

nhỏ màu xanh [16] Năm 1972, Michio Tanaka và Yoluhoto Sakanishi đã lấy mô lá của những chồi mọc từ mắt ngủ của phát hoa Phalaenopsis Kết quả có tiền chồi

hình thành trên bề mặt lá [55]

Đến năm 1974, Intuwong Oradee, Yoneo Sagawa đã tách mô từ chồi sinh ỡng có 6 - 7 lá Kết quả tạo chồi (protocom- like bodies) có màu xanh.Với kĩ thuật này nhiều cây Phalaenopsis amabilis, P Surfridess, P Rulylip đợc sản xuất [49]

d-Năm 1983 Lee và Mowe đã nuôi cấy đỉnh sinh trởng giống phong lan Aranda trong môi trờng Vacin và Went Mô tế bào thu đợc đem xử lý với Colchicine với các nồng

độ khác nhau thu đợc cây đa bội

Năm 1998 tác giả Đờng Lợi Na đã nghiên cứu phân loại tổng thể các loài địa lan Kiếm của Trung Quốc Mô tả đợc đặc điểm hình thái, thân, lá, hoa, hơng thơm

và nhất là kỹ thuật nuôi trồng, chăm sóc, phòng trừ sâu bệnh cũng nh kỹ thuật nhân giống, sang chậu các loài địa lan Kiếm quý giá Tiếp đến, năm 2003 Lu Chấn Long qua nhiều năm tìm hiểu và theo dõi loài địa lan Kiếm đã đa ra đợc cách thức trồng

và thởng thức các loài địa lan Kiếm của Trung Quốc, trong đó nêu rõ đợc kỹ thuật chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hại [14]

Sau đó năm 2004, các nhà nghiên cứu Singapore đã phát hiện đợc một gen

đặc biệt và biến đổi gen đó để làm cho lan mau ra hoa hơn và làm thay đổi cả hình dạng của cánh hoa Các nhà khoa học tại phân khoa sinh học thuộc Đại học Quốc gia Singapore đã tìm ra cách để rút ngắn tiến trình ra hoa của các cây bằng cách kiểm soát một loại gen đặc biệt

Nh vậy ngành trồng lan có những bớc tiến vô cùng quan trọng và chính thức

đa cây lan ra nhập vào ngành trồng hoa cây cảnh trên thế giới cách đây khoảng 400 năm [15] Hiện nay và trong tơng lai các loài mới và chi mới vẫn còn tiếp tục đợc

bổ sung Nhất là khi chúng ta áp dụng các phơng pháp phân tích đa hình di truyền các loại lan ở mức độ ADN (Garray, 1997)

2.2.1.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền của lan trên thế giới

* Nghiên cứu về hình thái học

Các nghiên cứu về hình thái học tâp trung vào các nghiên cứu nhằm thống kê toàn bộ họ của phong lan Các ví dụ nghiên cứu đợc lấy làm mẫu thờng có yêu cầu rất cao về mức độ phân loại nh thí nghiệm của Burns-Balogh & Funk (1986) và Dressler (1993) Theo thí nghiệm của Dressler những thống kê về sự phát sinh giống loài của Freudenstein và Rasmussen (1999) minh chứng rõ nhất cho điều này Bắt nguồn từ nhánh Orchideae Diseae– nhng không có nghĩa là nó sẽ đại diện cho 4 nhóm là Disa, Satyrium, Platanthera, Dactylor- hiza Mặc dù đã có rất nhiều nghiên

cứu về hình thái học qua hơn 2 thế kỷ qua nhng cha có bất kỳ nghiên cứu nào về các loài hoa ở Bắc bán cầu để đối chiếu với các nghiên cứu của H P Linder và H Kurzweil về hình thái học và nguồn gốc phát sinh giống loài của các loài hoa lan ở Nam bán cầu

* Nghiên cứu ở mức phân tử

- Những nghiên cứu về Allozyme và RFLP

Các phân tích allozyme và RFLP của Schlegel và cs (1989) đã nghiên cứu

về allozyme ở nhiều loài thuộc giống Phong lan ở những nghiên cứu trớc, ngời

ta cho rằng cả AnaCamptis morio và Neotinea ustulata đều thuộc họ Phong

lan nhng chúng lại không cùng một nhánh trong nhóm 6 loài của họ Phong lan Nghiên cứu của Rossi và cs (1994) đã nghiên cứu sâu hơn về khoảng cách

di truyền của 4 nhóm: nhóm xuất phát từ AnaCamptis s.l một nhóm là AnaCamptis (e.g A laxiflora), một nhóm có hoa giống hình dáng ngời thuộc loài Orchis s.s và một nhóm bắt nguồn từ giống này (đại diện là nhóm O quadripunctata và O brancifortii).

- Nghiên cứu trình tự ADN lạp thể

Các nghiên cứu về Orchidaceae đều cho thấy rằng, đại diện của nhóm

này là hai gen lạp thể rbcL và ndhF Nghiên cứu đầu tiên là ở gen rbcL phân

tích trên Disa tripetaloides và Platanthera ciliaris [34] Các nghiên cứu dựa

trên các trình tự của gen lục lạp đã giúp chúng ta hiểu rõ hơn về sự phát sinh hình thái của loài Orchideae.

Năm 1998, Cozzolino và cs đã sử dụng phơng pháp RFLP để nghiên cứu trên các ADN lạp thể của trên 9 loài của họ Orchis s.l liên quan đến

‘Aceras’ anthropo- phorum và AnaCamptis pyramidalis (nhng thiếu Neotinea s.l ) Trong nhóm này còn có Dactylorhiza saccifera, ở nhóm khác

còn có Serapias vomeracea và Cephalanthera rubra cũng liên quan đến nghiên

cứu về RFLP của Cozzolino Tuy nhiên, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng

Cephalanthera có khoảng cách di truyền khá xa so với Orchis s.l [28], trong

thực tế nhóm Serapias có quan hệ gần gũi với Orchis s.l hơn là Dactylorhiza

[60]

- Nghiên cứu trình tự ADN gen Ribosom

Những dữ liệu về ITS (Internal Transcribed spacer) đã đợc nghiên cứu

trên 190 giống Phong lan, bao gồm tất cả các loài và phần lớn đợc nghiên cứu ở

Orchidaceae, một số ở Habenariinae và một loài đơn trong hai chi Satyriinae và Disinae Gần đây, những nhà nghiên cứu thực vật đã tập trung vào các điều tra về

sự phát sinh giống loài từ cấp độ lớn nhất đến mức nhỏ nhất trong cây phân loại Nhóm Orchidaceae là đại diện nổi bật trong nhóm nghiên cứu này và ngời ta có

thể cho rằng đây là họ thực vật lớn thứ 2 và là một trong những họ đa dạng nhất để tiến hành nghiên cứu [31], [35], [60]

ITS trong gen ribosom nhân đã đợc giải trình tự lần đầu tiên bởi Cozzolino

và cs (1996) Sau đó, 5 loài O.’ coriophora; ‘O.’ morio; ‘O.’ laxiflora (AnaCamptis s.l.; O simia và O purpurea (Orchis s.s.) thuộc họ Orchis s.l đã

đợc giải trình tự đoạn ITS1, và ITS2 bởi Pridgeon và cs (1997) Phơng pháp phân

tích ADN ribosom đã đợc áp dụng và phát triển nhanh chóng bởi Pridgeon và Bateman 88 trình tự của cấu trúc ITS1-5.8S- ITS2 đã đợc nghiên cứu bởi nhóm

tác giả (Baldwin, 1992; Baldwin và cs., 1995; Hershkovitz, Zimmer & Hahn, 1999) Các thống kê đã đợc miêu tả chi tiết Bateman (1999a) cũng đã nghiên cứu về cây ITS bao gồm 129 loài khác nhau, trong đó có 5 loài mới, cha có mặt trong các nghiên cứu về ITS trớc đó Nghiên cứu tập trung vào tính tơng đồng ở mức hình thái của các nhánh trong cây phân loại so sánh hình thái và các cây phân

tử để xác định sự tiến hoá của các loài lan. Cây phân loại này đã phân ra thêm

đ-ợc 172 loài Orchideae trong kết luận về Genera Orchidacearum (Pridgeon và

cs., 2001, Aceto và cs, 1999) đã tiến hành những nghiên cứu độc lập về ITS1và ITS2 ở 30 loài Orchidinae để chứng minh ở Orchis s.l là 2n = 36 (điều này cũng

đã đợc chứng minh bởi Prigeon và cs, 1997, Cameron và cs, 1999) đã tiến hành phân tích gen rbcL của 6 loài Orchidinae nhằm phân loại và sử dụng trong các

nghiên cứu về Diseae và sử dụng các trình tự ITS (Douzery và cs., 1999) 9 trình

tự của Orchidinae và 5 trình tự của Habenariinae đã đợc nghiên cứu sớm hơn

(Bateman và cs., 1997; Pridgeon và cs., 1997) để so sánh với 6 trình tự của

Habenariids và 30 trình tự của Diseae, tìm ra nguồn gốc của Diseae s.l và thấy

rằng Orchidinae có mối liên quan ít với Habenariinae (<50%) Luo Y cũng

đã sử dụng phơng pháp ITS của Pridgenon để nghiên cứu bổ sung trình

tự của loài phong lan đại diện cho Đông Nam á là Habenaria và Peristylus Loài Orchidinae Platanthera, Galearis, Gymnadenia, Neottianthe, Amitostigma và Ponerorchis (bao gồm cả ‘Chusua’), cùng với 8 loài khác của

loài Hemipilia Mối quan hệ của các loài phong lan ở Đông Nam á vẫn đang

tiếp tục đợc nghiên cứu bao gồm cả Amitostigma - Hemipilia, tuy nhiên mối quan

hệ di truyền của các nhóm phong lan chị em nh Platanthera Gymnadenia– –

Dactylorhiza Pseudorchis Orchis s.s Galearis– – – cũng đã đợc nghiên cứu từ khá lâu bởi Pridgeon và cs., 1997 Cozzolino và cs., 2001 lại u tiên nghiên cứu những loài phong lan ở vùng Trung Đông, đặc biệt là nghiên cứu hiện tợng thụ phấn sinh học của Phong lan Trình tự ITS đã đợc sử dụng làm chỉ thị để phân loại rất tốt

hiện tợng thụ phấn nhờ côn trùng [68] Các nghiên cứu gần đây tập trung vào vùng

nhân của rDNA ở mức độ phân loại cao hơn để phân loại dới loài: thống kê ở 60 loài Orchidaceae [42], so sánh trình tự ITS2 với trình tự 26S rDNA, kết quả so

sánh dùng để phân biệt ở mức độ hình thái của 5 họ phụ bao gồm cả Orchidoideae s.l và nhiều nhóm lan khác nhng cũng nhấn mạnh vào mức độ khó khăn khi

nghiên cứu mối quan hệ của các nhóm lan này [6]

- Nghiên cứu chỉ thị PCR - RAPD

William và cs (1990) đã phát hiện kĩ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA) trên cơ sở kĩ thuật PCR Nói chính xác hơn, kĩ thuật đánh giá tính đa hình các phân đoạn ADN đợc nhân bản ngẫu nhiên (RAPD) đợc 2 nhóm nghiên cứu của Wilsh và Mc Clelland (1990); William và cs (1990) đồng thời xây dựng Đây là một kĩ thuật phát hiện chỉ thị di truyền dựa trên phản ứng chuỗi polymerzase (PCR), điểm khác của RAPD so với PCR thông thờng là phơng pháp này chỉ sử dụng một mồi ngẫu nhiên dài 10 nucleotid, quá trình nhân bản ADN là ngẫu nhiên Nh vậy, RAPD là phơng pháp PCR sử dụng mồi ngẫu nhiên cho phép phát hiện tính đa hình mà không cần biết trớc một trình tự nucleotid nhất định Trên đối tợng phong lan cũng đã có một số nghiên cứu sử dụng chỉ thị RAPD

để phân tích đa hình chủ yếu tập trung vào một vài giống nh: Goodyera procera; Eulophia sinensis, Zeuxine gracilis, Zeuxine strateumatica (Wong và cs., 1999) và Changnienia amoena, Paphiopedilum malippoense, Paphiopedilum micranthum

(Lin và cs, 2002) Năm 1999, Lim và cs đã tiến hành nghiên cứu trên giống Vanda,

Benner và cs (1995) đã nghiên cứu sâu hơn về quan hệ di truyền ở mức độ hình thái của loài Cattleya Một số nghiên cứu sớm hơn sử dụng chỉ thị RAPD là các nghiên

cứu trên đối tợng loài lan Hồ Điệp, nghiên cứu tiến hành trên 16 loài của giống lan

Hồ Điệp Chỉ thị RAPD cũng đã đợc sử dụng để xác định mức độ đa dạng di truyền của các loài Cymbidium Đến năm 2002, Been và cs đã tiến hành nghiên cứu trên 33

loài lan Hồ Điệp và chia chúng thành 8 nhóm dựa vào những đặc điểm hình thái của Sweet (1980)

2.2.2 Tình hình nghiên cứu lan ở Việt Nam

2.2.2.1 Tình hình nghiên cứu chung

Hoa lan đợc nhân dân ta biết đến từ lâu Trong th tích cổ còn lu lại từ đời Trần, Vua Trần Nhân Tông đã thu thập và lu giữ đợc vờn lan hơn 500 chậu chủ yếu

là lan Kiếm [19] Còn nghiên cứu khoa học một cách hệ thống về hoa lan Việt Nam, trớc hết phải kể đến nhà phân loại học ngời Pháp Lecompte từ 1932 nghiên cứu về phong lan ở Đông Dơng mà ông là ngời chủ biên Trong đó 2 tác giả F.Gagnepain

và A Gnitlaumin đã mô tả đợc 70 chi gồm 101 loài, trong cuốn thực vật Đông Dơng

chí “Flora Genera Indochine” xuất bản 1932-1934, lần đầu tiên ở Paris Sau đó là các tác giả Võ Văn Chi, Lê Khả Kế (1969), Phạm Hoàng Hộ (1974), Võ Văn Chi, Dơng Đức Tiến (1978), Trần Hợp (1990 – 1997), Nguyễn Tiến Bân (1990), Phan

Kế Lộc, Nguyễn Tiến Hiệp, Avernov (2000 – 2003) đã tiếp tục nghiên cứu và bổ sung, cho đến nay ở Việt Nam phát hiện đợc 897 loài thuộc 152 chi Trong đó có một số loài mới của Việt Nam và thế giới Một số loài trở thành quý hiếm không chỉ của Việt Nam mà còn cả cho thế giới nh Hài Hồng (Paphyopedilum delenatii Guill),

Thanh Ngọc (Cymbidium sp) đã đợc đa vào sách đỏ Việt Nam

Năm 1991, Phân viện Sinh học Đà Lạt đã tổ chức thu thập các loài lan rừng của Lâm Đồng Các loài lan đợc đa về trồng để theo dõi các đặc tính nông sinh học

và xây dựng bộ su tập lan nhằm bảo tồn nguồn gen, làm nguyên liệu ban đầu cho việc tuyển chọn và lai tạo những giống lan quý phục vụ cho nhu cầu tiêu dùng trong nớc và xuất khẩu Trong số 239 loài lan, trong đó 217 loài đã xác định tên khoa học bởi tiến sỹ L.V Averyanov và đợc ghi nhận 2 loài mới của Việt Nam là Liparis compressa và Thrixspermun leucarachne Ridl Có 7 loài cho đến nay cha đợc ghi

nhận có ở Lâm Đồng và 22 loài đặc hữu ở Việt Nam [1] Đến năm 1996 – 1997, Nguyễn Xuân Linh và cs – Viện Di Truyền Nông Nghiệp đã thu thập đợc 88 loài thuộc 34 chi, trong đó nhiều nhất là chi Cymbidium sp, sau đó là Dendrobium

Trong 88 loài có 30 loài có khả năng nở hoa ở Hà Nội Chúng đợc xem là nguồn gen quý cho công tác lai tạo giống sau này [11]

Bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào, trong thời gian ngắn có thể sản xuất một

số lợng lớn các cấy giống khoẻ, đồng đều và sạch bệnh Năm 1995, Đặng Phơng Trâm, Bùi Thị Nga đã nhân giống Phalaenopsis amabilis từ trụ phát hoa song kết

quả thu đợc còn hạn chế Năm 1999, Võ Thị Bạch Mai, Nguyễn Trần Đông Phơng

đã nghiên cứu khả năng tạo tiền củ của giống lan Hồ Điệp Dtps potuz Beauty-king Shiang Beaty x kow s valentine’ [13]

Những năm gần đây các nhà khoa học đã và đang nghiên cứu tập trung vào các lĩnh vực đánh giá, phân loại, cách thức nuôi trồng, phơng pháp phòng chống các loại bệnh hại của các loài lan Từ đó phát huy đợc tiềm năng nhân giống bằng phơng

pháp nuôi cấy mô tế bào, để bảo tồn phát triển đợc các loài lan quý hiếm, đồng thời tạo ra đợc nhiều giống mới có giá trị, giúp cho nguồn hoa lan ở nớc ta ngày càng trở nên phong phú Năm 2003 tác giả Nguyễn Quang Thạch đã nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống và nuôi trồng lan Hồ Điệp Vật liệu khởi đầu cho quá trình nhân giống vô tính lan Hồ Điệp là mắt ngủ, mô đỉnh ngọn của phát hoa Ngoài ra còn sử dụng phơng pháp gieo hạt để tạo nguồn vật liệu nhân giống, tuổi quả thích hợp để lấy hạt khoảng 120 ngày sau thụ phấn Sau 4 năm nghiên cứu tác giả đã xác

định đợc những khâu chính của quy trình nhân giống và nuôi trồng lan Hồ Điệp [20]

2.2.2.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền của lan ở Việt Nam

Cho đến nay ở Việt Nam vẫn cha có những nghiên cứu sâu về mặt di truyền phân tử của các loài hoa lan để lu giữ, khai thác và phát triển, phục vụ cho đa dạng hoá sản phẩm ở nớc ta, tạo công ăn việc làm và tăng thu nhập cho ngời dân Gần đây

đã có nhiều công trình nghiên cứu về hoa lan nh: đánh giá về một giống địa lan ở miền Bắc Việt Nam (Phạm Thị Liên 2001); Sổ tay ngời Hà Nội chơi lan (Trần Duy Quý và cs 2005); Các nghiên cứu về kĩ thuật nuôi trồng lan Hồ Điệp (Nguyễn Quang Thạch và cs 2003); Nghiên cứu đa dạng di truyền ở mức hình thái tập đoàn lan kiếm của Việt nam (Trần Duy Vơng, Khuất Hữu Trung và cs 2006), Nghiên cứu đa dạng di truyền tập đoàn lan Kiếm ở mức phân tử bằng kĩ thuật PCR - RAPD (Khuất Hữu Trung và cs 2007), Tuy nhiên, tất cả những nghiên cứu này mới chỉ…

đề cập đến một số đặc tính sinh học, phân bố, công thức gieo trồng, những kinh nghiệm nuôi trồng, chăm sóc trong dân gian chứ cha có những nghiên cứu sâu về

đặc tính di truyền, biến dị ở các mức độ khác nhau nh hình thái, tế bào học và đặc biệt là ở mức độ phân tử đối với những loài lan quí hiếm, nhất là những loài, chi thuộc chi Địa lan, lan Hồ Điệp (Phaleanopsis), Đai Trâu (Ryhnchostylis) đặc hữu

của Việt Nam (Trần Hợp, 1998)

2.3 nhân giống lan

2.3.1 Nhân giống bằng phơng pháp hữu tính

Sự thụ phấn:

Hồ Điệp cũng nh các loài hoa khác đều cần côn trùng, chim để giúp cho việc thụ phấn Vì vậy để hấp dẫn côn trùng, hoa của chúng thờng có màu sắc, mùi hơng ngọt ngào hay có hình dáng của côn trùng khác phái

Có hai cách thụ phấn:

Sự thụ phấn: Trong tự nhiên sự thụ phấn ở lan do côn trùng thực hiện Cấu

trúc hoa lan hoàn toàn thích ứng cho sự thụ phấn ấy Phấn hoa dính thành phần khối

để côn trùng có thể mang đi số lợng lớn phấn hoa trong một chuyến đi Ngoài ra con ngời cũng thụ phấn cho hoa nhằm mục đích lai tạo Mục đích của việc lai tạo nhằm tạo những cây hoa mang màu sắc đẹp hơn, cây có nhiều hoa và lâu tàn, cây khoẻ mạnh, kháng bệnh tốt …

Lai tạo: Lai là phơng pháp cơ bản của chọn giống, nó cho phép ta kết hợp với

chọn lọc để tạo ra giống mới mang đặc tính tốt của bố mẹ, có màu sắc độc đáo, hình dáng kích thớc phong phú Vì thế, phơng pháp lai tạo là vô cùng quan trọng để giải quyết định hớng những nhiệm vụ của nhà chọn giống [18], [50], [64]

Gieo hạt: Vì hạt lan quá nhỏ, không chứa chất dự trữ và chỉ có một phôi cha phân hóa nên không thể phát triển theo một phơng cách bình thờng đợc vì vậy mà việc làm cho hạt lan nảy mầm và phát triển thành cây lan trởng thành là vấn đề khó khăn vào lúc đầu của thời kì phát triển ngành lan Năm 1922, Knudson đã thành công khi gieo hạt lan vào môi trờng có thạch và đờng - gọi là phơng pháp không cộng sinh

2.3.2 Nhân giống vô tính bằng phơng pháp nuôi cấy mô tế bào

Cơ sở khoa học của biện pháp nhân giống vô tính bằng phơng pháp nuôi cấy mô tế bào

Tế bào đợc coi là đơn vị cấu trúc và chức năng của mọi cơ thể sinh vật Các tế bào thực vật có ‘tính toàn năng’, nghĩa là nó có khả năng sống và phát triển độc lập

để tái sinh thành các cây hoàn chỉnh Dựa trên cơ sở đó mà công nghệ nuôi cấy mô-

tế bào thực vật ra đời

Có hai đặc tính quan trọng của tế bào thực vật đợc coi là cơ sở lý thuyết cho

công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật.

1 Tính toàn năng của tế bào.

Năm 1952, Haberlandt đã đề xuất học thuyết tính toàn năng của tế bào: “Mỗi một tế bào của một cơ thể đa bào đều mang trong mình đầy đủ các thông tin di truyền để kiến tạo nên một cơ thể hoàn chỉnh Vì vậy khi đặt tế bào trong điều kiện thuật lợi, nó có thể phát triển thành một cơ thể” Ngày nay khoa học đã chứng minh

đợc sự đúng đắn của học thuyết ấy

2 Sự phân hoá và phản phân hoá.

Sau khi thụ tinh hình thành hợp tử, hợp tử phân chia đều đặn tạo phôi gồm các tế bào hoàn toàn giống nhau về hình dạng, chức năng Sau đó các tế bào này trải qua quá trình chuyên hóa tạo các tế bào có hình dạng, kích thớc (mô, cơ quan) và thực hiện các chức năng sinh lý khác nhau Đây chính là sự phân hoá của tế bào Ngợc lại, trong một số trờng hợp nhất định, từ một tế bào đã chuyên hoá lại trở thành tế bào phôi và những tế bào phôi này chỉ có khả năng phân chia mà mất đi khả năng thực hiện chức năng chuyên hoá Đó đợc gọi là quá trình phản phân hoá Ví dụ

từ những mô lá, thân, rễ trong môi trờng thích hợp chúng có thể hình thành mô sẹo

Sự phân hoá và phản phân hoá là con đờng thể hiện tính toàn năng của tế bào trong công nghệ nuôi cấy mô - tế bào thực vật Trong thực tế đấy chính là sự hoạt hoá và ức chế các gen ở ADN của tế bào Khi gen quy định một hoạt động nào đó của tế bào đợc hoạt hoá thì tế bào sẽ thể hiện chức năng đó và ngợc lại Việc đóng hay mở các gen đợc thực hiện bởi các tín hiệu môi trờng hay của chính tế bào Trong nuôi cấy mô - tế bào thực vật, việc đó đợc điều khiển bởi các tác nhân của môi trờng nuôi cấy mà đặc biệt là các chất điều hoà sinh trởng bổ sung và môi tr-ờng

Quy trình nhân giống vô tính bằng phơng pháp nuôi cấy mô tế bào:

gồm 5 giai đoạn

Giai đoạn 1 (Giai đoạn chuẩn bị mẫu)

Mục đích của giai đoạn này là tạo ra nguồn nguyên liệu thực vật vô trùng đa vào nuôi cấy in vitro Chọn lọc cẩn thận các cây mẹ: sạch bệnh và ở giai đoạn sinh trởng.

Giai đoạn 2 (Tái sinh mẫu nuôi cấy)

Là giai đoạn khử trùng đa mẫu vào nuôi cấy in vitro Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trởng tốt

Giai đoạn 3 (Giai đoạn nhân nhanh chồi)

Là giai đoạn kích thích các mô phát sinh hình thái và tăng nhanh số lợng thông qua con đờng: hoạt hóa chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính

Giai đoạn 4 (Giai đoạn hình thành rễ)

Khi chồi đạt đến kích thớc nhất định, các chồi đợc chuyển từ môi trờng nhân nhanh sang môi trờng tạo rễ Môi trờng tạo rễ thờng đợc bổ xung một lợng nhỏ các hợp chất auxin

Giai đoạn 5 (Đa cây ra vờn ơm)

Cây con ở giai đoạn 4, sau một thời gian nhất định khi cây có đủ rễ, thân, lá thì đa ra ngoài vờn ơm Đây là bớc cuối cùng của giai đoạn vi nhân giống

2.4 tình hình sản xuất và phát triển lan trên thế giới và ở việt nam

2.4.1 tình hình sản xuất và phát triển lan trên thế giới

Vào năm 1812, Loddiges là ngời đầu tiên trên thế giới thiết lập vờn lan thơng mại Trong những thập kỉ gần đây cùng phơng tiện giao thông phát triển mạnh mẽ, các thành tựu về công nghệ sinh học ứng dụng rộng rãi, việc xuất nhập khẩu hoa lan ngày càng tăng với quy mô lớn Những năm đầu thế kỉ 20, ngời Châu Âu đã biến cây hoa lan trong sản xuất và xuất khẩu trở thành thế mạnh của họ Hiện nay, nhiều nớc đã trở thành cờng quốc xuất khẩu hoa lan nh Thái lan, Đài Loan, Nhật, Hà Lan, Hoa lan đã và đang là nguồn lợi lớn của các nớc Đông Nam á và thế giới [5],

[39], [64] Theo số liệu năm 1984 của trung tâm phát triển xuất khẩu Liên Hợp Quốc, ớc tính hàng năm kim ngạch xuất khẩu đạt 1,8 tỷ USD Tổng giá trị sản lợng hoa trên thế giới năm 1995 đạt khoảng 20 tỉ USD thì hoa lan đạt 2 tỉ USD – chiếm 10% Đến năm 2001, giá trị sản xuất hoa trên thế giới tăng lên 45 tỉ USD Trong đó hoa lan là 7 tỉ USD – tăng lên 16 % Điều đó chứng tỏ rằng hoa lan ngày càng đợc các nớc trên thế giới a chuộng và càng ngày càng chiếm tỉ phần quan trọng trong sản xuất hoa của thế giới.

ở Trung Quốc, từ thập kỉ 80 đã bắt đầu nhập nội lan Hồ Điệp, đầu những năm 90 vẫn là giai đoạn nghiên cứu (Trung tâm nghiên cứu hoa – Viện KHNN Quảng Đông, Trung tâm KHNN Thẩm Quyến, Khoa Sinh học - Đại học Lan Châu), các cơ sở này đều lai tạo đợc một số giống lan bằng kĩ thuật gieo hạt in vitro và nhân vô tính Năm 2002, sản lợng hoa lan Hồ Điệp của Trung Quốc là 3 triệu cây, bao gồm 50-60 xí nghiệp có quy mô lớn, trong đó Quảng Đông có hơn 10 công ty sản xuất khoảng 1,2 triệu cây (40% sản lợng Trung Quốc) [21] Trung Quốc cũng là nớc sản xuất lan trồng chậu (hầu hết là Cymbidium) lớn nhất nhng tất cả đều đợc tiêu thụ

trong nớc

ở Singapore, nghề trồng hoa lan xuất khẩu trên quy mô lớn bắt đầu từ năm

1987 Năm 1992, giá trị xuất khẩu hoa lan đạt hơn 18 triệu USD, hiện nay Singapore chiếm 12% thị trờng kinh doanh phong lan trên thế giới [6] Chính phủ Singapore

đặt kế hoạch vào năm 2010 đạt 100 triệu USD xuất khẩu Mỗi năm ấn Độ sản xuất

đợc 10 triệu cây hoa lan mỗi năm Nhật Bản cũng đã đầu t 6,6 triệu USD cho Thái Lan để mở rộng cơ sở sản xuất với công suất 10 triệu cây hoa lan mỗi năm Hiện nay, Nhật là khách hàng lớn nhất của Singapore với khả năng tiêu thụ 60% số cây lan của nớc này

Hiện nay, sản xuất hoa trên thế giới đang phát triển mạnh mẽ và trở thành một nghành thơng mại cao Sản xuất hoa đã mang lại lợi ích to lớn cho nền kinh tế các nớc trồng hoa trên thế giới ở các nớc Châu á sản xuất hoa đang phát triển mạnh và cạnh tranh quyết liệt để chiếm lĩnh thị trờng hoa thế giới Riêng về xuất khẩu lan cắt cành trên thế giới những chủng loại đợc gọi là mặt hàng chính thì có tới

trên 95% có xuất xứ từ các vùng nhiệt đới Do vậy, từ năm 1967 các nớc Châu á nh: Thái Lan, Singapore, Indonesia đã phát triển nhanh sản xuất kinh doanh xuất khẩu hoa phong lan một cách mạnh mẽ Năm 2000, thơng mại xuất khẩu hoa lan đã vợt con số 150 triệu USD trong đó 128 triệu lan cành và chừng 23 triệu là lan cây Châu á thống trị hoa lan trên thế giới: Thái Lan là nớc xuất khẩu hoa lan lớn nhất thế giới với 2.240 ha đất sản xuất lan, giá trị xuất khẩu hàng năm đạt hàng chục triệu USD, năm 1991 đạt 30 triệu USD [16] Năm 2000, Thái Lan đã xuất khẩu 54 triệu USD lan cành và lan cây, xuất khẩu 50 triệu đô la lan cành và 4 triệu đô la lan cây, hầu hết xuất đi Nhật Bản [15]

Đối với lan cắt cành, Nhật Bản cũng là nớc nhập khẩu lan cành lớn nhất thế giới: 5,8 tỷ cành, trị giá 54 triệu USD đợc nhập Dù chỉ 23% lan mua ở Nhật là nhập khẩu nhng cũng đã chiếm đến 42% số lan mua bán trên thế giới Hơn 50% số lan nhập vào Nhật là từ Thái Lan, 19% từ Tân Tây Lan, 13% từ Singapore, phần còn lại

từ Đài Loan, Srilanca và các nơi khác ý là nớc đứng hàng thứ 2 về nhập khẩu lan cắt cành với 24 triệu USD, Pháp đứng thứ 3 với 14 triệu USD lan cắt cành đợc nhập, việc tiêu thụ lan đã gia tăng sau gần một thập niên bị coi là lỗi thời Đứng hàng thứ 4

là Đức với 11 triệu USD, theo sau là Mỹ 6,7 triệu USD, Anh quốc hạng 6 với 2,9 triệu USD, Hà Lan hạng 7 với 1,9 triệu USD, áo hạng 8 với 1,7 triệu USD, Bỉ 1,4 triệu, Hy Lạp 1,2 triệu – kể đến Bồ Đào Nha, Tây Ban Nha, Canada, Phần Lan,

Đan Mạch và Thuỵ Sỹ [15] ở Mỹ, tổng giá trị hoa lan mang lại cho Mỹ là 100 triệu USD trong năm 2000, trong đó khoảng 75% lan đợc bán ra thị trờng là

Phalaenopsis [44] Riêng tiểu bang Hawaii đã có số bán lan cắt cành trị giá 2,3 triệu

USD trong năm 2000 Việc mua bán lan cắt cành ở Mỹ đợc ớc lợng vào khoảng 9 triệu USD Nhật Bản, dân số ít hơn phân nửa Mỹ có giá mua bán lan là 230 triệu USD Nếu việc mua bán hoa lan cắt cành tại Mỹ gia tăng tơng xứng nh việc mua bán lan ở Nhật thì giá mua bán có lẽ tăng gấp 50 lần [15] Cần có một thời gian trớc khi

điều này xảy ra nhng hiện nay Hà Lan đang khiến cho các nhà trồng lan cắt cành và công chúng ở khắp nơi trên thế giới cảm thấy phấn khích

Đối với lan trồng chậu, Đài Loan là nớc xuất khẩu lan chậu lớn nhất thế giới

Đài Loan cũng đang tăng nhanh sản xuất lan Hồ Điệp và chọn tạo nhiều giống mới,

đợc cả thế giới ngỡng mộ Hồ Điệp của Đài Loan đợc tiêu thụ khắp toàn cầu, nguyên nhân chính dẫn đến sự thành công là do Đài Loan đã thành lập đợc một hệ thống tiên tiến hàng đầu thế giới trong việc lại tạo giống mới Đài Loan đã trở thành nơi sản xuất chủ yếu lan Hồ Điệp của thế giới Các nớc xuất khẩu lan cây theo thứ tự quan trọng là Thái Lan, Anh, ý, Nhật, Braxin, ấn Độ, Srilanka, Peru, Việt Nam, Singapore, Philippines, Madagascar và Trung Quốc ở Châu Âu Cymbidium, Phalaenopsis sản xuất nội địa đợc tiêu thụ hầu hết ở trong nớc Cây trồng trong

chậu đợc giá nhất là ở Hà Lan là Phalaenopsis với doanh số cao hơn cây sống đời

(Kalanchoe) đợc bán nhiều ở thập niên trớc Với lan trồng chậu, Mỹ là nớc nhập

khẩu lan cây lớn nhất thế giới với 18 triệu USD, gấp 3 lần lan cây nhập vào Châu

Âu Hơn 11 triệu USD lan cây nhập vào Mỹ là từ Đài Loan, nhiều nhất là

Phalaenopsis trồng chậu và đợc bán trong các siêu thị ở Mỹ

2.4.2 tình hình sản xuất và phát triển lan ở việt nam

Những năm gần đây, ngành trồng hoa lan ở nớc ta cũng đã và đang đợc mở rộng Theo nhiều kinh nghiệm nghiệm nghiên cứu cho thấy rừng Việt Nam có trữ l-ợng hoa lan lớn và tập trung nhiều loài lan quý hiếm mà nhiều nơi không có, cùng với đó là điều kiện khí hậu thuận lợi khiến cho ngành trồng lan ở nớc ta ngày càng phát triển mạnh mẽ, nhiều trang tại sản xuất hoa lan và nhiều phòng nghiên cứu về hoa lan đợc thành lập đa ngành trồng lan lên một tầm cao mới

Trong những năm 80, phong trào trồng hoa lan phát triển khá rầm rộ chủ yếu

ở thành phố Hồ Chí Minh, Đà Lạt, những vùng có khí hậu cũng nh điều kiện xã hội thuận lợi cho việc phát triển ngành sản xuất lan Mặc dù cha phải là cao so với các nớc khác nhng Việt Nam cũng đã xuất khẩu đợc một số sản phẩm lan cắt cành sang các nớc Đông Âu nh CHLB Nga, CH Séc thông qua Vegetexco Đà Lạt Cụ thể từ năm 1980 đến 1986 Việt Nam xuất đợc 336000 cành, từ năm 1989 đến 1990 mỗi năm 32000 cành [19]

Khoảng 10 năm trở lại đây, khi nền kinh tế phát triển mạnh mẽ, hoa lan bắt

đầu đợc nuôi trồng nhiều Nhiều loài lan mới có đợc màu sắc đẹp, đa dạng đã đợc ra

đời nhờ công nghệ lai giống Các giống lan lai tạo đang ngày càng phong phú đặc biệt là các giống lan Hồ Điệp, địa lan Kiếm Cùng với mức sống của ngời dân ngày càng cao thì nhu cầu tiêu thụ cũng nh thởng thức loài hoa vơng giả này ngày càng trở nên phổ biến Giá trung bình của một chậu địa lan Kiếm thông thờng là khoảng

100 nghìn đồng Tuy nhiên, có những giống lan quý đạt đến 4 - 5 triệu đồng 1 chậu nh: Thanh Ngọc, Thanh Trờng, Hoàng Điểm, Hoàng Vũ Đặc biệt đa số các loài…

địa lan Kiếm ở nớc ta thờng ra hoa vào dịp tết nguyên đán, đây là thời điểm mà nhu cầu tiêu thụ của loài hoa này rất lớn, vì thế vào thời điểm này Địa lan thờng có giá rất cao Diện tích trồng hoa cũng ngày một tăng, trồng lan đã trở thành con đờng làm giàu chắc chắn Đến nay, đã có nhiều trang trại sản xuất và kinh doanh hoa lan Trang trại RINSUN tại Gia Hiệp – Di Linh – Lâm Đồng đã đầu t trang thiết bị hiện đại có thể tự tạo ra nguồn cây giống để sản xuất Sản phẩm đặc biệt ở đây là lan

Hồ Điệp với 16-17 màu hoa khác nhau Trang trại đã đầu t hơn 10.000 m2 diện tích nuôi trồng hiện đại, cung cấp trung bình 400.000 chậu lan Hồ Điệp mỗi năm Ngoài tiêu thụ trong nớc, lan Hồ Điệp của trang trại còn xuất khẩu sang Mỹ, Nhật, và các nớc Châu Âu, Đông Nam á Mặc dù nớc ta có điều kiện khí hậu thuận lợi nhng giá trị xuất khẩu hoa lan còn rất khiêm tốn, từ năm 1998 - 2003 nớc ta xuất khẩu hoa lan chỉ đạt 90000 – 150000 USD/năm

Đối với thị trờng hoa trong nớc, sản lợng hoa phong lan cũng không đáp ứng nhu cầu ngời tiêu dùng Các cơ sở sản xuất hoa lan chỉ đáp ứng đợc 30-40% nhu cầu lan cắt cành, còn lại nhập từ các nớc khác Theo ông Đồng Văn Khiêm – GĐ Công

ty Phong lan Xuất khẩu Thành phố Đà Nẵng thì khó khăn lớn nhất là nhà nớc ta cha

có chính sách phát triển ngành lan, cha có một văn bản nào để khuyến khích, chính sách thuế không rõ ràng

Kế hoạch từ 2002 đến 2010 chính phủ Việt Nam đã đề ra chỉ tiêu xuất khẩu 1

tỷ bông hoa Theo đó, với vốn đầu t khoảng 5 triệu USD, diện tích trồng hoa của nớc

ta sẽ tăng từ 4000 ha lên đến 9000 ha, tơng đơng sản lợng 4,5 tỷ đô la Hoa của Việt Nam hoàn toàn có đủ tiêu chuẩn để xuất khẩu và nếu chúng ta có đủ giống tốt và

trồng đúng kỹ thuật thì xuất khẩu hoa sẽ lên tới con số 1 tỷ bông, doanh thu của hoa

sẽ đạt dự kiến 60 triệu USD Bộ NN và PTNN và Bộ KH – CN đợc giao phối hợp thực hiện phát triển các dự án có chất lợng và giá trị cao hơn các giống hoa hiện nay Theo kế hoạch này, các vùng trồng hoa tập trung sẽ là Hà Nội, TPHCM, Quảng Ninh, Thanh Hoá, Đà Lạt - Lâm Đồng Hoa hồng sẽ chiếm 30 % diện tích đ… ợc trồng, cúc 25 %, phong lan sẽ chiếm 10 % còn lại sẽ là các loài hoa khác [17] Để

có thể đạt chỉ tiêu này vào năm 2010 Việt Nam đã và đang tiến hành trồng đại trà hoa chất lợng cao Trớc đây một cành hoa hồng nhập ngoại có giá từ 5.000 - 7.000

đồng, trong khi nhân giống trong nớc chỉ phải chi 800 - 1.000 đồng Dự án "Phát triển giống hoa có chất lợng cao" của Viện Di truyền nông nghiệp - Bộ Nông nghiệp

và Phát triển nông thôn đang đa các loài hoa đẹp, sạch và không có mầm bệnh về các vờn hoa Việt Nam Dự án đang đợc thử nghiệm trên 5 loại hoa thế mạnh: Hồng, Cúc, Lan, Lay Ơn, Đồng tiền tại Viện Di truyền nông nghiệp (Từ Liêm - Hà Nội), trại thực nghiệm Văn Giang (Hng Yên) và trại giống hoa Sa Pa (Lào Cai) [17]

2.5 Vai trò của sinh học phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền

2.5.1 KháI Niệm về sinh học phân tử

Sinh học phân tử cung cấp nhiều kỹ thuật hiện đại để nghiên cứu và điều khiển sự sống Hoạt động của từng gen cũng nh sự phối hợp giữa các gen; kiểm soát

sự tái bản, sao chép và phiên dịch thông tin di truyền cũng nh sự phân bố của các protein trong tế bào; các phản ứng sinh học đảm bảo hoạt động của tế bào cũng nh

sự điều hoà hoạt động giữa các mô, tổ chức, đã đợc khám phá nhờ các kỹ thuật sinh học phân tử

Sinh học phân tử không chỉ làm rõ lên vai trò của axit nucleic mà còn cho phép triển khai các kỹ thuật để phân lập và nhân lên các gen in vitro Tất cả các chuyên ngành của sinh vật học có liên quan đến protein thì đều cần có sự hỗ trợ của các kỹ thuật sinh học phân tử Và nhờ sinh học phân tử mà các chuyên khoa đó có một tầm nhìn sâu sắc trong phân tích các vấn đề Tuy nhiên, sinh học phân tử không

có chỗ đứng riêng của nó, nó không thể giải đáp tất cả các câu hỏi về sự sống mà

đòi hỏi phải có sự hiểu biết về các chuyên ngành khác nh di truyền, sinh hoá, vi sinh, tế bào, [23].

2.5.2 ứng dụng của sinh học phân tử

Sinh học phân tử tuy mới ra đời nhng nó đã và đang đợc ứng dụng ngày càng nhiều vào các lĩnh vực khác nhau của đời sống xã hội: trong nghiên cứu cơ bản, trong y tế (xác định trình tự toàn bộ gen ngời, sinh học phân tử còn hớng đến giải quyết nhiều vấn đề lớn: bệnh ng th, sự phát triển phôi và biệt hoá mô), trong công nghiệp, nông nghiệp và ngày nay sinh học phân tử còn đóng góp vào một lĩnh vực mới đó là khoa học máy tính [2], [12], [23]

2.5.3 Một số kĩ thuật sinh học phân tử dùng trong nghiên cứu

đa dạng di truyền

2.5.3.1 Chỉ thị RFLP

Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism): Chỉ thị này đợc các nhà di truyền học lần đầu tiên giới thiệu trong nghiên cứu lập bản đồ các gen liên quan đến bệnh ở ngời [33] Các đa hình RFLP sinh ra bởi những đột biến tự nhiên ở những điểm cắt enzym giới hạn trong ADN bộ gen, ví dụ nh đảo đoạn, thêm

đoạn, mất đoạn, hoặc sự mất đi hay thêm vào của một hay nhiều nucleotit khác nhau tuỳ thuộc vào đặc điểm riêng biệt của mỗi giống, loài, thậm chí mỗi cá thể Mỗi một loài sinh vật có một bộ ADN genom đặc hiệu trong cấu trúc Vì vậy khi sử dụng những enzym giới hạn để cắt phân tử ADN của hệ gen, ngời ta có thể nhận biết đợc những đoạn ADN có chiều dài khác nhau bằng kĩ thuật lai ADN với những mẫu dò (probe) Đó là nguyên lý kĩ thuật đa hình chiều dài các mảnh phân cắt giới hạn RFLP ở thực vật, chỉ thị này lần đầu tiên đợc áp dụng trong nghiên cứu gen chịu trách nhiệm tổng hợp ARN ribosom trong vùng cấu trúc nhân của lúa mì (Appels và Dvorak, 1982) Từ đó, việc lập bản đồ di truyền sử dụng chỉ thị RFLP đã đợc ứng dụng đối với nhiều loại cây trồng khác nhau bao gồm cà chua (Bernatzky và Tanksley, 1986), ngô (Helentjaris và cs., 1986), cải bắp (Figdore và cs., 1985), khoai tây (Gebhardt và cs., 1989) Chỉ thị RFLP còn đợc sử dụng trong lập bản đồ

QTLs cho tính trạng chất lợng và năng suất lúa (Lin và cs., 1996), các gen kháng

đạo ôn (Hittalmani và cs., 1994), gen kháng rầy nâu (Murata và cs., 1998) v.v…

Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả các alen của cùng một locut gen Do vậy, có thể phân biệt đợc các cá thể đồng hợp tử (AA hoặc aa) và các cá thể dị hợp tử (Aa) Đây là đặc điểm u việt của loại chỉ thị RFLP Hạn chế của phơng pháp này là tiêu tốn nhiều thời gian và sức lực, đòi hỏi nhiều trang thiết bị phòng thí nghiệm Đặc biệt là tiêu hao một lợng lớn ADN mà số lợng đa hình thu đợc rất ít ỏi, thậm chí ở một số loài khó nhận đợc đa hình

2.5.3.2 Chỉ thị PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase chain reaction-PCR) đợc Kary Mullis

và cs phát minh năm 1985 Với một tiềm năng to lớn, phơng pháp này đã nhanh chóng đợc sử dụng hầu hết ở các phòng thí nghiệm trên toàn thế giới (Nair và cs., 1996) Nhờ vào việc phát hiện ra loại enzym chịu nhiệt đợc tách từ một loại vi khuẩn suối nớc nóng có tên là Thermus aquaticus hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 70-800C, ngời ta đã kết hợp với những tính chất cơ bản của ADN là có khả năng duỗi xoắn ở một nhiệt độ thích hợp, có khả năng kết cặp với những đoạn ADN có trình tự nucleotit bổ sung với đoạn ADN khuôn mẫu và có khả năng nhân đôi dới xúc tác của enzym đặc hiệu để nhân bội những đoạn ADN khuôn mẫu Sau đó là sự phát minh ra máy PCR để có thể dễ dàng thực hiện đợc những phản ứng nhân bội ADN Phản ứng PCR dựa trên nguyên tắc tổng hợp ADN nhờ enzym ADN Polymerase

chịu nhiệt (Taq, Pfu ) với sự có mặt của đoạn ADN khuôn mẫu, ADN mồi, các…nucleotit (dNTP) gồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP và ion Mg2+ hoạt động nh một chất xúc tác Tuỳ theo bản chất của những đoạn mồi sử dụng mà có những hệ thống chỉ thị đặc trng gồm chỉ thị RAPD, SSR, AFLP…

2.5.3.3 Chỉ thị STS (Sequence Tagged Sites)

Phơng pháp STS lần đầu tiên đợc nêu ra bởi M.Olson năm 1989 trong nghiên cứu lập bản đồ gen ở ngời ngay sau khi kĩ thuật PCR ra đời (Olson và cs., 1989) Loại chỉ thị này đợc đa ra nhờ việc xác định trình tự 2 đầu các đoạn mẫu dò RFLP, trên cơ sở đó ngời ra thiết kế mồi dùng cho phản ứng PCR

2.5.3.4 Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)

Loại chỉ thị này đợc sinh ra bởi phản ứng PCR, do sự nhân bội những đoạn ADN

hệ gen, sử dụng những đoạn mồi đơn lẻ, ngẫu nhiên (random primer) dài khoảng 10 nucleotit dới nhiệt độ kết cặp thấp (khoảng 370C) (Williams và cs., 1990) Sản phẩm của phản ứng đợc phân tách bằng điện di trên gel agarose, nhuộm trong ethidium bromide và quan sát dới đèn tím RAPD sinh ra những chỉ thị trội bởi sự có mặt hay vắng mặt những băng ADN đặc trng Vì vậy không phân biệt đợc thể dị hợp tử Đó

là hạn chế của loại chỉ thị này so với chỉ thị đồng trội RFLP Mặc dù vậy, chỉ thị này vẫn là một công cụ hữu hiệu trong việc lập bản đồ ở những dòng nhị bội, những dòng cận phối hay các quần thể lai trở lại Lợi thế của loại chỉ thị này là không cần biết những thông tin về trình tự (William và cs., 1993) Chỉ thị RAPD còn có thể sử dụng trong việc điền vào những chỗ trống trên bản đồ phân tử RFLP (Chang và Meyerowitz, 1991), lập bản đồ gen kháng đạo ôn ở lúa (Naqvi và cs., 1995) Chỉ…thị RAPD còn có một hạn chế nữa là độ nhạy của RAPD bị phụ thuộc vào điều kiện của phản ứng, đôi khi kết quả không lặp lại đợc, đặc biệt là ở những cơ thể có bộ gen lớn nh lúa mì

Để khắc phục hạn chế này, đôi khi ngời ta nhân dòng những băng RAPD đặc hiệu, xác định trình tự của chúng rồi thiết kế những đoạn mồi dài khoảng 20bp từ cả hai đầu và gọi là chỉ thị SCARs (sequence – Characterized Amplified Region)

2.5.3.5 Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Loại chỉ thị này đợc sử dụng rộng rãi trong những nghiên cứu lập bản đồ gen và xác định chỉ thị phân tử liên kết gen Kĩ thuật tạo ra các loại chỉ thị này đợc gọi là nhân bội chọn lọc những mảnh cắt giới hạn (Selective restriction Fragment Amplication = SRFA) Phơng pháp linh hoạt này có thể phát hiện đợc sự có mặt của những mảnh cắt giới hạn trong bất kỳ loại ADN nào [65] Nguyên lý của kĩ thuật SRFA dựa trên cơ sở nhân bội có chọn lọc những mảnh cắt giới hạn từ ADN hệ gen

Kĩ thuật này bao gồm ba bớc:

- Bớc 1: ADN hệ gen đợc cắt bằng hai loại enzym, một enzym cắt hiếm (a rare

cutter) ví dụ nh PstI hoặc EcoRI và một enzym cắt thờng (a frequent cutter) ví dụ

MseI, TaqI Kết quả là sinh ra những mảnh cắt có một đầu là trình tự cắt hiếm và

một đầu là trình tự cắt thờng Sau đó gắn bộ thích ứng (adapter) vào hai đầu mảnh cắt Các bộ thích ứng AFLP bao gồm hai phần: phần cốt lõi (core sequence) và chuỗi trình tự đặc hiệu của enzym Vị trí nhận biết của enzym giới hạn trên các bộ thích ứng đợc loại bỏ bằng cách thay đổi một gốc bazơ ở đầu 5’ Ví dụ vị trí nhận biết của enzym giới hạn EcoRI là 5’ –GAATTC-3’, nhng G trên bộ thích ứng đợc

thay bằng C, do vậy mà sau khi đã gắn bộ thích ứng vào mảnh ADN hệ gen thì vị trí này không thể bị cắt một lần nữa vì đã mất vị trí đặc hiệu Tơng tự nh vậy, vị trí nhận biết của enzym giới hạn MseI là 5’-TTAA-3” Nhng gốc T ở đầu 5’ trên bộ

thích ứng đợc thay bằng G Nhờ kĩ thuật này mà ADN hệ gen có thể đợc cắt và gắn

đồng thời Khi cắt ADN hệ gen bằng hai enzym EcoRI và MseI, sẽ có 3 loại mảnh

cắt gồm: mảnh có hai đầu cắt bởi MseI, mảnh có hai đầu cắt bởi EcoRI, mảnh cắt có

một đầu là EcoRI và một đầu là MseI.

- Bớc 2: Nhân bội những mảnh cắt giới hạn sử dụng mồi đặc hiệu bổ sung với

trình tự của bộ thích ứng và trình tự giới hạn của enzym Bớc này đợc thực hiện nhằm giảm bớt số lợng quá lớn của các mảnh ADN sau khi cắt và gắn bộ thích ứng

Sự nhận bội chọn lọc đạt đợc bởi sử dụng những mồi đợc kéo dài phía điểm cắt giới hạn bằng cách thêm các nucleotid vào vị trí cắt Do vậy mà chỉ có những mảnh ADN có trình tự bổ trợ với các bazơ thêm vào mới đợc nhân bội Phản ứng thứ nhất gọi là nhân bội sơ bộ (pre-amplification) hay tiền nhân bội Phản ứng thứ hai gọi là nhân bội chọn lọc (selective PCR) Các mồi AFLP gồm có ba phần: Chuỗi cốt lõi (CORE), chuỗi đặc hiệu enzym (ENZ) và phần thêm vào các nucleotit chọn lọc (EXT) Điều này đợc minh họa sau đây với 3 nucleotit thêm vào đợc biểu thị bằng N1N2N3:

Mồi EcoRI: 5’- GACTGCGTACC AATTC N1N2N3 -3’

Mồi MseI : 5’ – GATGAGTCCTGAG TAA N1N2N3 -3’

Các mồi AFLP cho các enzym cắt hiếm khác (ví dụ PstI) cũng tơng tự nh mồi EcoRI, và mồi TaqI cũng tơng tự mồi MseI, chỉ khác ở chỗ phần đặc hiệu ENZ là t-

ơng ứng với trình tự cắt của mỗi loại enzym

Sử dụng phơng pháp này có thể tạo ra một bộ tập hợp những mảnh cắt giới hạn nhờ PCR mà không cần biết trình tự của chúng, cho phép nhân đặc hiệu một số lợng lớn những mảnh cắt giới hạn Một bộ gồm tập hợp một số lợng lớn những mảnh cắt ADN có thể phân tích đồng thời, phụ thuộc vào độ phân giải của hệ thống phát hiện.

- Bớc 3: Điện di các sản phẩm của phản ứng PCR nhờ hệ thống chạy điện di trên

gel polyacrylamit Thờng là từ 50 – 100 mảnh cắt giới hạn đợc nhân lên và phát hiện trên gel polyacrylamit biến tính nhờ sử dụng đồng vị phóng xạ hoặc nhuộm bạc Kĩ thuật AFLP cung cấp một lợng vân tay ADN lý tởng từ ADN của bất kỳ nguồn gốc nào Đây là một kĩ thuật thiết thực và đáng tin cậy bởi sự nghiêm ngặt của điều kiện phản ứng

Tính hợp lý của việc sử dụng hai enzym cắt là ở chỗ:

1) Enzym cắt thờng sẽ sinh ra những đoạn ADN ngắn, nằm trong miền kích thớc

lý tởng cho việc nhân bội và phân tách trên gel polyacrylamit

2) Số lợng các mảnh ADN đợc nhân bội sẽ giảm xuống nhờ sử dụng enzym cắt thờng bởi vì chỉ có những mảnh cắt bởi một đầu là enzym cắt hiếm và một đầu là enzym cắt thờng mới đợc nhân lên

3) Việc đánh dấu một đầu của mồi ngăn cản sự xuất hiện băng kép

4) Sử dụng hai loại mồi sinh ra tính linh hoạt lớn trong việc điều chỉnh số lợng ADN nhân bội

5) Một lợng lớn đa hình khác nhau có thể đợc sinh ra khi nhân bội bằng những tổ hợp mồi khác nhau

Tính đặc hiệu của loại đa hình này còn thể hiện bởi trình tự đặc hiệu và số ợng của các nucleotit đợc thêm vào đầu 3’ của mỗi mồi Theo tính toán, cứ thêm một nucleotit vào mồi AFLP thì số lợng các chủng loại băng ADN nhân bội trong phản ứng PCR lại giảm xuống 4 lần vì trong số các mảnh ADN chỉ có một trong 4 nucleotit đợc chọn lọc và nhân bội Nh vậy là thêm 2 nucleotit vào đầu của mỗi mồi thì số lợng các chủng loại băng ADN giảm xuống 42 lần, nếu thêm vào 3 nucleotit thì số lợng băng giảm xuống 43 lần Việc thêm các nucleotit vào 2 đầu của các mồi AFLP dẫn đến kết quả là tạo ra những bộ phụ (subset) của bộ đa hình gốc Điều này

l-chỉ ra rằng việc cho thêm các nucleotit lực chọn là con đờng chính xác và có hiệu quả để lựa chọn một bộ đặc hiệu những mảnh cắt cho quá trình nhân bội Bằng tất cả những kĩ thuật đợc mô tả ở trên, kĩ thuật AFLP có thể tạo ra số lợng chỉ thị di truyền nhiều nhất so với các kĩ thuật khác đối với mỗi tổ hợp mồi Lợng ADN tổng số tiêu tốn cho kĩ thuật này lại rất ít Đây là một phơng pháp có hiệu quả cả trong nghiên cứu đa dạng di truyền, tìm chỉ thị liên kết và lập bản đồ gen Tuy nhiên, mặt hạn chế của AFLP là chỉ thị di truyền trội, không có khả năng phân biệt giữa thể đồng hợp tử

và dị hợp tử, giá thành cho nghiên cứu tơng đối cao

2.5.3.6 Chỉ thị SSR (Microsatellite hay Simple Sequence Repeates)

Chỉ thị vi vệ tinh, là những đoạn ADN lặp lại một cách có trật tự, gồm những

đơn vị lặp lại gồm từ 1 đến 6 nucleotit, theo kiểu lặp lại ngắn SSR đã đợc nghiên cứu lần đầu tiên trên ngời [45], [67] và cho đến nay nó đợc tìm thấy trong các hệ gen của một số cơ thể Eukaryot khác nh các gia cầm, động vật có vú [37], [52], [56], [62] cá và trên vài loài cây một lá mầm và hai lá mầm [56], [66] Bản chất đa hình của SSR có thể đợc sinh ra do sự nhân bội từ ADN tổng số của hệ gen nhờ sử dụng 2 đoạn mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại Giá trị của SSR

là ở chỗ nó sinh ra đa hình từ rất nhiều vùng tơng ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen và

có bản chất đồng trội, dễ dàng phát hiện bằng PCR Những chuỗi đa hình đơn giản này đã đợc ứng dụng trong việc lập bản đồ ở cả hai đối tợng động vật và thực vật [63] ở ngời, SSR đợc gọi là thế hệ thứ hai của các chỉ thị phân tử ở thực vật, tần số

và số lợng SSR đã đợc xác định trên các cây rừng nhiệt đới, cây bắp cải, lúa mì, và

34 giống cây trồng khác [56] Những kết quả nghiên cứu này đã chỉ ra rằng ở thực vật, SSR mang trình tự lặp lại (AT)n nhiều hơn so với ở động vật, trong khi ở những loài động vật thì lại giàu SSR kiểu (GT)n hơn Những nghiên cứu trên lúa, ngô và

Arabidopsis cũng cho kết quả tơng tự Nghiên cứu sàng lọc (screening) th viện

genome lúa cho thấy có khoảng 5.700-10.000 vi vệ tinh ở lúa [54]

3 VËt liÖu vµ ph¬ng ph¸p nghiªn cøu3.1 VËt liÖu

3.1.1 Thùc vËt

3 VËt liÖu vµ ph¬ng ph¸p nghiªn cøu

B¶ng 3.1 C¸c mÉu gièng lan Hå §iÖp nghiªn cøu

Stt gièng MÉu Tªn la tinh hiÖu KÝ Stt gièng MÉu Tªn la tinh hiÖu KÝ

3.1.2 Hóa chất

- Một số hóa chất thông dụng dùng trong nghiên cứu sinh học phân tử của các hãng Sigma, Pharmacia, Merck, nh Tris-bazơ, agarose, isopropanol, Etanol, chloroform, isoamylalcohol, CH3COONa, SDS, CTAB, NaCl, EDTA,

- Các hóa chất cho phản ứng PCR: bốn loại deoxynucleotit triphosphat (dNTPs) của Sigma, Taq-ADN polymeraza của Fermentas

- 26 mồi RAPD của hãng Operon Technologies và hãng Bioneer (bảng 3.2)

Bảng 3.2 Trình tự nucleotit của các primer đợc sử dụng trong các phản ứng

PCR-RAPD Stt Primer Trình tự nucleotit Stt Primer Trình tự

nucleotit

3.2 Phơng pháp nghiên cứu

3.2.1 Phơng pháp mô tả hình thái

- Xác định nguồn gốc và đánh dấu phân biệt nguồn gốc của từng loài từ đó

tiến hành theo dõi quan sát

- Phương pháp mô tả hình thái (theo phương pháp mô tả chi tiết các đặc

điểm hình thái của Pellegrino G., v cs 2005): Sà ử dụng kính hiển vi chuyên dụng hoặc mắt thường quan sát, từ đó mô tả hình thái, m u sà ắc của lá, hoa; dùng thước

đo chiều d i, chià ều rộng của lá, cánh hoa, c nh hoa; thà ống kê, so sánh số lượng hoa trên một c nh, theo dõi thà ời điểm ra hoa v à độ bền hoa của từng mẫu giống

3.2.2 Phơng pháp tách chiết ADN

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn phơng pháp có sử dụng CTAB của P Obara-Okeyo & Kako (1998) có một số cải tiến nhỏ để tiến hành tách chiết ADN tổng số từ 31 mẫu Hồ Điệp nghiên cứu

Quy trình:

1 Chuẩn bị sẵn dung dịch đệm chiết CTAB ở 600C

2 Nghiền 0.3 gam mẫu lá bằng chày cối sứ vô trùng trong nitơ lỏng đến khi thành dạng bột mịn (mẫu lan, chày, cối đợc giữ trớc ở - 800C)

3 Hoà tan mẫu đã nghiền nhỏ trong 800àl CTAB buffer và 60àl SDS 10% Thành phần dung dịch đệm chiết: Tris-bazơ 100 mM, EDTA 20 mM, NaCl 1,4M ; CTAB 2%, PVP 2%

4 ủ mẫu ở 650C trong bể ổn nhiệt, thời gian 60 phút

5 Bổ sung hỗn hợp CHCl3-IsoA (24:1) với tỷ lệ 1:1 về thể tích so với dịch mẫu Lắc nhẹ cho tới khi thành dạng nhũ sữa Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng Hút dung dịch phía trên chuyển sang ống mới

6 Tiếp tục chiết lần 2 bằng hỗn hợp CHCl3-IsoA (24:1) Thu đợc dịch chiết chứa ADN

7 Tủa ADN bằng ethanol đã làm lạnh Để ở -200C trong 1 giờ

8 Ly tâm thu tủa 14000 vòng/phút trong 15 phút ở 40C

9 Rửa tủa bằng etanol 70%, ly tâm thu tủa, làm khô và hoà tan trong đệm TE

10 Loại ARN : bổ sung RNaza vào mẫu ADN và ủ ở 370C trong 1 giờ

Các bớc tiếp theo tơng tự các bớc 5 - 9

3.2.3 Phơng pháp nhân gen bằng kỹ thuật PCR

Muốn khuếch đại một đoạn gen nào đó bằng kỹ thuật PCR cần phải thiết lập một phản ứng gồm: ADN khuôn, dNTPs đã đợc hoạt hoá, enzym Taq- polymeraza chịu nhiệt, mồi Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng PCR với các đoạn mồi ngẫu nhiên đợc gọi là PCR-RAPD Thành phần của hỗn hợp phản ứng PCR-RAPD bao gồm:

+ Đệm 10X: 1,5 àl+ MgCl2 25mM: 1,0 àl+ dNTPs 10mM: 0.6 àl+ Mồi RAPD: 1.5 àl+ ADN khuôn: 1,0 àl+ Taq-polymeraza: 0,2 àl+ H2O: 9,2 àl

Tổng: 15 àl

Phản ứng PCR đợc thực hiện qua nhiều chu kì, mỗi chu kì gồm 3 giai đoạn:+ Giai đoạn biến tính: thực hiện biến tính ở nhiệt độ 950C trong thời gian 1 phút ở giai đoạn biến tính đầu tiên là 950C trong thời gian 6 phút; giai đoạn này có thể khác nhau tuỳ từng loại ADN khuôn

+ Giai đoạn gắn mồi: Đối với mồi RAPD đợc thực hiện ở nhiệt độ 350C Các

đoạn mồi sẽ bắt cặp với ADN khuôn mạch đơn ở các vị trí bổ sung

+ Giai đoạn kéo dài chuỗi: thực hiện ở nhiệt độ 720C trong thời gian 2 phút

30 giây đối với phản ứng PCR-RAPD vì đây là nhiệt độ tối u cho sự hoạt động của enzym Taq-polymeraza Dới sự xúc tác của enzym này những đoạn mồi đã bắt cặp với ADN khuôn sẽ đợc kéo dài về phía 5’ của sợi dùng làm khuôn

Tóm tắt chu trình nhiệt :

- Tra mẫu: Sản phẩm PCR đợc trộn với 2àl đệm mẫu và tra vào các giếng trên gel.

- Chạy điện di: Sau khi tra mẫu điện di xong, máy điện di đợc kết nối với

bộ nguồn Đặt 50V, 90mA

- Quan sát: gel đợc soi dới đèn tử ngoại, ADN sẽ đợc phát sáng nhờ liên kết với EtBr

- Chụp ảnh

3.2.5 Phơng pháp LAI TạO HOA LAN

1 Chọn lọc những cây bố mẹ khoẻ mạnh, không sâu bệnh

2 Khi cây ra hoa, thực hiện phơng pháp thụ phấn nhân tạo: lấy hạt phấn từ cây

bố để thụ phấn cho cây mẹ và ngợc lại vào thời điểm cây nở hoa đợc 1/3 số

nụ trên cành Cho thụ phấn hoa thứ 2 hoặc thứ 3 trên cành tính từ hoa đầu tiên

3 Khi quả chín (thờng 4 tháng sau khi thụ phấn), chọn thời điểm thu hoạch tốt nhất trớc khi quả chín nứt tự nhiên Xử lý vỏ và tiến hành gieo trong điều kiện vô trùng trên môi trờng Vacxin & Went.

4 Thông thờng trong 1 quả lan, nếu gieo thành công, sẽ thu đợc hàng trăm ngàn cây con Do đó, khi hạt nảy mầm và hình thành thân lá phải tiến hành tách dần bằng phơng pháp cấy chuyển 2 tháng/lần

5 Khi cây đã phát triển ổn định thân lá và có bộ rễ hoàn chỉnh, đa cây ra khỏi ống nghiệm, tiếp tục nuôi trong điều kiện phòng thí nghiệm và chọn lọc cây

ở năm thứ 2 và cây chuẩn bị ra hoa

Trong đó:

3.3 Địa điểm nghiên cứu

2nij

Jij =

ni + nj

- Các chỉ tiêu đo đếm thực hiện tại vờn lan, Viện Di truyền nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

- Các thí nghiệm nghiên cứu đợc thực hiện tại Phòng Kĩ thuật di truyền, Viện

Di truyền nông nghiệp, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam

4 Kết quả và thảo luận4.1 Kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền ở mức hình thái

4.1.1 kết quả điều tra thu thập tập đoàn lan Hồ Điệp ở Việt Nam

Việt Nam là nớc có khí hậu gió mùa nóng ẩm, điều kiện tự nhiên với nhiều vùng sinh thái khác nhau cho nên từ Nam chí Bắc, từ đồng bằng đến tận cao nguyên,

có rất nhiều giống hoa lan quý hiếm đợc thế giới công nhận Để đánh giá nguồn tài nguyên hoa lan nói chung và hoa lan Hồ Điệp nói riêng chúng tôi đã tiến hành điều tra, thu thập đợc 31 mẫu giống lan Hồ Điệp bao gồm 13 mẫu giống Hồ Điệp tự nhiên (Hồ Điệp dại) ở các vùng sinh thái khác nhau trong nớc, 7 mẫu giống Hồ Điệp thu thập ở Hà Nội và 12 giống Hồ Điệp nhập nội Kết quả thu thập các mẫu giống hoa Hồ Điệp đợc trình bày ở bảng 4.1 Qua bảng 4.1 cho thấy, các mẫu giống lan

Hồ Điệp có phân bố ở nhiều vùng sinh thái khác nhau, trong số 12 mẫu giống lan

Hồ Điệp dại (từ HD1-HD12) chủ yếu thu thập tại các tỉnh có vùng núi cao của Việt Nam nh: Vĩnh Phúc, Thái Nguyên, Lào Cai, Đà Lạt, Hòa Bình 7 mẫu giống từ HD20 đến HD26 đợc nuôi trồng lu truyền lâu năm tại Hà Nội cha rõ nguồn gốc, các mẫu giống từ HD13 đến HD19 đợc nhập nội từ Đài Loan và 5 mẫu giống từ HD27

đến HD31 đợc nhập nội từ Hà Lan

Bảng 4.1: Kết quả điều tra, thu thập các mẫu giống lan Hồ Điệp