Nghiên cứu, xác định cây ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ bằng kĩ thuật PCR và đánh giá di truyền

Tuy nhiên, để đa nhanh các cây chuyểngen vào sản xuất tại Việt Nam thì việc nghiên cứu tạo cây chuyển gen, trồng thửnghiệm và kiểm soát cây trồng biến đổi gen cần phải tiến hành trớc một

Mở đầu

Đầu những năm 80 thế kỷ XX xuất hiện những công bố đầu tiên về câychuyển gen và từ đó mở ra một ra chân trời mới, chứa đựng một tơng lai đầy hứahẹn về cải tiến cây trồng Nhiều giống cây trồng đã đợc chuyển gen để tạo ra các

đặc tính u việt, giúp cải thiện năng suất, chống chịu sâu bệnh, hạn, mặn, lạnh,tăng chất lợng và cải thiện môi trờng Từ đó kỹ thuật gen trở thành công cụ hữuhiệu đợc ứng dụng trong cải tiến giống cây trồng

Sự phát triển nhanh chóng của Công nghệ Sinh học đã đa các thực vậtchuyển gen và các sản phẩm của chúng đến với thị trờng tiêu dùng Và kể từ khi

kỹ thuật gen thực vật đợc thiết lập, thử nghiệm thành công thì những ứng dụngcủa nó đã đợc đầu t và đợc tiến hành một cách rộng rãi để giải quyết các vấn đềcòn tồn tại của Nông nghiệp Vì vậy thực vật chuyển gen đã đợc trồng phổ biếntrên đồng ruộng để làm tăng tính kháng bệnh, kháng sâu, kháng thuốc trừ cỏtrong hệ thống canh tác Từ cuối năm 1997, các cây trồng biến đổi gen và các sảnphẩm của chúng đã đợc chấp nhận thơng mại hoá ở một số quốc gia Ngày nayviệc sản xuất và sử dụng cây trồng chuyển gen đang ngày một gia tăng, và khẳng

định tầm quan trọng trong nền sản xuất nông nghiệp và một số nghành khác.Năm 2007 diện tích trồng tiếp tục tăng 2 con số, đạt 12% tơng đơng với 12,3triệu hecta (30 triệu mẫu Trong đó tổng diện tích trồng trong 12 năm (1996-2007) đạt 690 triệu héc-ta (1,7 tỷ mẫu) Với mức tăng cha từng thấy gấp 67 lần từ1996-2007, trở thành công nghệ cây trồng đợc áp dụng nhanh nhất trong thờigian gần đây

Ngày nay, cây chuyển gen đợc trồng ngày càng rộng rãi ở rất nhiều nớctrên thế giới Nhng câu hỏi về sự an toàn trong việc sử dụng các sản phẩm củacây chuyển gen cũng đồng thời đợc đặt ra và trở thành một vấn đề nóng bỏng vớihàng loạt các vấn đề liên quan xoay quanh nó, liệu chúng đợc sử dụng dới dạngnào và khả năng rủi ro đến với sức khoẻ con ngời, với sự đa dạng sinh học, tiềm

ẩn ô nhiễm môi trờng ở Việt Nam, đến nay vẫn đang trong thời gian xây dựng

và hoàn thiện các quy chế về quản lý an toàn sinh học các cây chuyển gen vàkiểm soát các sản phẩm biến đổi gen Tuy nhiên, để đa nhanh các cây chuyểngen vào sản xuất tại Việt Nam thì việc nghiên cứu tạo cây chuyển gen, trồng thửnghiệm và kiểm soát cây trồng biến đổi gen cần phải tiến hành trớc một bớc.Trong số các cây trồng biến đổi gen đang thử nghiệm thì cây ngô đang rất đợcquan tâm nhất đặc biệt là ngô chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ

Để đáp ứng các chỉ tiêu kỹ thuật trong việc phát hiện chính xác ngôchuyển gen kháng thuốc trừ cỏ và nhanh chóng sử dụng các dòng ngô này phục

vụ công tác tạo giống ngô lai kháng thuốc diệt cỏ của Việt Nam Chúng tôi đã

thực hiện đề tài “Nghiên cứu, xác định cây ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ bằng kĩ thuật PCR và đánh giá đa dạng di truyền tập đoàn ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ”

Mục đích của đề tài:

–Thu thập dữ liệu về cây trồng biến đổi gen và tìm hiểu một cách tổng quan

về cây ngô chuyển gen

–Bớc đầu làm quen với các kỹ thuật nghiên cứu về cây chuyển gen

–Xác định đoạn trình tự đặc trng của promoter CaMV-35S (195bp) có trongngô chuyển gen

–Xác định gen PAT (Phosphinothricin-N-Acetyltransferase) là gen khángthuốc trừ cỏ glufosinate có trong ngô chuyển gen bằng kỹ thuật PCR

–Đánh giá đặc điểm hình thái, chỉ tiêu nông sinh học chính và đa dạng ditruyền ở mức phân tử bằng kĩ thuật PCR-RAPD của một số dòng ngô thuần manggen kháng thuốc trừ cỏ phục vụ cho công tác backcross tạo dòng ngô u việt mang

gen gen kháng thuốc trừ cỏ

Phần I: Tổng QUAN Tài Liệu 1.1 Giới thiệu về cây ngô

đối với loại Zea.

Nhóm Euchleana

Z penrennis (Hitch) Reeves & Mangelsdorf

Z mexicana (Schrader) Kuntze

Nòi Guatemala

Nhóm Luxuriantes

Z diploperennis Iltis Doebly & Guzman

Z perennis Hitch Reeves & Mangelsdorf

Nhóm Zea

Nòi Chalco Nòi Cao nguyên trung phần Nòi Nobogame

Z mays subsp mays

Từ loài Zea mays L, dựa vào cấu trúc nội nhũ của hạt đợc phân thành các loài phụ, sau đó dựa vào màu hạt và màu lõi để phân các thứ (varieta) Những

loài phụ chính bao gồm:

Zea mays Subsp indurata - ngô đá

Zea mays Subsp indentata - ngô răng ngựa

Zea mays Subsp ceratina - ngô nếp

Zea mays Subsp saccharata - ngô nếp

Zea mays Subsp everta - ngô bột

Zea mays Subsp amylacea - ngô bột

Zea mays Subsp tunecata - ngô bọcNgô có nguồn gốc từ Trung Mỹ song cây ngô đã thích nghi nhanh vớinhững điều kiện sinh thái rất khác nhau ở Bắc bán cầu, ngô có thể trồng ở ĐanMạch đến vĩ tuyến 55o-56o, còn ở Liên Xô cũ và Canada tới vỹ tuyến 58o ở Nambán cầu, ngô đợc trồng ở New Zealand đến vĩ tuyến 42o-43o (Humlam John,

1942, Necula GH và cs, 1957) Ngô cũng là cây trồng thích ứng rộng TheoNecula G H (1957) ngô có thể trồng ở độ cao 3900m Tuy nhiên càng xa khỏixích đạo thì độ cao càng giảm Ví dụ nh Peru (16o nam) ngô trồng đợc ở độ cao3900m, ở Bắc Carolia (34o-37o bắc) trồng đợc ở 1200m, ở Châu á nh thung lũngKasmir ở 2000m, còn ở Châu Âu (khoảng 45o-48o bắc) ở độ cao 500-800m [10]

Trên phạm vi thế giới, các nhà khoa học đã chia sinh thái cây ngô thành 4vùng chính:

– Ôn đới

– Cận nhiệt đới

– Nhiệt đới cao (trên độ cao 2000m so với mặt biển)

– Nhiệt đới thấp (dới 2000m)

Theo phân loại này, Việt Nam nằm trong vùng sinh thái nhiệt đới thấp.Các bộ giống từ vùng nhiệt đới thấp biểu hiện sự thích ứng hơn cả thông qua khả

năng chống chịu và năng suất, kể cả ở các thảo nguyên cao phía Bắc hoặc vụ

đông ở Đồng bằng Bắc Bộ

1.1.2 Nguồn gen và đa dạng di truyền cây ngô

Ngô là cây trồng đợc thu thập, mô tả và bảo tồn rất tốt từ các trung tâm đadạng di truyền Từ năm 1943, quỹ Rockefeller hợp tác với các nớc Mỹ La tinh đãthu thập nguồn gen ngô từ những trung tâm đa dạng chính, tạo cơ sở cho các tập

đoàn ngô ở Mexico, Colombia và Brazil Ngày nay có khoảng 15.000 mẫu giốngngô đã đợc thu thập từ các nớc khác nhau trên thế giới

ở Việt Nam, nguồn gen ngô đợc bảo tồn tại Viện nghiên cứu ngô vớikhoảng 400 mẫu giống thụ phấn tự do và 3.000 dòng [10]

Tập đoàn ngô Mexico – trung tâm xuất của ngô có sự đa dạng tối đa ở

đây có bốn nòi chính đợc xác lập đó là:

A Nhóm nòi bản địa cổ đại: Ngời ta cho rằng nhóm này xuất phát từ ngô

bọc nguyên thuỷ ở Mexico Các nòi ở nhóm này khác nhau bởi sự phát triển độclập ở những địa bàn và môi trờng khác nhau tuy chúng cùng một tổ tiên Bốn nòi

chính trong nhóm này là Palomero toluqueno, Arrocillo amarillo, Chapalote và Nal-tel

B Nhóm nhập nội tiền Columbus: Các nòi của nhóm này đợc nhập vào Mexico từ Trung và Nam Mỹ vào thời tiền sử Bốn nòi này là: Cacahuacintle, Harinoso de Ocho, Oloton và ngô ngọt.

C Nhóm con lai tiền sử: Nhóm này bao gồm các nòi đợc coi là tạo ra từ việc lai tạp giữa các nòi bản địa cổ đại với các nòi nhập nội tiền Columbus, hoặc giữa hai nhóm trên với Teosinte Hiện nay còn tám nòi là: Conico, Reventador, Tablonicillo, Tehua, Tepecintla, Comiteco, Jala và Zapalote chico.

D Nhóm hiện đại: Bao gồm các nòi phát triển gần đây và cha đạt đến

trạng thái ổn định, tuy nhiên có những đặc điểm phân biệt xác định Có bốn nòi

đợc gọi là: Chalqueno, Celaya, Conico Norteno và Bolita.

Từ đây ta thấy rõ sự biến dị to lớn đã đợc xảy ra nh thế nào Đó là nhữngnòi giống cơ bản sản sinh ra nguồn gen ngô thế giới và sự đa dạng di truyền củanó

Sự đa dạng di truyền của ngô đợc thể hiện ở tất cả các tính trạng của câybông cờ và bắp ở các đặc điểm của cây, sự biến động thể hiện ở chiều cao cây,chiều cao đóng bắp và đặc điểm của lá (dài lá, chiều rộng lá, số lá trên cây, số látrên bắp), màu thân và dạng lóng Sự biến động ở cờ thể hiện ở độ dài bông cờ,

cuống bông cờ, độ nhánh dài, số nhánh cấp hai và ba, đờng kính bắp và số hànghạt Đặc biệt sự biến động rất đa dạng ở nội nhũ hạt, từ đây ta phân biệt các dạngrăng ngựa, đá rắn, bột, đờng, nếp, nổ và bọc Sự biến động còn thể hiện ở kích th-

ớc hạt, màu hạt và chất lợng hạt

ở Việt Nam ngô là cây trồng nhập nội do vậy sự phong phú về nguồn gen

có hạn hẹp Theo các nghiên cứu phân loại ngô địa phơng Việt Nam (GS.TS NgôHữu Tình, 1995) từ những năm 60 đến nay cho thấy, ngô Việt Nam tập trung chủyếu vào hai loài phụ là đá rắn và nếp

Ngày nay để đánh giá sự đa dạng di truyền của một loài, ngời ta không chỉdựa vào các đặc điểm thực vật học dễ nhận biết và riêng rẽ mà cần phân tích trêncơ sở nhiều tính trạng để phân biệt các nhóm cách biệt di truyền thông quakhoảng cách Ơclit hoặc khoảng cách Mahalanobis Gần đây công nghệ sinh học

đã góp phần rất đắc lực trong việc xác định đa dạng di truyền thông qua kỹ thuậtIsozyme hoặc “sự đa hình độ dài các phân đoạn cắt hạn chế” (RFLP –Restriction Flagment Length Polymorphis), RAPD (Đa hình các đoạn khuếch đạingẫu nhiên)…

1.1.3 Đặc điểm hình thái cây ngô

 Rễ: Ngô có hệ rễ chùm tiêu biểu cho bộ rễ các cây họ hòa thảo Ngô có ba

loại rễ chính:

Rễ mầm: Gồm rễ mầm sơ sinh (rễ phôi) và rễ thứ sinh, hai loại rễ mầm này

tạo thành hệ rễ tạm thời cung cấp nớc và các chất dinh dỡng cho cây ngô khoảngthời gian 2-3 tuần Sau đó vai trò này nhờng lại cho hệ rễ đốt

Rễ đốt (rễ phụ cố định): Xuất hiện ở các đốt thấp của thân, mọc vòng

quanh các đốt dới mặt đất Ngô ra rễ đốt đầu tiên lúc 3-4 lá và có số lợng lớn từ8-16 rễ ở mỗi đốt Ban đầu rễ đốt có chiều hớng ăn ngang sau đó ăn sâu xuống

đất Rễ đốt giúp cây ngô hút nớc và các chất dinh dỡng suất đời cây ngô

Rễ chân kiềng: Rễ chân kiềng mọc xung quanh các đốt gốc sát mặt đất Rễ

chân kiềng to, nhẵn, ít phân nhánh, không có rễ con và lông hút ở phần trên mặt

đất Rễ này giúp cây chống đỡ và bám chặt vào đất, chúng cũng tham gia hút nớc

và thức ăn

 Thân, lá: Ngô thuộc họ hòa thảo, song có thân khá chắc, có đờng kính từ

2-4cm tùy thuộc vào giống, điều kiện sinh thái và chăm sóc Thân có chiều caokhoảng 1,5-4m Thân chính của cây ngô có nguồn gốc từ chồi mầm (plumule),bao phủ bởi bao lá mầm (coleotyl) nằm trong phôi của hạt ngô Từ thân chính

phát sinh ra nhánh hay thân phụ từ các đốt dới đất Số nhánh thờng biến động từ1-10 Nhánh có hình dạng tơng tự nh thân chính.

Thân ngô trởng thành bao gồm nhiều lóng (dóng) nằm giữa các đốt và kếtthúc bằng bông cờ Số lóng và chiều dài lóng là chỉ tiêu quan trọng trong việcphân loại các giống ngô Lóng mang bắp có một rãnh dọc cho phép bắp bám vàphát triển bình thờng

Sau khi bao lá mầm mọc lên khỏi mặt đất, các lá bắt đầu lần lợt mở ra.Mỗi lá đợc cấu tạo bởi bản lá (phiến lá), bẹ lá ôm chặt lấy thân và lỡi lá (thìa lìa).Lá của các giống khác nhau thay đổi về số, về chiều dài, chiều rộng, độ dày, lôngtơ, màu lá, góc lá và thân lá Số lá là một đặc điểm khá ổn định có quan hệ chặtchẽ với số đốt và thời gian sinh trởng Để tính số lá của ngô ở một giai đoạn nào

đó ta chỉ đếm số lá đã có bẹ lá nhìn thấy đợc bằng mắt

 Bông cờ và bắp: Ngô là loại cây có hoa khác tính cùng gốc Hai cơ quan

sinh sản đực (bông cờ) và cái (bắp) tuy cùng nằm trên một cây, song ở các vị tríkhác nhau

Hoa đực: Hoa đực thờng đợc gọi là bông cờ nằm ở đỉnh cây Hoa đực xếp

thành chùm gồm các trục chính và nhiều nhánh, hoa đực đợc mọc thành bôngnhỏ còn gọi là bông chét, bông con hoặc gié Trong mỗi bông nhỏ có hai hoa,một hoa cuống dài và một hoa cuống ngắn Bao quanh các bộ phận của một hoa

có hai mày nhỏ – mày ngoài tơng ứng với lá bắc hoa và mày trong tơng ứng vớilá đài hoa Khi hoa chín các mày phồng lên, các chỉ nhị dài ra, bao phấn tách rakhỏi hoa và tung ra các phấn hình trứng có đờng kính khoảng 0,1 mm Mỗi bôngnhỏ có hai hoa, mỗi hoa có 3 nhị đực, mỗi hị đực có một bao phấn, mỗi bao phấn

có 2 ô và trong mỗi ô chứa khoảng 1000-2500 hạt phấn Mỗi bông cờ có từ

700-1400 hoa Nh vậy tổng cộng mỗi bông cờ cho 10-30 triệu hạt phấn Khi bắt đầu

nở, các hoa ở 1/3 phía đỉnh trục chính tung phấn trớc, sau đó tung phấn theo thứ

tự từ trên xuống dới và từ ngoài vào trong

Hoa cái: Hoa tự cái (bắp ngô) phát sinh từ chồi nách các lá, song chỉ 1-3

chồi khoảng giữa thân mới tạo thành bắp Hoa có cuống gồm nhiều đốt ngắn,mỗi đốt trên cuống có một lá bi bao bọc Lá bi thờng không có phiến lá Trêntrục chính hoa cái (cùi, lõi ngô), hoa mọc từng đôi bông nhỏ Mỗi bông nhỏ cóhai hoa, nhng một hoa thoái hóa, chỉ còn một hoa tạo thành hạt Phía ngoài hoa

có hai mày là mày ngoài và mày trong Ngay sau mày ngoài quan sát thấy dấu

vết của nhị đực và hoa cái thứ hai thoái hóa, chính giữa là bầu hoa, trên bầu hoa

có núm và vòi nhụy vơn dài và thành dâu

 Hạt: Hạt ngô thuộc loại quả dính gồm năm phần chính: vỏ hạt, lớp alơron,

phôi, nội nhũ và chân hạt Vỏ hạt bao quanh hạt, là một màng nhẵn Lớp alơronnằm dới vỏ hạt, bao lấy nội nhũ và phôi Nội nhũ là phần chính của hạt chứa các

tế bào dự trữ chất dinh dỡng Nội nhũ có hai phần: nội nhũ bột và nội nhũ sừng

Tỷ lệ này phục thuộc vào chủng ngô và các giống ngô khác nhau

1.1.4 Tình hình và định hớng phát triển cây ngô ở Việt Nam

ở Việt Nam, ngô là cây lơng thực quan trọng thứ hai sau cây lúa, có sựphát triển rộng khắp, liên tục và đạt đỉnh điểm vào năm 2005 Theo “tổng quannông nghiệp năm 2005” của Nguyễn Sinh Cúc (NN và PTNT – 1/2006) thì sảnxuất ngô năm 2005 có tiến bộ vợt bậc: Diện tích đạt 1039 nghìn ha, năng suất đạt35,5 tạ/ha và sản lợng đạt 3,69 triệu tấn, đã làm thay đổi tỷ trọng cơ cấu sản lợngthực từ 5,7% năm 2000 lên 9% năm 2005 [1]

Những tiến bộ về sản xuất ngô Việt nam thể hiện rất rõ nét trong giai đoạn

20 năm thực hiện đờng lối đổi mới của Đảng Trong suất 20 năm qua 2004) diện tích, năng suất và sản lợng ngô Việt Nam tăng liên tục với tốc độ rấtcao Tỷ lệ tăng trởng bình quân hàng năm trong suốt 20 năm về diện tích là7,5%/năm, năng suất 6,7%/năm và sản lợng là 24,5%/năm, cao hơn nhiều 10năm trớc đó khi đất nớc ta thống nhất 1975-1985 (các tỷ lệ tơng ứng giai đoạnnày là 4,2%; 3,9% và 10,0%) Nếu chúng ta lấy số liệu tuyệt đối của 2 năm(1985) và sau 20 năm đổi mới (2004) thấy rằng diện tích ngô tăng 2,5 lần, năngsuất 2,3 lần và sản lợng 5,9 lần [1]

(1985-Tuy nhiên, năng suất ngô của Việt Nam năm 2004 (34,9 tạ/ha) vẫn cònthấp hơn năng suất bình trung bình thế giới (48,5 tạ/ha), vẫn thấp hơn nhiều sovới Mỹ (100,0 tạ/ha) và Trung Quốc (51,1 tạ/ha) song đã vợt đợc năng suất bìnhquân khối các nớc đang phát triển (31,3 tạ/ha) Mặc dầu vậy, khách quan mà nói:Sản xuất ngô Việt Nam trong thời kỳ đổi mới đã có sự phát triển vợt bậc, toàndiện và đáng trân trọng

1.2 Cây trồng biến đổi gen

1.2.1 Khái niệm về cây trồng biến đổi gen

Cây trồng biến đổi gen hoặc cây trồng công nghệ sinh học là các cây trồng

đã đợc biến đổi về mặt di truyền nhằm làm cho cây trồng mang một số đặc tínhquý giá mà cây trồng tự nhiên không có Công nghệ này cho phép các gen riêng

biệt đã chọn lọc đợc chuyển từ một cơ thể này sang một cơ thể khác cũng nh giữacác loài không có liên quan với nhau Các tính trạng thờng đợc chuyển vào câytrồng nh tính kháng côn trùng, kháng nấm bệnh, kháng vi khuẩn, kháng thuốc trừ

cỏ, kháng mặn, cho năng suất cao, chất lợng sản phẩm tốt Đây là một phơng ớng quan trọng giải quyết vấn đề an toàn lơng thực cho nhân loại góp phần giảmthiểu các loại nông dợc và phân bón hoá học, bảo vệ môi trờng sinh thái bềnvững

h-Sự biến đổi về mặt di truyền thờng bao gồm sự chèn đoạn ADN, tái tổ hợpnhững mảnh ADN nhỏ hơn vào trong hệ gen của cây trồng bị biến đổi Cấu trúccủa gen chèn điển hình trong GMC (Genetically Modified Crops) đợc tạo nên bởi

để có sự kết hợp dễ dàng của các thành phần khác nhau trong cấu trúc đoạn ADNchèn Cấu trúc của đoạn ADN chèn phải tơng hợp với hệ gen của cơ thể nhận để

nó có sự di truyền ổn định

1.2.2 Những vấn đề liên quan đến cây trồng biến đổi gen

1.2.2.1 Lợi ích của cây trồng biến đổi gen

Thực trạng phát triển nhanh chóng của cây trồng biến đổi gen trong nhữngnăm qua đã chứng tỏ chúng có những mặt mạnh nổi trội hơn hẳn những cây trồngkhông biến đổi gen Sau đây là những lợi ích mà chúng đem lại cho con ngờitrong thời gian kể từ khi cây trồng biến đổi gen đầu tiên xuất hiện cho đến nay:– Lợi ích trong nghiên cứu cơ bản: Việc sử dụng GMC đã góp phần to lớntrong việc phát hiện các gen quan trọng, xác định đợc chức năng của một gen bấtkỳ

– Lợi ích trong cải tạo giống cây trồng: Nhờ có công nghệ gen mà nhiềugiống cây trồng mới đợc tạo ra với các đặc tính không có ở cây trồng tự nhiên nh

khả năng chống chịu các điều kiện ngoại cảnh, chống chịu sâu bệnh, chống chịuthuốc diệt cỏ nhằm nâng cao sản lợng và chất lợng cây trồng.

– Lợi ích trong chăn nuôi gia súc: Công nghệ chuyển gen thực vật đã tạo racác loại thức ăn gia súc chứa các kháng thể đặc hiệu hay vacxin tái tổ hợp, làmtăng sức đề kháng của vật nuôi đối với bệnh tật, tạo ra các loại thức ăn có chất l -ợng dinh dỡng cao

– Lợi ích trong công nghệ thực phẩm: Rất nhiều loại thực phẩm mới có chấtlợng dinh dỡng cao, mẫu mã đẹp, thời gian bảo quản lâu, hay làm thay đổi hàm l-ợng acid béo trong dầu thực vật nhằm làm giảm nguy cơ mắc bệnh tim mạch đã

đợc tạo ra nhờ công nghệ chuyển gen thực vật

– Lợi ích trong công nghệ dợc phẩm: Nhờ kỹ thuật ADN tái tổ hợp, ngời ta

có thể sản xuất ra các sản phẩm nh các kháng nguyên, các protein ngời,hemoglobin, một số kháng thể từ cây trồng biến đổi gen

– Lợi ích về môi trờng: Năng suất của cây trồng biến đổi gen cao hơn rấtnhiều so với các cây trồng tự nhiên do đó sự phát triển của GMC sẽ làm giảm nhucầu chuyển đổi đất rừng và đất ở thành đất nông nghiệp Làm giảm nhu cầu sửdụng thuốc trừ sâu, thuốc trừ cỏ, bón đạm nh vậy sẽ làm giảm ô nhiễm nguồnnớc và nguy cơ gây hại cho sức khoẻ con ngời

– Lợi ích về kinh tế: GMC đã và đang mang lại cho ngời nông dân nhiều lợiích về kinh tế, nó làm giảm chi phí sản xuất, giảm sức lao động và tăng giá trị sảnphẩm Năm 2007, doanh thu từ GMC đạt 6,9 tỷ USD và dự định năm 2008 là 7,5

tỷ USD [42]

– Lợi ích ngời tiêu dùng: Nhờ có công nghệ chuyển gen thực vật mà ngờitiêu dùng có thể có đợc các sản phẩm thực phẩm có lợi hơn đối với con ngời nhcác sản phẩm có chất lợng dinh dỡng cao, có hơng vị, có thời gian bảo quản lâu,hay đợc bổ sung một số chất nh vitamin A, vitamin E, văcxin Ngoài ra ngời ta

đã chứng minh khả năng làm giảm tỷ lệ nhiễm độc tố do nấm bệnh tạo ra vàgiảm mức độ tạo độc tố nấm trong thời gian bảo quản của hạt ở giống ngô khángsâu, nhờ đó mà những độc tố này không thể gây hại đến sức khoẻ của con ngời

và vật nuôi [12, 20]

– Ngoài những lợi ích to lớn kể trên, khi đa GMC ra ngoài môi trờng ngời ta

đặc biệt quan tâm đến những ảnh hởng của nó đối với môi trờng và sự cân bằng

hệ sinh thái Thực tế đã cho thấy cây trồng biến đổi gen có ích lợi tiềm tàng đốivới môi trờng Chúng giúp bảo tồn các nguồn lợi tự nhiên, sinh cảnh và các

nguồn lợi bản địa, chúng góp phần giảm xói mòn đất, cải thiện chất lợng nớc, cảithiện rừng và nơi c ngụ của động vật hoang dại.

1.2.2.2 Những rủi ro có thể có của cây trồng biến đổi gen

Cây trồng biến đổi gen mang các đặc tính đã đợc cải biến nhằm mang lạinhững lợi ích tối đa cho con ngời nhng khi đa chúng ra môi trờng tự nhiên và th-

ơng mại hoá chúng thì không thể không đánh giá những rủi ro có thể xảy ra.Những rủi ro này thờng đợc xem xét ở một số khía cạnh chính sau:

– Hiểm hoạ cỏ dại: Các thực vật biến đổi gen có thể ảnh hởng tiêu cực lên hệsinh thái tự nhiên vì chúng làm tăng hiểm hoạ cỏ dại theo hai con đờng Trớctiên, GMC tạo nên những quần thể độc lập tồn tại bên ngoài các hoạt động canhtác, điều đáng quan tâm là những thực vật này có thể trở thành cỏ dại và xâm lấncác quần thể tự nhiên rồi từ đó gây ra sự suy giảm nhiều hơn về tính đa dạng sinhhọc của sinh cảnh thực vật bản địa Các gen mới trong GMC có thể chuyển sangcây họ hàng sống hoang dã ngoài tự nhiên theo phơng thức lan truyền hạt phấnnhờ vào khả năng sống sót và tính hữu thụ của các cây lai đợc tạo ra Điều này cóthể gây tác động tiêu cực lên quần thể thực vật mọc hoang dã nếu các gen mớinêu trên đợc nhập nội trở lại vào chính các quần thể thực vật nguyên thuỷ đó.Khả năng tạo ra các loài cỏ mới kháng thuốc trừ cỏ hay loài cỏ kháng côn trùng[5]

– Khả năng kháng sâu: Cây trồng kháng sâu có khả năng tiêu diệt các loàisinh vật không phải là sinh vật cần diệt làm ảnh hởng đến chuỗi thức ăn tự nhiên,

ảnh hởng đến sự đa dạng sinh học Ví dụ nhóm chất độc Bt chủ yếu diệt các loàitrong bộ cánh vảy (bớm, sâu đục thân ngô Châu Âu ) nhng đồng thời lại có ảnhhởng lên cả bộ cánh cứng (ví dụ nh gián)

– Nguy cơ phát sinh các mầm bệnh: Một nguy cơ tiềm tàng khác là khả năngtái tổ hợp của một gen virus sẵn có trong GMC với các gen từ một virus khácnhiễm vào cây đó và tạo ra một virus mới [5]

– Sự kháng kháng sinh: Do các GMC thờng đợc chuyển các gen quy địnhtính trạng kháng kháng sinh, vì thế gây ra mối lo lắng rằng liệu các gen này cóthể đợc phát tán từ GMC sang các vi sinh vật c trú trong ruột ngời và làm chúngtăng khả năng đề kháng đối với kháng sinh Tuy nhiên ngời ta thấy rằng mốinguy cơ này xảy ra với xác suất vô cùng nhỏ và nếu có xảy ra thì tác động nàycũng không đáng kể vì gen chỉ thị đợc sử dụng trong GMC đợc ứng dụng rất íttrong thú y và y học [12]

1.2.2.3 Vấn đề an toàn và những quy định về quản lý cây trồng biến đổi gen

Mặc dù GMC đang đợc thơng mại hoá có nhiều đặc tính u việt hơn so vớicác cây trồng cùng loại nhng do mới xuất hiện nên ngời ta cha đánh giá hết đợcnhững ảnh hởng bất lợi của chúng Vì vậy yêu cầu đặt ra khi thơng mại hóa GMC

và sản phẩm của chúng là chúng ta phải đặt vấn đề xem xét về mức độ an toàncủa các sản phẩm này lên hàng đầu Vì thế bất kỳ một sản phẩm chuyển gen nàotrớc khi đợc đa ra thị trờng phải đợc thử nghiệm toàn diện, đợc các nhà khoa học

và giám định viên đánh giá độc lập xem có an toàn hay không về mặt dinh dỡng,

độc tính, khả năng gây dị ứng và các khía cạnh khoa học thực phẩm khác Những

đánh giá về an toàn thực phẩm này dựa trên những quy định của từng quốc gia.Chúng bao gồm: một hớng dẫn sử dụng sản phẩm, một thông tin chi tiết về mục

đích sử dụng sản phẩm, các thông tin về phân tử, hoá sinh, độc tính, dinh dỡng,khả năng gây dị ứng

Do những rủi ro và những lo ngại bất thờng xung quanh quá trình biến đổi

di truyền mà việc bắt buộc dán nhãn các sản phẩm GMC đã trở thành một yêucầu và là quy định của nhiều quốc gia Việc dán nhãn GMC cho phép ngời tiêudùng lựa chọn sản phẩm theo phong tục, tôn giáo, chế độ ăn hàng ngày của họ vìnhiều tôn giáo không thích sử dụng các sản phẩm đợc tạo ra nhờ sự biến đổi ditruyền

1.2.3 Tình hình sản xuất, sử dụng cây trồng biến đổi gen trên thế giới

Sau khi những kết quả nghiên cứu đầu tiên về cây trồng biến đổi gen đợccông bố những năm 80 thế kỷ XX, sự phát triển của cây trông biến đổi gen cónhững bớc đột phá quan trọng về những kết quả nghiên cứu và ứng dụng chúngvào sản xuất:

Năm 1994, lần đầu tiên FDA (Cơ quan quản lý thực phẩm và dợc phẩmMỹ) chấp nhận thực phẩm đợc tạo ra bằng CNSH là cà chua Năm 1996, câytrồng biến đổi gen thực sự bùng nổ với sự ứng dụng rộng rãi trong sản xuất Năm

1997, cây trồng biến đổi gen lần đầu tiên đợc thơng mại hóa, diện tích cây trồngbiến đổi gen thơng mại hoá đạt gần 11 triệu hecta (chủ yếu là Mỹ, Achentina,Auxtralia, Canada, Trung Quốc và Mehico) Năm 2000, diện tích cây trồng biến

đổi gen đạt 44,2 triệu ha trên 13 nớc Năm 2001, chèn thành công gen đơn từArabidopsis vào cây cà chua để tạo ra cây trồng đầu tiên có thể trồng trên đất vànớc mặn Năm 2002, tổng giá trị thị trờng toàn cầu của cây trồng biến đổi gen ớctính đạt khoảng 4,5 tỷ USD Năm 2004, diện tích cây trồng biến đổi gen đạt con

số 81 triệu hecta Năm 2005 diện tích cây biến đổi gen đã đạt 90 triệu hecta,diện tích cây trồng biến đổi gen đã tăng hơn 50 lần trong thập kỷ đầu tiên câybiến đổi gen đợc trồng đại trà, số nớc trồng cây biến đổi gen tăng lên tới 21 nớc.Năm 2007 diện tích cây CNSH tiếp tục tăng 2 con số, đạt 12% tơng đơng với12,3 triệu hecta (30 triệu mẫu) Diện tích đất canh tác cây CNSH lên tới 114, 3triệu hecta [41]

Tổng diện tích đất trồng cây CNSH từ năm 1996 đến năm 2007 đạt 690triệu hecta (1,7 tỷ mẫu), tăng 67 lần so với năm 1996, đa CNSH trở thành thànhtựu đợc ứng dụng nhanh nhất trong nông nghiệp Năm 2007 cũng là năm đầutiên tổng luỹ kế số nông dân quyết định canh tác cây trồng CNSH vợt con số 50triệu ngời [41]

Hình 1: Diện tích cây trồng CNSH trên toàn cầu 1996-2007 (triệu ha)

Từ năm 1996 đến năm 2007, tỉ trọng diện tích trồng cây CNSH của các nớc

đang phát triển so với diện tích trồng trên toàn thế giới tăng đều mỗi năm Năm

2007, 43% diện tích cây trồng CNSH trên toàn cầu là ở các nớc đang phát triển(tăng 3% so với tỷ trọng 40% năm 2006), tơng đơng với 49,4 triệu hecta Trongkhoảng thời gian từ 2006 đến 2007, diện tích trồng cây CNSH ở các nớc đangphát triển (8,5 triệu ha hay 21%) tăng cao hơn so với các nớc công nghiệp (3,8triệu ha hay 6%) Đáng chú ý là có 5 nớc lớn và đang phát triển đa cây trồngCNSH vào canh tác, nằm ở 3 châu lục: Trung Quốc và ấn Độ ở Châu á, Achentina

và Braxin ở châu Mỹ Latinh, Nam Phi ở châu Phi; tổng dân số ở cả 5 quốc gia này

là 2,6 tỉ ngời, chiếm 40% dân số thế giới, trong đó có 1,3 tỉ ngời sống hoàn toàndựa vào nông nghiệp

Bảng 1: Diện tích trồng cây CNSH năm 2007 phân theo nớc (đ/v: triệu ha)

TT Nớc trồng Diện tích trồng Loại cây biến đổi gen

1* Hoa Kỳ 57.7 Đậu tơng, ngô, bông, cải, đu đủ, cỏ alfalfa2* Achentina* 19.1 Đậu tơng, ngô, bông

* 13 nớc đợc coi là có diện tích trồng lớn, từ 50,000 héc-ta trở lên

Trong số các cây trồng CNSH đợc đa vào thơng mại hoá từ năm 1996 đếnnăm 2007 tính trạng chịu thuốc trừ cỏ vẫn là tính trạng nổi trội Năm 2007, tínhtrạng chịu đợc thuốc trừ cỏ đợc triển khai trên cây đậu tơng, ngô, cải canola, cỏalfalfa với diện tích trồng là 72,7 triệu hecta (chiếm 63% diện tích đất trồng câyCNSH toàn cầu) Năm 2007, Hoa Kỳ, Achentina, Braxin, Canada, ấn Độ vàTrung Quốc tiếp tục là các nớc đa cây trồng CNSH vào canh tác nhiều nhất Hoa

Kỳ vẫn dẫn đầu thế giới với 57,7 triệu hecta (chiếm 50% diện tích đất trồng câyCNSH trên thế giới), do nhu cầu ngày càng tăng của thị trờng ngô dùng trong sản

xuất cồn ethanol, diện tích trồng ngô CNSH tăng tới 40% - mức tăng này đã phầnnào bù lại mức giảm đôi chút đối với diện tích trồng đậu tơng và bông CNSH.

Đáng chú ý là 63% ngô CNSH, 78% bông CNSH và 37% các loại cây CNSHkhác ở Hoa Kỳ là các sản phẩm mang gien độn (các sản phẩm tập hợp nhiều đặctính) có chứa hai hay ba đặc tính và đem lại nhiều lợi ích trên một cây trồng Xuthế của tơng lai là sử dụng những loại cây trồng CNSH mang gien độn kiểu nàynhằm đáp ứng nhu cầu của nông dân và ngời tiêu dùng

Nh vậy, trên thế giới tình hình phát triển của cây trồng biến đổi gen rấtmạnh mẽ, nó đã đem lại rất nhiều lợi ích cho con ngời, đặc biệt trong lĩnh vựcnông nghiệp: cây trồng biến đổi gen cho phép tạo ra nhng cây trồng cho năngsuất cao, chất lợng tốt, có khả năng chống chịu sâu bệnh, hạn, mặn

1.2.4 Tình hình sản xuất và sử dụng cây trồng biến đổi gen ở Việt Nam

Hiện nay ở nớc ta lĩnh vực nghiên cứu tạo sinh vật biến đổi gen, đặc biệt làcây trồng biến đổi gen đang đợc tiếp cận, đầu t và triển khai nghiên cứu, ứngdụng với sự chú trọng đặc biệt Nhiều gen quý có giá trị ứng dụng nh năng suấtcao, chất lợng tốt, có khả năng chống chịu đã đợc phân lập và nghiên cứu nhằmchuyển vào cây trồng để tạo nên những giống lý tởng CNSH Việt Nam nóichung và lĩnh vực cây trồng biến đổi gen nói riêng đã có những bớc phát triển

đáng chú ý:

Đã thành công trong việc phân lập đoạn promoter đặc trng hạt của genGluteline lúa và thiết kế các gen Cry Xa21 vào Plasmid pCAMBIA nhằm làmchủ nguồn gen có giá trị để tạo ra chủng vi khuẩn Agrobacterium cho việcchuyển gen vào thực vật Hoàn thiện quy trình chuyển gen CryIA(b), CryIA(c)kháng côn trùng, gen Chitinase kháng bệnh nấm, gen Xa21 kháng bệnh bạc lá vikhuẩn và gen Bar kháng thuốc diệt cỏ thông qua vi khuẩn Agrobacterium vào câylúa giống C71, giống DT10 và DT13, cây cải dầu và bắp cải [38]

Đối với cây lúa, đã tạo đợc lúa biến đổi gen giống Nàng Hơng Chợ Đào và

2 dòng cây biến đổi gen GUS A và hph

Kết quả đã thu đợc những cây trồng biến đổi gen và lu giữ chúng trong

điều kiện invitro và trong điều kiện nhà kính

1.3 Cây ngô biến đổi gen

1.3.2 Tình hình sản xuất cây ngô biến đổi gen trên thế giới

Trên thế giới thì diện tích cây ngô biến đổi gen là lớn thứ 2 sau đậu tơngvới diện tích 25,2 triệu ha chiếm 25% diện tích cây trồng biến đổi gen trên thế

giới Cây ngô biến đổi gen đợc trồng nhiều nhất ở Mỹ, Achentina, Brazin,Canada, China, Nam Phi, Uruguay, Philippin…Cây ngô chủ yếu đợc nghiên cứu,sản xuất và sử dụng giống có tính trạng chống chịu thuốc trừ cỏ, kháng sâu, chịuhạn

Năm 2006, thêm một số nớc thuộc liên minh Châu Âu (EU) lần đầu tiên

đ-a ngô Bt vào trồng đại trà Tổng diện tích trồng ngô Bt ở 5 n ớc (Pháp, Cộng HoàSéc, Bồ Đào Nha, Đức và Slovakia) đã tăng trên 5 lần từ xấp xỉ 1.500 ha năm

2005 lên gần 8.500 ha năm 2006, diện tích này còn tăng lên rất nhiều trong năm2007

Ngô là cây trồng đợc các quốc gia trên thề giới cấp phép sử dụng làm thựcphẩm và thức ăn chăn nuôi nhiều nhất với tổng số 35 giống khác nhau, vợt hẳncây trồng đứng thứ 2 là bông (với 19 giống khác nhau) Giống ngô đợc cấp phépnhiều nhất là ngô kháng sâu bệnh (MON 810) và ngô kháng thuốc trừ cỏ(NK603), cả hai giống ngô đợc 18 nớc cấp phép

Năm 2006, theo ớc tính của hãng phân tích thị trờng Cropnosis, thị trờngcây trồng biến đổi gen toàn cầu trị giá khoảng 6,15 tỷ đô la, chiếm 16% thị trờngcây trồng đợc bảo hộ trên toàn cầu và chiếm 21% thị trờng hạt giống toàn cầu.Trong đó giá trị của ngô biến đổi gen chiếm 39% tơng đơng khoảng 2,39 tỷ đô la[41]

Do đặc tính sinh lý của cây ngô nên tỷ lệ đạt kết quả nghiên cứu chuyểngen trong cây ngô trên thế giới là rất cao và đạt độ an toàn cao nhất so với cácloại cây trồng biến đổi gen trên thế giới Nh vậy, với việc đa cây ngô biến đổi genvào sản xuất đã góp phần ổn định lơng thực trên thế giới trong hiện tại và trong t-

ơng lai

1.3.3 Tình hình sản xuất và sử dụng cây ngô biến đổi gen tại Việt Nam

Việt Nam là một quốc gia với nền kinh tế nông nghiệp chủ yếu Ngô làmột trong những cây lơng thực đóng vai trò quan trọng Vì vậy, việc nghiên cứucây ngô biến đổi gen đang đợc đầu t mạnh mẽ

Vào ngày 5/09/2005 thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành trồng thửnghiệm hai loại bắp chuyển gen trên diện tích 1.000 m2 đất ở Q.12 Hai loại ngôchuyển gen nói trên là hai loại ngô đã đợc chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ vàkháng sâu [40]

Kết quả từ việc trồng thử nghiệm bắp chuyển gen sẽ đợc so sánh với cácgiống bắp thông thờng hiện đang đợc trồng tại thành phố Hồ Chí Minh Trên cơ

sở đó, các nhà khoa học sẽ đề xuất nên hay không nên ứng dụng trồng ngôchuyển gen ở Việt Nam.

Đặc biệt mới đây, đề tài/dự án tạo ngô biến đổi gen kháng sâu và khángthuốc diệt cỏ đợc nghiên cứu tại viện Di Truyền Nông Nghiệp do TS NguyễnVăn Đồng chủ nhiệm đề tài, mục tiêu là tạo dòng ngô kháng sâu và kháng thuốcdiệt cỏ có năng suất cao và thích nghi tốt với các vùng sinh thái khác nhau Đây

là đề tài/dự án thuộc chơng trình trọng điểm “Phát triển ứng dụng công nghệ sinhhọc trong lĩnh vực Nông nghiệp” thực hiện từ tháng 10 năm 2006

1.4 Những vấn đề liên quan đến cây trồng kháng thuốc trừ cỏ và một số dòng ngô mang gen kháng thuốc trừ cỏ

1.4.1 Một số vấn đề liên quan đến cây trồng kháng thuốc trừ cỏ

Khi đợc hỏi, bất cứ ngời nông dân nào cũng trả lời rằng cỏ dại luôn là mộtvấn đề gây lo lắng cho họ Cỏ dại không chỉ cạnh tranh với cây trồng để lấy nớc,chất dinh dỡng, ánh nắng mặt trời, khoảng không để mọc mà còn là nơi c trú chocôn trùng và các loại sâu bọ gây bệnh, gây tắc nghẽn hệ thống tới tiêu, làm giảmsút chất lợng mùa màng, và còn đem theo cả hạt giống cỏ vào cây trồng đợc thuhoạch

Thông thờng, nông dân sẽ cày bừa trớc khi trồng trọt nhằm làm giảm số ợng cỏ dại trên cánh đồng Sau đó họ phun thuốc diệt cỏ theo diện rộng để làmcho cỏ dại không thể mọc đợc ngay trớc khi geo hạt Biện pháp diệt cỏ này rấttốn kém và việc cày xới đất sẽ khiến gió và nớc làm xói mòn lớp đất phía trên bềmặt gây hậu quả nghiêm trọng kéo dài cho môi trờng Ngoài ra, một số thuốcdiệt cỏ lại tồn tại dai dẳng trong môi trờng Sự tạo thành các cây trồng khángthuốc diệt cỏ là một cách để khắc phục các yếu điểm đó

l-Một số cải biến sinh học khác nhau có thể làm cho cây trồng trở nênkháng thuốc diệt cỏ có thể nêu ra là:

– Tạo ra một loại protein mới giải độc thuốc diệt cỏ

– Thay đổi protein mục tiêu của thuốc diệt cỏ do vậy mà protein này sẽkhông bị tác động bởi thuốc diệt cỏ

– Sản xuất quá mức protein mục tiêu nhạy cảm thuốc diệt cỏ sao cho vẫn có

d để duy trì các chức năng tế bào bất chấp sự có mặt của thuốc diệt cỏ

– Cho cây khả năng bất hoạt về mặt chuyển hoá thuốc diệt cỏ

Ba cách đầu tiên là những cách phổ biến nhất mà các nhà khoa học dùng

để phát triển loại cây trồng chịu đợc thuốc diệt cỏ (bảng 2)

Trong số các cây trồng CNSH đợc đa vào thơng mại hóa từ năm 1996 đếnnăm 2007 tính trạng chịu thuốc trừ cỏ vẫn là tính trạng nổi trội Năm 2007, tínhtrạng chịu đợc thuốc trừ cỏ đợc triển khai trên cây đậu tơng, ngô, cải canola, cỏalfalfa với diện tích trồng là 72,7 triệu hecta (chiếm 63% diện tích đất trồng câyCNSH toàn cầu) Các giống phổ biến nhất là chịu đợc thuốc glyphosate vàglufosinate [41] Bảng dới đây (bảng 3) cho thấy các nớc đã chuẩn y các loại câytrồng chịu đợc thuốc diệt cỏ chính dùng làm thực phẩm

Bảng 2: Một số ví dụ về sự kháng thuốc diệt cỏ

Thuốc diệt cỏ Cơ chế phát triển tính kháng thuốc diệt cỏ

Tính kháng thuốc là do sự thay đổi gen psbA mã hoá

cho đích của thuốc diệt cỏ, protein lục nạp D-1

Các gen mã hoá các dạng kháng của enzym axetolactat synthetaza đã đợc đa vào lúa, cây dơng, cây lanh, cây cải dầu

Các giống có các dạng enzym axetolactat synthetaza kháng đã đợc chọn lọc trong nuôi cấy mô

Các thuốc diệt cỏ này kìm hãm enzym axetyl coenzym A carboxylaza Sự kháng đợc chọn lọc trong nuôi cấy mô, có đợc là do enzym thay đổi không nhạy cảm thuốc diệt cỏ hoặc phân huỷ thuốc diệt cỏ

Tính kháng do sản xuất quá mức EPSPS, đích của thuốc diệt cỏ này Tính kháng thuốc đợc cải biến bằng biến nạp đặc trng với gen EPSPS kháng glyphosat và thuốc lá với gen glyphosat oxidoreductaza mã hoá enzym phân huỷ glyphosat.Cây bông và thuốc lá có tính kháng đợc tạo thành

bằng biến nạp với gen tfdA từ Alcaligenes mã hoá

dioxygenaza phân huỷ chất diệt cỏ này

Hơn 20 loại cây khác nhau đã đợc biến nạp với gen

Cây thuốc lá kháng đợc sinh ra khi gen xyanamit

hydrataza từ nấm Mycrothecium verrucaria đợc đa vào Enzym mã hoá gen này chuyển xyanamit thành

ure

Canola Ôxtralia, Canađa, Nhật bản, Hoa kỳ, Achentina

Bông Achentina, Ôxtralia, Canađa, Nhật Bản, Hoa kỳ

Ngô Achentina, Ôxtralia, Canađa, Liên minh Châu âu, Nhật

Bản, Thuỵ sỹ, Anh, Hoa kỳ

Đậu tơng Achentina, Ôxtralia, Braxin, Canađa, Nhật Bản, Hàn

Quốc, Mêxicô, Hà Lan, Nga, Nam Phi, Thuỵ sỹ, Hoa

kỳ, Uruguay

Củ cải đờng Ôxtralia, Canađa, Nhật Bản, Hoa kỳ

Bảng 3: Một số nớc đã chuẩn y các loại cây trồng chịu đợc thuốc diệt

cỏ chính dùng làm thực phẩm

1.4.2 Một số gen kháng thuốc trừ cỏ Phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT), Bar

 Gen Phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT)

Gen Phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT) là một trong những genkháng thuốc trừ cỏ đã đợc chuyển vào một số cây trồng nh ngô và đậu tơng Gennày chống chịu đợc với thuốc trừ cỏ glufosinate, đợc phân lập từ một loại xạ

khuẩn đất Streptomycesviridochromogenes Gen PAT cho phép sản sinh raenzyme phosphinothricine N-acetyltransferase (PAT), enzym này có khả năngchống chịu đợc glufosinate.

 Gen Bar

Gen Bar là một trong các gen kháng thuốc trừ cỏ ammonium-glufosinate(hay phosphinothricin) Ammonium-glufosinate là thành phần hoạt tính củathuốc diệt cỏ Basta, Finale, Buster, Harvest và Liberty, đây là loại thuốc trừ cỏ có

hệ thống phân loại rõ nét mà nó đã đợc sử dụng rộng rãi để kiểm soát khôngchọn lọc đối với các loài cỏ dại 1 năm và lâu năm, là chất diệt cỏ có phổ rộng và

đợc sử dụng để kiểm soát vùng cỏ dại rộng lớn trong quá trình canh tác.Glufosinate là hợp chất tự nhiên đợc phân lập từ 2 loài nấm Streptomyces, ức chếhoạt tính của enzym tổng hợp glutamin, enzym cần thiết cho sự tạo thànhglutamin và độc tính ammonia Việc sử dụng glufosinate dẫn đến làm giảm hàmlợng glutamin và làm tăng ammonia trong mô thực vật Điều này làm cho quátrình quang hợp ngừng và cây chết sau vài ngày

Gen Bar mã hoá cho enzym phosphinothricin- N- acetyltransferase (PAT)

đợc phân lập từ chủng Streptomyces hygroscopicus HP632 Ngoài việc cung cấptính trạng kháng thuốc trừ cỏ, gen mã hoá enzym PAT còn đợc sử dụng nhmarker chọn lọc để xác định các cây đã chuyển gen trong suốt quá trình tái sinhnuôi cấy mô làm cho thành phần hoạt tính trong thuốc trừ cỏ glufosinate làphosphinothricin không hoạt động, cho phép các cây trồng sống sót trong khi màứng dụng khác của glufosinate có thể gây chết

1.4.3 Một số dòng ngô mang gen kháng thuốc diệt cỏ

 Event Bt16

Ph ơng pháp chuyển nạp: Sử dụng súng bắn gen.ương pháp chuyển nạp: Sử dụng súng bắn gen

Dòng Bt16 đ ợc cải biến di truyền để kháng thuốc trừ cỏ ammonium-ương pháp chuyển nạp: Sử dụng súng bắn gen.glufosinate (hay phosphinothricin), th nh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta,μnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta,Finale, Buster, Harvest v Liberty Ammonium-glufosinate l một chất diệt cỏμnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta, μnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta,

có phổ rộng, không chọn lọc Nó đ ợc sử dụng để kiểm soát cỏ dại sau khi câyương pháp chuyển nạp: Sử dụng súng bắn gen.mọc hoặc kiểm soát thảm thực vật mọc trên đất m chúng không sử dụng choμnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta,mục đích gieo trồng Nó có thể bị vi khuẩn phân huỷ ở mức độ cao, không cóhoạt tính d thừa, v mức độ độc tính đối với con ng ời v động vật rất thấp.ương pháp chuyển nạp: Sử dụng súng bắn gen μnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta, ương pháp chuyển nạp: Sử dụng súng bắn gen μnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta,Khả năng chống chịu glufosinate trong dòng n y l do gen μnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta, μnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta, bar, gen n y mã hoáμnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta,

cho enzym phosphinothricin-N-acetyltransferase (PAT) m cho phép các câyμnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta,trồng n y sống sót trong khi m ứng dụng khác của glufosinate có thể gây chết.μnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta, μnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta,

Hình 2: Cấu trúc pDPG165 sử dụng trong biến nạp event Bt16

 Event GA21

Ph ơng pháp chuyển nạp: Sử dụng súng bắn gen.−ơng pháp chuyển nạp: Sử dụng súng bắn gen

Dòng GA21 l ngô Roundup Ready, chống chịu thuốc trừ cỏ glyphosate.μnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta,Glyphosate l 1 loại thuốc trừ cỏ đ ợc biết sau n y, đây l loại thuốc trừ cỏ cóμnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta, −ơng pháp chuyển nạp: Sử dụng súng bắn gen μnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta, μnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta,

hệ thống phân loại rõ nét m nó đã đ ợc sử dụng rộng rãi để kiểm soát khôngμnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta, −ơng pháp chuyển nạp: Sử dụng súng bắn gen.chọn lọc đối với các lo i cỏ dại 1 năm v lâu năm Dòng GA21 có khả năngμnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta, μnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta,kháng thuốc trừ cỏ nhờ chuyển gen EPSPS nội sinh của ngô v o genome của cây,μnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta,enzym mã hoá của gen n y không nhạy với sự khử hoạt tính bởi glyphosate.μnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta,

Hình 3: Đoạn ADN của cấu trúc pDPG434 sử dụng trong biến nạp để tạo ra

event GA21

 Event T14, T25

Ph ơng pháp chuyển nạp: Chuyển ADN trực tiếp v o genome của cây.−ơng pháp chuyển nạp: Sử dụng súng bắn gen μnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta,T14 v T25 đã đ ợc cải biến di truyền để chống chịu ammoniumμnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta, −ơng pháp chuyển nạp: Sử dụng súng bắn gen.glufosinate (phosphinothricin), th nh phần hoạt tính của các loại thuốc trừ cỏμnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta,của các hãng Basta, Finale, Buster, Harvest v Liberty Tính kháng thuốc trừ cỏμnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta,ammonium glufosinate có đ ợc l do gen PAT.−ơng pháp chuyển nạp: Sử dụng súng bắn gen μnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta,

Hình 4: Plasmid p35S/Ac đã đợc sử dụng để tạo ra event T14, T25

 Event TC1507

Ph ơng pháp biến nạp: Chuyển nạp nhờ súng bắn gen.ương pháp chuyển nạp: Sử dụng súng bắn gen

TC1507 đ ợc cải tiến di truyền để kháng côn trùng v thuốc trừ cỏương pháp chuyển nạp: Sử dụng súng bắn gen μnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta,glufosinate Dòng n y chứa gen cry1F - l protein cry1F của côn trùng có nguồnμnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta, μnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta,

gốc từ B thuringiensis var aizawai Protein n y có hiệu quả trong việc kiểmμnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta,soát ấu trùng của nhiều lo i sâu bọ phổ biến ở ngô chẳng hạn nh sâu đục thânμnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta, ương pháp chuyển nạp: Sử dụng súng bắn gen.ngô Châu Âu, sâu đục thân ngô Tây Bắc, sâu ng i đen, sâu cắn gié Dòngμnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta,TC1507 có khả năng chống chịu ammonium glufosinate l do chuyển gen PATμnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta,

v o genome của dòng n y.μnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta, μnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta,

Hình 5: Plasmid PHI8999A đã đợc sử dụng để tạo ra event TC1507 1.5 Các phơng pháp phát hiện cây trồng biến đổi gen

Việc nhận biết GMC có rất nhiều ứng dụng nh để đánh giá mức độ sạchcủa Cây giống hay đối với việc bắt buộc dán nhãn thực phẩm ở một số quốc gia

Có rất nhiều kỹ thuật đã và đang đợc phát triển để đáp ứng nhu cầu này Nhậnbiết GMC và dẫn xuất của nó có thể đợc thực hiện nhờ sự nhận biết phân tử mànhững phân tử này có nguồn gốc từ gen đợc chèn [13, 14] Có 3 phơng pháp đểxác định GMC đó là:

1.5.1 Phơng pháp khuếch đại dựa trên cơ sở nucleotit:

Bao gồm kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction), phản ứng LCP(Ligase Chain Reaction), khuếch đại dựa trên trình tự acid nucleic (NASBA), các

kỹ thuật RFLP, AFLP, RAPD

- Dựa trên cơ sở ARN: Nhờ vào sự liên kết đặc hiệu giữa phân tử ARN và

phân tử ADN hoặc ARN tổng hợp (gọi là primer) Thờng thì sự liên kết giữaARN và primer sẽ dẫn đến sự chuyển hoá phân tử ARN thành ADN thông quaquá trình sao chép ngợc Cuối cùng ADN có thể đợc nhân lên nhờ kỹ thuật PCR.Hoặc ARN đợc phiên mã thành hàng trăm bản coppy nh là một mẫu chuẩn trong

kỹ thuật NASBA [13]

- Dựa trên cơ sở ADN: Chủ yếu là nhờ vào sự nhận đôi của ADN đặc hiệu

với kỹ thuật PCR Đây là kỹ thuật đợc sử dụng phổ biến ở các phòng thí nghiệmbởi đó là một phơng pháp nhạy và có tính đặc hiệu cao, có thể phát hiện đợcADN ngay ở hàm lợng rất thấp Kỹ thuật PCR không những đợc sử dụng để xác

định GMC mà còn đợc sử dụng vào mục đích định lợng

1.5.2 Phơng pháp dựa trên cơ sở protein:

Bao gồm điện di SDS một chiều, điện di SDS hai chiều, phân tích blot, kỹ thuật ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assays) Là phơng phápnhờ vào sự liên kết đặc hiệu giữa protein và kháng thể Kháng thể chính là tácnhân bảo vệ cơ thể chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn và virus, khi kháng thểnhận ra phân tử lạ thì nó sẽ liên kết với phân tử này và trong các phân tích nhậnbiết GMC thì sự phức tạp của mối liên kết lần lợt đợc nhận biết nhờ phản ứnghình thành sắc tố Đây chính là kỹ thuật ELISA Tuy nhiên kháng thể có thểkhông đợc sinh ra nếu không nhận đợc protein sạch Protein này phải đợc làmsạch ngay từ bản thân GMC hoặc có thể đợc tổng hợp trong th viện nếu nh biếtthành phần của acid amin của protein Phơng pháp này thích hợp với việc phântích đối với nguyên liệu thô [13, 19]

Western-1.5.3 Phơng pháp dựa trên sự phát hiện hoạt tính của enzym:

Phơng pháp này không thích hợp với các thực phẩm đã qua chế biến bởi vìlúc này protein đã bị biến tính [17]

Cho đến nay các phơng pháp chính để phát hiện GMC và các dẫn suất của

nó chủ yếu dựa trên sự phát hiện ADN, trong khi chỉ có một vài phơng pháp đợcphát triển để phát hiện ARN hoặc protein

1.6 Tình hình nghiên cứu sử dụng PCR để xác định cây trồng biến đổi gen

Rất nhiều nghiên cứu sử dụng kỹ thuật PCR để xác định GMC đã đợc tiếnhành Kỹ thuật PCR cũng đã đợc ứng dụng rất nhiều để phát hiện ngô GM và đậutơng GM Để nhận biết đậu tơng Roundup Ready GM và ngô Bt 176, các nhà

khoa học Đài Loan đã sử dụng các cặp mồi 35S, NOS, EPSPS và LE để phát hiện

đoạn promoter 35S, đoạn terminator NOS, vùng gen cấu trúc EPSPS (enolpyruvylShikinate-3-phosphate Synthase) của đậu tơng Roundup Ready và gen lectin Sửdụng các cặp mồi Cry IA(b), CDPK-cry, IVR để nhận biết gen Delta-Endotoxin(đoạn 184 bp và 211bp) và gen Invertase trong ngô Bt 176

Cũng với 2 đối tợng nghiên cứu trên và sử dụng các cặp mồi 35S1/2, SPA/

B, LE1/2, Cry1/2, IVR1/2, một nghiên cứu khác của các nhà khoa học Anh vềkhả năng nhận biết ngô GM và đậu tơng GM trong thực phẩm nhờ PCR cũng đã

đợc chấp nhận [15] Một ứng dụng khác của PCR là định lợng GMC cũng đã đợccác nhà khoa học Argentina nghiên cứu thử nghiệm trên đối tợng là ngô Bt 176 ởnghiên cứu này, các mẫu ngô GM đợc trộn lẫn với ngô không biến đổi gen ở các

tỷ lệ khác nhau (0,5%, 1%, 2%, 5%, 20%) và nghiên cứu này cho thấy ở hàm ợng GMC lớn hơn 5% cho phản ứng dơng tính [14]

l-1.7 Đa dạng di truyền

Các cá thể trong một quần thể thờng có bộ gen (genom) khác nhau Sự đadạng về bộ gen có đợc là do các cá thể có các gen khác nhau, dù chỉ là rất ít.Những alen khác nhau của một gen có thể ảnh hởng đến sự phát triển và đặc

điểm sinh lý của mỗi cá thể theo cách khác nhau Những cây trồng đợc lai ghéphay những động vật đợc lai tạo phát huy những gen của mình để hình thànhnhững giống cây con cho năng suất cao, có khả năng chống chịu sâu bệnh, cỏ dạitốt

Trong quá trình sinh sản hữu tích, kiểu gen của các cá thể trong quần thể

sẽ tăng lên do kết quả tái tổ hợp hoặc do đột biến

Các gen đa hình là nguyên nhân dẫn đến sựu tồn tại các kểu gen dị hợptrong quần thể Sự khác biệt về kiểu gen của các cá thể trong quần thể này thíchnghi hơn so với những thay đổi của môi trờng

1.7.1 ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền

Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã tựnhiên và rất quan trọng đối với con ngời Sự đa dạng di truyền là cần thiết cho tấtcả các sinh vật để duy trì khả năng sinh sản, khả năng đề kháng với các loại dịchbệnh và khả năng thích nghi với những thay đổi của môi trờng sống Sự đa dạng

di truyền ở cây trồng và vật nuôi có giá trị đặc bệt trong chọn tạo giống câytrồng, vật nuôi mới phục vụ cho lợi ích của con ngời

1.7.2 Một số phơng pháp nghiên cứu đa dạng di truyền

1.7.2.1 Phơng pháp sử dụng các chỉ tiêu hình thái.

Các chỉ tiêu hình thái trong phân loại sinh vật đợc sử dụng từ rất sớm Tuynhiên, những đặc tính hình thái đợc sử dụng nh là một chỉ thị di truyền là nhữngtính trạng do một locus gen quy định và sự thể hiện của chúng không bị ảnh hởngcủa nhân tố môi trờng Trong trờng hợp này dấu chỉ tiêu hình thái đợc sử dụng

 Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism):

Phơng pháp RFLP (Đa hình chiều dài các đoạn ADN cắt giới hạn) doBotstein và cs, phát minh năm 1980 Nguyên lý của phơng pháp này là: ADN của

bộ gen sau khi đợc xử lý bằng enzym giới hạn sẽ bị cắt thành những đoạn có kíchthớc khác nhau Sau khi điện di, các đoạn này phân bố ở những vị trí khác nhautrên gel, qua biến tính các đoạn này sẽ trở thành sợi đơn và đợc chuyển lên màngcelulose hoặc nylon với vị trí không thay đổi Trong quá trình lai ADN tiếp theotrên mẫu dò (thực chất là một đoạn ADN) sẽ bắt cặp với những đoạn có trình tựnucleotic tơng đồng với nó trên màng lai – kỹ thuật lai Southern Khi phân tích

đa hình di truyền, sự đa dạng của các cá thể đợc thể hiện qua sự khác nhau củacác băng lai trên màng lai

 Chỉ thị PCR (Polymerase Chain Reaction):

Phản ứng PCR dựa trên nguyên tắc tổng hợp ADN nhờ enzym ADN Polymerase chịu nhiệt (Taq, Pfu…) với sự có mặt của đoạn ADN khuôn mẫu,ADN mồi, các nucleotit (dNTP) gồm dATP, dCTP, dGTP, dTTP vμnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta, ion Mg2+

hoạt động nh một chất xúc tác −ơng pháp chuyển nạp: Sử dụng súng bắn gen

Phản ứng PCR gồm các giai đoạn sau:

– Giai đoạn biến tính (Denaturation): Hỗn hợp phản ứng đợc làm nóng đếnkhoảng 90-98oC, nhiệt độ này thờng lớn hơn Tm của phân tử ADN, do đó cácphân tử ADN mạch kép đợc tách nhau ra hoàn toàn tạo nên sợi đơn dùng làm

khuôn cho các đoạn mồi và taq ADN polymerase hoạt động Giai đoạn này thờngkéo dài trong vòng 30 giây đến 1 phút.

– Giai đoạn gắn mồi (Annealing): Nhiệt độ của giai đoạn này phải thích hợpcho quá trình bắt cặp bổ sung của mồi với chuỗi ADN khuôn, nó nhỏ hơn Tm của

2 đoạn mồi khoảng 2-3oC Tại đây, các đoạn mồi sẽ gắn bổ sung với trình tự bổtrợ trên các phân tử ADN khuôn Thời gian của giai đoạn này thờng kéo dài từ 30giây đến 1 phút

– Giai đoạn tổng hợp (Extention): Nhiệt độ ở giai đoạn này đợc tăng lên đếnnhiệt độ thích hợp cho ADN polymerase hoạt động tổng hợp nên sợi mới từ phứchợp mồi-khuôn Đối với Taq ADN polymerse thì nhiệt độ hoạt động tối u làkhoảng 72oC Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào độ dài của chuỗi ADN,thờng kéo dài từ 30 giây đến vài phút

Một chu kỳ phản ứng với 3 giai đoạn trên sẽ đợc lặp lại nhiều lần và mỗilần lặp lại làm tăng gấp đôi lợng mẫu của lần trớc Số chu kỳ phản ứng thờng là20-40 chu kỳ Sau khi chu kỳ cuối cùng kết thúc, giữ nhiệt độ ở 72oC trongkhoảng 5-10 phút để tất cả các sợi ADN đợc tổng hợp xong và các sợi đơn ADNxoắn lại tạo sản phẩm PCR Cuối cùng, nhiệt độ đợc hạ xuống 4oC để bảo quản

Kỹ thuật PCR đợc ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau nh: sản xuấtmẫu dò, phân lập gen, nhân bội ARN, nhận dạng ở mức độ phân tử, xác định vàchẩm đoán bệnh Tuỳ theo bản chất của những đoạn mồi sử dụng mμnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta, có những

hệ thống chỉ thị đặc tr ng gồm chỉ thị RAPD, SSR, AFLPương pháp chuyển nạp: Sử dụng súng bắn gen …

Hình 6: Các giai đoạn của một chu kỳ PCR

 Chỉ thị RAPD (Random Amplified Polymorphism ADN)

RAPD (Đa hình các đoạn khuếch đại ngẫu nhiên) đợc định nghĩa là sự đahình các đoạn ADN đợc khuếch đại ngẫu nhiên PCR_RAPD thực hiện dựa trêncơ sở sự bắt cặp ngẫu nhiên của các mồi đơn ngắn (10 nucleotide) với mạchkhuôn Các đoạn mồi oligonucleotide nếu bắt cặp ngẫu nhiên với cả hai mạch đốidiện của mạch khuôn ADN trong khoảng cách có thể khuếch đại đợc (dới3000bp) sẽ cho ra những đoạn ADN có kích thớc khác nhau sau khi khuếch đại.Sản phẩm thu đợc là tập hợp đa dạng các dòng đoạn ADN đặc trng cho mỗi loàithậm trí cho mỗi cá thể William và cộng sự (1990)

Theo lý thuyết 1 mồi ngẫu nhiên gồm 10 nucleotid thì xác suất bắt gặpbằng 1/410 = 1/1.048.576, nghĩa là một đoạn ADN khuôn có 1.048.576 cặpnucleotic có một trình tự bắt cặp với mồi Nh vậy, với một đoạn mồi ngẫu nhiên

có thể có 524 vị trí bắt cặp mồi, nghĩa là có thể có 262 đoạn ADN đợc nhân bội.Trong thực tế số lợng các đoạn đợc nhân bội nhỏ hơn nhiều vì nó phụ thuộc vào

độ dài đoạn đợc nhân bội và sự sắp xếp các trình tự bắt cặp với mồi trên ADNcủa bộ gen

Nguyên tắc phản ứng RAPD cũng nh nguyên tắc phản ứng PCR thông ờng Tuy nhiên, vì sử dụng mồi ngẫu nhiên nên nhiệt độ bắt cặp của mồi thấp đểtạo điều kiện bắt cặp không nghiêm ngặt Nhiệt độ bắt cặp của phản ứng là 30oC-

th-36oC Chính vì yếu tố đặc hiệu thấp nên kết quả RAPD thờng có độ lặp lại khôngcao và khó tối u phản ứng Đây chính là trở ngại lớn nhất của RAPD vì kết quảphụ thuộc rất nhiều yếu tố nh thành phần phản ứng PCR (đặc biệt là thành phần

Mg2+ và chất lợng ADN bản mẫu), các thiết bị cũng nh thao tác thí nghiệm

Khi phân tích đa hình di truyền bằng phơng pháp RAPD, nếu 2 cá thể có

bộ gen hoàn toàn giống nhau thì khi tiến hành phản ứng PCR_RAPD với bất kỳmồi nào cũng cho băng ADN giống nhau Nếu chúng ít nhiều có sự khác nhau về

bộ gen thì với một số mồi sẽ cho những băng khác nhau giữa chúng Sự khácnhau này thể hiện sựu đa hình di truyền của các cá thể cần nghiên cứu Do đó, nó

đợc sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm về di truyền phân tử

 Chỉ thị SSR (Microsatellite hay Simple Sequence Repeates)

Chỉ thị vi vệ tinh, l những đoạn ADN lặp lại một cách có trật tự, gồmμnh phần hoạt tính của thuốc diệt cỏ Basta,những đơn vị lặp lại gồm từ 1 đến 6 nucleotit, theo kiểu lặp lại ngắn Bản chất đahình của SSR có thể đ ợc sinh ra do sự nhân bội từ ADN tổng số của hệ gen nhờương pháp chuyển nạp: Sử dụng súng bắn gen