NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA CHỦNG NẤM MEN LÊN MEN VANG NHO CABERNET SAUVIGNON

Lý do chọn đề tài Rượu đã được con người sản xuất và sử dụng cách đây rất lâu vào khoảng 6000 năm trước Công Nguyên, trong đó rượu vang wine, vine là một sản phẩm được tạo thành trong qu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

NHO CABERNET SAUVIGNON

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

HÀ NỘI, 2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

NHO CABERNET SAUVIGNON

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Người hướng dẫn khoa học PGS TS Đinh Thị Kim Nhung

HÀ NỘI, 2015

LỜI CẢM ƠN

Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành gửi lời cảm

ơn đến cô giáo PGS TS Đinh Thị Kim Nhung - giảng viên môn Vi sinh,Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 - người đã tận tình hướngdẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóaluận này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo, các anh chị và các bạntrong tổ Vi sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, đã tạođiều kiện, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóaluận

Con cảm ơn bố mẹ, anh trai vì đã luôn yêu thương con và cho con cơhội để học bao điều hay trong cuộc sống…

Cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt thờigian qua

Tôi xin trân trọng cảm ơn !

Hà Nội, tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Thị Ngọc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các kếtquả nghiên cứu, số liệu được trình bày trong khóa luận là trung thực và khôngtrùng với tác giả khác

Hà Nội, tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Nguyễn Thị Ngọc

DANH MỤC BẢNG

CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

S cerevisiae : Saccharomyces cerevisiae

CFU : Colony Forming Unit

MỤC LỤC

7

MỤC LỤC 8

MỞ ĐẦU 8

1 Lý do chọn đề tài 8

2 Mục đích nghiên cứu 9

3 Nội dung nghiên cứu 9

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 10

5 Điểm mới của đề tài 10

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11

CHƯƠNG 2 27

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

32

CHƯƠNG 3 33

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Rượu đã được con người sản xuất và sử dụng cách đây rất lâu vào khoảng 6000 năm trước Công Nguyên, trong đó rượu vang (wine, vine) là một sản phẩm được tạo thành trong quá trình lên men từ dịch ép trái nho của một số chủng nấm men Song phải đến hàng ngàn năm sau, nhờ sự phát triển của khoa học kĩ thuật mà việc sản xuất rượu nho mới thực sự trở thành nghề mang tính thương mại của nhiều quốc gia trên thế giới như: Anh, Pháp, Đức (các nước thuộc khối liên minh Châu Âu), hay như Hoa Kỳ, Úc, Bungary, Bồ Đào Nha, Nga… với tổng sản lượng đạt khoảng 29 tỷ lít/năm Đến nay, rượu vang không chỉ được làm từ nho mà còn được làm từ nhiều loại quả khác

nhau rất phong phú và đa dạng như vang dâu, vang vải, vang mơ, vang táo,vang sherry, vang điều, vang lê,… tùy thuộc vào điều kiện tự nhiên của từngquốc gia Ở Việt Nam ngành sản xuất rượu vang mới thực sự bắt đầu nhữngnăm 80 của thế kỷ XX, được đánh dấu bằng sự hiện diện của vang ThăngLong Sau đó có một số cơ sở sản xuất rượu vang khác như vang Gia Lâm,Vang Thanh Ba, vang Đà Lạt… [12]

Nho Cabernet Sauvignon là giống nho làm rượu vang đỏ nổi tiếng nhất thế giới, được tạo ra nhờ sự kết hợp giữa hai dòng nho Sauvignon Franc và

Cabernet Blanc Đây là loại nho dễ trồng, có khả năng thích ứng rất tốt với

nhiều vùng đất khác nhau và đem trồng ở đâu cũng vẫn giữ được những đặctính rất riêng của thứ nho Quý phái nhất thế giới Hiện nay và những năm sắptới nhu cầu tiêu thụ rượu vang nho rất lớn và thị trường này đầy tiềm năng,

chính vì vậy việc nghiên cứu sử dụng nho Cabernet Sauvignon để sản xuất

vang theo chúng tôi là cần thiết có triển vọng và phù hợp với điều kiện thựctiễn của Việt Nam Chính vì những lí do trên nên tôi đã chọn và tiến hành

nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng nấm men

lên men vang nho Cabernet Sauvignon”.

2 Mục đích nghiên cứu

Phân lập được chủng nấm men có khả năng lên men vang nho

Cabernet Sauvignon Nghiên cứu một số tính sinh học và khả năng lên men

vang nho Cabernet Sauvignon của chủng nấm men tuyển chọn.

3 Nội dung nghiên cứu

3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang nho Cabernet Sauvignon

3.2 Nghiên cứu một số đặc tính sinh học của chủng nấm men lên men vang nho Cabernet Sauvignon

3.3 Lên men vang nho Cabernet Sauvignon

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

4.1 Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng

nấm men có khả năng lên men vang nho Cabernet Sauvignon.

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Nghiên cứu góp phần đưa ra qui trình sản xuất vang từ nho Cabernet

Sauvignon.

5 Điểm mới của đề tài

Đề tài không chỉ phân lập và tuyển chọn được chủng nấm men có khả

năng lên men vang nho Cabernet Sauvignon mà đã đi sâu nghiên cứu được

đặc điểm sinh lý, sinh hóa của chủng nấm men có khả năng lên men vang nho

Cabernet Sauvignon

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Sơ lược về đặc điểm và tình hình phát triển của nho Cabernet Sauvignon

Nho Cabernet Sauvignon là một trong những loại nho số 1 để làm vang

đỏ trên thế giới Quả của giống nho này nhỏ, tròn, có màu đen với vỏ rất dầy

và cứng cáp Nhờ lớp vỏ đó, loại nho này có thể chống chọi lại sâu bệnh, ít bịhỏng và có thể chống chịu được với những trận mưa của mùa thu Chính

những đặc tính đó kết hợp với hương vị được ưa thích nên Cabernet

Sauvignon là một trong những loại nho đỏ làm rượu vang phổ biến nhất trên

thế giới Quả nho có bốn thành phần chính: Cuống (3 đến 5% tổng trọnglượng): mỗi chùm có một cuống, được loại bỏ vào lúc ban đầu của quá trìnhlàm rượu Vỏ quả (6 đến 10%): chứa các chất tạo màu, cùng chất tannin vàcác men, làm cho nước cốt lên men Thịt (82 đến 90%): phần mềm bên trongcủa quả, là nguồn cấp nước cốt, gồm nước, đường, các acid, các chất muốikhoáng và vitamin Các hạt (2 đến 4%): giàu chất tannin và các dầu

Cabernet Sauvignon được trồng chủ yếu ở Bordeaux (thung lũng xứ

Loire, Languedoc, Roussillon, Provence và ở Tây Nam nước Pháp) và đượclan rộng cả ở các vùng trồng nho nổi tiếng khác ở các nước Tân thế giới như:

Chile, Argentina, Nam Phi, Úc, California (Mỹ) Ở Việt Nam, nho Cabernet

Sauvignon được trồng nhiều ở Ninh Thuận.

1.2 Khái quát chung về rượu vang

1.2.1 Phân loại rượu vang

Rượu vang là loại nước giải khát thơm ngon giàu chất bổ dưỡng với độcồn nhẹ và có hương thơm từ trái cây còn giữ lại trong rượu Rượu vang theođúng nghĩa là rượu lên men từ nước ép quả nho (không chưng cất) Gần đây

người ta mới mở rộng khái niệm rượu vang để chỉ các loại rượu lên men từcác loại quả khác nhau như: mơ, táo, dứa, vải, nhãn, xoài, [24].

Có nhiều cách phân loại khác nhau, có thể căn cứ vào chỉ tiêu giới hạn

về màu sắc của sản phẩm mà phân thành các loại: rượu vang đỏ là loại rượuvang có màu đỏ, đỏ lựu, đỏ thẫm; rượu vang trắng là rượu vang có màu vàngrơm đến vàng ánh; rượu vang hồng có màu hồng đến đỏ tươi

Hoặc căn cứ theo độ rượu, hàm lượng đường, hàm lượng axit cótrong rượu vang mà phân thành các loại: rượu vang khô, rượu vang dịu, rượuvang ngọt Nhưng xu hướng chung thì rượu vang được phân thành hai nhómchính là rượu vang không có gas (trong rượu vang thành phẩm không có CO2)

và rượu vang có gas (trong rượu vang thành phẩm có CO2), trong đó mỗinhóm lại phân thành một số loại khác nhau tùy theo hương, vị của từng loạisản phẩm

Bảng 1.1 Phân loại rượu vang

Loại rượu vang Độ cồn (%/V) Độ đường(%)

nặng (Fortified

wine)

Nặng 17 ÷ 20 1 ÷ 14Điểm

tâm

Nửa ngọt 14 ÷ 16 5 ÷ 20Ngọt 15 ÷ 17 14 ÷ 20Tạo hương 16 ÷ 18 6 ÷ 16

Rượu vang bọt

Đỏ 11 ÷ 13,5 7 ÷ 8Hồng 10,5 ÷ 12,5 6 ÷ 7Thơm (Muxcat) 10,5 ÷ 12,5 9 ÷ 12Rượu vang bọt 9 ÷ 12 3 ÷ 8

1.2.2 Nguyên liệu sản xuất rượu vang

Đây được coi là yếu tố hàng đầu, quyết định đến chất lượng của rượuvang Từ lâu nguồn nguyên liệu chủ yếu để sản xuất rượu vang ở hầu hếtquốc gia vẫn là dịch ép quả nho chín Để sản xuất rượu vang, người ta thườngphải quan tâm đến một số chỉ tiêu chất lượng của nguyên liệu như sau [24]:

Hàm lượng đường: là chỉ tiêu chính đánh giá chất lượng nguyên liệu,các giống nho được lựa chọn để sản xuất rượu vang cho đến nay hầu hết đều

có hàm lượng đường khá cao từ 18 ÷ 25%V

Thành phần và hàm lượng axit: Hai loại axit chủ yếu của nho là D-tartric và L - malic, trong đó D - tartric là axit khá mạnh, là chất đệm để giữrượu ở pH tương đối thấp Trong sản xuất rượu vang người ta ưa dùng loạinho có hàm lượng axit malic thấp

Pectin: Trong một số loại quả chín, pectin chiếm tỉ lệ trung bình từ 0,02

÷ 0,6% chủ yếu ở dạng keo và araban Sự có mặt của pectin trong thành phầndịch lên men và trong rượu vang sẽ làm tăng độ nhớt và bọt của sản phẩm,ảnh hưởng tới giá trị cảm quan

Tanin: Có chủ yếu ở cuống, vỏ và hạt quả, các loại nho trắng chứa hàmlượng tanin ≈ 0,02% ít hơn so với nho đỏ Sự có mặt của tanin trong rượuvang sẽ làm cho rượu có vị chát và có độ trong hơn, nhưng khi hàm lượngtanin trong dịch lên men càng nhiều sẽ ức chế hoạt động của nhiều loại enzim

và làm giảm quá trình lên men rượu

Các loại vitamin: Là thành phần chủ yếu có trong dịch quả và có vai tròrất quan trọng đối với sự sinh sản, phát triển của nấm men cũng như chấtlượng rượu vang

Các loại enzym: Trong dịch quả nho ép người ta đã phát hiện được một

số loại enzym proxylaza, polyphemoloxydaza, tananaza, pectinanza, catalaza,esteraza, có liên quan đến quá trình chín, hình thành màu của quả

1.2.3 Thành phần của rượu vang

Các thành tố cơ bản của một rượu vang đã hoàn thành là nước vàalcohol, một số thành tố khác có hàm lượng rất nhỏ, nhưng là tác nhân về chấtlượng và đặc điểm của rượu [26]

Nước (80 đến 85%): nước này phát sinh từ nước cốt trái nho, nên tinhkhiết về sinh học

Alcohol (10 đến 17%): các alcohol trong rượu vang là từ những chấtđường được nấm men chuyển hóa

Acid (0.4 đến 1%): các acid trong rượu vang cho rượu vang có vị chuađặc trưng, giúp tăng hương vị khi cân xứng với các thành tố khác

Các chất đường: trái nho chứa 15 đến 25% glucoza và fructoza, lànhững đường phần lớn được chuyển hóa thành alcohol trong quá trình lênmen

Các muối khoáng (0.2 đến 0.4%): các muối được sinh ra từ các acidkhoáng hoặc acid hữu cơ, thêm vị tươi mát vào hương vị của rượu vang

Các chất tạo hương vị và tạo màu (0.01 đến 0.5%): các phức chấtphenol tạo màu cho rượu và những khác biệt trong hương vị giữa các vang đỏ

và vang trắng

1.2.4 Tàng trữ rượu vang

Để rượu vang có chất lượng cao, người ta thường tàng trữ rượu vangvào trong các thùng gỗ sồi Những hóa chất có sẵn trong gỗ sồi có ảnh hưởngsâu sắc tới rượu vang Chất phenol trong gỗ sồi khi tác dụng với rượu vang sẽtạo mùi vanilla và vị ngọt chát của trà hay vị ngọt của hoa quả Gỗ sồi cũngtác động lên màu sắc của rượu

Chai rượu vang thường được bảo quản ở tư thế nằm ngang, từ 6 thángđến 1 năm trước khi bán nhằm đảm bảo tiếp xúc trực tiếp giữa rượu vang vànút, để có được tính chất hài hòa và bắt đầu phát triển những mùi thơm thứcấp thứ ba, được gọi là bouquet Điều này sẽ hạn chế việc nút chai bị khô vàkhả năng thẩm thấu của không khí qua các khe hở tạo ra trên nút khô nứt.Nhiệt độ thích hợp bảo quản rượu tốt nhất dưới 200C Nhiệt độ phải ít daođộng, sự thay đổi nhiệt độ làm rượu mau hỏng Tránh để rượu tiếp xúc vớiánh sáng trực tiếp của mặt trời Độ ẩm thích hợp 55% đến 75% Không khíkhô ráo, độ ẩm thấp là nguyên nhân vang mau hư hại.

Không phải mọi loại rượu vang đều thích hợp cho tàng trữ lâu để tăngchất lượng rượu Phần lớn các loại rượu vang trắng nên dùng khi còn trẻ Cácloại rượu vang đỏ giàu tannin được tàng trữ lâu hơn để chúng đạt đến độ chín.Vang đóng chai có thể bảo quản hàng chục năm trong hầm chứa ở nhiệt độthấp (khoảng 160C) [14]

1.3 Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men vang

Hệ vi sinh vật của rượu vang rất đa dạng và phong phú bao gồm cácloại nấm men, nấm mốc, vi khuẩn, chúng tồn tại trong không khí, đất, nước,dịch ép cùi quả và tham gia vào quá trình lên men rượu vang, trong số đó cónhiều loại khi tham gia vào quá trình biến đổi đã tạo ra những sản phẩm cólợi, nhưng cũng có nhiều loại lại tạo ra nhiều sản phẩm không có lợi, thậm chílàm hỏng rượu vang [28]

1.3.1 Nấm men

1.3.1.1 Sơ lược về nấm men

Nấm men (yeast) là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào,sinh sản chủ yếu theo lối nảy chồi Ngay từ năm 1857, Pasteur đã có nhữngnghiên cứu khá kỹ về nấm men rượu

Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên (trong đất, nước, không khí,thực phẩm, hoa quả), trong đó có nhiều loại nấm men có khả năng lên menrượu Chính vì vậy, từ lâu con người đã biết sử dụng chúng để sản xuất rượubia Nấm men sinh sản nảy chồi nhanh chóng, sinh khối của chúng giàuprotein và vitamin nên chúng còn được sử dụng rộng rãi trong các ngành côngnghiệp sản xuất thức ăn bổ sung cho người như sản xuất protein đơn bào, tạohương nước chấm, sản xuất dược phẩm, gần đây còn được sử dụng để sảnxuất lipit [13] Tuy nhiên, bên cạnh những nấm men có ích cũng có một sốloại nấm men dại có hại cho người, gia súc và làm hỏng sản phẩm.

Trước đây, căn cứ vào cấu tạo, đặc điểm sinh lý, khả năng lên men tạocồn và hương vị đặc trưng của nấm men khi lên men rượu vang, người tathường phân nấm men thường gặp trong quá trình sản xuất thành một số loại

S.vini chứa tới hơn 80% tổng số Saccharomyces, chúng có khả năng sinh ra

invectaza ngoại bào để chuyển hóa saccaroza thành fructoza và glucoza vì vậy

có thể sử dụng S.vini để lên men rượu từ dịch quả có bổ sung thêm saccaroza

ở hàm lượng khá cao S.vini có thể tạo được 18 ÷ 19%V cồn, có khả năng kết

lắng khá nhanh sau khi kết thúc quá trình lên men

Saccharomyces cerevisiae (còn gọi là S.cerevisiae var ellipsoideus) là

những tế bào có hình elip, kích thước tương tự như Saccharomyces vini, nhân

tế bào có chứa 17 đôi nhiễm sắc thể Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy S.

cerevisiae có khả năng lên men dịch có hàm lượng đường cao và có thể tạo

được 18 ÷ 20%V cồn, khả năng kết lắng và tạo hương, vị đặc trưng cho rượu

vang của S.cerevisiae cũng rất tốt, vì vậy trong sản xuất rượu vang có độ cồn cao, người ta thường sử dụng S.cerevisiae để lên men.

Saccharomyces oviformis: có hình dạng và kích thước tương tự như S.vini nhưng khả năng sinh sản và phát triển ở giai đoạn đầu chậm hơn S.vini,

do có khả năng chịu cồn khá tốt, nên số lượng tế bào vẫn tiếp tục tăng dần

trong quá trình lên men S oviformis không lên men galactoza, và có thể tạo thành màng trên bề mặt rượu vang khô có chứa 10%V cồn S oviformis có

khả năng lên men kiệt đường và độ rượu có thể đạt tới 18%V, sản phẩm cóhương vị khá tốt, nên thường được sử dụng để sản xuất các loại rượu vangkhô

Tuy nhiên theo công bố gần đây nhất của Barnet J A., Payne R W.,

Yarrow D., thì các chủng nấm men trên chỉ đồng danh của S cerevisiae [31].

Hình 1.1 Hình ảnh nấm men Saccharomyces cerevisiae

trong lên men rượu vang

1.3.1.2 Hình dạng, kích thước của tế bào nấm men

Tế bào nấm men đa số có cấu tạo hình cầu, hình trứng hoặc hình ô van.Hình dạng này có thể thay đổi phụ thuộc vào điều kiện môi trường, điều kiệnnuôi cấy và tuổi của tế bào [10]

Kích thước tế bào khoảng 3 – 10 µm x 5 – 12 µm Nấm men có màutrắng đục,vàng hoặc hồng nhạt, bề mặt tế bào thường khô và căng, có thể dínhriêng lẻ hoặc dính nhau thành chuỗi

1.3.1.3 Cấu tạo của tế bào nấm men

Các tế bào nấm men khác nhau thì có cấu tạo, thành phần khác nhaunhưng nhìn chung đều bao gồm: màng, chất nguyên sinh và nhân [10]

Màng: Màng tế bào có cấu tạo chủ yếu là hemixenluloza, chiếm khoảng

70% trọng lượng khô của tế bào (31% mannan + 29% glucam), ngoài ra cònchứa 1 – 3% kitin, 6 – 10% protein, 8 – 8.5% lipit, 7% chất khoáng

Chất nguyên sinh: Màng chất nguyên sinh là lipoprotein, chúng ăn sâuvào chất nguyên sinh tạo thành mạng lưới nội chất gồm 2 lớp và rầy 30 – 40

A0 Chất nguyên sinh của tế bào nấm men có một số bào quan như:

Ty thể: Có hình bầu dục hoặc dạng hạt và có thể thay đổi tùy thuộc vàođiều kiện của môi trường cũng như trạng thái sinh lý của tế bào Ty thể cómàng trong suốt, mỏng (60 – 80A0) có tính thấm cao,màng có cấu tạo 2 lớp,lớp trong hình thành nếp gấp hoặc ống nhỏ hình răng lược, lớp ngoài có cấutrúc bằng nhiều đơn vị hình thái Có khoảng 10 – 20 ty thể trong một tế bàonấm men, chúng tham gia vào quá trình sinh trưởng tế bào, sự hình thành vànảy chồi bào tử

Phức hệ golgi: Là nơi giải phóng các sản phẩm của quá trình dị hóa,đồng thời tổng hợp oligosaccarit từ monosaccarit cho màng tế bào

Lizoxom: Có chứa nhiều loại enzyme có khả năng phân giải protein,lipit, polysaccarit

Ngoài ra, trong tế bào nấm men còn chứa một hệ thống không bào hìnhthành từ thể golgi hay mạng lưới nội chất

Nhân: Khác với tế bào vi khuẩn tế bào nấm men có nhân thật Nhân cóhình ovan được bao bọc bởi lớp màng nhân Nhân có kích thước từ 1 – 2.4µm

× 2 – 8µm cấu tạo bởi protein, ADN, ARN và nhiều enzym

1.3.1.4 Sinh sản của tế bào nấm men

Nấm men có nhiều hình thức sinh sản (sinh sản vô tính, sinh sản hữutính) Bình thường tế bào nấm men sinh sản nảy chồi, khi gặp điều kiện khôngthuận lợi một số có thể sinh sản theo cách tạo bào tử [10], [19].

Sinh sản vô tính: sinh sản nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến nhất.Khi tế bào phát triển đến mức độ nhất định thì cơ thể nó đâm ra một chồi nhỏgọi là mầm (hay chồi) Mầm (tế bào con) đâm ra ở vị trí lệch tâm trên một đầucủa tế bào mẹ Cùng một lúc tế bào mẹ có thể đâm ra nhiều chồi Ở phía khácnhau, ở mỗi chồi sẽ nhận được một phần chất nhân và chất nguyên sinh ở tếbào mẹ Sau khi nảy mầm tế bào con có thể tách ra khỏi tế bào mẹ và tiếp tụcnảy mầm tạo ra một lớp tế bào giống nhau và giống hình cành cây

Nấm men có khả năng hình thành bào tử Bào tử túi được sinh ra trongnhững túi nhỏ gọi là túi nang Mỗi túi nang chứa từ 1 đến 8 bào tử Nấm menđược tạo thành từ một tế bào riêng rẽ không qua tiếp hợp Bào tử túi gặp điềukiện thuận lợi sẽ phát triển thành nấm men

Sinh sản hữu tính là hình thức hợp nhất hai tế bào nấm men thành hợp

tử Tế bào này phát triển thành túi trong đó có giảm nhiễm để hình thành cácbào từ

1.3.2 Vi khuẩn lactic

Các nghiên cứu đã chứng minh được trong quá trình sản xuất rượuvang, ngoài quá trình lên men tạo cồn của nấm men còn có quá trình lên menkhác là sự lên men malolactic để chuyển hóa axit malic có trong dịch quả nho

và rượu vang non thành axit lactic có vị chua dịu hơn ở trong rượu vang thànhphẩm mà tác nhân của quá trình lên men này chính là vi khuẩn lactic [7]

Hình 1.2 Một số vi khuẩn lactic trong lên men rượu vang

1.3.3 Các vi sinh vật gây hỏng rượu vang

Có không ít các loại vi khuẩn làm cho rượu vang bị đục, có vị chua gắt,

mùi khó chịu, làm cho rượu vang bị hỏng như Bacterium gacile, Acetobacter

xylium, Acetobecter xylium, Acetobacter acetic [7].

Các vi khuẩn kỵ khí: mặc dù một số vi khuẩn lactic đóng vai trò quan

trọng đối với sự lên men malolactic, xong phần lớn vi khuẩn lactic như: Lb.

brevis, Lb pastoriaus, Lb buchneri… đã làm cho rượu vang bị vẩn đục, có

mùi dưa muối, ngay cấu khi đã lắng xuống đáy thùng lên men, đã làm chohương vị của rượu vang bị thay đổi đáng kể

Các vi khuẩn hiếu khí: Một số loại nấm men tạo màng trên bề mặt rượu

vang như Pichia, Candida, Zygopichia… phân giải đường thành những axit

hữu cơ: xitric, axetic,… làm cho rượu vang bị đục, độ chua tăng cao

Các vi khuẩn thuộc Acetobacter oxy hóa etylic thành axit axetic và CO2

và H2O đã làm cho rượu vang có vị chua gắt của dấm, rượu vang bị nhớtkhông thể sử dụng được

Một số loại nấm men thuộc Torulopsis, Brettanomyces… lên men

đường thành rượu và nhiều loại axit bay hơi, làm hỏng rượu vang bị nhầy hóa,

Hansenula oxy hóarượu etylic, glyxerin, axit hữu cơ… làm cho rượu vang bị

đục, có vị đắng

1.4 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men

1.4.1 Nguồn cacbon

Cacbon có trong tế bào chất thành tế bào, trong tất cả các phản ứngenzyme, axit và các sản phẩm trao đổi chất [10] Vì vậy, những hợp chấtcacbon chiếm vị trí hàng đầu cho sự sống của nấm men Nguồn thức ăn chủyếu của nấm men là hidratcacbon đáp ứng 3 nhu cầu: sản sinh năng lượng, tạotiền chất và thực hiện các quá trình oxy hóa khử

1.4.2 Nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ

Nitơ rất cần cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm men Do đó, môitrường nuôi cấy cần cung cấp đầy đủ các hợp chất nitơ mà nấm men có thểđồng hóa Nitơ có tác dụng cung cấp nguyên liệu cho tế bào tổng hợp protein

và các chất khác của nguyên sinh chất [10]

1.4.3 Nguồn photpho vô cơ

Photpho có vai trò quan trọng đối với nấm men, là nguyên liệu để tổnghợp lên axit nucleic, các enzyme, các hợp chất cao năng ATP… nếu thay đổinồng độ của hợp chất photpho trong môi trường sẽ dẫn đến sự thay đổi cácquá trình tổng hợp hàng loạt các hợp phần của tế bào có chứa photpho như tếbào chất và nhân [10]

1.4.4 Nguồn nguyên tố khoáng

Trong môi trường dinh dưỡng cần phải có một lượng khoáng để đảmbảo cho tế bào phát triển [10] Các nguyên tố S, P đóng vai trò quan trọngtrong trao đổi chất của tế bào nấm men, tham gia chủ yếu vào thành phần củanhân, nhiễm sắc thể, các enzyme Ion Ca2+, Mg++ điều chỉnh sự phát triển của

tế bào nấm men Ion Fe++, Mg++ nằm trong thành phần của enzyme hoạt động

1.4.5 Ảnh hưởng của oxi

Oxi cần trong giai đoạn đầu giúp nấm men sinh trưởng, tăng sinh khối.Quá trình lên men diễn ra ở điều kiện hiếm khí để tăng hiệu quả tạo cồn, sựkhuấy đảo làm tăng tốc độ lên men rút ngắn thời gian lên men Ngoài ra,nguồn oxi có liên quan tới sự tổng hợp các xitocrom Nếu nồng độ oxi là 0,05micromol/l thì hệ thống xitocrom b, c1, c, a, a3 sẽ vắng mặt [10].

1.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men vang

1.5.1 Nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng của rượu vang, các côngtrình nghiên cứu cảu Hickinbotham, Ryan, Breckmann và Stier cho thấy khilên men ở điều kiện nhiệt độ lạnh thì hương, vị của rượu sẽ có mùi trái cây vàtươi hơn, hàm lượng axit bay hơi thấp hơn, hàm lượng glyxerin sẽ tăng hơn,ngược lại khi lên men ở nhiệt độ cao thì chất lượng của rượu vang sẽ bị kém

đi rõ rệt [26]

1.5.2 Độ pH

Nấm men có thể sinh sản và phát triển trong môi trường có độ pH từ2,5 ÷ 7,5, tuy nhiên độ pH phù hợp nhất với sự sinh sản và phát triển của nấmmen được xác định là 4 ÷ 6, nhiều chủng nấm men có thể sinh sản và pháttriển tốt ở pH 3 ÷ 3,5 vì vậy để hạn chế quá trình lây nhiễm và phát triển củanhiều loại vi khuẩn, phù hợp với độ pH tự nhiên của nguyên liệu các nhà sảnxuất luôn duy trì độ pH ở mức 3,2 ÷ 4,0 Theo Desoto và Warkentin ở pH ˂3,7 rượu vang sẽ chống được sự kết tủa của canxitartrate đồng thời cũng làmtăng giá trị cảm quan của sản phẩm [27] Độ pH thấp hoặc quá cao cũng sẽlàm thay đổi cấu trúc protein của nhiều loại enzyme tham gia trực tiếp vàoquá trình lên men rượu vang và làm giảm khả năng hoạt hóa của enzyme

1.5.3 Nồng độ rượu

Trong quá trình lên men rượu, nồng độ rượu tăng dần sẽ gây ức chếkhông chỉ cho các hoạt động sống của nấm men mà còn kìm hãm hoạt động

của nhiều loại enzyme chuyển hóa đường thành rượu, khả năng sống sót củanấm men phụ thuộc vào nhiệt độ và nồng độ rượu có trong dịch lên men [26].

1.5.4 Hàm lượng đường

Nhiều chủng nấm men có thể tồn tại trong dịch lên men có hàm lượngđường đạt tới 80% nhưng hầu hết các chủng nấm men lại không có khả nănglên men rượu, khi hàm lượng đường trong dịch lên men có từ 1 ÷ 2% thì tốc

độ lên men đạt nhanh nhất nhưng hiệu suất lên men lại thấp Hàm lượngđường phù hợp cho quá trình lên men rượu vang được xác định là 12÷20% vàkhi hàm lượng đường đạt 25% sẽ ức chế quá trình lên men [28]

Tỉ lệ các loại đường trong dịch lên men cũng ảnh hưởng lớn tới tốc độ

và hiệu suất lên men, glucoza là loại đường phù hợp nhất cho sự sinh sản vàphát triển của nấm men cũng như quá trình tạo rượu, tiếp đó là đườngfructoza và sacaroza…

1.5.5 Men giống

Số lượng tế bào nấm men có trong dịch lên men càng thấp thì thời giannhân giống và lên men rượu vang sẽ bị kéo dài hơn, dễ bị nhiễm khuẩn,ngược lại hàm lượng men giống trong dịch lên men càng cao thì thời gian lênmen sẽ ngắn hơn, hạn chế được khả năng nhiễm khuẩn do sự áp đảo của nấmmen Nhìn chung thì số lượng men giống trong dịch lên men chỉ nên từ 6 ÷ 10triệu tế bào/1ml dịch lên men là phù hợp [7]

1.5.6 Oxy hòa tan

Nồng độ oxy hòa tan giữ vai trò quan trọng không chỉ đối với sự sinhsản và phát triển tối đa của nấm men mà còn quyết định đến hiệu suất lên men

và chất lượng của rượu vang [7]

Khi môi trường có đủ oxy thì nấm men sẽ sử dụng đường làm nguồnnăng lượng tăng sinh khối theo phương trình:

C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + H2O + Q

Ngược lại, khi môi trường thiếu oxy thì nấm men lại tiến hành hô hấp

kỵ khí và chuyển hóa đường thành rượu theo phương trình:

C6H12O6 → 6CO2 + 2C2H5OH + Q

Sự có mặt của oxy trong quá trình lên men rượu sẽ làm cho sự tạothành ATP mạnh mẽ hơn và trạng thái tích lũy năng lượng E.C (eneray chare)của tế bào tăng lên đã ức chế quá trình lên men, làm giảm hiệu suất lên menrượu và được gọi là Hiệu ứng Pasteur

Vì vậy, khi lên men rượu vang để có được hiệu suất lên men rượu caonhất, đồng thời hạn chế quá trình tạo aldyhyt, rượu bậc cao, axit bay hơi,diaxetyl và axeton… có trong rượu thành phẩm, người ta hạn chế tối đa sự cómặt của oxy có trong dịch lên men khi tiến hành lên men kỵ khí [10], [29]

1.5.7 Ảnh hưởng của chất khử trùng

SO2 làm tăng lượng axetaldehyt và glyxerin trong quá trình lên men,đồng thời cũng hạn chế sự lên men malolactic, vì vậy việc sử dụng SO2 trongquá trình lên men rượu vang cũng cần phải có sự tính toán phù hợp với côngnghệ và thông thường sử dụng SO2 với hàm lượng 75 – 100ppm làm chất diệtkhuẩn, đồng thời là chất chống oxy hóa là phù hợp và có hiệu quả tốt [28]

1.6 Tình hình sản xuất vang nho Cabernet Sauvignon trên thế giới và ở

Việt Nam

Việc sản xuất rượu vang đã được con người biết từ thời Ai Cập cổ đại.Năm 1875, lần đầu tiên trong lịch sử, nhà bác học người Pháp Louis Pasteur

đã công bố các kết quả nghiên cứu của ông về quá trình lên men rượu Bước

“đột phá” này đã làm thay đổi về nhận thức, kỹ thuật với những cải tiến vềcông nghệ đã tạo ra các loại rượu vang có chất lượng cao hơn, được sản xuấtvới quy mô lớn hơn Tuy nhiên phải tới những năm 60 của thế kỉ 20 ngànhsản xuất rượu vang mới thực sự phát triển mạnh mẽ cả về số lượng và chấtlượng, có rất nhiều công trình nghiên cứu khoa học về kỹ thuật sản xuất rượu

vang đã được công bố và đưa vào sản xuất trong giai đoạn này, đánh dấu thời

kỳ hưng thịnh của rượu vang với sản lượng đạt khoảng 27,6 tỷ lít/năm Châu

Âu đứng đầu thế giới về sản xuất rượu vang với 80 % tổng sản lượng rượuvang trên toàn thế giới, châu Mỹ 14 %, châu Phi 5 %, châu Á – Úc 0,5 % Vớimột số thương hiệu vang nổi tiếng như: Johnnie Walker – thương hiệu hàngđầu trên thế giới với 2 nhãn hiệu lớn là Red Label và Black Label, hãngCourvoier với nhãn hiệu Courvoier XO nổi tiếng, rượu Bordeau –Pháp Sảnlượng rượu vang toàn cầu đã đạt mức đỉnh vào năm 2004 khi cung vượt cầukhoảng 600 triệu thùng (1 thùng gồm 12 chai, tương đương với 9 lít) và đangtrên đà sụt giảm kể từ đó đến nay Năm 2013 sản lượng vang toàn cầu có thểđược coi là tương đối cao, mang đến hy vọng về một sản lượng rượu vang caotrong những năm kế tiếp [15], [16] Hiện nay trên thế giới đã có nhiều côngtrình nghiên cứu và sản xuất các loại vang khác nhau Đặc biệt là vang nho

Cabernet Sauvignon đã trở thành loại vang nổi tiếng số 1 thế giới, đặc biệt là

ở Pháp được trồng và sản xuất vang Cabernet Sauvignon với số lượng lớn.

Ở Việt Nam, từ những năm cuối thập niên 90 trở về trước, vẫn chưa cómột nhà sản xuất rượu vang nào trong nước sản xuất ra những loại rượu vang

“chính thống”, theo công nghệ Châu Âu, rượu vang trong nước chủ yếu đượcnhập ngoại từ các nước Châu Âu, với nhãn hiệu vang Bordeaux của Pháp,được nhiều người tiêu dùng biết đến, sử dụng Tuy nhiên khoảng 100 nămnay nhờ sử dụng quy trình sản xuất rượu vang chất lượng cao chúng ta cho rađời dòng vang đầu tiên khá thành công Vine Wine Theo công nghệ sản xuất

đó một loạt những dòng vang khác lần lượt ra đời: Vang Gia Lâm, vang Đông

Đô, vang Tây Hồ,… Đến nay nhiều công trình nghiên cứu trong lĩnh vực sảnxuất rượu vang nho cũng đã và đang được tiến hành mang lại nhiều kết quảtốt Đồng thời vang Việt Nam cũng bắt đầu bước vào thời kỳ hội nhập các sảnphẩm cũng được xuất khẩu đến 1 số nước trên thế giới Vang Đà Lạt, Anh

Đào, Sao La là những sản phẩm được yêu thích ở Việt Nam bởi mùi vị vàchất lượng Đặc biệt năm 2008 vang Đà Lạt được Phòng Thương mại Côngnghiệp Việt Nam và AC Nielsen Việt Nam trao tặng danh hiệu Thương hiệunổi tiếng (trong top 500 thương hiệu nổi tiếng nhất tại thị trường Việt Nam).Theo thống kê của Hiệp hội Rượu Bia và Nước giải khát Việt Nam, hiện cảnước có hơn 15 doanh nghiệp sản xuất và đóng chai rượu vang với sản lượng

mỗi năm tăng khoảng 12 – 13 triệu lít [11] Nho Cabernet Sauvignon là loại

nho mới ở Việt Nam chưa được biết đến nhiều, nên chưa có nhiều công trình

nghiên cứu và hoạt động sản xuất rượu vang nho Cabernet Sauvignon.

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Dịch siro nho Cabernet Sauvignon do TS Nguyễn Quang Thảo, Vụ

Khoa Học Công Nghệ, Bộ Công Thương cung cấp Cây nho thuộc họ Nho:

Vitaceae Loài: Vitis vinifera.

Các chủng nấm men nghiên cứu được phân lập từ dịch siro nho

Cabernet Sauvignon.

2.1.2 Hóa chất

Các loại đường: saccaraza, glucoza, fructoza, một số chất vô cơ, hữucơ: KH2PO4, MgSO4.7H2O, NaOH, HCl, (NH4)2HPO4, (NH4)2SO4 Rượuetylic, pepton, agar, phenolphthalein, nước máy, cồn

KH2PO4 : 1,0g(NH4)2SO4 : 1,0g Nước cất : 1000ml

2.1.4.3 Môi trường lên men (MT3): g/l

Dịch siro hoa quả: 200ml MgSO4.7H2O : 0,5g

KH2PO4 : 1,0g(NH4)2SO4 : 1,0g Nước cất : 1000ml

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp thu mẫu

Nguyên liệu để sản xuất rượu vang là nho Cabernet Sauvignon Dùng siro nho Cabernet Sauvignon do TS Nguyễn Quang Thảo cung cấp, đem pha

loãng với nước cất theo tỉ lệ 2 :1 ta được dịch siro nho, dùng dịch đó để phânlập và lên men Siro nho lấy về bảo quản trong tủ lạnh ở 40C

2.2.2 Phương pháp phân lập

Dịch siro nho sau khi pha loãng, ta để trong tủ ấm 280C trong 3 ngàyrồi tiến hành phân lập Dùng pipet hút 1ml dịch siro này chuyển sang ốngnghiệm chứa sẵn 9ml nước biển đã thanh trùng, trộn đều, được dịch siro có độ

pha loãng 10-2 Thao tác tương tự với ống nghiệm thứ hai, thu được dịch siro

có độ pha loãng 10-3 Thao tác tương tự với ống nghiệm thứ ba, thu được dịchsiro có độ pha loãng 10-4 Thao tác tương tự với ống nghiệm thứ tư, thu đượcdịch siro có độ pha loãng 10-5 Thao tác tương tự với ống nghiệm thứ năm, thuđược dịch siro có độ pha loãng 10-6 Dùng pipet hút 100µl dịch siro có độ phaloãng 10-5 , 10-6 nhỏ lên bề mặt thạch trong hộp petri chứa môi trường phân lậpMT1, trang đều dịch siro trên bề mặt thạch, sau đó gói các hộp petri lại và đặttrong tủ ấm 24 - 28ºC Sau 24 - 48h trên mặt thạch xuất hiện các khuẩn lạc to,trơn, nhẵn, bóng Sau đó đem cấy vào ống thạch nghiêng để tiến hành cácnghiên cứu tiếp theo [5]

2.2.3 Phương pháp giữ giống

Tiến hành cấy truyền các chủng nấm men giống định kỳ 1.5 - 2 thángmột lần trên ống nghiệm thạch nghiêng chứa môi trường MT1, đặt trong tủ

ấm 24 - 28ºC, sau 1- 2 ngày khi nấm men đã mọc tốt thì chuyển sang giữtrong tủ lạnh ở nhiệt độ 4ºC

2.2.4 Phương pháp hoạt hóa giống

Cấy chủng nấm men nghiên cứu trên môi trường MT1 ở nhiệt độ 28ºCtrong 48h, cấy chuyển sang môi trường MT2, nuôi trong máy lắc với tốc độ

180 vòng/phút ở nhiệt độ 28ºC trong 24 giờ, lúc này chủng nấm men đã đượchoạt hóa xong (giống nấm men) sẵng sàng sử dụng cho các thí nghiệm tiếptheo Các thí nghiệm được lặp lại 3 lần và lấy giá trị trung bình [9]

2.2.5 Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men

Xác định hoạt lực lên men của nấm men thông qua hàm lượng CO2

được sinh ra (g/l dịch lên men) khi tiến hành lên men các chủng nấm men đãhoạt hóa trong các bình tam giác chứa môi trường lên men MT3 và có cùng sốlượng tế bào nấm men của các giống khác nhau Hàm lượng CO2 sinh ra càngnhiều chứng tỏ hoạt lực lên men càng tốt Sau 72 giờ lên men đem cân trọnglượng chênh lệch giữa 2 lần cân là 0,1 thì dừng lại Hàm lượng CO2 sinh ra