ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn lọc cá thể mang gen tăng số hạt trên bông phục vụ công tác chọn tạo giống lúa cao sản

Tôi xin cảm ơn đề tài :“ Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết với các tính trạng cấu thành năng suất tạo giống lúa thuần siêu năng suất”, mã số: KC.06.12/11-15 do Bộ Khoa học và

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

LÊ THỊ THÀNH

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CHỌN LỌC CÁ THỂ MANG GEN TĂNG SỐ HẠT TRÊN BÔNG PHỤC

VỤ CÔNG TÁC CHỌN TẠO GIỐNG LÚA CAO SẢN

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

HÀ NỘI, 2015

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN

LÊ THỊ THÀNH

ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CHỌN LỌC CÁ THỂ MANG GEN TĂNG SỐ HẠT TRÊN BÔNG PHỤC

VỤ CÔNG TÁC CHỌN TẠO GIỐNG LÚA CAO SẢN

Chuyên ngành : Khoa học cây trồng

Mã số : 60620110

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :

TS TRẦN ĐĂNG KHÁNH

HÀ NỘI, 2015

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất tận tình của cơ quan, của thầy hướng dẫn, các thầy cô và Ban Đào tạo sau Đại học

Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS Trần Đăng Khánh (Viện

Di truyền Nông nghiệp) đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Viện Di truyền và ban lãnh đạo Trung tâm Chuyển giao công nghệ và Khuyến nông đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện tốt

đề tài nghiên cứu trong những năm qua

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Bộ môn Sinh học phân tử (Viện Di truyền Nông nghiệp) nơi tôi thực hiện nội dung phân tử và các thí nghiệm trong luận văn

Tôi xin cảm ơn đề tài :“ Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết với các tính trạng cấu thành năng suất tạo giống lúa thuần siêu năng suất”, mã số: KC.06.12/11-15 do Bộ Khoa học và Công nghệ là cơ quan chủ quản đề tài đã hỗ trợ kinh phí để tôi thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể các bạn trong lớp cao học khóa K22, đồng nghiệp và gia đình đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành bản luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Học viên

Lê Thị Thành

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Toàn bộ số liệu

và kết quả nghiên cứu trong luận án này là trung thực và chưa được sử dụng để bảo

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Lời cam đoan iii

Mục lục iv

Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt vi

Danh mục bảng vii

Danh mục hình viii

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài 2

2.1 Mục tiêu của đề tài 2

2.2 Yêu cầu của đề tài 2

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài 2

3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài 3

4.1 Đối tượng nghiên cứu 3

4.2 Phạm vi nghiên cứu 3

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 4

1.1 Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu 4

1.1.1 Chỉ thị phân tử và những ứng dụng trong nghiên cứu di truyền 4

1.1.2 Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử 8

1.2 Một số kết quả nghiên cứu trong nước và trên thế giới 15

1.2.1 Tình hình nghiên cứu chọn giống nhờ phương pháp MAS và QTL/gen tăng số hạt/bông trên thế giới 15

1.2.2 Tình hình nghiên cứu và một số thành tựu nghiên cứu về chọn giống nhờ phương pháp MAS và QTL/gen tăng số hạt /bông trong nước 20

CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Vật liệu nghiên cứu 23

2.3 Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng 24

2.3.1 Kỹ thuật sử dụng trong phòng thí nghiệm 24

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu thí nghiệm ngoài đồng ruộng 28

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 Xác định cá thể của tổ hợp Khang Dân 18 và KC25 mang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông 31

3.1.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số 31

3.1.2 Xác định cá thể F4 của tổ hợp lai Khang Dân 18/KC25 mang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông 32

3.2 Đánh giá các cá thể của tổ hợp Khang Dân 18 và KC25 mang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông trên đồng ruộng 34

3.2.1 Đặc điểm sinh trưởng ở giai đoạn mạ của các dòng lúa thí nghiệm 34

3.2.2 Thời gian qua các giai đoạn sinh trưởng của các dòng, giống lúa thí nghiệm 36

3.2.3 Động thái sinh trưởng của các dòng, giống lúa thí nghiệm 39

3.2.4 Đặc điểm hình thái của các dòng giống lúa thí nghiệm 48

3.2.5 Sự xuất hiện sâu bệnh tự nhiên trên đồng ruộng 50

3.2.6 Một số tính trạng số lượng của các giống lúa thí nghiệm 53

3.2.7 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 56

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 61

1 Kết luận 61

2 Đề nghị 62

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

DANH MỤC TÀI LIỆU ĐÃ CÔNG BỐ 67

PHỤ LỤC 68

DANH MỤC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Từ/ cụm từ

ADN : Acid Deoxyribonucleoic

Đ/C : Đối chứng

IRRI : Viện nghiên cứu lúa quốc tế

NSLT : Năng suất lý thuyết

TGST : Thời gian sinh trưởng

NSTT : Năng suất thực thu

QTL : Tính trạng di truyền số lượng

MARKER : Chỉ thị

DANH MỤC BẢNG

TT

Bảng 2.1 Thông tin các cặp mồi sử dụng 23

Bảng 2.2 Thành phần của phản ứng PCR 25

Bảng 3.1 Đặc điểm sinh trưởng của mạ trong vụ Xuân 2015 của các dòng, giống lúa thí nghiệm 35

Bảng 3.2 Thời gian các giai đoạn sinh trưởng của các dòng lúa thí nghiệm Vụ Xuân 2015 37

Bảng 3.3 Tốc độ tăng trưởng chiều cao của các giống lúa thí nghiệm 41

Bảng 3.4 Động thái tăng trưởng số nhánh của dòng giống trong vụ Xuân 2015 43

Bảng 3.5 Động thái ra lá của các giống lúa thí nghiệm vụ Xuân 2015 46

Bảng 3.6 Đặc điểm hình thái của các giống lúa thí nghiệm vụ Xuân 2015 49

Bảng 3.7 Tình hình xuất hiện sâu bệnh trên các giống lúa thí nghiệm trong vụ Xuân 2015 51

Bảng 3.8 Một số tính trạng số lượng của các giống lúa thí nghiệm vụ Xuân 2015 53

Bảng 3.9 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất của các dòng, giống lúa trong vụ Xuân 2015 57

Bảng 3.10 Giới thiệu dòng lúa có triển vọng 60

trong vụ Xuân 2015 40 Hình 3.5 Đồ thị động thái tăng trưởng số nhánh của dòng giống thí nghiệm

trong vụ Xuân 2015 44 Hình 3.6 Đồ thị tốc độ ra lá của các dòng, giống trong vụ Xuân 2015 47 Hình 3.7 Đồ thị chiều cao cây của các dòng giống lúa trong thí nghiệm 54 Hình 3.8 Đồ thị một số tính trạng số lượng của các dòng, giống lúa trong

thí nghiệm 55 Hình 3.9 Đồ thị số hạt/bông của các dòng, giống lúa trong thí nghiệm 58

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong ba loại cây lương thực chính trên toàn

thế giới (lúa mì, lúa nước và ngô), khoảng 40% dân số thế giới coi lúa gạo là nguồn lương thực chính và 25% dân số sử dụng lúa gạo trên 1/2 khẩu phần lương thực hàng ngày (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2009) [1]

Ở châu Á và khu vực Đông Nam Á (trong đó có Việt Nam) lúa gạo là cây trồng truyền thống Việt Nam là một trong năm nước có diện tích trồng lúa lớn nhất thế giới và là một trong những nước xuất khẩu gạo đứng hàng đầu trên thế giới, đây

là nguồn thu ngoại tệ lớn nhất của nền nông nghiệp xuất khẩu Theo số liệu thống kê năm 2014, Việt Nam với diện tích khoảng 7,81 triệu hecta sản xuất được 44,98 triệu tấn thóc, không những đảm bảo an ninh lương thực Quốc gia mà còn xuất khẩu được 6,9 triệu tấn gạo (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2014) [2]

Ngày nay, công nghệ sinh học đã tạo ra một công cụ hỗ trợ to lớn và hiệu quả cho công tác chọn tạo giống cây trồng Sử dụng chỉ thị phân tử ADN cho phép phân tích di truyền và những tính trạng nông học quan trọng Chọn giống cây trồng nhờ chỉ thị phân tử đã trở nên hữu hiệu, không chỉ đối với các tính trạng được điều khiển bởi các gen chính mà đối với cả những tính trạng số lượng được điều khiển bởi các gen phụ hay các QTL Hiệu quả đã cải tiến năng suất cây trồng tăng gấp nhiều lần

so với chọn giống cổ điển nhờ thực hiện chọn lọc không cần trực tiếp trên tính trạng mong muốn, mà thông qua chỉ thị phân tử liên kết với kiểu gen quy định tính trạng

đó Mặt khác, phương pháp này cho phép thanh lọc kiểu hình với một khối lượng quần thể lớn, thông qua chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử người ta có thể xác định được kiểu hình ở ngay thế hệ phân ly đầu tiên ở F2, F3, góp phần tiết kiệm thời gian và công sức cho quá trình nghiên cứu Bằng con đường chọn giống nhờ chỉ thị phân tử nhiều gen kháng sâu bệnh và gen quy định năng suất, chất lượng đã được quy tụ thành công vào một số giống lúa

Trong những năm gần đây, quá trình đô thị hóa, công nghiệp hóa diễn ra

nhanh chóng, diện tích đất trồng lúa ngày càng bị thu hẹp và chịu những ảnh hưởng tiêu cực từ biến đổi khí hậu, bên cạnh đó áp lực dân số ngày càng tăng đòi hỏi nguồn cung lương thực ngày càng lớn Việc phát triển nguồn giống cho năng suất cao, chất lượng tốt là yếu tố quan trọng, cấp bách và có ý nghĩa cho an toàn lương thực, đảm bảo sản lượng lúa Trước thực tiễn đó, việc ứng dụng chỉ thị phân tử nhằm chuyển các gen tăng năng suất vào giống lúa trồng đại trà là một vấn đề cấp thiết

Xuất phát từ những vấn đề trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Ứng

dụng chỉ thị phân tử trong chọn lọc cá thể mang gen tăng số hạt trên bông phục vụ công tác chọn tạo giống lúa cao sản”

2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

2.1 Mục tiêu của đề tài

- Ứng dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử để kiểm tra, xác định các cá thể trong quần thể F4 mang QTL/gen tăng số hạt trên bông

- Đánh giá, chọn lọc các cá thể mang QTL/gen tăng số hạt/bông với các đặc điểm nông sinh học, thời gian sinh trưởng, phát triển, hình thái, năng suất phù hợp với các đặc tính mong muốn để phát triển giống mới mang QTL/gen quy định số hạt/bông

2.2 Yêu cầu của đề tài

Chọn, tạo được 1- 2 dòng/giống lúa trồng tại Đồng bằng Sông Hồng mang QTL/gen tăng số hạt trên bông

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3.1 Ý nghĩa khoa học của đề tài

Ứng dụng chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là phương pháp thiết thực, hiệu quả trong việc chọn được dòng/giống mang locus gen quy định tính trạng di truyền số lượng (QTL) hay gen quan tâm giúp khắc phục được những hạn chế của chọn giống truyền thống đặc biệt là đối với các gen tăng số hạt trên bông, cho phép rút ngắn quá trình chọn lọc, giảm chi phí trong chọn giống Làm cơ sở cho chương trình chọn tạo giống lúa có năng suất cao ở khu vực đồng bằng sông Hồng

3.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

- Ứng dụng chọn giống nhờ chỉ thị phân tử góp phần rút ngắn thời gian trong quá trình chọn giống và ứng dụng nhanh vào thực tiễn sản xuất

- Sản phẩm của đề tài: Một số dòng mang QTL/gen tăng số hạt trên bông được chọn lọc sẽ là vật liệu khởi đầu rất tốt phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa thuần năng suất cao

4 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu của đề tài

4.1 Đối tượng nghiên cứu

- Quần thể F4 mang QTL/gen quy định tính trạng số hạt/bông

Đề tài thực hiện từ tháng 6/2014 đến tháng 6/2015

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI

1.1 Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu

1.1.1 Chỉ thị phân tử và những ứng dụng trong nghiên cứu di truyền

1.1.1.1 Khái niệm chỉ thị phân tử

Trong một vài thập kỷ vừa qua, chúng ta đã chứng kiến sự phát triển vượt bậc của công nghệ sinh học, đặc biệt là quá trình phát triển nhanh chóng trong lĩnh vực di truyền học phân tử đã cho ra đời nhiều kỹ thuật phân tích biến dị di truyền đạt kết quả cao Chỉ thị di truyền gồm có ba loại chỉ thị hình thái, chỉ thị hoá sinh, chỉ thị phân tử Trong đó, chỉ thị phân tử được xem là công cụ rất hiệu quả để đánh giá đa dạng sinh học phục vụ công tác chọn giống cây trồng (Nguyễn Quang Thạch

và CS, 2005)[10] Vậy chỉ thị phân tử là gì? Chỉ thị phân tử (chỉ thị DNA) có thể được định nghĩa như một đoạn DNA đặc hiệu, biểu hiện khác biệt ở mức độ phân tử trong hệ gen (genome) Chúng có thể có hoặc không tương quan tới biểu hiện kiểu

chỉ thị phân tử có thể hiểu đơn giản chúng như những “cột mốc” nằm trên trình tự

ADN trong hệ gen Sự hiện diện của các cột mốc và khoảng cách tương đối giữa chúng phản ánh mức độ biến dị giữa các cá thể, giống, loài trong một quần thể Sinh vật có khả năng nhân bản DNA của chúng với độ chính xác cao nhưng có nhiều cơ chế xảy ra có thể làm thay đổi cấu trúc DNA, đơn giản như sự thay đổi bắt cặp hoặc phức tạp hơn như sự đảo đoạn, chuyển đoạn hoặc mất đoạn… Do đó chỉ thị phân tử được xem là công cụ cực kì hiệu quả trong việc đánh giá tính đa dạng sinh học phục

vụ cho công tác nghiên cứu di truyền và chọn giống cây trồng

Chỉ thị phân tử cho phép xác định được các đặc điểm trực tiếp của kiểu gen

thông qua việc xác định trình tự nhất định của gen hoặc các trình tự liên kết chặt với các gen mang tính trạng mong muốn Bằng việc sử dụng các chỉ tiêu phân tích trực tiếp kiểu gen trên, con người đã đi thẳng vào bản chất di truyền của các tính trạng, khắc phục được ảnh hưởng của các yếu tố môi trường, theo dõi và phát hiện các gen mong muốn, sự biến đổi của chúng qua các thế hệ ngay cả khi chưa có sự biểu hiện

ra kiểu hình Vì vậy, chỉ thị phân tử được coi là chỉ tiêu phản ánh chân thật bản chất

di truyền (Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 2005)[10] Các chỉ thị phân tử DNA bao gồm:

- Chỉ thị phân tử không dựa trên cơ sở lai DNA hay chỉ thị RFLP

- Chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản DNA bằng kỹ thuật PCR như AFLP, RAPD, STS, SSR

Trong đó chỉ thị dựa trên cơ sở nhân bản DNA được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền học, sinh thái học, phân loại và di truyền học tiến hoá, chọn giống do đặc điểm đơn giản và dễ sử dụng bởi PCR, sau đó thực hiện trên gel điện

di biến tính để xác định kích thước alen và mức độ thông tin cao được cung cấp bởi một số lượng alen lớn trên locus

1.1.1.2 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu di truyền

* Nghiên cứu đa dạng di truyền

Một trong những ứng dụng của chỉ thị phân tử trong chọn giống là phân tích tính đa dạng di truyền Dựa vào chỉ thị phân tử có thể xác định tính đa dạng di truyền giữa các giống, các loài, giữa các cá thể trong cùng loài Những chỉ thị phân

tử phản ánh những thay đổi có thể di truyền trong trình tự chuỗi ADN ở cả những vùng mã hóa và không mã hóa Bởi vậy nó cung cấp những công cụ hữu hiệu cho việc nghiên cứu đa dạng di truyền giúp cho việc khám phá sự biến đổi loài và mối quan hệ chủng loại phát sinh giữa các quần thể và giữa các loài

Không chỉ có vậy, nghiên cứu đa dạng di truyền còn giúp đánh giá nguồn tài nguyên di truyền của các tập đoàn giống cây trồng, vật nuôi, giúp cho việc sử dụng nguồn tài nguyên di truyền hiệu quả hơn Đặc biệt, nghiên cứu đa dạng di truyền có thể giúp tiên đoán khả năng cho ưu thế lai giữa các cặp bố mẹ Cặp bố mẹ nào có khoảng cách di truyền xa hơn thường sẽ cho ưu thế lai lớn hơn

Một số chỉ số cần thiết

Tương đồng di truyền giữa 2 mẫu: I =

2 1

12

Q Q q

Khoảng cách di truyền giữa 2 mẫu: D = – ln(I)

Trong đó: q12 - số các alen đồng nhất ở cả 2 mẫu

Q1 và Q2 - tổng số các alen của mẫu 1 và mẫu 2

Tương đồng di truyền: biến thiên từ 0 đến 1 Các mẫu có độ tương đồng càng gần trị số 1 thì chúng có mức độ tương đồng di truyền càng lớn hơn Khoảng cách

di truyền: Biến thiên từ 0 đến ∞ (vô cực) Các mẫu có khoảng cách di truyền gần tới trị số 0 thì chúng càng gần nhau Các mẫu có khoảng cách di truyền càng lớn thì chúng càng xa nhau (về phương diện di truyền) Dựa vào tương đồng di truyền hoặc khoảng cách di truyền, người ta thiết lập sơ đồ cây Sơ đồ cây phản ánh trực quan các nhóm mẫu gần nhau hay xa nhau

Một số chương trình phân tích đa dạng di truyền

NTSYS: Rất phổ biến Sử dụng các thông số “1” hay “+” (có mặt), và “0” hay “-“ (vắng mặt) Có thể dùng chương trình NTSYS cho các chỉ thị phân tử RAPD, AFLP hay các chỉ thị “trội’ khác

PopGene: Tương đối phổ biến Sử dụng các thông số “1” (có mặt), và “0” (vắng mặt) trong trường hợp chỉ thị di truyền là “trội”, hoặc các thông số AA, BB,

CC, AB, AC, BC trong trường hợp chỉ thị di truyền là “đồng trội” Ngoài ra, PopGene còn được sử dụng trong trường hợp cần đánh giá những mẫu vật của nhiều quần thể hoặc nhóm các quần thể

* Lập bản đồ phân tử

Một trong những ứng dụng quan trọng của chỉ thị phân tử là lập bản đồ di truyền Bản đồ di truyền hiện đại được thiết lập dựa trên cơ sở các loại chỉ thị phân tử ADN (các chỉ thị RFLP, STS, SSR, RAPD, AFLP ) Trong quá trình giảm phân, các gen trên cùng nhiễm sắc thể (NST) thường được phân ly cùng nhau như một nhóm liên kết gen Tuy nhiên, sự liên kết này không hoàn toàn do kết quả của quá trình trao đổi chéo giữa các NST tương đồng Kết quả của hiện tượng này là sự tái tổ hợp giữa các gen trong một cặp NST Tần số trao đổi chéo

giữa hai gen nào đó phản ánh khoảng cách tương đối giữa chúng Như vậy bản đồ

di truyền của NST biểu thị vị trí tương đối của các gen Sự liên kết của những gen nằm trên cùng một NST được trình bày thành một bản đồ liên kết hay bản đồ NST thể hiện trình tự tuyến tính của các gen dọc theo NST với khoảng cách giữa các gen liền kề tỉ lệ thuận với tần số tái tổ hợp giữa chúng Đơn vị khoảng cách trong bản đồ liên kết được coi là đơn vị bản đồ, nó được xác định bằng phần trăm (%) tần số tái tổ hợp, trong đó 1 centiMorgan (cM) tương đương với 1% tái tổ hợp Bản đồ di truyền hiện đại được lập trên cơ sở sự liên kết giữa các chỉ thị phân tử với các gen kiểm soát các tính trạng nghiên cứu Sự có mặt của gen quan tâm trong các cá thể được biểu hiện ở kiểu hình Các chỉ thị ADN đồng phân ly với các gen là những chỉ thị liên kết gen Khoảng cách giữa các chỉ thị và gen được thể hiện bằng tần số tái tổ hợp giữa chúng

* Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (Marker-assisted selection)

Từ lâu, các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị hình thái liên kết với một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng chúng như một phương tiện hữu ích trong quy trình chọn tạo giống mới Ở đây, thay vì phải đánh giá kiểu hình của

cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong muốn, người ta chỉ cần đi tìm những cá thể riêng biệt mang các chỉ thị hình thái liên kết với các gen đó Tuy nhiên các chỉ thị hình thái vốn có số lượng không nhiều, còn những chỉ thị

“may mắn” (liên kết với gen quan tâm) lại càng hiếm gặp, vì thế giá trị thực tiễn của chỉ thị hình thái trong chọn giống gặp nhiều hạn chế Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chỉ thị phân tử, các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm nhiều hơn tới vấn

đề chọn giống nhờ chỉ thị phân tử MAS (Marker-assisted selection) với ý đồ sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết với các gen mong muốn trong chọn tạo giống mới

1.1.1.3 Ưu thế chỉ thị phân tử so với chỉ thị hình thái

Tanksley (2009) [28] khi lập bản đồ đa gen đã nêu ra những ưu thế của chỉ thị phân tử so với chỉ thị hình thái như sau:

a Kiểu gen của các locus chỉ thị phân tử có thể được xác định tại bất kỳ giai đoạn nào và ở bất cứ mức độ nào: tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể, trong khi kiểu hình của phần lớn các chỉ thị hình thái chỉ có thể phân biệt được trong những giai đoạn

nhất định và thường ở mức độ toàn bộ cơ thể

b Số lượng các chỉ thị phân tử là cực kỳ lớn, trong khi số lượng các chỉ thị hình thái rất hạn chế

c Các alen khác nhau của chỉ thị phân tử thường không liên kết với các hiệu ứng có hại, trong khi việc đánh giá các chỉ thị hình thái thường hay đi kèm với những hiệu ứng kiểu hình không mong muốn

d Các alen của các chỉ thị phân tử phần lớn là đồng trội, vì thế cho phép phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào, còn các alen của các chỉ thị hình thái thường tương tác theo kiểu trội-lặn, do đó bị hạn chế sử dụng trong nhiều tổ hợp lai

e Đối với chỉ thị hình thái, các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc đánh giá các cá thể phân ly ở trong cùng một quần thể phân ly, còn đối với chỉ thị phân

tử, hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất hiếm gặp (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2004) [4]

1.1.2 Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử

1.1.2.1 Khái niệm chọn giống nhờ chỉ thị phân tử

Trong khi các ứng dụng kỹ thuật di truyền vào chọn giống đã dành được nhiều sự quan tâm trên thế giới, một kỹ thuật chọn giống khác hiện đại được gọi là chọn giống nhờ chỉ thị phân tử (Marker-assisted selection) có thể nói MAS đã trải qua một cuộc cách mạng thầm lặng trong những năm gần đây

Bert Collard, (2006) [24] đưa ra khái niệm chọn lọc giống lúa dựa trên chỉ thị phân tử (MAS) là sử dụng chỉ thị ADN liên kết chặt với locus mục tiêu để thay cho chọn lọc đánh giá kiểu hình với giả định chỉ thị ADN có thể dự đoán kiểu hình một cách đáng tin cậy Hay nói cách khác, chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là việc sử dụng chỉ thị di truyền để kiểm soát khu vực chứa bộ gen mã hoá cụ thể đặc điểm của cây trồng Sử dụng chỉ thị phân tử liên kết chặt với locus mục tiêu để xác định tính trạng mong muốn thay cho kiểm tra hay đánh giá kiểu hình Để việc chọn giống

có hiệu quả, phải xác định được chỉ thị phân tử đa hình giữa giống bố mẹ và các cá thể trong quần thể phân tích Mức độ xác định chỉ thị phân tử đa hình phụ thuộc vào

hệ thống chỉ thị được sử dụng Với chỉ thị phân tử, cho phép các nhà chọn giống xác

định được chính xác các gen/locus gen quy định những tính trạng mong muốn Các gen/locus gen này cũng sẽ được chuyển vào các giống mới trong quá trình chọn tạo giống bằng chỉ thị phân tử

Thông thường, trong quy trình chọn tạo giống truyền thống, người ta đưa nguồn gen mới có tính trạng mong muốn vào 1 giống khác bằng phương pháp hồi giao liên tục qua 5 - 6 thế hệ, hoặc chọn lọc cá thể trong quần thể phân ly từ thế hệ

F2 đến các thế hệ tiếp theo Với các gen kháng mỗi gen chính thường chỉ kháng được với 1 chủng gây bệnh hoặc nòi gây hại nào đó Do vậy nếu quy tụ được vài gen kháng vào một dòng hoặc giống lúa thì sẽ tạo ra được một dòng lúa kháng được với nhiều chủng gây bệnh hoặc nhiều nòi gây hại Muốn tạo ra giống lúa kháng bền vững đối với dịch hại, người ta phải đưa được vài gen kháng hiệu quả cao vào

"genom đích" Bằng phương pháp chọn giống truyền thống, việc đưa gen lặn vào tổ hợp lai, hoặc du nhập cùng một lúc vài gen mong muốn vào "genom đích" (quy tụ nhiều gen vào một dòng ưu việt) thường gặp rất nhiều khó khăn hoặc đôi khi không thể thực hiện được (Mohan và cs., 1997) [25]

Trong chọn giống truyền thống, các cá thể cây trồng thể hiện các tính trạng mới mong muốn, chẳng hạn như độ ngọt hơn của quả dâu tây, củ to hơn của khoai tây, được chọn lọc từ các tổ hợp lai dâu tây và khoai tây Trong khi đó, các tính trạng đơn giản chẳng hạn như kích cỡ hay độ ngọt có thể dễ dàng tính toán được, các tính trạng phức tạp hơn chẳng hạn như tính kháng sâu bệnh, hay tính trạng chịu hạn gây khó khăn lớn đối với các nhà chọn giống khó có thể quan sát khi lựa chọn các cá thể biểu hiện tính trạng đó trong một quần thể cây trồng

Như vậy, chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là một kỹ thuật ứng dụng chỉ thị phân

tử, không thay thế phương pháp chọn giống truyền thống, nhưng là một phương tiện hữu hiệu, trợ giúp đắc lực cho chọn giống truyền thống nhằm khắc phục những trở ngại mà công tác chọn giống truyền thống rất khó giải quyết

Gần đây thuật ngữ chọn giống thông minh “Smart breeding” hàm ý chọn lọc với chỉ thị và kỹ thuật công nghệ tiên tiến Chọn giống bằng phương pháp MAS mang lại hiệu quả và đáng tin cậy hơn so với chọn lọc kiểu hình MAS cũng được gọi là chọn giống nhờ chỉ thị (Marker assisted breeding/MAB), cho dù MAS không

chắc chắn là đáp án cho tất cả cá lĩnh vực chọn giống, tuy nhiên MAS vẫn là một bước tiếp cận hỗ trợ đầy hứa hẹn cho phương pháp chọn giống truyền thống ( Lã Tuấn Nghĩa, 2011) [9]

1.1.2.2 Phương pháp MAS và sự sàng lọc trong các thế hệ chọn giống

Từ lâu các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị hình thái liên kết với một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng chúng như một phương tiện hữu ích trong quy trình chọn tạo giống mới Ở đây, thay vì phải đánh giá kiểu hình của

cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong muốn, người ta chỉ cần đi tìm những cá thể riêng biệt mang các chỉ thị hình thái liên kết với các gen đó

Sự phát triển của công nghệ chỉ thị phân tử đã giải phóng các nhà chọn giống khỏi một khối lượng lớn công việc khi phải chọn lọc, phát hiện một lượng ít ỏi những cá thể quan tâm trong số vô vàn các cá thể khác nhờ việc xác định sự có mặt hay vắng mặt của những chỉ thị phân tử liên kết với những alen đặc hiệu mà không cần đánh giá kiểu hình Phương pháp này còn có thể giúp ta chọn lọc những cá thể mang những tổ hợp gen cần thiết và loại bỏ các nhiễu do các tương tác trong cùng alen hay giữa các alen gây ra những tương tác này thường không thể phát hiện được bằng các phân tích kiểu hình Phương pháp này đặc biệt hiệu quả trong trường hợp cần đưa gen lặn hoặc thậm chí đưa cùng lúc nhiều gen khác nhau vào một genome đích Nguồn gen mới nhập được phát hiện gián tiếp thông qua các chỉ thị phân tử liên kết chặt với những gen đó

Như vậy, chỉ thị phân tử làm tăng thêm hiệu quả sàng lọc trong các chương trình chọn giống nhờ cung cấp thêm:

- Khả năng chọn lọc ngay từ giai đoạn cây con đang nẩy mầm trong khi nhiều dấu hiệu chỉ có thể sàng lọc khi chúng được biểu hiện ở những giai đoạn muộn hơn trong quá trình sống nếu chỉ sử dụng phương pháp chọn giống cổ điển (ví dụ: chất lượng quả và hạt, tính bất dục đực, khả năng phản ứng chu kỳ quang)

- Khả năng sàng lọc những dấu hiệu mà việc đánh giá các đặc tính này thường khó khăn, đắt tiền, tốn thời gian (ví dụ: như hình thái rễ, tính kháng nhiễm đối với các dịch hại hoặc đối với những nòi, những bệnh đặc hiệu, hay tính kháng những điều kiện gây sốc sinh học như hạn, mặn, thiếu muối, các chất độc)

- Khả năng phân biệt trạng thái đồng hợp tử hay dị hợp tử của nhiều locus trong cùng một thế hệ mà không cần kiểm tra thế hệ sau

- Khả năng chọn lọc đồng thời vài đặc tính trong cùng một thời gian, do vậy

mà có thể đưa vào cùng lúc vài gen có giá trị về mặt nông học, ví dụ đưa vào cùng một lúc nhiều gen kháng dịch hại khác nhau Trong trường hợp này, các phương pháp sàng lọc kiểu hình các cá thể thông qua sự lây nhiễm (đồng thời hoặc thậm chí lần lượt từng thể gây bệnh hay từng côn trùng gây hại) rất khó đạt được kết quả, nếu không muốn nói là không thể được (Mohan và ctv, 1997) [25] Nhưng nếu ta áp dụng công nghệ chỉ thị phân tử, ta có thể kiểm tra sự có mặt hay vắng mặt của từng alen kháng (hay nhiễm) khác nhau ở từng cá thể riêng biệt

1.2.3 Ưu điểm và ứng dụng của phương pháp MAS trong chọn giống

Sinh học phân tử là một công cụ mới trong nghiên cứu di truyền và chọn giống cây trồng Hiệu quả của phương pháp này trong chọn giống là rất lớn như: nhanh chóng, mức chi phí hợp lý, chính xác, nâng cao được năng suất sản lượng

Chỉ thị di truyền và bản đồ di tuyền cho phép nhà chọn giống thấy rõ mối quan hệ: “Tính trạng - Gen (QTLs) - Môi trường” Do vậy ứng dụng quan trọng nhất của MAS là sử dụng những chỉ thị phân tử cho ba mục đích sau:

- Tìm kiếm phát hiện những biến dị di truyền, các gen quan tâm trong số các

cá thể, giữa các giống, loài

- Phân lập nhanh các cá thể cần quan tâm trong quần thể dựa trên thành phần của gen hay các chỉ thị liên kết với các alen quan tâm đối với các locus mong muốn

- Chuyển một vùng gen, đối với những tính trạng quan tâm được quy định bởi đơn gen hay một gen chịu trách nhiệm phần lớn biểu hiện kiểu hình của tính trạng

Trong chọn giống lúa, MAS ngày càng được sử dụng rộng rãi để rút ngắn các quá trình phục hồi các dòng bố mẹ trong các chương trình lai trở lại MAS sẽ giúp lai chuyển được những gen quan tâm vào các giống có cấu trúc hệ gen khác nhau một cách nhanh chóng do MAS cho phép tối ưu hoá số cây cần chọn, số lần lai trở lại, hoặc loại bỏ các cá thể không liên quan đến những gen quan tâm, các chỉ thị phân tử có thể được áp dụng chọn giống nhằm phân biệt giữa các cá thể trong một

quần thể phân ly và xác định giống Khi so sánh với chọn giống truyền thống, vai trò trợ giúp của chỉ thị phân tử có thể cải thiện hiệu quả chọn giống ở các điểm:

- Phân biệt kiểu gen đồng hợp tử và dị hợp tử: Để phân biệt các kiểu gen trong phương pháp chọn giống truyền thống là dựa trên chọn lọc kiểu hình Chọn lọc kiểu hình ít hiệu quả hơn trong việc phân biệt kiểu gen đồng hợp tử và dị hợp tử Khả năng xác định sự khác nhau là cần thiết tại một số bước trong các chương trình chọn giống

- Phân biệt thế hệ đầu: Trong chọn giống truyền thống, các nhà chọn giống thường xuyên tạo số lượng cá thể lớn để xác định hiệu quả và chọn lọc các kiểu gen mong muốn Điều này sẽ kéo dài chương trình chọn giống MAS cho phép nhà chọn giống loại bỏ các kiểu gen không mong muốn trong chương trình chọn giống bằng việc sàng lọc các cá thể ngay ở giai đoạn cây con

- Thuận tiện sàng lọc: Đối với tính trạng khó đánh giá kiểu hình, chọn lọc đối với một chỉ thị alen cây bố mẹ cho gen tại vị trí locus gần với gen quan tâm có thể làm tăng hiệu quả và độ chính xác của chọn lọc Mục tiêu của chọn giống tương tự như lai tạo tính kháng bệnh thối rễ thì tốn công sức để có được kết quả bởi vì cây trồng phải cần được đào ra khỏi mặt đất để đánh giá Các chỉ thị liên kết với các tính trạng như vậy có thể sẽ tạo dễ dàng cho các nhà chọn giống để tiến hành nhanh chóng trong chương trình chọn giống và chí phí sàng lọc

- Giảm không gian sàng lọc: Bởi vì ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên kiểu hình đặc biệt đối với các tính trạng phức hợp, chọn giống truyền thống yêu cầu chọn lọc được thực hiện trên các nhóm cá thể phân ly được trồng trong nhóm Giai đoạn đầu của MAS có thể được thực hiện ngay ở giai đoạn cây non trong một không gian hẹp ví dụ như trong phạm vi nhà kính

- Giảm thời gian chọn lọc: thử nghiệm ngay ở giai đoạn đầu và dễ dàng sàng lọc để lựa chọn có thể rút ngắn chương trình chọn giống

Nhược điểm:

Cho đến nay, ứng dụng MAS đã đạt được nhiều thành công khác nhau trong chọn giống cây trồng, tuy nhiên để ứng dụng MAS trở nên phổ biến thì vẫn có một

số tồn tại Hạn chế lớn nhất là rào cản tồn tại của MAS là cải tiến tính trạng đa gen

Lý do chính tồn tại của rào cản này là xác định vị trí chính xác QTL trên bản đồ Vì

QTL thiếu các ảnh hưởng kiểu hình riêng biệt và không thể lập bản đồ QTL như thể chúng là locus định lượng hoặc locus di truyền Menden riêng biệt Mặc dù các công

cụ tính toán thống kê phức tạp được sử dụng, khả năng luôn tồn tại là vị trí hợp lý tối đa theo quy định có thể không là vị trí chính xác của QTL Một trong những thách thức chính trong chọn giống các tính trạng định lượng là bị ảnh hưởng lớn từ điều kiện môi trường biểu hiện lên tính trạng đó, do vậy có tính di truyền thấp Các nghiên cứu cũng chứng minh rằng MAS là hiệu quả nhất khi các giá trị chọn giống

dự đoán bởi chỉ số giá trị QTL kiểu gen, như từ kiểu gen chỉ thị liên kết và ước lượng hiệu ứng QTL và các giá trị kiểu hình

1.1.2.4 Yêu cầu cơ bản của chỉ thị phân tử để ứng dụng phương pháp MAS trong chọn giống cây trồng

Sự thành công của hệ thống chọn giống nhờ MAS phụ thuộc vào các yếu tố chính:

- Thể hiện tính đa hình cao: Chỉ thị được chọn cần phải phân biệt hiệu quả giữa những biến dị di truyền hiện có trong quần thể lai tạo Kiểm tra tính phù hợp cần phải được thực hiện trong quần thể hợp lý

- Đơn giản và dễ sử dụng: Khả năng đánh giá một số lượng lớn cá thể trong một thời gian và thành hiệu quả Phương pháp cần đơn giản, nhanh chóng sử dụng, khả năng tự động hoá cao, dễ chấm điểm và phân tích với kết quả có khả năng tái lặp là cần thiết

- Bản đồ di truyền với một số lượng hợp lý các chỉ thị đa hình tại các vùng tương đồng để định vị chính xác QTLs hay gen quan tâm

- Mối liên kết chặt giữa chỉ thị và các gen hay QTLs

- Sự tái tổ hợp thích hợp giữa các chỉ thị và phần còn lại của bộ gen

- Hiệu quả chi phí: Các phương pháp xác định phải có hiệu quả chi phí hợp lý

Hệ thống chỉ thị có thể sử dụng protein thô hoặc một lượng nhỏ DNA là thuận lợi trong việc cắt giảm thời gian chuẩn bị trước khi thực hiện

Khi đề cập đến ứng dụng chỉ thị PCR trong chọn giống, Kangle Zheng (1995) [18] cũng cho rằng mức chính xác của MAS phụ thuộc vào mối liên kết chặt giữa gen quan tâm và chỉ thị phân tử Mặc dù chỉ thị và gen có mối liên hệ về di

truyền, nhưng mối liên hệ này có thể bị phá vỡ do có sự tái tổ hợp giữa chúng Khoảng cách di truyền phản ánh tỷ lệ tái tổ hợp giữa gen quan tâm và chỉ thị Vì thế, để có độ tin cậy cao, làm giảm sự tái tổ hợp giữa gen quan tâm và chỉ thị là điều cần thiết Điều này có thể thực hiện khi áp dụng MAS với những chỉ thị cách gen quan tâm không quá 5cM và với những nhóm marker nằm về cả hai phía của gen Theo lý thuyết, với những chỉ thị cách gen trong khoảng 5cM, độ chính xác thu được khi sử dụng MAS là 99,75% hoặc có thể cao hơn

1.1.2.5 Các bước chọn giống nhờ chỉ thị phân tử

Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử đề cập đến một phương pháp chọn giống, trong đó việc xác định chỉ thị DNA và chọn lọc được lồng ghép vào chuơng trình chọn giống truyền thống Thực hiện lai đơn là một ví dụ, các bước thực hiện:

- Chọn lọc bố mẹ (dòng cho gen và nhận gen) và thực hiện lai tạo, ít nhất một hoặc cả hai có alen chỉ thị DNA cho tính trạng mong muốn

- Phát triển quần thể F1 và xác định sự có mặt của các alen chỉ thị để loại bỏ các cây lai không đủ điều kiện

- Phát triển quần thể F2 phân ly, sàng lọc các cá thể bằng các chỉ thị và thu các cá thể mang alen chỉ thị mong muốn

- Trồng cây F2:3 và sàng lọc các cá thể bằng chỉ thị Số lượng lớn cá thể F3 trong phạm vi một hàng có thể được sử dụng cho việc sàng lọc chỉ thị nhằm xác định hơn nữa trong trường hợp cần thiết nếu thấy cây F2 trước là đồng hợp tử với chỉ thị Chọn lọc và thu các cá thể với alen chỉ thị và các tính trạng mong muốn khác

- Trong thế hệ tiếp theo (F4 và F5) thực hiện sàng lọc chỉ thị và chọn lọc tương tự như ở thế hệ F2:3, nhưng cần chú ý với những cá thể có đặc tính nổi trội của các dòng đồng hợp tử

- Trong thế hệ F4:5 hoặc F5:6, dựa trên dữ liệu chỉ thị các dòng tốt nhất theo đánh giá kiểu hình của tính trạng mục tiêu và cũng như kiểu hình của các tính trạng khác

- Đánh giá năng suất cây trồng toàn diện để lựa chọn ra các dòng năng suất, chất lượng và tính chống chịu cũng như các đặc tính quan tâm khác

Trong đó, một số bước đơn giản thực hiện MAS với chỉ thị DNA như sau:

- Tách DNA từ mô tế bào của mỗi cá thể trong quần thể lai

- Sàng lọc các mẫu DNA sử dụng PCR cho các chỉ thị liên kết với QTL quan tâm

- Phân tích các sản phẩm PCR, sử dụng kỹ thuật phù hợp để phân biệt và xác định sản phẩm chẳng hạn như điện di trên gel agarose

- Xác định các cá thể có các alen chỉ thị mong muốn liên kết với QTL mục tiêu

- Kết hợp kết quả của chỉ thị với một số tiêu chí chọn lọc khác, chọn lọc các con lai của quần thể tin cậy bởi sàng lọc alen chỉ thị và các cá thể trội trong các quần thể của chương trình lai tạo

1.2 Một số kết quả nghiên cứu trong nước và trên thế giới

1.2.1 Tình hình nghiên cứu chọn giống nhờ phương pháp MAS và QTL/gen tăng số hạt/bông trên thế giới

Từ hơn hai thập kỷ trước người ta đã dự đoán rằng công nghệ chỉ thị phân tử

sẽ định hình lại các chương trình chọn giống và thúc đẩy nhanh trong chọn lọc các tính trạng kinh tế của cây trồng Khoảng 14 năm trước đây, Concibido và cs (1996) [14] đã mô tả ứng dụng MAS chọn tạo giống đậu tương kháng u nang tuyến trùng (Heterodera glycines) Tuy nhiên, trong khi đó MAS được sử dụng hiệu quả hơn trong chọn tạo các tính trạng đơn gen, nhưng lại không hiệu quả trong chọn tạo tính trạng đa gen, đặc biệt trong trường hợp nhiều alen với các hiệu ứng nhỏ liên quan đến một kiểu hình cụ thể MAS đã và đang được ứng dụng rộng rãi trong các chương trình chọn giống để chuyển gen và quy tụ gen, đặc biệt các gen kháng sâu bệnh của các loại cây trồng chính, mà còn đối với cả các nhóm cây trồng thứ yếu

Các nhà khoa học ở Trường ĐHTH Cornel (Mỹ) là những người đầu tiên định vị hàng loạt các chỉ thị phân tử RFLP trên bản đồ di truyền ở lúa Trong chương trình genome lúa do Nhật chủ trì, các nhà khoa học đã phát hiện và tách dòng hơn 3000 đoạn ADN bổ trợ Đến nay đã có khoảng chục nghìn chỉ thị phân tử SSR (vi vệ tinh) ở lúa đã được phát hiện và thiết kế, trong đó có nhiều chỉ thị liên kết với gen có ý nghĩa kinh tế quan trọng (Linh và cs, 2006) [22]

Cho đến nay, hàng nghìn QTL/gen liên kết với hầu hết các tính trạng ở lúa đã

được xác định Trong đó nhiều QTLs/gen quy định tính trạng có ý nghĩa kinh tế quan trọng đã được xác định lập bản đồ và ứng trong cải tiến giống Hiện nay có khoảng 40 QTLs/gen kháng bệnh bạc lá, 90 QTL/gen kháng đạo ôn, trên 30 gen kháng rầy nâu và một số QTL kháng đạo đã được phát hiện (Zhang G, 1997), (Kang

và cs, 2015; Liu và cs, 2014) [32], [19], [23]

Phân tích, lập bản đồ di truyền phân tử đã được thiết lập rất phổ biến bằng việc sử dụng quần thể phân ly F2 hay dòng cập phối (RIL) từ tổ hợp lai xa về di

truyền như giữa hai loài phụ Indica và Japonica, thế hệ tái tổ hợp thu được nhiều đa

hình hơn là trong cùng loài phụ (Fancia và cs., 2005) [15]

Một số tiến bộ về ứng dụng MAS đã được thực hiện tại Viện nghiên cứu Lúa Quốc tế (IRRI), các nhà khoa học đã chuyển các QTL/gen kháng vào các nền di truyền của giống lúa ưu tú (Li và cs, 2004) [21] Số lượng QTL liên quan đến tính chịu hạn ở lúa mạch đã được lập bản đồ, bao gồm một số tính trạng sinh lý, sinh hóa chẳng hạn như khả năng điều chỉnh thẩm thấu, hàm lượng protein, khí khổng dẫn, hay carbonhydrate bão hòa trong nước nhưng ứng dụng MAS vẫn còn là những thách thức (Li và cs, 2004) [21]

Trong số các ức chế phi sinh học như hạn hán và nhiễm mặn là một trong những ức chế chính gây thiệt hại kinh tế lớn Một tiến bộ đạt được nhờ ứng dụng MAS đã phát triển một số giống cây trồng chịu hạn và chịu mặn sử dụng phương pháp lai truyền thống kết hợp với ứng dụng chỉ thị phân tử Nhiều QTL kiểm soát tính kháng hạn và chịu mặn đã được phân lập Zhang và cs (2005) [32] cho thấy ảnh hưởng của sự thay đổi trong các màng acid béo trên khả năng chịu hạn và chịu mặn Tuy nhiên, mức độ áo dụng của những phát hiện này đối với các chương trình chọn giống vẫn còn bị hạn chế

Tiến sỹ Makill của IRRI đã thành công trong việc phát triển một số giống lúa

chịu hạn ngập sử dụng locus Sub I (Septiningsih và cs, 2009) [26] Hai giống cải tiến mang gen Sub I đã được phóng thích gần đây MAS được ứng dụng nhằm giảm

số lần lai hồi giao (BC) và giảm bớt các liên kết kéo theo Giống cải tiến Sub I” được trồng ở Ấn Độ và Bangladesh, giống IR64-Sub I được trồng ở những vùng thường bị ảnh hưởng ngập lụt ở Philipin và Indonesia Tiến sỹ Varshney

“Swarna-(IRRI) và ICRISAT đã công bố rằng đang thực hiện chuyển một QTL chính kiểm soát 30% biến dị kiểu hình rễ ở đậu Hà Lan (Chickpea) Tiến sỹ Xu (CIMMYT) cũng công bố xác định được locus chịu hạn

Ở Trung quốc các nhà khoa học đã thành công quy tụ các QTL/gens quy định yếu tố cấu thành năng suất vào một giống (Bai và cs, 2012, Bian và cs, 2015) [12], [13] Những giống lúa cải tiến này được tạo ra bằng sự kết hợp cả hai phương pháp chọn giống truyền thống và hiện đại Bước đột phá trong việc chọn giống lúa siêu cao sản trở nên có thể thực hiện được sau khi locus điều khiển tính trạng tăng năng suất (QTLs) được xác định Bằng việc sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai trở lại đã đẩy nhanh quá trình quy tụ các gen đó vào những giống mới năng suất cao (Thomson và cs., 2009; Septiningsih và cs., 2009; Singh

và cs., 2009, Bian và cs, 2015) [29], [26], [27], [13]

Các nhà khoa học ở Viện ngiên cứu lúa quốc tế (IRRI) đã phát hiện ra một gen có tên là PSTOL1 ( Phosphorus Starvation Tolerance), gene này làm cho lúa phát triển rễ lớn hơn và tốt hơn, giúp tăng hấp thu phốt pho của cây lúa khoảng

20% Gene PSTOL1 được trích xuất từ giống lúa Kasalath vốn được trồng trên các

cánh đồng nghèo dinh dưỡng tại khu vực phía đông Ấn Độ đã được phát hiện bởi Tiến sĩ Matthias Wissuwa từ Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Nông nghiệp Quốc tế Nhật Bản Hiện tại, các nhà khoa học đã áp dụng kỹ thuật cấy gene để đưa gene PSTOL1 vào các giống lúa thuộc 2 phân loài lúa lớn là Indica và Japonica Kết quả cho thấy, sản lượng lúa đã tăng thêm 60% so với giống lúa không cấy gen PSTOL1[34]

Giáo sư Hont Ma trường Đại học Quốc gia Pennsylvania và cộng sự đã tìm

ra loại gen quy định khối lượng và kích thước của hạt gạo hướng tới sự đẩy mạnh sản lượng cây trồng Các nhà khoa học đã tiến hành điều tra và định dạng dòng đột biến gây giảm khối lượng của hạt trên cây lúa Sau khi kiểm tra đột biến này các nhà khoa học đã đưa ra kết luận sự đột biến ở trong gen GIF1 Gen GIF1 có trách nhiệm trong việc điều khiển hoạt động của enzyme invertase, nằm ở màng tế bào và biến đổi sucrose thành chất nào đó và thường cấu tạo nên tinh bột Nhóm đã tạo một

số dòng cây lúa chuyển gen GIF1, so sánh với dòng bình thường, cây chuyển gen

thân to và cho hạt nặng hơn Kết quả nghiên cứu được Đại học Quốc gia Pennsylvania công bố vào ngày 28/9/2008 trên báo Nature Genetic [33]

Các nhà khoa học Trung Quốc đã xác định được một gen đơn lẻ có tên là GHD7, có vai trò kiểm soát sản lượng, cũng như chiều cao và thời gian trổ bông của cây lúa Những nghiên cứu trước đây đã từng định dạng được một vùng trên nhiễm sắc thể số 7, được cho là nơi quyết định 3 đặc điểm trên của cây lúa, nhưng không thể tập trung vào một gen cụ thể nào Tiến sĩ Zhang Qifa và đồng nghiệp ở Trường Đại học Huazhong, tỉnh Vũ Hán đã thực hiện cuộc nghiên cứu này ở 19 đồng lúa khác nhau trên khắp châu Á và thấy rằng, những cây lúa thấp hơn, ít hạt hơn và trổ sớm hơn có dấu hiệu thiếu gen GHD7 Sau khi được bổ sung loại gen này đã xuất hiện sự thay đổi theo chiều hướng tăng rõ rệt: tăng năng suất, tăng thời gian trổ bông và tăng 67% chiều cao [35]

Các nhà nghiên cứu Trung Quốc đã xác định được một gen quan trọng trong

hạt thóc có thể giúp tăng vượt trội đồng thời cả năng suất và chất lượng lúa Đầu

tiên, các nhà khoa học tại Hàn lâm Viện Khoa học Xã hội (Trung Quốc) thực hiện nghiên cứu loại lúa Basmati từ Pakistan, một loại lúa gạo ngon nổi tiếng trên thế giới, và tìm thấy gene GW8 có ảnh hưởng lớn đến việc tăng chất lượng gạo Gen GW8 còn có thể cải thiện cả hình dáng và màu sắc của hạt gạo Khi tiếp tục nghiên cứu gen GW8, các nhà khoa học còn phát hiện thấy gen này cũng tồn tại ở một số loại lúa cao sản trồng tại Trung Quốc Nhưng nó là một biến thể gen GW8 khác, tuy không ảnh hưởng tới chất lượng song lại có vai trò trong trọng lượng hạt và tăng năng suất của lúa Sau đó, nhóm nghiên cứu đã xác định được biến thể thứ ba của gen GW8 có thể kết hợp những ưu điểm của hai biến thể gen kia, hứa hẹn một giống lúa mới giúp tăng cả năng suất và chất lượng của lúa Biến thể GW8 mới nếu được ghép vào loại lúa Basmati có thể giúp tăng năng suất 14% so với bình thường

mà vẫn giữ nguyên được chất lượng gạo Còn nếu ghép vào lúa cao sản ở Trung Quốc, nó có thể nâng cao đáng kể chất lượng hạt gạo và giữ nguyên năng suất [36] Với sự ra đời của hàng loạt các kỹ thuật chỉ thị phân tử đã cho phép xác định những QTL liên kết đến các tính trạng nông sinh học, yếu tố cấu thành năng suất Trong nghiên cứu xác định chỉ thị phân tử và lập bản đồ QTL/gen điều khiển một

tính trạng năng suất hay yếu tố cấu thành năng suất Đây là một việc làm khó vì năng suất hay yếu tố cấu thành năng suất là tính trạng di truyền số lượng, nó là tổ hợp tính trạng như: số hạt chắc trên bông, số bống trên khóm, khối lượng nghìn hạt Những nằm gần đây, nhiều QTL/gen quy định tính trạng cấu thành năng suất đã được xác định trên rất nhiều các quần thể từ các tổ hợp lai giữa giống hay các loài phụ QTL/gen năng suất và yếu tố cấu thành năng suất được xác định trên tất cả các

nhiễm sắc thể của lúa Ghd7 là gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông đã được phát hiện từ giống lúa Minghui 63 Ghd7 nằm gần tâm động, trên nhiễm sắc thể số 7 Ghd7 làm tăng (65.8%) số hoa trên bông trên giống Zhenshan97 Gpa7 được phát hiện từ giống lúa hoang O Rufipogon Gpa7 làm tăng số hạt trên bông trên giống lúa Indica Guichao 2 Gw9.1 là QTL liên kết tính trạng tăng khối lượng

1000 hạt, đã được phát hiện từ lúa hoang Oryza Rufipogon Gw9.1 được phát hiện nằm trên nhiễm sắc thể số 9 Gw11 liên kết tính trạng khối lượng hạt, đã được các

nhà chọn giống ở trường đại học tổng hợp quốc gia Chungnam Hàn Quốc phát hiện

từ giống lúa hoang O grandiglumis Linh và cs (2006) [22] đã lập bản đồ QTL yd7 liên kết tính trạng tăng năng suất từ lúa hoang O minuta trên nhiễm sắc thể số 7 Sự

có mặt của yd7 trên giống lúa trồng đại trà Hwaseongbyeo làm tăng 15 đến 20%

năng suất

Bên cạnh đó, MAS đã được triển khai và ứng dụng đáng kể để cải tiến các giống cây trồng thương mại chẳng hạn như lúa mỳ, gạo, ngô, đậu tương, và một số loại rau như cà chua và cây tiêu Tuy nhiên, các nguồn vốn công hỗ trợ ứng dụng MAS trong chọn tạo giống vẫn còn bị hạn chế (Xu và Crouch, 2008) [31] Trong khi đó nhiều thành công đã được công bố với các tính trạng kiểm soát bởi các gen đơn Một số lượng lớn các tính trạng đơn gen hoặc các QTL chính đã được tập trung nghiên cứu cải tiến lúa mỳ nhờ MAS Các tính trạng này bao gồm tính kháng bệnh rỉ sắt, FHB, kháng vi rút ở lúa mạch (BYDV), kháng giun tròn và rệp ở lúa mỳ Nga Ngoài ra có một số tính trạng chất lượng như hàm lượng protein, độ cứng của hạt, mầu sắc hạt, chất lượng bánh mỳ, chất lượng sơ (Gupta và cs, 2010) [16] MAS được ứng dụng hiệu quả hơn trong chọn giống khởi đầu dựa trên cơ sở thông tin từ Ils, có thể tạo những giống mang các đoạn nhiễm sắc thể cụ thể đã được

biết có các alen chính liên quan đến các tính trạng số lượng như hàm lượng đường

(Brix) và năng suất

1.2.2.Tình hình nghiên cứu và một số thành tựu nghiên cứu về chọn giống nhờ phương pháp MAS và QTL/gen tăng số hạt /bông trong nước

Những nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống (như kỹ thuật chuyển gen, kỹ thụât sinh học phân tử ) thực tế đã được triển khai từ những năm cuối của thế kỷ trước tại một số viện nghiên cứu và trường đại học Tuy nhiên, các

kỹ thuật công nghệ này mới thực sự phát triển và được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu vào những năm gần đây Phần lớn các nghiên cứu xác định chỉ thị liên kết gen và lập bản đồ gen của các tác giả Việt Nam được tiến hành trên đối tượng cây lúa trong khuôn khổ các dự án nghiên cứu và dự án hợp tác quốc tế

Một số công trình nghiên cứu sử dụng chị thị phân tử để phát hiện gen kháng bệnh và lập bản đồ gen kháng đối với một số cây trồng chính, trong đó có nghiên cứu về gen kháng bệnh bạc lá đối với cây lúa đã được triển khai tại một số viện nghiên cứu và trường đại học trong nước (Đại học NN1, Viện Di truyền NN, Viện công nghệ sinh học, Viên lúa ĐBSCL ) Nghiên cứu đầu tiên của Viện nghiên cứu lúa ĐBSCL và Viện KHKTNN Miền nam về phân tích di truyền tính kháng rầy nâu của giống lúa hoang nhờ chỉ thị phân tử Các nhà nghiên cứu đã xác định được hai

gen mới kháng rầy nâu ở một loài lúa dại (O officinalis) định vị trên NST số 3 và số

7 liên kết với 2 chỉ thị tương ứng là RM168 và RM18

Việc lập bản đồ các QTLs liên quan đến tính chịu mặn, chịu độc nhôm, chịu hạn ở lúa cũng đã được tiến hành nghiên cứu Một số nghiên cứu khác về ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa kháng bạc lá, và đã có một số dòng kháng

có triển vọng được tạo ra bằng kỹ thuật này Những năm gần đây, Viện Di truyền Nông nghiệp đã sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử và lai hồi quy (MABC) và đã thành công trong việc chọn tạo giống lúa mới bằng việc chuyển QTL/gen kháng rầy nâu vào giống lúa trồng đại trà như Q5 (Lưu Thị Ngọc Huyền,

2010) [6] đã lập bản đồ phân tử cho 3 gen kháng rầy nâu bphX, bph4, Bph6 và phát

hiện được một loạt chỉ thị phân tử SSR liên kết gần với các gen kháng đó

Ngoài ra, Nguyễn Thị Lang với cộng tác của các tác giả thuộc IRRI đã thành

công trong việc lập bản đồ gen kháng Bph10 – 1 gen kháng tốt đối với quần thể rầy

nâu ở đồng bằng Sông Cửu Long [20] Tiếp theo là nghiên cứu xác định gen kiểm soát tính trạng kháng đạo ôn và rầy nâu ở lúa bằng kỹ thuật AFLP, trong đó các tác giả đã tìm được một số chỉ thị AFLP liên kết với tính kháng rầy nâu và đạo ôn ở hai dòng lúa nghiên cứu

Ngoài các QTLs/gen quy định năng suất và yếu tố cấu thành năng suất, gen thơm của giống Jasmin, gen điều khiển tính trạng hạt dài, gen điều khiển thời gian sinh trưởng và nhiều gen và QTL có liên quan đến các tính trạng khác của cây lúa như chịu hạn, chịu mặn, chịu độc nhôm, chịu thiếu phốt pho, bất dục đực nhân nhạy cảm quang chu kỳ, nhiệt độ, gen tương hợp rộng cũng được phát hiện hay được lập bản đồ phân tử để đưa vào sử dụng trong chọn giống Ngoài ra, ứng dụng chỉ thị phân tử thông qua việc đánh giá đa dạng di truyền và khoảng cách di truyền, chỉ thị phân tử còn giúp các nhà chọn giống xác định gián tiếp các cặp lai có khả năng cho

ưu thế lai (Bùi Chí Bửu và cs, 2004), (Nguyễn Trí Hoàn, 2009) [3], [7]

Gần đây, đề tài nghiên cứu tại trung tâm Tài nguyên Thực vật do Lã Tuấn Nghĩa và cs (2011) [9] đã quy tụ và chọn lọc được dòng lúa mang cả hai gen kháng

bệnh đạo ôn P1-1 và P1-5 sử dụng chỉ thị phân tử liên kết với các gen để chọn lọc

Để phục vụ cho chương trình nghiên cứu lúa lai tại Việt Nam, nghiên cứu lập bản đồ gen kiểm soát tính bất dục đực nhạy cảm nhiệt độ cũng đã được tiến hành Các tác giả thuộc Viện Di truyền NN đã tìm được bốn chỉ thị phân tử AFLP liên kết

gen tgms-vn1 (gen bất dục đực nhân nhạy cảm với nhiệt độ) với khoảng cách gần

nhất là 3,5cM trên vai ngắn của NST số 2 của hệ gen lúa

Liên quan đến các công trình công bố về ứng dụng marker phân tử trong chọn tạo giống lúa chống chịu mặn, Vương Đình Tuấn và ctv (2000) [11] đã báo cáo về lập bản đồ xác định vị trí của gen di truyền về số lượng ảnh hưởng tính chống chịu mặn của cây lúa Tác giả xác định được 3 marker RFLP là R1928, R674 và G257 có liên kết với các QTL điều khiển tính chống chịu mặn trên các nhiễm sắc thể số 1, 6

và 11 theo thứ tự Bùi Chí Bửu và ctv (2000) [3] đã sử dụng 30 SSR marker để lập bản đồ gen cho tính chống chịu mặn của quần thể F3 gồm 257 cá thể phân ly, phát triển từ tổ hợp lai IR28 /Đốc Phụng Các tác giả xác định 10 SSR marker cho thể đa

hình của các sản phẩm PCR giữa các cá thể phân ly và bố mẹ Tuy nhiên chỉ có marker RM223 liên kết với gen chống chịu mặn với khoảng cách 6,3 cM trên nhiễm sắc thể số 8 RM223 nhân bản đoạn ADN kích thước 120 bp, liên kết với gen chống chịu mặn Từ giống Đốc Phụng và sản phẩm PCR có kích thước 160 bp từ giống nhiễm IR28 Nguyễn Thị Lang và ctv (2001) [20] đã báo cáo marker OSR1 và RM315 liên kết với QTL cho tính chống chịu mặn ở lúa, định vị trên nhiễm sắc thể

số 1 Marker RM223 liên kết với gen chống chịu mặn với khoảng cách di truyền là 6,3 cM trên nhiễm sắc thể số 8

Gần đây, nhóm nghiên cứu thuộc Viện Di truyền Nông nghiệp do Giáo sư Lê Huy Hàm đứng đầu đã công bố thành công trong việc lai chuyển QTL/gen chịu ngập (Sub1) và QTL/gen chịu mặn bằng ứng dụng chỉ thị phân tử vào một số giống

ưu tú Việt Nam (Lê Huy Hàm và Trần Đăng Khánh, 2015) [5]

Nghiên cứu di truyền phân tử tính trạng kháng rầy nâu của cây lúa của Viện nghiên cứu lúa đồng bằng sông Cửu Long dùng phương pháp PCR chọn giống kháng rầy nâu có gen Bph-10 ở nhiễm sắc thể số 12 liên kết với marker RG457 (tổ hợp lai PTB33/TN1) và RM227 (IR64/Hoa Lài)

Ở nước ta, chọn tạo giống bằng chỉ thị phân tử và lai trở lại là lĩnh vực non trẻ và còn nhiều hạn chế, chưa có nghiên cứu nào chuyên sâu về cải tiến năng suất

lúa Đề tài “Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết với các tính trạng cấu

thành năng suất tạo giống lúa thuần siêu năng suất”, mã số: KC.06.12/11-15 do

Bộ Khoa học và Công nghệ là cơ quan chủ quản đề tài là bước khởi đầu cho việc ứng dụng phương pháp MAS để chuyển QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông vào một số giống lúa trồng đại trà tại Việt Nam

CHƯƠNG II VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu nghiên cứu

- Gồm 74 cá thể trong quần thể F3 của tổ hợp KD18 và KC25 Đây là nguồn vật liệu được kế thừa từ nguồn vật liệu thuộc đề tài “ Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị phân tử liên kết với các tính trạng cấu thành năng suất tạo giống lúa thuần siêu năng suất”

- KC25 là dòng cho gen: có nguồn gốc nhập nội từ Hàn Quốc, đây là giống lúa

thuộc loài phụ Japonica, mang QTL/gen yd7 quy định tính trạng tăng số hạt trên

bông

- Khang dân 18 là giống nhập nội vào Việt Nam từ đầu những năm 90 và trở

thành giống được trồng phổ biến ở nhiều vùng sản xuất lúa gạo, sử dụng làm giống đối chứng

- Sử dụng chỉ thị phân tử RM500, RM21615 để xác định các cá thể trong quần

thể F4 mang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông [8]

Bảng 2.1 Thông tin các cặp mồi sử dụng

Kích thước đoạn nhân ( bp )

1 RM500 3’GAGCTTGCCAGAGTGGAAAG5’ 3’GTTACACCGAGAGCCAGCTC5’ 259

2 RM21615 3’CTTTCCTCCTCGGCCGTTGC5’ 3’GAGGAGCCAGGCGAACATCACC5’ 130

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Sử dụng các chỉ thị RM21612 và RM500 liên kết chặt với QTL/gen quy định

tính trạng tăng số hạt trên bông để xác định các cá thể mang gen đồng hợp tử

- Đánh giá đặc điểm sinh trưởng, phát triển, nông sinh học và, khả năng chống chịu sâu bệnh của các dòng mang QTL/gen

2.3 Phương pháp nghiên cứu và kỹ thuật sử dụng

2.3.1 Kỹ thuật sử dụng trong phòng thí nghiệm

- Tách chiết và tinh sạch ADN theo phương pháp CTAB cải tiến (của phòng thí nghiệm Di truyền học, Trường đại học Gent, Vương Quốc Bỉ) (1984)

- Chọn lọc các cá thể/dòng mang QTL/gen quy định trạng số hạt/bông thông qua phương pháp MAS với các chỉ thị SSR liên kết với QTL/gen

* Tách chiết và tinh sạch ADN

ADN lúa được tách chiết và tinh sạch theo phương pháp CTAB cải tiến

- Lá của các giống lúa nghiên cứu được cắt lấy mẫu sau khi cấy 2 -3 tuần Mẫu được lấy vào sáng sớm là lúc nồng độ muối trong lá thấp, các enzym hoạt động ít là điều kiện tốt để tách chiết ADN

- Cho mẫu vào eppendorf 2ml và cho 1ml đệm chiết (100mM Tris HCl, pH

8): 500mM NaCl: 50mM EDTA, pH 8,0): 0,07% µl - Mercaptol ethanol) rồi đảo

đều, giữ trong đá và thêm 50µl SDS 10%

- Đặt vào nồi cách thủy ủ trong 30 phút ở 650C, 5 phút đảo 1 lần cho dịch được trộn đều

- Ly tâm 13500 vòng/phút trong 20 phút

- Lấy ra đổ dịch nổi ở phía trên sang một eppendorf mới Thêm 1ml isopropanol alcohol rồi để vào tủ 40C cho kết tủa khoảng 30 phút (hoặc qua đêm) không để vào tủ lạnh sâu -200C vì sẽ gây hiện tượng kết tủa muối

- Ly tâm 13500 vòng/phút trong 25 phút

- Đổ hết dịch nổi ở trên rồi giữ lại tủa ở dưới đáy eppendorf Cho 400µl

đệm TE (10mM Tris HCl pH=8,0; 0,5 mM EDTA pH=8,0) cho vào tủ 650C ủ trong 5 phút Dùng pipet nhỏ hoặc búng nhẹ hoà tan tủa, bước này có thể giữ ở

40C qua đêm

- Cho 3µl Rnase (10mg/ml) vào mỗi eppendorf Ủ ở 37oC khoảng 3 tiếng

- Thêm 400µl đệm CTAB (0,2M Tris HCl (pH 8,0): 2M NaCl: 0,05M EDTA (pH 8,0): 2% CTAB, đặt vào nhiệt độ 650C trong 15 phút, thỉnh thoảng trộn, lắc đều

- Cho và tủ hút, thêm vào 800µl chloroform/isoamyl alcohol (24:1), lắc trộn

từ 5 – 7 phút nhằm loại bỏ protein

- Ly tâm ở 13500 vòng/phút trong 10 phút Dung dịch bên trong eppendorf tách thành 2 phần Sử dụng pipet hút chuyển dịch nổi ở phía trên sang một eppendorf mới Nếu chưa sạch có thể chiết lại lần 2 bằng chloroform/isoamyl alcohol (24:1)

- Thêm 2,5 lần thể tích ethanol 96% và giữ trong tủ lạnh sâu (-200C)

- Ly tâm 13500 vòng/phút trong 30 phút, loại bỏ cồn giữ lại tủa trắng ở đáy ống

- Rửa tiếp bằng 400µl cồn 70% rồi đưa vào máy ly tâm 13500 vòng/phút trong

5 phút Dùng pipet rút bỏ cồn giữ lại tủa, cho vào máy làm khô chân không 10 phút làm khô tủa (ADN), sau đó cho 100µl TE (10: 1) vào mỗi eppendorf hoà tan tủa

- Giữ ADN trong tủ lạnh sâu (- 200C) để sử dụng cho các bước nghiên cứu sau

* Kiểm tra độ tinh sạch và xác định hàm lượng ADN

Độ tinh sạch ADN của lá lúa được kiểm tra bằng cách xác định OD ở 260nm

và OD ở 280nm trên máy quang phổ kế Tỷ lệ OD260/OD280 cho biết độ tinh sạch của mẫu ADN Tỷ lệ này được sử dụng trong khoảng từ 1,6 đến 1,8 Hàm lượng ADN được tính theo công thức: ADN (µg/µl) = (OD260 x 50µg/µl)/1000

- Chu trình của phản ứng PCR được biểu diễn theo sơ đồ sau:

Hình 2.1 Sơ đồ chu trình của phản ứng PCR

(*): Nhiệt độ gắn mồi: Có thể thay đổi tùy theo từng cặp mồi SSR

cụ thể

- Sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra kết quả trên gel agarose 0,8%, đệm TAE 1X

* Kỹ thuật điện di trên gel agarose 0,8%

- Cân 0.8g agarose, đong 100ml TBE 0,5X (5,4g Tris base; 2,76g axít boric; 2ml 0,5M EDTA, pH = 8,0) cho vào bình tam giác

- Hấp nóng trong lò vi sóng cho đến khi tạo thành một dung dịch đồng nhất

- Để nguội đến khoảng 50 - 600C, thêm 5µl ethidium bromide nồng độ 10 mg/ml và lắc đều

- Chuẩn bị khay và lược Đổ dung dịch agarose vào khay sao cho không có bọt khí Chờ khoảng 45 - 60 phút khi gel đông

- Rút lược, đặt gel vào bể điện di Đổ 0,5X TBE ngập mặt gel khoảng 2mm -Tra sản phẩm PCR đã được trộn với Xylen cyanol vào giếng Thời gian

và điện thế sử dụng để điện di dài hay ngắn phụ thuộc vào kích thước của cặp mồi thí nghiệm cần kiểm tra Các mẫu chạy với ladder 50 bp

- Soi gel trên máy soi cực tím

* Phương pháp phân tích kết quả trên gel polyacrylamide

a Chuẩn bị gel polyacrylamide

1 Lau kính 3 lần bằng nước cất, 2 lần bằng ethanol 95% với giấy mềm,

2 Chuẩn bị dung dịch gắn (Binding solution): 3µl Bind Silane + 1ml acetic axit 0,5% trong 95% ethanol Lau đều dung dịch gắn lên tấm kính 1 bằng giấy mềm

3 Cho 3ml Sigmacote lên bề mặt tấm kính 2 Phủ đều Sigmacote lên tấm kính bằng giấy mềm khô Để khô 5 phút,

4 Lắp ráp kính để đổ gel,

5 Thêm 100 µl TEMED (N,N,N’,N’-Tetraethyl - Ethylendiamine) và 500 microlit APS 20% vào dung dịch Acrylamide 4,5% (50,4g Urea: 12 ml TBE 10X: 13,5ml Acrylamide/Bis-acrylamide 40% (19:1) trong 120ml dung dịch) Trộn nhanh Bơm dung dịch vào giữa hai tấm kính bằng xylanh 140cc, tránh không để tạo bọt khí,

6 Cài lược vào gel (6-8mm),

7 Để gel đông tự nhiên ít nhất 1 giờ

b Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide

1 Rút lược ra khỏi gel Lau sạch gel dính trên khuôn gel bằng nước cất,

2 Dựng gel lên giá chạy Đổ 2 lít TBE 1X (10,8g Tris base: 0,92g EDTA: 5,52g Boric acid trong 1 lít dung dịch) vào phía trên và dưới của khoang đệm Chạy gel ở 90W để bề mặt gel đạt tới nhiệt độ 50oC,

3 Chuẩn bị mẫu:

Thêm STR 3X với tỷ lệ thể tích là 1 STR: 2 mẫu

Biến tính mẫu và marker 5 phút ở nhiệt độ 94oC Đưa ngay vào đá

4 Dùng xylanh đuổi hết bọt khí ở bề mặt phía trên của khuôn gel, cài răng lược vào gel (1 - 2mm) Tra 8µl từng mẫu vào giếng, chạy gel trong thời gian 1 giờ

ở điều kiện điện thế 100V, cường độ dòng điện 15 mA, 5oC

c Nhuộm bạc

- Sau khi hoàn thành quá trình chạy điện di, tháo gel khỏi giá chạy, rút lược ra khỏi gel Gỡ kính ra một cách nhẹ nhàng Gel được giữ trên tấm kính Làm sạch phần kính xung quanh gel bằng nước cất,

- Đặt gel vào khay,

Nhuộm bạc theo các bước như sau:

1 Hãm gel trong dung dịch hãm (Glacial acetic acid 10%) 30 phút,

2 Rửa 3 lần bằng nước cất, mỗi lần 2 phút,

3.Nhuộm trong dung dịch nhuộm (2g Silver nitrate (AgNO3): 3ml

Formadehyde 37% trong 2 lít dung dịch) 30 phút,

4 Rửa gel bằng nước cất không quá 10 giây,

5 Đưa gel vào dung dịch hiện (4 - 10oC) (60g Sodium carbonate: 3ml Formaldehyde (H2CO) 37%: 400µl Sodium thiosulfate (Na2S2O.5H2O) (10mg/ml) trong 2 lít dung dịch) từ 2 - 5 phút đến khi các băng ADN hiện rõ,

6 Hãm gel trong dung dịch hãm 3 - 6 phút,

7 Rửa bằng nước cất 2 - 3 phút,

Chú ý: Tất cả các bước trên đều thực hiện trên máy lắc,

8 Để gel khô tự nhiên qua đêm,

9 Sấy gel ở 50oC trong 5 giờ,

10 Ghi nhận kết quả

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu thí nghiệm ngoài đồng ruộng

2.3.2.1 Bố trí thí nghiệm

- Trong nhà lưới: các cây theo dõi được trồng trong xô nhựa

- Trên ruộng thí nghiệm: bố trí theo kiểu tuần tự, không nhắc lại Diện tích mỗi

ô thí nghiệm : 2m x 2,5m = 5m2 Khoảng cách đường công tác 30cm Cấy cây cách cây 12 cm và hàng cách hàng 18 cm

2.3.2.2 Các chỉ tiêu và phương pháp theo dõi trên đồng ruộng

Theo IRRI, 1996 [17] quá trình sinh trưởng của cây lúa được chia thành 9 giai đoạn như sau:

Giai đoạn 1: Nảy mầm Giai đoạn 2: Mạ Giai đoạn 3: Đẻ nhánh Giai đoạn 4: Vươn lóng Giai đoạn 5: Làm đòng Giai đoạn 6: Trỗ bông Giai đoạn 7: Chín sữa Giai đoạn 8: Vào chắc Giai đoạn 9: Chín

Các tính trạng theo dõi và đánh giá được thực hiện theo Hệ thống đánh giá tiêu chuẩn cây Lúa của IRRI, 1996 [17] bao gồm:

* Theo dõi thời gian qua các giai đoạn sinh trưởng

- Thời gian từ gieo đến cấy, đến đẻ nhánh, đến trỗ 10%, trỗ 50%, trỗ xong

- Thời gian bắt đầu trỗ, nở hoa

- Thời gian sinh trưởng

* Đặc điểm nông sinh học

- Chiều cao cây: Động thái tăng trưởng chiều cao cây và chiều cao cây

- Theo dõi động thái ra lá

- Theo dõi động thái đẻ nhánh và số nhánh hữu hiệu

- Chiều dài lá đòng: Đo từ tai lá đến mút lá

- Chiều rộng lá đòng: Đo nơi rộng nhất của phiến lá

- Chiều dài bông: Từ đốt có gié đến đầu mút bông không kể râu

- Chiều dài cổ bông

- Năng suất thực thu: thu mẫu của cả ô trên dòng, tuốt hạt phơi khô đưa về độ

ẩm 13%, cân tính ra năng suất thực thu

- Tính trung bình: X =

n Xi

Trong đó: n là số mẫu quan sát Công thức tính một số đại lượng thống kê

cơ bản cần quan tâm:

X là giá trị trung bình của tính trạng quan sát

S2 là phương sai mẫu

Xi là giá trị thứ của tính trạng quan sát ở tính trạng thứ i

CHƯƠNG III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Xác định cá thể của tổ hợp Khang Dân 18 và KC25 mang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông

3.1.1 Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số

Tách chiết ADN là bước đầu tiên khá quan trọng trong mọi nghiên cứu về sinh học phân tử Nếu có ADN đủ độ tinh sạch là điều kiện tốt cho các bước nghiên cứu tiếp theo Có nhiều phương pháp tách chiết và tinh sạch ADN Tùy theo từng loại cây và mục đích nghiên cứu mà có thể chọn những phương pháp tách chiết ADN khác nhau Trong nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp tách chiết ADN bằng CTAB có cải tiến Lá non 3 tuần sau khi cấy của những giống nghiên cứu được thu để tách chiết ADN Nồng độ và độ tinh sạch của ADN được kiểm tra

bằng điện di trên gel agarose 0,8% cùng với lamda ADN chuẩn chuẩn200ng/µl Nhuộm gel bằng dung dịch ethidum bromide và ghi nhận kết quả trên máy soi cực tím Kết quả tách chiết ADN được minh hoạ ở hình 3.1

Hình 3.1 Hình ảnh kiểm tra ADN tổng số tách chiết theo phương pháp CTAB

trên gel agarose 0,8%

Giếng số 1: Lambda ADN nồng độ chuẩn (200ng/µl), Các giếng từ 2 -17: ADN mẫu nghiên cứu

Kết quả tách chiết ADN cho thấy phương pháp tách chiết ADN bằng CTAB

có cải tiến cho hiệu quả cao, 100% số mẫu ADN đủ độ tinh sạch Nồng độ trong

khoảng từ 200 – 300ng/µl khi so sánh với lambda ADN chuẩn nồng độ 200ng/µl

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17