“nghiên cứu phát triển chủng actinoplanes sp và tối ưu điều kiện lên men sinh tổng hợp acarbose”

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình

Trang 1

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

DƯƠNG THỊ HẢI YẾN

“NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỦNG ACTINOPLANES SP

VÀ TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP

Trang 2

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng được bảo vệ ở bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, tháng 7 năm 2015 Tác giả luận văn

Dương Thị Hải Yến

Trang 3

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành bài luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ nhiệt tình của các cá nhân, tập

thể trong và ngoài trường

Tôi xin chân thành cảm ơn TS Vũ Văn Hạnh và TS Đồng Huy Giới đã tạo điều kiện cho tôi được nghiên cứu và thực hiện bài luận văn tại Phòng Các chất chức năng sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã định hướng nghiên cứu, hướng dẫn thí nghiệm, chỉnh sửa luận văn và tạo điều kiện về vật tư, hóa chất và thiết bị cho nghiên cứu để chúng tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tất cả các anh chị làm việc tại Phòng Các chất chức năng sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tận tình và cho tôi được sống, học tập, làm việc trong môi trường hòa đồng, thân thiện trong thời gian vừa qua

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới các thầy cô giáo khoa Công nghệ sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kiến thức chuyên ngành cũng như trong cuộc sống trong suốt thời gian học tập tại trường

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, tập thể lớp CH22CNSHB và tất

cả bạn bè đã luôn động viên, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho chúng tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn

Hà Nội, tháng 5 năm 2015 Tác giả luận văn

Dương Thị Hải Yến

Trang 4

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii

1.1 Acarbose – thuốc điều trị bệnh tiểu dường type 2 21.1.1 Nhóm ức chế hoạt động của α-glucosidase 2

1.1.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất acarbose từ các chủng vi sinh vật trên

1.4 Ảnh hưởng của các thành phần môi trường đến khả năng sinh tổng hợp

Trang 5

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv

1.4.1 Ảnh hưởng của nguồn Cacbon đến khả năng sinh tổng hợp acarbose

Trang 6

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v

3.2.2 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) 383.2.3 Ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) 393.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) 41

3.2.6 Hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) của chủng Actinoplanes trong môi

3.3 Tinh sạch chất hoạt tính ức chế α-glucosidase từ dịch lên men dòng NV45.18 483.3.1 Tinh sạch qua cột trao đổi cation (amberlyst resin exchange 15R) 483.3.2 Xác định độ tinh sạch và hàm lượng acarbose trong dịch tinh sạch 50

Trang 7

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi

DANH MỤC BẢNG

2.1 Danh mục các hóa chất chính dùng trong thí nghiệm 142.2 Các dung dịch đệm và dung dịch hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu 15

3.1 Số lượng khuẩn lạc nhặt ngẫu nhiên sau khi xử lý NTG + UV 263.2 Hoạt tính ức chế α-glucosidase của một số dòng đột biến chọn lọc 303.3 Sắc ký đồ TLC của các dòng đột biến bởi NTG + UV 333.4 So sánh hoạt tính α-glucosidase (%) trước và sau đột biến 363.5 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) 373.6 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) 383.7 Ảnh hưởng của pH môi trường đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) 403.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) 41

3.10 Các giải pháp nhận được sau sử dụng phương pháp RSM- CCD 46

Trang 8

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii

DANH MỤC HÌNH, ĐỒ THỊ

1.1 Cấu trúc enzyme α- glucosidase trong phức hợp maltose and NAD+ (http://en.wikipedia.org/wiki/Alpha-glucosidase) 21.2 Ảnh hưởng của chất ức chế α-glucosidase đến quá trình trao đổi

3.1 Đường cong sống sót của chủng Actinoplane sp KCTC 9162 VD sau

3.2 Các dòng khuẩn lạc của xạ khuẩn chủng Actinoplanes sp sau các

3.3 Sắc kí đồ TLC dịch lên men lỏng từ một số dòng đột biến 313.4 Sắc kí đồ TLC dịch lên men lỏng từ các dòng đột biến 323.5 Tính ổn định của sáu dòng đột biến qua các thế hệ 343.6 Sắc ký đồ TLC dịch lên men lỏng từ sáu dòng đột biến qua các thế hệ: Acarbose chuẩn 10mg/ml (C), NV45.15(1), NV45.18 (2), NV15.8 (3), NV15.5 (4), NV30.4 (5): A, B, C, D, E, F lần lượt là sắc

ký đồ TLC dịch lên men lỏng từ các dòng đột biến ở thế hệ 2, thế hệ

3, thế hệ 4, thế hệ 5, thế hệ 6 và thế hệ 7) 353.7 So sánh hoạt tính α-glucosidase (%) trước và sau đột biến 363.8 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) 373.9 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) 393.10 Ảnh hưởng cả pH môi trường đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) 403.11 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) 41

Trang 9

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii

3.12 Tương tác giữa hàm lượng maltose và pH tới khả năng ức chế

3.18 So sánh hoạt tính ức chế α-glucosidase (%) của dịch lên men chủng

NV45.18 trong môi trường trước và sau khi tối ưu 483.19 Sắc ký đồ TLC hoạt chất acarbose từ dịch lên men dòng NV45.18

3.20 Sắc ký đồ TLC các phân đoạn acarbose từ dịch lên men dòng NV45.18 khi qua cột trao đổi ion dạng acid amberlyst 15R

3.21a Phổ MS của mẫu chuẩn Acabose (C25H43NO18, KLPT 645.60) từ Sigma (CAS Number 56180-94-0, EC Number 260-030-7, (Sigma) được xác định trong dung môi methanol hệ thống LC/MS-MS-xevo

Trang 10

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ix

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Chữ viết tắt Tên đầy đủ

NTG N-methyl-N’-nitron-nitrosoguanidine

AGI α-glucosidase inhibition

Trang 11

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Acarbose là hợp chất hữu cơ giả đường (pseudo-oligosaccharide), hoạt động như một chất ức chế cạnh tranh α-glucosidase, khó bị tiêu hóa và không có độc tính (Wehmeier UF and Piepersberg W 2004) Hiện nay, acarbose đã được sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh đái tháo đường type 2 (không phụ thuộc insullin) (Kihara Y, Ogami Y et al 1997; Hanefeld M 2007; Hanefeld M, Schaper F et al 2008) Khi dùng acarbose duy nhất để điều trị đái tháo đường type 2 cùng chế độ

ăn, acarbose làm giảm nồng độ trung bình của hemoglobin glycosylat (0.6 đến 1%) Trái ngược với tác dụng của sulfonylurea, acarbose không làm tăng tiết insulin Các hoạt động ức chế sự tăng đường huyết xuất phát từ một sự ức chế cạnh tranh thuận nghịch α-amylase tuyến tụy và enzyme thủy phân tạo đường ở màng ruột kết Acarbose thuộc nhóm C7 N-aminocyclitol, một sản phẩm tự nhiên

(Mahumud T 2003) do các chủng Actinoplanes sp như Actinoplanes sp SE50 (Goeke K, Drepper A et al 1996) Actinoplanes sp A56 (Wei S, Cheng X et al 2010), Actinoplanes sp.CKD485-16 (Choi BT and Shin CS 2003) sinh tổng hợp ra

Actinoplanes là một chủng xạ khuẩn được nghiên cứu rộng rãi, nhiều

nghiên cứu đã chứng minh chủng Actinoplanes sp sinh tổng hợp ra acarbose như

là một sản phẩm tự nhiên Maltose cần được duy trì ở nồng độ cao trong môi trường trong suốt quá trình lên men để sinh tổng hợp acarbose có hiệu quả (Choi

BT and Shin CS 2003) Dịch chiết ngô là phụ phẩm chính trong công nghiệp chế biến bột ngô, được sử dụng rộng rãi và thành công làm môi trường giá thấp trong nhiều quá trình lên men (De Azeredo LAI, de lima MB et al 2006) Ngoài ra,

maltose có tác động rõ rệt đến sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp

A56 do maltose cấu thành nên acarbose (Lee S, Saueribrei B et al 1997; Choi

BT and Shin CS 2003; Cheng X, Xu B et al 2008; Wei SJ, cheng X et al 2010)

Tỷ lệ mắc bệnh tiểu đường đang tăng nhanh trên toàn thế giới, nhu cầu đối với các thuốc tiểu đường cũng như acarbose ngày càng tăng Vì vậy, việc

nghiên cứu phát triển chủng Actinoplanes sp tổng hợp acarbose cao sản có vai

Trang 12

trò hết sức quan trọng và cấp thiết Tuy nhiên, ở nước ta có rất ít đề tài nghiên cứu và sản xuất thành công chế phẩm kìm hoãm hoạt động của men α-glucosidase từ các chủng xạ khuẩn dùng cho bệnh tiểu đường type 2 Cũng có nhiều phương pháp đã được sử dụng để nâng cao việc sản xuất acarbose (Beunink J, Schedel M et al 1997; Choi BT and Shin CS 2003) Nhưng cho đến nay, có ít thông tin về việc tối ưu hóa môi trường lên men sinh tổng hợp acarbose Xuất phát từ những yêu cầu thực tiễn, chúng tôi tiến hành đề tài

“Nghiên cứu phát triển chủng Actinoplanes sp và tối ưu điều kiện lên men sinh tổng hợp acarbose”

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Chọn được một chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp acarbose năng suất cao

- Tối ưu môi trường lên men sinh tổng hợp acarbose của chủng xạ khuẩn theo phương pháp RSM- CCD

- Tối ưu qui trình tinh sạch acarbose

3 Nội dung nghiên cứu của đề tài

- Gây đột biến chủng xạ khuẩn bằng cách sử dụng hóa chất gây đột biến NTG (N-methyl-N’-nitron-nitrosoguanidine) và tia UV (tia cực tím)

- Sàng lọc các chủng đột biến từ chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp acarbose cao nhất

- Tối ưu môi trường lên men sản xuất acarbose từ chủng xạ khuẩn chọn lọc sau đột biến

- Tinh sạch acarbose từ môi trường lên men chủng xạ khuẩn chọn lọc sau đột biến

Trang 13

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Acarbose – thuốc điều trị bệnh tiểu dường type 2

1.1.1 Nhóm ức chế hoạt động của α-glucosidase

α-glucosidase gồm nhóm các enzyme (amylase, succrase, maltase, α- amylase) thủy phân hydratcacbon để giải phóng ra đường; α-glucosidase có nhiều nguồn gốc khác nhau: vi khuẩn, nấm mốc, đường tiêu hóa động vật…, α-glucosidase từ nguồn gốc khác nhau sẽ dẫn đến sự khác biệt về pH hoạt động, nhiệt độ hoạt động, hoạt tính…(Chiba S 1997)

Hình 1.1: Cấu trúc enzyme α- glucosidase trong phức hợp maltose and

Sau đó, α-glucosidase thủy phân các oligosaccharid thành các monosaccharit tại ruột non và làm tăng quá trình hấp thu monosaccharit, làm tăng đường huyết Chất

ức chế α-glucosidase có tác dụng ngăn cản sự tạo thành monosaccharit từ oligosaccharid được dùng trong điều trị tiểu đường type 2 (Bischoff H 1995)

Trang 14

Amylase

Hình 1.2: Ảnh hưởng của chất ức chế α-glucosidase đến quá trình trao đổi

đường trong cơ thể

Acarbose (tên thương mại Precose): là chất ức chế α-glucosidase và làm

chậm tốc độ thủy phân tinh bột để tạo glucose; làm tăng nồng độ lactate và làm giảm tổng acid béo dễ bay hơi liên quan đến toan cấp tính đã bị giảm; ngăn chặn

và giảm tỷ lệ nhiễm acid hiệu quả hơn việc dùng natri bicarbonate trong mô hình thử nghiệm cấp tính (McLaughlin CL, Thompson A et al 2009) Acarbose là hợp chất hữu cơ giả đường (pseudo-oligosaccharide), hoạt động như một chất ức chế cạnh tranh α-glucosidase, khó bị tiêu hóa và không có độc tính (Wehmeier UF and Piepersberg W 2004) Hiện nay, acarbose đã được sử dụng rộng rãi trong điều trị bệnh đái tháo đường type 2 (không phụ thuộc-insullin) (Kihara Y, Ogami

Y et al 1997; Hanefeld M 2007; Hanefeld M, Schaper F et al 2008)

Tinh bột

Maltose (Glucose + Glucose)

Saccharose (Glucose + Fructose)

Trang 15

1.1.2 Tính chất hóa học của acarbose

Acarbose thuộc nhóm C7 N-aminocyclitol, một sản phẩm tự nhiên

(Mahumud T 2003) do các chủng Actinoplanes sp như Actinoplanes sp SE50 (Goeke K, Drepper A et al 1996) Actinoplanes sp A56 (Wei SJ, cheng X et al 2010), Actinoplanes sp.CKD485-16 (Choi BT and Shin CS 2003) sinh tổng hợp

ra Cấu trúc của acarbose gồm một nửa là phân tử acarviose và nửa còn lại là maltose Acarviose là đơn vị lõi của acarbose, với chức năng quan trọng và chủ yếu kìm hãm α-glucosidase Các đơn vị maltosyl cấu thành nên phân tử acarbose hầu hết bắt nguồn từ phân tử maltose (Lee S, Saueribrei B et al 1997)

Hình 1.3: Công thức cấu tạo của acarbose

Acarbose (C25H43NO18), với danh pháp O-4,6- dideoxy4-[[(1S, 4R,5S, 4,5,6- trihydroxy-3-(hydroxymethyl)-2- cyclohexen-1-yl] amino] α-D- glucopyranos YL-(1→4)-O-α-D- glucopyranosyl-(1→4)-D-glucose PLT 645,6 hòa tan trong nước và có pKa là 5,1

6S)-1.1.3 Cơ chế tác dụng và dược lý

• Cơ chế tác dụng

Khi dùng acarbose duy nhất để điều trị đái tháo đường type 2 cùng chế

độ ăn, acarbose làm giảm nồng độ trung bình của hemoglobin glycosylat (vào khoảng 0,6-1%) Trái ngược với sulfonylurea, acarbose không tăng cường tiết insullin Các hoạt động ức chế sự ra tăng đường huyết xuất phát từ một sự ức chế cạnh tranh thuận nghịch α-amylase tuyến tụy và enzyme thủy phân tạo đường ở

Trang 16

màng ruột kết α-Amylase tụy thủy phân tinh bột thành oligosacchride trong lumen của ruột non, trong khi màng có các α-glucosidase thủy phân oligosacchride, trisaccharide, và disaccharide thành glucose và các monosaccharide khác trong ruột non (Viera Horváthová, Štefan Janeček et al 2000)

• Dược động học

Chuyển hóa acarbose:

Acarbose được chuyển hóa hoàn toàn trong đường tiêu hóa, chủ yếu do

hệ vi khuẩn đường ruột, bên cạnh đó nó còn được chuyển hóa bởi các enzyme tiêu hóa khác Một phần nhỏ các chất chuyển hóa (khoảng 34% liều dùng) được hấp thu và sau đó bài tiết qua nước tiểu Một chất chuyển hóa cũng có bản chất

ức chế hoạt động α-glucosidase (phân tử acarbose đã cắt bớt đi một phân tử glucose) (Hanefeld M, Schaper F et al 2008)

Một số ưu điểm và nhược điểm khi sử dụng acarbose

• Ưu điểm

Giảm sự gia tăng đường huyết, giảm lượng hemoglobin liên kết với đường, không có nguy cơ hạ đường huyết khi dùng đơn trị liệu, giảm lượng insullin phải dùng hàng ngày, giảm tình trạng tăng insullin huyết ở bệnh nhân đái tháo đường type 2, cải thiện việc sử dụng insullin, cải thiện tình trạng chuyển hóa của bệnh nhân về lâu dài (http://tailieu.vn/doc/acarbose-599748.html)

• Nhược điểm

Khi dùng thuốc có một vài tác dụng không mông muốn có thể xảy ra như đầy hơi, đau bụng, tiêu chảy Khi đang dùng phối hợp acarbose với các thuốc hạ đường huyết khác, nếu đường huyết giảm quá mức phải giảm liều các thuốc dùng kèm theo cho thích hợp, acarbose sẽ không gây hạ đường huyết (http://tailieu.vn/doc/acarbose-599748.html)

1.1.4 Tình hình nghiên cứu, sản xuất acarbose từ các chủng vi sinh vật trên thế giới và ở Việt Nam

• Trên thế giới

Chủng Actinoplanes sp CKD485-16 được lên men sinh tổng hợp

acarbose với năng suất 2,3 g/l acarbose và 0,6 g/l thành phần C của acarbose sau

Trang 17

khi kết thúc lên men Maltose, bán phân tử của acarbose, cần được duy trì ở nồng

độ cao trong môi trường trong suốt quá trình lên men để sinh tổng hợp acarbose

có hiệu quả (Choi BT and Shin CS 2003) Các liên kết giữa phân tử acarviose và maltose trong phân tử acarbose được hình thành bởi acarviosyl transferase (Hemker M, S.A et al 2001) Đã có nhiều lỗ lực trong nghiên cứu để cải thiện sản xuất acarbose (Beunink J, Schedel M et al 1997) Tuy nhiên, đến nay, rất ít thông tin, công trình được công bố liên quan đến tối ưu hóa quá trình lên men sinh tổng hợp acarbose, họ mới chỉ báo cáo ở mức độ phân lập và nhận biết các chủng sinh tổng hợp acarbose (Cheng X, Xu B et al 2008)

Để nâng cao năng suất sinh tổng hợp acarbose, Wei et al (2010) đã tối

ưu môi trường lên men cho chủng Actinoplanes sp A56, ảnh hưởng của glucose,

maltose, dịch chiết ngô, bột đậu tương và monosodium glutamate đến sinh tổng hợp acarbose Maltose và dịch chiết ngô là hai yếu tố có tác dụng quan trọng, làm tăng sinh tổng hợp acarbose từ 837 đến 1043mg/l (Wei SJ, cheng X et al 2010)

Maltose có tác động rõ rệt đến sinh tổng hợp acarbose bởi chủng

Actinoplanes sp A56 (Lee S, Saueribrei B et al 1997), nồng độ maltose trong dịch nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất acarbose Choi và Shin (2003), đánh giá ảnh hưởng maltose đến việc sản xuất acarbose bởi chủng

Actinoplanes sp CKD485-16 và maltose cần được duy trì ở nồng độ cao trong suốt quá trình lên men Nồng độ maltose trong môi trường tối ưu được tăng từ 30 lên 61,25g/l (Choi BT and Shin CS 2003; Wei SJ, cheng X et al 2010)

Dịch chiết ngô (corn steep liquor) là nguồn nitrogen rất quan trọng đối với nhiều vi sinh vật (Shah MM and Cheryan M 1995; Silveira MM, Wisbeck E

et al 2001; Vu VH and Kim K 2009) Hơn nữa dịch chiết ngô là phụ phẩm chính trong công nghiệp chế biến bột ngô, được sử dụng rộng rãi trong nhiều quá trình lên men như sản xuất dung môi, kháng sinh và enzyme do giá thành thấp (De Azeredo LAI, de lima MB et al 2006) Dịch chiết ngô là một yếu tố quan trọng

để sản xuất acarbose và sử dụng làm nguồn nitrogen rẻ tiền để sản xuất acarbose

ở qui mô công nghiệp bởi Actinoplanes sp A56 (Wei SJ, cheng X et al 2010)

Trang 18

làm chủ nhiệm, hai đề tài này mới ở giai đoạn bắt đầu thực hiện Những công trình nghiên cứu về chất ức chế hoạt động của α-glucosidase mới bắt đầu trong những năm gần đây tại Viện CNSH: “phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp chất ức chế α-glucosidase (AGI) dùng trong điều trị bệnh đái tháo đường” 2011-2012

1.2 Actinoplanes sinh tổng hợp acarbose

1.2.1 Tổng quan về xạ khuẩn

Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn đặc biệt, khuẩn lạc khô và đa số có dạng hình phóng xạ (actino-) nhưng khuẩn thể lại có dạng sợi phân nhánh như nấm (myces) Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên Số lượng đơn vị sinh khuẩn lạc xạ khuẩn trong 1g đất thường đạt tới hàng triệu Trên môi trường đặc đa số xạ khuẩn có hai loại khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh (aerial mycelium) và khuẩn ty cơ chất ( substrate mycelium) Nhiều loại chỉ có khuẩn ty cơ chất nhưng cũng có loại (như chi Sporichthya) lại chỉ có khuẩn ty khí sinh Giữa khuẩn lạc thường thấy có nhiều bào tử màng mỏng gọi là bào tử trần (conidia hay conidiospores) Nếu bào tử nằm trong bào nang (sporangium) thì được gọi là nang bào tử hay bào

tử kín (sporangiospores) Bào tử ở xạ khuẩn được sinh ra ở đầu một số khuẩn ty theo kiểu hình thành các vách ngăn (septa) Các chuỗi bào tử có thể thẳng, có thể xoắn, có thể ở hình dạng lượn sóng, có thể mọc đơn hay mọc vòng… Các cuống sinh bào tử (sporophore) và cuống sinh nang bào tử (sporangiophorres) có thể

riêng rẽ, có thể phân nhánh (http://vietsciences.free.fr.)

Trang 19

1.2.2 Đặc điểm, hình thái của xạ khuẩn

Đặc điểm nổi bật của xạ khuẩn là có hệ sợi phát triển, phân nhánh mạnh

và không có vách ngăn Hệ sợ xạ khuẩn mảnh hơn nấm mốc với đường kính thay đổi trong khoảng 0.2-1µm đến 2-3µm, chiều dài có thể đặt tới một vài cm (Dũng

NL, Quyến NĐ et al 2007) Kích thước và khối lượng hệ sợi của xạ khuẩn thường không ổn định và phụ thuộc vào điều kiện sinh lý, nuôi cấy Khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng da, dạng vôi, dạng nhung tơ hay dạng mảnh dẻo Khuẩn lạc xạ khuẩn có màu sắc rất đa dạng: đỏ, da cam, vàng, nâu, xám, trắng… tùy thuộc vào loài và điều kiện ngoại cảnh Các sản phẩm trong quá trinh trao đổi chất như: chất kháng sinh, độc tố, enzyme, vitamin, axit hữu cơ…

có thể được tích lũy trong sinh khối của tế bào xạ khuẩn hay được tiết ra môi trường Hình thái luôn là đặc điểm chung để nhận dạng và định danh xạ khuẩn Tuy nhiên, trình tự 16S rRNA cho thấy các đặc điểm hình thái của xạ khuẩn có ít mối tương quan về di truyền và tiến hóa giữa các chủng xạ khuẩn (Hà BT 2008)

Trang 20

có hình dạng xác định Các bào tử hình cầu có đường kính 1-1,5 mm, xuất hiện trong vòng xoắn theo trật tự, hoặc đột ngột được sắp xếp trong bọc bào tử (Simone M, Monciardini P et al 2013)

Actinoplanes sp tổng hợp acarbose cao sản được sử dụng trong lên men với qui mô lớn kể từ năm 1990 (UF W and WP 2004) Chủng Actinoplanes sp cho năng suất sinh tổng hợp acarbose 2,3g/l môi trường lên men chứa matlose

Actinoplanes sp còn được ứng dụng trong việc sản xuất các loại dược liệu như: kháng khuẩn (Fremmer W, Puls W et al 1975; Vértesy L, Ehlers E et

al 2000), kháng nấm (Cooper R, Truumees I et al 1992) và các tác nhân chống ung thư (Jung H-M, Jeya M et al 2009)

1.3 Đột biến và cải biến chủng

1.3.1 Giới thiệu về đột biến

Đột biến là những biến đổi bất thường trong vật chất di truyền ở cấp độ phân tử (ADN, gen) hoặc cấp độ tế bào (nhiễm sắc thể), dẫn đến sự biến đổi đột ngột của một hoặc một số tính trạng, những biến đổi này có tính chất bền vững

và có thể di truyền cho các đời sau (Lê Đình Trung 2002)

Đột biến là quá trình xảy ra đột ngột, riêng rẽ, ngẫu nhiên, không định hướng ở cơ thể sống trong điều kiện tự nhiên Đa số là đột biến gen lặn và có hại, một số ít có lợi và có ý nghĩa rất lớn đối với quá trình tiến hóa và chọn giống (Lê Đình Trung 2002)

Chúng có thể chỉ xảy ra đối với một tế bào đơn lẻ hoặc có thể được chuyền từ một tế bào khác trong một sinh vật đa bào (tế bào soma đột biến), hoặc

có thể được truyền từ một thế hệ khác đột biến thông qua giao tử (mầm dòng đột biến) Đột biến có thể được gây ra bởi các yếu tố tự nhiên từ môi trường, từ sự hoạt động hay không hoạt động của enzyme sửa chữa, và từ những hóa chất (chất gây đột biến) hoặc các bức xạ năng lượng cao Tỷ lệ đột biến khác nhau giữa các loài sinh vật, giữa các gen, thời gian và địa điểm Nó có thể gây ra tác động đáng

kể không chỉ đối với cá nhân mà còn cả sự tiến hóa chung của các loài Những biến đổi này có tính chất bền vững và có thể di truyền cho các thế hệ sau, góp phần thúc đẩy đa dạng sinh học (Mai Xuân Lương 2001)

Trang 21

Đối với các enzyme sử dụng trong công nghiệp phải được sản xuất với chi phí thấp và có thể tái sử dụng và tái sản xuất Để đạt được điều này, việc cải thiện thường được thực hiện bằng kỹ thuật đột biến Người ta có thể tạo

đột biến bằng các chất gây đột biến hóa học như nitrosoguanidine (NTG), EMS… hoặc bằng cách chiếu xạ vật lý như tia X, tia

N-methyl-N’-nitro-N-UV (Zhang M and et al 2009)

Sự đột biến các dòng nấm để tạo ra các enzyme công nghiệp khác nhau như: protease, chitinase, cellulose, glucoamylase….đã được sử dụng rộng rãi (Kudad R, Kumar M et al 1994; Chand P and et al 2005)

1.3.2 Sự cải biến chủng trên thế giới

Trước thập kỷ 70, công nghệ sinh học được hiểu là sự lên men công nghiệp vi sinh vật để tạo thương phẩm Trong những thập kỷ 60 và 70 công nghệ lên men đã phát triển thành một ngành công nghiệp lớn Giống vi sinh vật được xem là yếu tố quyết định trong thành công của ngành công nghiệp lên men này Phương pháp chọn giống cổ điển được tiến hành trên các chủng phân lập từ tự nhiên và sau đó đột biến bằng tia tử ngoại và bằng hoá chất

Năm 1994, Kuhad và cộng sự đã xử lý chủng nấm Fusarium oxysporum

bằng tia cực tím, chủng đột biến được xử lý với NTG đã làm tăng khả năng tổng hợp Cellulose lên nhiều lần so với chủng tự nhiên (Kudad R, Kumar M et al 1994)

Năm 1992, các nhà khoa học Nhật Bản đã đột biến chủng

Actinoplanes sp N902-109 (FERM BP-3832) và biến nạp để sản xuất rapamycin (Nakao Kojima and Yasuhiro Kojima et al 1992)

Năm 1996, Anneliese Crueger và cộng sự đã đột biến chủng

Actinoplanes sp SE 50/110 để chọn lọc ra gene sinh tổng hợp acarbose từ chủng

xạ khuẩn đột biến này (Anneliese Crueger and Jurgen Distler et al 1996)

Năm 1998, Kim và cộng sự đã sử dụng xung điện và hóa chất NTG để

cải biến hai chủng nấm men S diastaticus (ATCC 28339) và Saccharomyces spp trong sản xuất cồn sinh học Dòng đột biến chọn lọc NF30-9 lên men được ethanol nồng độ cao hơn (Keun K and Jae- Yeon L 1998)

Trang 22

Năm 2003, các nhà khoa học Hàn Quốc là Lee Jae-Chan và cộng sự đã

đột biến chủng Actinoplanes teicomyceticus bằng hóa chất NTG và tia UV đã

làm tăng khả năng sinh tổng hợp teicoplanin (Jae-Chan Lee and Hae-Ryong Park

et al 2003)

Năm 2005, Chand và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm gây đột biến trên nấm sợi bằng NTG kết hợp với ethidium bromide và UV hoặc NTG kết hợp với ethidium bromide Kết quả sang lọc đột biến được chủng có khả năng tổng hợp

cellulose tăng lên nhiều lần so với chủng tự nhiên (Chand P and et al 2005)

Năm 2011, Klaus Selber và cộng sự đã đột biến chủng Actinoplanes utahensis dại SE50-100 nhằm cải biến gene nâng cao năng suất sinh tổng hợp acarbose (Klaus Selber and Bernhard Weingaertner et al 2011)

1.3.3 Sự cải biến chủng ở Việt Nam

Năm 2009 , Hồ Tuyên và cộng sự đã sử dụng ba phương pháp gây đột biến gồm chiếu tia cực tín (UV) vào bào tử, xử lý hóa chất gây đột biến NTG đối với tế

bào trần và các phân đoạn khuẩn ty nâng cao hoạt tính kháng sinh của Acremonium chrysogenum Biến chủng tối ưu thu được có hoạt tính kháng sinh tăng khoảng 75%

so với chủng ban đầu (Hồ Tuyên, Nguyễn Thị Hồng Liên et al 2009)

Năm 2010, tác giả Nguyễn Quỳnh Uyển và cộng sự đã sử dụng hóa chất gây dột biến NTG để nâng cao hoạt độ phân giải protein của protease ngoại bào

của vi khuẩn Bacillus sp Sau khi gây đột biến bằng NTG và sàng lọc, hai chủng

vi khuẩn đột biến có hoạt độ phân giải protein cao hơn 1,5 lần và 2 lần so với hoạt độ so của chủng gốc đã thu được (Nguyễn Quỳnh Uyển and et al 2010)

Năm 2011, Vũ Văn Hạnh và các cộng sự đã xử lý chủng nấm sợi

Aspergillus sp bằng cách kết hợp tia Rontghen và hóa chất NTG để gây đột biến Chủng nấm đột biến chọn lọc có khả năng tổng hợp men phân hủy tinh bột sống cellulase tăng lên rất rõ rệt so với chủng tự nhiên (Hanh V V, Anh P.T et al 2009; Hanh V V, Anh P.T et al 2010)

Năm 2012, Vũ Văn Hạnh và các cộng sự tiến hành thí nghiệm nâng cao

độc lực diệt rệp đào của chủng nấm ký sinh côn trùng Lecanicillium bằng đột

biến tia UV và NTG nhằm sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Sàng lọc 42 dòng nấm

Trang 23

đột biến, trong đó hai thể đột biến UV (UV10.4 và UV60.3) và ba thể đột biến NTG (NTG30.2, NTG50.2 và NTG60.2) diệt 100% rệp muội sau 4 đến 5 ngày phun Độc lực của các thể đột biến tăng từ 10 đến 20% so với kiểu dại (Vũ Văn Hạnh, Lê Thị Thùy Dương et al 2012)

1.4 Ảnh hưởng của các thành phần môi trường đến khả năng sinh tổng hợp acarbose của các chủng xạ khuẩn

1.4.1 Ảnh hưởng của nguồn Cacbon đến khả năng sinh tổng hợp acarbose của các chủng xạ khuẩn

Cacbon là nguyên tố có mặt ở hầu hết các chất trong cơ thể xạ khuẩn cũng như trong các sản phẩm trao đổi chất Các hợp chất hữu cơ chứa cả Cacbon

và Nito (pepton, nước thịt, nước chiết ngô, nước chiết nấm men, nước chiết đại mạch, nước chiết giá đậu .) có thể sử dụng vừa làm nguồn Cacbon vừa làm nguồn Nito đối với vi sinh vật Các hợp chất cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong sinh trưởng và hình thành acarbose (Ronald and M A 1946)

Ngoài ra, maltose có tác động rõ rệt đến sinh tổng hợp acarbose từ chủng

xạ khuẩn do maltose cấu thành nên acarbose (Lee S, Saueribrei B et al 1997), nồng độ maltose trong dịch nuôi cấy đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất acarbose Choi và Shin (2003), đánh giá ảnh hưởng maltose đến việc sản xuất

acarbose bởi chủng Actinoplanes sp CKD485-16 và maltose cần được duy trì ở

nồng độ cao trong suốt quá trình lên men Nồng độ maltose trong môi trường tối

ưu được tăng từ 30 lên 61,25g/l (Choi BT and Shin CS 2003; Wei SJ, Cheng X et

Trang 24

chủng xạ khuẩn Actinoplanes(Ronald and M A 1946)

Ngoài ra, pH môi trường và nhiệt độ lên men cũng là hai yếu tố quan trọng trong quá trình sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn

Trong những năm gần đây nhóm nghiên cứu chúng tôi đã và đang tìm kiếm những hợp chất ức chế α-glucosidase như acarbose, 1-Deoxynojirimycin (DNJ) định hướng sử dụng trong điều trị đái tháo đường type 2 (Quyền Đình Thi and Vũ Văn Hạnh 2011; Vũ Thi Hằng, Vũ Văn Hạnh et al 2012; Bạch Hoàng

Mi, Nguyễn Thị Nguyệt et al 2013; Đỗ Thị Tuyên, Vũ Văn Hạnh et al 2013; Thi Tuyen Do, Thanh Hoang Le et al 2014; Thi Tuyen Do and Vu Van Hanh et

al 2014) Đề tài “Nghiên cứu quy trình công nghệ điều chế acarbose làm nguyên liệu thuốc chữa bệnh đái tháo đường” thuộc chương trình NCKH

trọng điểm quốc gia phát triển Công nghiệp dược liệu đến năm 2020, Bộ công thương 2012-2015 do TS Đỗ Thị Tuyên chủ nhiệm cũng đang được tiến hành

Trong khuôn khổ của luận văn thạc sỹ, chúng tôi đặt ra nhiệm vụ “Nghiên cứu

phát triển chủng Actinoplanes sp và tối ưu điều kiện lên men sinh tổng hợp

acarbose” Mục đích của nghiên cứu này là chọn được chủng đột biến tổng hợp

acarbose cao hơn chủng tự nhiên, chọn được môi trường tối ưu rẻ tiền để sản xuất acarbose cao sản, đồng thời đưa ra được qui trình tinh sạch acarbose

Trang 25

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

2.1.1 Chủng vi sinh vật

Chủng Actinoplane sp KCTC 9162 VD tại phòng Các chất chức năng

sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.1.2 Hóa chất

Các hóa chất được sử dụng trong thí nghiệm đều ở mức độ tinh khiết

Bảng 2.1 Danh mục các hóa chất chính dùng trong thí nghiệm

Tên hóa chất Hãng, nước sản xuất Tên hóa chất Hãng, nước sản xuất

Pepton Bio Basic Inc (Mỹ) MgSO4.7H2O Trung Quốc

Bột đậu tương Thị trường Muối Natri citrate C.ty HC Đức Giang, VN

Giang, VN

ρ- nitrophenyl α- D-

glucopyranoside Sigma α- glucosidase Sigma

Và một số hóa chất khác tinh khiết mức phân tích được sử dụng trong nghiên cứu

2.1.3 Dung dịch đệm

Các dung dịch và đệm sử dụng trong nghiên cứu được liệt kê ở bảng

Trang 26

dưới đây Thành phần hóa chất, nồng độ, cách pha được thực hiện theo hướng dẫn của các bài báo đã được công bố (Yamaki K and Mori Y 2006; Đỗ Thị Tuyên, Lê Thanh Hoàng et al 2011)

Bảng 2.2 Các dung dịch đệm và dung dịch hóa chất được sử dụng

trong nghiên cứu

α- glucosidase (từ ruột lợn) 0,4% pha trong đệm PP pH= 6,8

Nước muối sinh lý 0,9% NaCl

2.1.4 Môi trường

- Chủng Actinoplane sp được giữ trong môi trường thạch nghiêng (g/L): glucose 20, peptone 5, KCl 0,5, K2HPO4 1, MgSO4 0.5 và agar 20, pH=7

- Môi trường nhân giống (g/L): glucose 30, bột đậu tương 40, KH2PO4

1, MgSO4 1, agar 20 và CaCO3 20, pH=7

- Môi trường lên men (g/l): sucrose 30; pepton 2; casein hydrolysate 1;

K2HPO4.3H2O 1; KCl 0.5; MgSO4.7H2O 0.5; FeSO4.7H2O 0.1

Tất cả các môi trường lỏng, đặc dùng cho nuôi cấy vi sinh vật đều được khử trùng ở 115oC trong 30 phút trước khi sử dụng

Trang 27

Bảng 1.3 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

Máy ly tâm bàn KUBOTA’2010 Nhật Bản

Máy li tâm lạnh Mikro 22R Hettich (Đức)

2.2.1.2 Phương pháp lên men lỏng và thu dịch ngoại bào

Khuẩn lạc thuần khiết được nuôi cấy trong bình tam giác 250ml chứa 50ml môi trường lỏng Thành phần môi trường lỏng (g/L): sucrose 30; pepton 2; casein hydrolysate 1; K2HPO4.3H2O 1; KCl 0.5; MgSO4.7H2O 0.5; FeSO4.7H2O

Trang 28

0.1, nuôi lắc ở 28°C, 200 vòng/phút trong 5 ngày Môi trường sau lên men 5 ngày được ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi để xác định hoạt tính

ức chế α-glucosidase (AGI) và chạy sắc kí bản mỏng (TLC)

2.2.2 Xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase (AG) (Yamaki K and Mori Y 2006)

Chuẩn bị các hóa chất cho phản ứng:

- Dung dịch đệm kali phosphate 0,1 M, pH=6,8

- Dung dịch α-glucosidase (AG): Bột enzyme intestinal acetone powder từ chuột (Sigma I1630-10G) chứa các enzyme (AG, maltase, α-amylase và sucrase được pha trong đệm 100mM potassium phosphate, pH 6,8 với nồng độ 0,4% (w/v), lắc kỹ trong 5 phút Sau đó ly tâm ở 10,000 rpm trong 10 phút để thu dịch nổi

- Cơ chất nitrophenyl α-D-glucopyranoside (pNP-G): 12mM nitrophenyl α-D-glucopyranoside được pha trong đệm kali phosphate (0,1M, pH=6,8)

p Dung dịch làm dừng phản ứng: 200mM Na2CO3

Tiến hành phản ứng:

Dịch nuôi cấy của mỗi chủng Actinoplanes sp sau loại bỏ cặn được sử

dụng để thử khả năng ức chế AG, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, riêng bước sàng lọc chọn chủng sinh tổng hợp chất có hoạt tính ức chế AG chỉ thí nghiệm 1 lần Mỗi thử nghiệm gồm 3 ống: 1 ống thí nghiệm (TN), 1 ống đối chứng âm (CÂ) và một ống đối chứng dương (CD) Dịch nổi (10µl) được hút cho vào mối ống TN và CÂ; bổ sung 10µl dung dịch AG vào ống TN và CD, 100µl cơ chất p-nitrophenyl α-D-glucopyranoside cho vào cả 3 ống trên, ủ hỗn hợp phản ứng ở

37oC Sau khi ủ 30 phút, bổ sung 100µl 200mM Na2CO3để kết thúc phản ứng Hỗn hợp phản ứng được đo ở bước sóng 415 nm trên máy đo UV-VIS 752 Tỷ lệ (%) ức chế AG được tính theo công thức (i):

Trong đó, A415(TN), A415(CÂ), A415(CD) là giá trị OD đo tại bước sóng 415nm của các ống TN, CÂ và CD

Trang 29

2.2.3 Phương pháp sắc ký lớp mỏng

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng silica gel Merck 60 F254, dày 0,25mm với hệ dung môi: n-butanol: ethanol: H2O theo tỉ lệ 9: 7: 4, sau đó bản mỏng TLC được xông hơi axit nhằm phát hiện ra phân tử đường có trong dịch mẫu Bản TLC sau khi chạy xong được sấy khô dung môi và phun hơi acid 10% H2SO4 pha trong methanol và sấy 15 phút ở 120°C

Cách tiến hành:

Chấm dung dịch lên bản mỏng: kẻ 1 vạch nằm ngang bằng bút chì, cách mép dưới của bản sắc kí 1cm làm vạch xuất phát và 1 vạch nằm ngang cách mép trên của bản sắc kí 0.5 cm làm vạch kết thúc Dùng pipet chấm các vết dịch nổi của các dòng đột biến đã lên men 5 ngày và dung dịch acarbose chuẩn lên đó Các mẫu phải cách nhau và cách mép ít nhất là 0.5 cm Các vết chấm phải nhỏ và

để khô tự nhiên sau khi chấm Bản sắc kí sau đó được nhúng vào một dung môi thích hợp, và được đặt vào trong một bình chứa có nắp

Sau khi dung môi đã chạy đến mép trên của bản mỏng thì ta lấy ra để khô tự nhiên Phát hiện các vết trên bản mỏng bằng cách dùng dung dịch thuốc nhuộm H2SO4 10% và sấy ở 120°C sẽ xuất hiện các vạch màu tối

2.2.4 Phương pháp gây đột biến bằng NTG kết hợp với tia UV

Phương pháp tiến hành:

Trang 30

Chủng xạ khuẩn Actinoplanes sp KCTC 9162 VD được nuôi lắc ở 28°C

trong bình nón chứa môi trường CPC Sau khoảng 5 ngày, hút ra 2ml dịch bào tử

và tiến hành li tâm ở 10.000 vòng/ phút trong 15 phút để thu sinh khối, bổ sung 0.5 ml dung dịch NTG rồi vortex đều, đổ ra bề mặt đĩa petri Bật tia UV (50W), khoảng cách từ nguồn UV đến đĩa khoảng 25- 30cm, sau các khoảng thời gian

15, 30, 60, 90 phút thì hút ra 100 µl vào ống effendort và ngay lập tức mang đi ly tâm ở 10000 vòng/phút, thu tế bào, loại bỏ hóa chất Rửa lại mẫu đã đột biến bằng nước cất 2 lần, sau đó bổ sung 200 µl nước muối sinh lí Hút 100 µl dịch chứa tế bào tiến hành cấy trang trên đĩa petri có chứa môi trường thạch bột đậu tương Các đĩa xạ khuẩn được nuôi ở 28°C trong 5 ngày để đếm số khuẩn lạc mọc trên các đĩa thạch Nhặt ngẫu nhiên các khuẩn lạc trên đĩa thạch để lên men

và chọn được dòng đột biến mong muốn

2.2.5 Tối ưu môi trường lên men sản xuất acarbose

Từ các dòng đột biến, chọn ra một dòng đột biến có hoạt tính acarbose cao nhất Ta sẽ sử dụng dòng đột biến này để nuôi và tối ưu môi trường lên men sản xuất acarbose thích hợp cho dòng đột biến này

A Tối ưu đơn hướng các yếu tố

2.2.5.1 Tối ưu nguồn cacbon

Hình 2.1: Sơ đồ thí nghiệm tối ưu nguồn cacbon

Nuôi cấy chủng Actinoplane sp đã được chọn trong

các nguồn cacbon khác nhau (g/L)

Maltose Glucose Sucrose Rỉ đường

Xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase

Xác định nguồn cacbon thích hợp

Trang 31

Trang 32

Tiến hành tối ưu nguồn cacbon trong môi trường lên men với thành phần môi trường lỏng (g/L): nguồn cacbon khác nhau (sucrose 30, maltose 30, glucose

30, rỉ đường); pepton 2; casein hydrolysate 1; K2HPO4.3H2O 1; KCl 0.5; MgSO4.7H2O 0.5; FeSO4.7H2O 0.1 tới sinh trưởng và phát triển cũng như hoạt tính ức chế α-glucosidase Nuôi lắc ở 28oC, 180 rpm trong 5 ngày Môi trường sau khi lên men 5 ngày được ly tâm ở 10,000 rpm trong 10 phút, thu dịch nổi để xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase Xác định nguồn cacbon thích hợp nhất (Carlo Taurino, Luca Frattini et al 2011)

2.2.5.2 Tối ưu nguồn nitrogen

Nuôi cấy lắc chủng vi sinh vật trong môi trường lỏng (g/L): succrose 30, casein hydrolysate 1; K2HPO4.3H2O 1; KCl 0.5; MgSO4.7H2O 0.5; FeSO4.7H2O 0.1, và các nguồn nitogen khác nhau ( bột ngô:2, bột đậu tương 2, peptone:2, cao nấm men:2) với tốc độ lắc là 180 rpm ở nhiệt độ 280C trong các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau để đánh giá tốc độ sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật Sau các khoảng thời gian nuôi cấy khác nhau, lấy dịch tiến hành đo OD và kiểm tra hoạt tính ức chế α-glucosidase Tìm nguồn nitrogen thích hợp nhất

Hình 2.2: Sơ đồ thí nghiệm tối ưu nguồn nitrogen:

Nuôi cấy chủng Actinoplane sp đã được chọn trong các nguồn

nitrogen khác nhau

Casein

Trang 33

2.2.5.3 Tối ưu nhiệt độ

Tiến hành tối ưu nhiệt độ nuôi cấy trong môi trường lên men với thành phần môi trường lỏng (g/L): Sucrose 30; pepton 2; casein hydrolysate 1;

K2HPO4.3H2O 1; KCl 0.5; MgSO4.7H2O 0.5; FeSO4.7H2O 0.1 tới sinh trưởng và phát triển cũng như hàm lượng acarbose Nuôi lắc ở các nhiệt độ khác nhau (25

oC, 28oC, 30 oC, 35 oC), 180 rpm trong 5 ngày Môi trường sau khi lên men 5 ngày được ly tâm ở 10,000 rpm trong 10 phút, thu dịch nổi để xác định hoạt tính

ức chế α-glucosidase Xác định nhiệt độ nuôi cấy thích hợp nhất

Hình 2.3: Sơ đồ thí nghiệm tối ưu nhiệt độ

Nuôi cấy chủng Actinoplane sp đã được chọn ở các nhiệt

Trang 34

2.2.5.4 Tối ưu pH

Hình 2.4: Sơ đồ thí nghiệm tối ưu pH

Nuôi cấy chủng vi sinh vật trong môi trường lên men tối ưu, trong môi trường pH khác nhau từ 6– 8 với tốc độ lắc 180rpm, ở 280C trong 5 ngày Xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase qua chỉ số đo OD ở bước sóng 415nm Tìm khoảng pH nuôi cấy thích hợp

B Tối ưu đa hướng các yếu tố

Từ tối ưu đơn hướng chúng tôi tìm được các khoảng thích hợp

Để kiểm tra sự ảnh hưởng lẫn nhau của các yếu tố tới quá trình lên men sinh tổng hợp acarbose, chúng tôi tiếp tục tối ưu các yếu tố môi trường trong lên men sinh tổng hợp acarbose theo phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM) dựa trên phần mềm Design- Expert® RSM là một phương pháp thực hiện hiệu quả, chi phí thấp, cho phép nghiên cứu sự tương tác và đồng thời tiên đoán được giá trị tối

ưu của các yếu tố - thiết kế thí nghiệm tối ưu đa yếu tố theo Plackett-Burman (RL Plackett and JP Burman 1946; KJL Dennis 1995) đã được đưa ra và sử dụng rộng rãi để sàng lọc thành phần môi trường trong điều kiện nuôi cấy lắc (Li Y,

Nuôi cấy chủng Actinoplane sp đã được chọn trong các pH

khác nhau

Xác định pH nuôi cấy thích hợp Xác định hoạt tính ức chế α-glucosidase

Trang 35

Liu Z et al 2007; Liu C, Sun ZT et al 2008), tối ưu hóa sinh tổng hợp lipase từ

Bacillus licheniformis GBDTY1(Huỳnh Thị Thanh Hiền, Trịnh Thị Bích Huyền

et al 2010), tối ưu sinh tổng hợp acarbose từ chủng Actinoplanes sp A56 (Wei

SJ, cheng X et al 2010)

Sau bước sàng lọc ban đầu, thí nghiệm tối ưu theo phương pháp CCD được dùng để tối ưu hóa giá trị các yếu tố đang được nghiên cứu Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã tối ưu hóa các thành phần dinh dưỡng môi trường lên men là nguồn Cacbon và điều kiện nuôi cấy theo thiết kế Plackett-Burman và phương pháp RSM-CCD để thăm dò điều kiện lên men cho hoạt tính ức chế α-glucosidase cao (sản lượng của acarbose cực đại) từ dịch lên men chủng xạ

RSM-khuẩn Actinoplanes sp

Hàm đáp ứng được chọn là phần trăm ức chế α-glucosidase (Y, % ức chế) Số liệu được phân tích bằng chương trình Design expert ® 9.0.3 của Stat-Ease Inc USA Từ kết quả phân tích, xác định mức tối ưu của các yếu tố cho hoạt tính ức chế α-glucosidase đạt cực đại

2.2.6 Tinh sạch acarbose

Thu dịch lên men: Sau khoảng thời gian lên men, ly tâm 10000

vòng/phút trong 10 phút để thu dịch nổi và loại bỏ tế bào, kiểm tra lại hoạt tính

và tiến hành bước loại protein

Loại protein: dịch nổi được đun nóng ở 80- 90°C trong 30 phút Sau đó để

lạnh ở 4°C 1- 2 giờ và ly tâm 10000 vòng/phút trong 20 phút thu dịch nổi Tiến hành

cô đặc dịch nổi còn 1/3 thể tích để loại bỏ bớt nước Tiếp theo thực hiên bước tủa bằng chloroform với tỷ lệ chloroform: dịch nổi là 1:4, để thu dịch nổi

Tinh sạch bằng cách lọc qua amberlyst -cation exchange resin 15R: Sử

dụng mẫu thu được bằng phương pháp tủa với chloroform, cô đặc dịch khoảng 1/3 thể tích Sau đó chúng tôi tra 10ml dịch lên cột sắc ký trao đổi cation dạng acid mạnh amberlyst 15R Sau khi rửa cột bằng nước đề ion với thể tích gấp 5 lần thể tích cột, chúng tôi tiến hành thôi acarbose bằng dung dịch HCl 1M Các phân đoạn thu được tiến hành chạy TLC để kiểm tra khả năng tinh sạch và hoạt chất acarbose

Trang 36

Trang 37

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả đột biến và sàng lọc

3.1.1 Tạo dòng đột biến bằng NTG kết hợp tia UV

Với mục tiêu cải biến chủng để nâng cao khả năng sinh tổng hợp

acarbose, chúng tôi đã tiến hành gây đột biến chủng xạ khuẩn Actinoplanes sp

KCTC 9162 VD bằng NTG kết hợp tia UV

Chủng Actinoplanes sp KCTC 9162 VD được nuôi trong môi trường

lên men lỏng Sau 5 ngày, hút 2ml dịch đem ly tâm 10 phút (10000v/phút) để thu sinh khối Sau đó, bổ sung 0.5 ml dung dịch NTG, vortex đều và đổ ra bề mặt đĩa petri Bật tia UV (50W), sau các khoảng thời gian 15, 30, 60, 90 phút thì hút ra

100 µl ly tâm thu tế bào, loại bỏ hóa chất Sau đó bổ sung nước muối sinh lí và tiến hành cấy trang trên đĩa petri Sau 5 ngày nuôi cấy, chọn ngẫu nhiên từ mỗi đĩa 5 khuẩn lạc Kết quả được thể hiện trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Số lượng khuẩn lạc nhặt ngẫu nhiên sau khi xử lý NTG + UV

Thời gian

(phút) Ký hiệu của các thể đột biến

Số lượng dòng đột biến

15

NV15.1, NV15.2, NV15.3, NV15.4, NV15.5, NV15.6,

NV15.7, NV15.8, NV15.9, NV15.10, NV15.11, NV15.12, NV 15.13, NV15.14, NV15.15, …, NV15.73

73

30

NV30.1, NV30.2, NV30.3, NV30.4, NV30.5, NV30.6,

NV30.7, NV30.8, NV30.9, NV30.10, NV30.11, NV30.12, NV30.13, NV30.14, NV30.15, …, NV30.40

Trang 38

Tác động của tác nhân gây đột biến NTG và UV là khác nhau ở các khoảng thời gian khác nhau được thể hiện ở tỷ lệ sống sót NTG và tia UV có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng sống sót của bào tử Thời gian xử lý với NTG và thời gian chiếu tia UV càng lâu thì khả năng sống sót của bào tử càng giảm Qua các khoảng thời gian khác nhau 15 phút, 30 phút, 60 phút, 90 phút, ta thấy rằng dưới

sự ảnh hưởng của NTG kết hợp UV, số lượng khuẩn lạc giảm dần theo thời gian NTG và tia UV đã tác động lên bào tử của xạ khuẩn gây đột biến làm chết, làm giảm số lượng bào tử sống sót (Hình 3.1)

Hình 3.1: Đường cong sống sót của chủng Actinoplane sp KCTC 9162 VD

sau khi đột biến bằng NTG kết hợp tia UV

Dựa vào hình 3.1, ta thấy rằng:

Tỉ lệ (%) sống sót của bào tử khi xử lý bằng NTG kết hợp tia UV giảm dần ở các khoảng thời gian từ 15 phút đến 90 phút Kết quả trên cũng phù hợp với một số nghiên cứu gây đột biến trên vi khuẩn của (Lê Uyển and et al 2009) Sau khoảng thời gian 15 phút, tỷ lệ (%) sống sót của bào tử giảm đi gần 80%, chỉ còn 21,79% bào tử còn sống sót Sau 30 phút, lượng bào tử sống sót lúc này còn 11,54% so với ban đầu Sau 45 phút lượng bào tử sống sót còn 6.41% Ở 60 phút,

tỷ lệ bào tử giảm còn 2.56%, đến 90 phút, bào tử không thể sống sót Ảnh hưởng

Trang 39

của tác nhân gây đột biến NTG và UV tác động trực tiếp đến cấu trúc di truyền của bản thân sinh vật, ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng sống sót của sinh vật nói chung và xạ khuẩn nói riêng nên ảnh hưởng đến tỷ lệ sống sót sau đột biến (Vikto´ ria La´za´ r and Gajinder Pal Singh 2013)

Các khuẩn lạc sau khi xử lý đột biến bằng NTG kết hợp UV ở các khoảng thời gian khác nhau được nhặt ngẫu nhiên để nghiên cứu

Hình 3.2: Các dòng khuẩn lạc của xạ khuẩn chủng Actinoplanes sp

sau các khoảng thời gian đột biến

KCTC 9162 VD sau đột biến ở các khoảng thời gian khác nhau.(A, B, C,

D, E, F) lần lượt là khuẩn lạc thu được sau khi xử lý bởi NTG kết hợp tia UV sau

0, 15, 30, 45, 60, 90 phút

Sau 3 lần thực hiện gây đột biến chủng xạ khuẩn Actinoplanes sp KCTC

9162 VD bằng NTG kết hợp tia UV, chúng tôi đã nhặt ngẫu nhiên được 139 dòng đột biến

Việc tạo đột biến ở chủng vi sinh vật đã làm tăng những đặc tính mong muốn cho việc sử dụng chủng giống đó (Stanbury P F., Whitaker A et al 1995):

Năm 2011, Klaus Selber và cộng sự đã đột biến chủng A utahensis hoang dã

SE50-100 nhằm cải biến gene nâng cao năng suất sinh tổng hợp acarbose (Klaus

Định dạng
Số trang	79
Dung lượng	2,33 MB