nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của lợn được tiêm vacxin tai xanh nhược độc chủng prrs hanvet1 vn

2.1.3 So sánh hiệu quả của vacxin Tai xanh do Hanvet sản xuất với một số vacxin phòng bệnh PRRS hiện có trên thị trường 26 2.2 Đối tượng, vật liệu sử dụng trong nghiên cứu 26 2.2.3 Các l

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi Các kết quả, số liệu nêu trong bản luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa được bảo vệ

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi còn nhận được sự giúp đỡ tận tình của nhiều cá nhân và tập thể Nhân dịp này cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn chân thành nhất tới:

PGS.TS Bùi Trần Anh Đào - bộ môn Bệnh lý, khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, thầy đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này

Các thầy cô giáo trong khoa Thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Trung tâm nghiên cứu và sản xuất sinh phẩm - Công ty Hanvet đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu Tôi xin cảm ơn gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp

Hà Nội, Ngày 19 tháng 04 năm 2015

Tác giả

Nguyễn Thanh Ba

1.1 MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN

1.2 TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VÀ CÁC NGHIÊN CỨU TẠI

1.2.2 Một số đặc điểm dịch tễ của bệnh Tai xanh tại Việt Nam 22

PHẦN II NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1.1 Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của lợn khi sử dụng vacxin Tai

2.1.2 Nghiên cứu độ tuổi sử dụng vacxin thích hợp 26

2.1.3 So sánh hiệu quả của vacxin Tai xanh do Hanvet sản xuất với

một số vacxin phòng bệnh PRRS hiện có trên thị trường 26 2.2 Đối tượng, vật liệu sử dụng trong nghiên cứu 26

2.2.3 Các loại môi trường, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 27

2.5 Bố trí thí nghiệm và phương pháp nghiên cứu 28

3.1 Kết quả nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của lợn được tiêm vacxin

3.1.1 Kết quả nghiên cứu đường đưa vacxin Tai xanh thích hợp 34 3.1.2 Kết quả về thời gian xuất hiện đáp ứng miễn dịch 35

3.1.4 Kết quả nghiên cứu về khả năng truyền kháng thể từ lợn mẹ sang

3.1.5 Hiệu quả bảo hộ của vacxin Tai xanh nhược độc chủng PRRS

Hanvet1.vn khi thử thách với virus cường độc 44 3.2 Kết quả nghiên cứu độ tuổi sử dụng vacxin thích hợp 52 3.3 So sánh hiệu quả sử dụng của vacxin nhược độc Tai xanh chủng

PRRS Hanvet1.vn với một số vacxin đang lưu hành trên thị trường 53

3.5b Hiệu giá kháng thể trung hòa thụ động của lợn con theo mẹ 43 3.6 Hiệu giá kháng thể của lợn được tiêm vacxin và lợn đối chứng

3.7 Biểu hiện lâm sàng của lợn sau khi công cường độc 45 3.8 Kết quả phân lậpvirus trong máu lợn sau khi công cường độc 47 3.9: Hàm lượng virus trong huyết thanh lợn đối chứng tại các thời

3.10 Kết quả kiểm tra virus huyết bằng kỹ thuật RT- PCR 48 3.11 Tăng trọng của lợn sau khi công cường độc 50 3.12 Hiệu giá kháng thể của lợn được tiêm các loại vacxin phòng bệnh

DANH MỤC HÌNH

1.1 Quan hệ về nguồn gốc di truyền của virus PRRS với các virus

khác trong bộ Nidovirales và họ Picornaviridae 3

1.3 Cấu trúc thông tin di truyền của virus PRRS 6 1.4 Đại thực bào bình thường (A), Đại thực bào bệnh lý (B) 12 1.5 Đáp ứng miễn dịch của lợn sau khi nhiễm virus PRRS 17 3.1 Hiệu giá kháng thể của lợn khi dùng vacxin theo các đường đưa

3.2a Sự hình thành kháng thể xác định bằng IPMA sau khi tiêm

3.2b Hiệu giá kháng thể trung hòa trong máu lợn sau khi tiêm vacxin 37 3.3a Biến động kháng thể của lợn xác định bằng IPMA 40 3.3b Biến động hàm lượng kháng thể trung hòa trong máu lợn 41 3.4a Hiệu giá kháng thể IPMA thụ động trung bình của lợn con 43 3.4b Hiệu giá kháng thể trung hòa thụ động của lợn con 44 3.5 Thân nhiệt của lợn sau khi công cường độc 46

3.7a Hiệu giá kháng thể xác định bằng IPMA của lợn ở các độ tuổi 52 3.7b: Hiệu giá KT trung hòa của lợn ở các độ tuổi 53 3.8a Hiệu giá kháng thể của lợn sau khi tiêm các loại vacxin PRRS,

3.8b Hiệu giá kháng thể trung hòa của lợn sau khi tiêm các loại vacxin

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DNA Deoxyribo Nucleic Acid

RNA Ribo Nucleic Acid

cDNA Complementary Deoxyribo Nucleotit Acid

CPE Cytopathic Effect

ELISA Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay

FBS Fetal Bovine Serum

HGKT Hiệu giá kháng thể

IPMA Immuno Peroxydase Monolayer Assay

MEM Minimum Essential Media

ORF Open Reading Frame

PBS Phosphate Buffered Saline

PRRS Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome

SVN Serum Virus Neutralization

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome – PRRS), hay còn gọi là bệnh Tai xanh, là một trong những dịch bệnh nguy hiểm nhất hiện nay Hàng năm PRRS gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi lợn ở Việt Nam và nhiều nước trên thế giới

Từ năm 2005 đến nay, 25 nước và vùng lãnh thổ có dịch bệnh PRRS (Cục Thú Y, 2007) Kể cả các nước có ngành chăn nuôi phát triển rất mạnh như Pháp, Đan Mạch hàng năm cũng phải chịu thiệt hại hàng trăm triệu USD để giải quyết những vấn đề xung quanh PRRS Năm 2006 ở Trung Quốc 10 tỉnh có dịch PRRS với 2 triệu con lợn mắc bệnh và hơn 400 ngàn

lợn chết, năm 2007 dịch xảy ra ở 26/33 tỉnh của Trung Quốc (Han et al.,

2006) Đây có lẽ là một trong những nguồn lây nhiễm mầm bệnh gây ra các

ổ dịch ở Việt Nam

PRRS được ghi nhận lần đầu tiên ở Việt Nam vào năm 1997, trên đàn lợn nhập về từ Mỹ vào các tỉnh phía nam Khi kiểm tra phát hiện 10/51 lợn giống có huyết thanh dương tính với PRRS

Với đặc tính lây lan mạnh, hơn nữa trong môi trường chăn nuôi manh mún và sự vận chuyển lợn bừa bãi, chỉ sau 10 năm xuất hiện PRRS đã trở thành dịch lớn ở Việt Nam Thực tế từ 2007 đến nay dịch PRRS phát triển rất phức tạp Mở đầu bằng vụ dịch xảy ra ngày 12/3/2007 tại Hải Dương, sau

đó dịch lây lan ra khắp cả nước gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi Theo số liệu thống kê của Cục Thú Y, năm 2007 Việt Nam có khoảng 7 vạn con lợn bị mắc PRRS, trong đó khoảng 1,2 vạn lợn chết (Cục Thú Y, 2007) Những năm tiếp theo dịch PRRS không giảm mà diễn biến phức tạp, rất khó kiểm soát Năm 2010 dịch lại nổ ra làm hai đợt vào tháng ba và tháng mười,

có thể nói PRRS ngày càng trở thành vấn đề thời sự Trước tình trạng nghiêm trọng của dịch PRRS Chính Phủ đã tiến hành nhiều biện pháp khác nhau để

khống chế dịch, trong đó quan trọng nhất là việc nhập khẩu và phân phối các loại vacxin phòng bệnh Tuy nhiên, các vacxin nhập khẩu từ các nước khác nhau tính kháng nguyên cũng khác nhau, đặc biệt từ các nước châu Âu Ngoài

ra, giá của các loại vacxin nhập khẩu rất cao (≥30 nghìn đồng/liều), nguồn vacxin không chủ động cũng gây khó khăn cho việc tiêm vacxin phòng bệnh Trước tình hình trên, Công ty Hanvet đã tập trung nghiên cứu, chế tạo được vacxin Tai xanh nhược độc từ chủng virus PRRS Hanvet1.vn với mong muốn tạo ra vacxin có chất lượng tốt, giá thành hạ, góp phần vào công tác phòng chống dịch bệnh Tai xanh

Để đánh khẳng định chất lượng của vacxin cũng như làm cơ sở cho việc

đăng ký lưu hành sản phẩm chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đáp ứng

miễn dịch của lợn được tiêm vacxin Tai xanh nhược độc chủng PRRS Hanvet1.vn”.

2 Mục tiêu của đề tài

Xác định được hiệu quả sử dụng của vacxin Tai xanh nhược độc

chủng PRRS Hanvet1.vn

3 Ý nghĩa của đề tài

Khẳng định về chất lượng của vacxin Tai xanh nhược độc do công

ty HANVET sản xuất

Cung cấp các số liệu quan trọng phục vụ cho công tác xin cấp phép lưu hành sản phẩm vacxin Tai xanh nhược độc

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN

VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PRRS)

1.1.1 Mầm bệnh

1.1.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Nguyên nhân gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn là do

virus thuộc họ Arteriviridae, tên gọi của họ này được bắt nguồn từ một loài virus trong họ Equine ateritis virus (virus gây viêm động mạch ngựa) Mặc

dù bộ gen của họ Ateriviridae chỉ bằng 1/2 bộ gen của họ Coronaviridae,

nhưng chúng có nét tương đồng về mặt di truyền và đều mang bản sao mã

đặc trưng của lớp Nidovirales Họ Ateriviridae chỉ có một giống Aterivirus bao gồm 2 thành viên là: Equine Ateritis Virus (EAV) gây viêm động mạch, sảy thai và viêm phổi ngựa non; Porcine Respiratory and

Reproductive Syndrome Virus (PRRSV) gây rối loạn hô hấp và sinh sản ở

lợn Ngày nay các nhà khoa học cho rằng giống Aterivirus còn có hai thành viên nữa là: Lactate Dehydrogenase Elevating Virus (LDEV) gây bệnh trên chuột và Simian Hemorrhagic Fever Virus (SHFV) gây bệnh sốt xuất huyết

ở khỉ và một số loài linh trưởng (Cavanagh, 1997)

Hình 1.1 Quan hệ về nguồn gốc di truyền của virus PRRS với các virus

khác trong bộ Nidovirales và họ Picornaviridae

Khi phân tích cấu trúc và nguồn gốc hệ gen các nhà khoa học đã chia

Hai nhóm virus này có sự tương đồng đến 60% về cấu trúc các

ribonucleotide (Han et al., 2006) Sự khác biệt về 40% cấu trúc gen dẫn đến

tính đa dạng về di truyền và kháng nguyên Ngoài ra các nhà khoa học còn cho biết PRRSV phân lập được từ các vùng địa lý khác nhau đều có dấu hiệu khác biệt về tính di truyền Hơn nữa virus của cùng một nhóm cũng có sự khác nhau đến 20% về trình tự và số lượng nucleotide, điển hình là các chủng

virus thuộc dòng Bắc Mỹ (Tian et al., 2007; Charerntantanakul, 2012)

Ngoài ra PRRSV còn biểu hiện trộn kháng nguyên giữa các chủng Bắc Mỹ và Châu Âu Chính sự đa dạng và khả năng thường xuyên biến đổi cấu trúc di truyền của PRRSV đó tạo ra sự phức tạp của mầm bệnh lưu hành trên thế giới

và gây rất nhiều khó khăn cho việc chế vacxin phòng bệnh.

Bảng 1.1 So sánh đặc điểm hệ gen của các chủng PRRSV trên thế giới

(Nielsen et al., 1999)

Hệ gen

ORF 1b

(Ghi chú: Độ dài gen và hệ gen tính bằng bp (base pair)

Đầu 5’ và đầu 3’ là phần không mã hóa ở đầu và cuối hệ gen)

Tổng độ dài của hệ gen của chủng virus VR2332 phân lập tại Mỹ (số

đăng ký: AY150564) thuộc genotype II, đại diện dòng Bắc Mỹ là 15451

bp, trong đó phần mã hóa sử dụng cho 7 khung đọc mở là 15071 bp

(Nielsen et al., 1999) Hệ gen của virus PRRSV chủng GD (Quảng Đông)

(số đăng ký: EU109503) đại diện cho một nhóm PRRS mới phân lập gần đây có độc lực rất cao ở Trung Quốc, cũng thuộc genotype II, dòng Bắc

Mỹ, có độ dài là 15353 bp, trong đó phần mã hóa sử dụng cho 7 khung đọc

1.1.1.2 Hình thái cấu trúc của PRRSV

Virus có hình cầu, có vỏ bọc và có các gai nhô ra Kích thước của virus vào khoảng 45-80nm, nhân nucleocapside 25-35nm, bề ngoài của virus được bao bọc bởi lớp vỏ Sự phát triển của virus bị dừng lại khi dùng chloroform hay ether chứng tỏ rằng vỏ của virus có chứa lipid

Hình 1.2 Virus PRRS

(http://www.pigprogress.net/Home/General/2008/3/Modified-PRRS-virus-cause-of-outbreak-in-China-PP001408W/) PRRS là ARN virus với bộ gen gồm một sợi ARN đơn dương có kích thước khoảng 15 kilobase với hai đầu 5´ và 3´ Đầu 5´ chứa đến 75% là ARN polymeraza, đầu 3´ chứa hầu hết các gen mã hóa protein cấu trúc

(Meng et al., 1995) Có 9 khung đọc mở ORFs (Open Reading Frame):

ORF1a, ORF1b, ORF2a, ORF2b, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 và ORF7 Trong đó ORF1a và ORF1b (kích thước khoảng 12kb) mã hóa cho 12 protein phi cấu trúc (Nonstructural Protein- NSP) NSP1- NSP12 Các ORFs còn lại mã hóa cho 9 protein cấu trúc, trong đó có 6 protein chính có khả năng trung hòa kháng thể, gồm 4 phân tử glycoprotein, một phân tử protein màng (M) một phân tử protein vỏ nhân virus (N) Hoạt động trung

hòa xẩy ra mạnh với các protein có khối lượng phân tử 25, 31 và 45 KD

Hình 1.3 Cấu trúc thông tin di truyền của virus PRRS

(http://www.porcilis-prrs.com/microbiology-prrsv-structure.asp)

Hệ gen mang mã di truyền có cấu trúc điển hình gồm 3 vùng chính: Vùng điều khiển hay vùng 5’ có một số trình tự đặc hiệu (promoter, operator…) có chức năng điều khiển hoạt động của gen Promoter là trình tự

nhận biết và vị trí tiếp cận với gen của RNA polymerase và các nhân tố phiên

mã, promoter có chức năng kiểm soát hoạt động của gen Vùng 3’ gọi là vùng kết thúc gồm các trình tự mang tín hiệu kết thúc và một số trình tự chưa rõ chức năng Ở giữa là vùng mang mã di truyền (coding sequence) hay khung đọc mở ORF (Open Reading Frame), từ đây các RNA dịch mã tạo ra các protein cần thiết cho virus

Virus hoạt động, nhân lên và gây bệnh được trong cơ thể vật chủ chính là nhờ các cấu trúc phiên mã (các ORFs) Dựa trên cơ chế sao mã và giải mã vật chất di truyền Trong đó ORF 1a và 1b là mã khởi nguồn để tạo ra ARN polymerase Trong tế bào của vật chủ, virus PRRS sinh ra 6 loại ARN thông tin (mARN) đều có cấu trúc khởi đầu ở đầu 5´ và kết thúc bằng đầu 3´

Hệ gen của virus PRRS có đặc điểm là các khung đọc mở (ORFs) lồng

vào nhau, cấu trúc tương tự các ORFs của Coronavirus (Cavanagh, 1997)

Khi phân tích hệ gen PRRS người ta thấy rằng các khung đọc mở (ORFs) lồng vào nhau từ 1-253 cặp base (base pair-bp) Ví dụ: khung đọc mở 4 (ORF4) và 5 (ORF5) lồng vào nhau bởi 1 bp, ORF3 và ORF4 lồng vào nhau bởi 253 bp Như vậy, virus sử dụng một phần gen chung để mã hóa cho các protein khác nhau

Bảng 1.2 Bộ gen của virus PRRS và các thông tin chính có liên quan

nsp 5 Protein chuyển màng Chưa biết

nsp 7α Chưa biết

Kháng nguyên cho xác định huyết thanh học về sự cảm nhiễm virus

2 ORF 1b

nsp 9 Polymerase RNA phụ thuộc Chưa biết

nsp 11 Endoribonuclease Chất đối kháng IFN mạnh

GP2a Protein vỏ nhỏ, tương tác với

6 ORF4 GP4 Protein vỏ nhỏ, tương tác với

8 ORF5 GP5 Protein vỏ chính, tương tác với

sialoadhesin Epitop trung hòa chính

Virus PRRS có thể tồn tại một năm trong điều kiện -20ºC đến -70°C

Ở 4ºC virus có thể sống 1 tháng Virus tồn tại được 6 ngày ở nhiệt độ 21ºC, 24 giờ ở 37ºC, 20 phút ở 56ºC Virus phát triển tốt trong khoảng pH 6.5-7.5, các hóa chất sát trùng thông thường và môi trường axit dễ dàng tiêu diệt virus Ngoài ra virus cũng bị vô hoạt bởi các điều kiện bất lợi của môi trường ngoài như ánh sáng mặt trời, tia tử ngoại (Nguyễn Bá Hiên và cs., 2012)

20-1.1.1.4 Đặc tính nuôi cấy của PRRSV

Virus PRRS có thể phát triển ở các loại môi trường tế bào sau

- Đại Thực bào phế nang lợn Porcine Alveolar Macrophage (PAM)

tế bào CL2621 hoặc MA104 khi nuôi cấy virus PRRS, sau 2-6 ngày cấy truyền cũng có các dấu hiệu bệnh lý tế bào đặc trưng, đầu tiên tế bào tập

trung thành cụm, dày lên, nhân co lại rồi bong ra (Bautista et al., 1993) Có

thể phát hiện virus trong bào tương của tế bào bằng phương pháp nhuộm huỳnh quang Hiện nay nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới đang dùng loại tế bào MARC- 145 để phân lập virus PRRS, sau 12, 24,36, 72 giờ nuôi cấy, quan sát các CPE (Cell Pathology Effect) để đánh giá sự nhân lên của

virus, đã có công bố về những nghiên cứu tác động của PRRSV lên tế bào Marc-145 Một số loại tế bào: Phổi lợn, biểu mô khí quản, tim, thận, tủy xương, tuyến giáp, tế bào xương xoăn mũi lợn, tế bào gan, phôi gà được kết luận là không có tác dụng trong nuôi cấy PRRSV

1.1.2 Dịch tễ học bệnh PRRS

1.1.2.1 Loài mắc bệnh

Mọi lứa tuổi lợn đều có thể cảm nhiễm với virus, mầm bệnh thường tồn tại lâu trong đàn nái Lợn nái thường truyền mầm bệnh cho bào thai Lợn rừng mọi lứa tuổi đều cảm nhiễm virus, có thể phát bệnh, nhưng cũng có thể không phát bệnh, đây có thể coi là nguồn tàng trữ bệnh tự nhiên rất nguy hiểm Người và các động vật khác không mắc bệnh, trong thiên nhiên có loài vịt trời

(Mallard duck) có thể mẫn cảm với virus (Zimmerman et al., 1997), đây là

nguồn reo rắc mầm bệnh trên diện rộng rất khó kiểm soát

1.1.2.2 Chất chứa mầm bệnh và sự lây truyền

Dịch mũi, nước bọt, phân, nước tiểu, tinh dịch của lợn ốm, lợn mang trùng đều được xác định là nguồn phát tán mầm bệnh Ở lợn nái mang trùng, virus có thể lây nhiễm qua bào thai từ giai đoạn chửa kỳ giữa Lợn nái nuôi con virus có thể được bài thải qua sữa Lợn trưởng thành có thể bài thải virus trong 14 ngày Lợn con và lợn choai có thể bài thải virus tới 1-2 tháng

Virus có thể phát tán thông qua các hình thức nhờ gió, bụi, bọt nước, dụng cụ chăn nuôi, dụng cụ bảo hộ lao động

Lợn mẫn cảm với virus PRRS theo các đường miệng, mũi, nội cơ, niêm mạc, âm đạo

Virus có thể bài thải qua nước tiểu đến 42 ngày, tinh dịch 43 ngày, nước mắt, nước mũi 14 ngày

Ký chủ mẫn cảm chủ yếu là lợn, đặc biệt vịt trời thải virus qua phân

và lợn cũng mẫn cảm với virus PRRS có nguồn gốc từ vịt trời này

Sự lây bệnh PRRS từ đàn này sang đàn khác rất đa dạng, có thể theo

tinh dịch khi phối giống, khi tiêm, nguồn nước, không khí (gió có thể mang mầm bệnh đi xa 3 km)

Các nghiên cứu ở Pháp cho thấy 56% số đàn mắc bệnh là do tiếp xúc, 20% do tinh dịch, 21% do dụng cụ chăn nuôi và 3% từ nguồn chưa xác định (Lê văn Lãnh, 2007)

Qua nhiều nghiên cứu thực tế bệnh gây ra do vận chuyển có thời gian

ủ bệnh từ 3-24 ngày, trung bình 19 ngày (theo dõi 9 đàn), 14-37 ngày (8 đàn), 10-18 ngày (6 đàn) Sự khác nhau về thời gian ủ bệnh nói lên sự khác nhau về độc lực giữa các chủng virus Sự khác nhau về thể trạng và mật độ của từng đàn lợn, cũng có thể biểu hiện ra triệu chứng lâm sàng khác nhau

1.1.2.3 Điều kiện lây lan

Thông thường trong đàn lợn đang nuôi ở vùng đã từng có dịch PRRS

đi qua tồn tại những cá thể lợn mang trùng là điều đương nhiên Song, không phải lúc nào mầm bệnh đó cũng phát tán và lây lan thành dịch Thực

tế cho thấy ở các nước, các vùng khác nhau, PRRS xẩy ra theo chu kỳ khác nhau, mùa vụ khác nhau và mức độ khác nhau Bởi vì virus muốn lây lan được cần phải có những điều kiện nhất định như: Môi trường chăn nuôi bị

ô nhiễm, khí hậu không thuận lợi, vận chuyển lợn ốm bừa bãi, kiểm dịch thiếu chặt chẽ Khi nghiên cứu 150 đàn lợn bị bệnh ở Đức thấy có 95% hoặc là đã mua giống dưới 4 tuần sau ổ dịch, hoặc là cách đàn bị bệnh trong vòng 5 km Qua nhiều nghiên cứu, người ta kết luận rằng còn có những tác nhân sau đây có ý nghĩa trong việc lây lan virus PRRS:

hạt của virus Nói cách khác, virus có ái lực cao với đại thực bào, đặc biệt

là đại thực bào phế nang Virus nhân lên ngay trong đại thực bào, sau đó phá hủy và giết chết đại thực bào, các virion ồ ạt được giải phóng và xâm nhập sang các tế bào khác Có tới 40% đại thực bào bị phá hủy làm cho sức

đề kháng của lợn bị suy giảm nghiêm trọng và dễ dàng mắc các bệnh truyền nhiễm kế phát (Nguyễn Hữu Nam và Nguyễn Thị Lan, 2007)

Thường thấy các vi khuẩn gây bệnh kế phát như Streptococcus suis;

Salmonella; E.Coli; Actinobacillus phneuropneumonia. bên cạnh đó nhiều

loại virus cũng nhân cơ hội trỗi dậy như Dịch tả lợn, Giả dại, Swine

Influenza Virus, Porcine Circovirus

Hình 1.4 Đại thực bào bìnhthường (A), Đại thực bào bệnh lý (B)

(http://voer.edu.vn/m/hoi-chung-roi-loan-sinh-san-va-ho-hap-o-lon-prrs/a463745b) Các nhà khoa học đã phân lập virus từ phổi, gan, lách, huyết thanh hoặc dịch cơ thể lợn con ốm và chết, nhưng không phân lập được virus từ thai chết khô Tuy nhiên khi kiểm tra dịch xoang ngực và sữa đầu đã phát hiện ra kháng thể đặc hiệu chống virus PRRS Dấu hiệu này chứng tỏ rằng bệnh truyền qua nhau thai là phổ biến trong giai đoạn giữa và cuối thai kỳ Mặt khác do rối loạn hô hấp cho nên cơ thể lợn bệnh luôn trong trạng thái thiếu ôxy, gây ra rối loạn chuyển hóa của thai, thai bị suy dinh dưỡng rồi chết thai Lợn chửa ở kỳ cuối là lúc bào thai phát triển mạnh nhất, cũng là

lúc nhu cầu ôxy tăng cao hơn do đó sự thiếu hụt ôxy càng trầm trọng dẫn đến sẩy thai hoặc chết thai Trong thực tế các vụ dịch, lợn nái chửa kỳ cuối thường chết với tỷ lệ khá cao, khi mổ khám thấy hầu hết các bào thai đã hoại tử rất nặng, đây chính là nguyên nhân gây chết cho lợn mẹ

1.1.4 Về nghiên cứu sản xuất vacxin

1.1.4.1 Tính kháng nguyên của virus PRRS

Bộ gen của virus PRRS dễ dung nạp các biến đổi bên trong cấu trúc của nó như sự mất đoạn gen hay ghép thêm đoạn gen Khi có sự biến đổi hay sự mất đoạn nhỏ trong bộ gen, virus PRRS vẫn sao chép tốt và ổn định, không mất khả năng gây nhiễm của nó Chính vì vậy mà tính kháng nguyên

của virus PRRS cũng tương đối phức tạp

Trong tự nhiên đã quan sát được sự biến đổi trên toàn bộ hệ gen của virus PRRS, nghĩa là bộ gen dễ dàng biến đổi ở nhiều điểm, nhiều đoạn virus vẫn sống và vẫn có khả năng gây nhiễm

Dựa trên kết quả phân tích trình tự gen các chủng virus PRRS ở Tây Ban Nha, Prieto và cộng sự (2011) đã tính được tỷ lệ đột biến là 1 - 3×10-2thế hệ (Substitution) cho mỗi năm ở 1 vị trí của bộ gen

Về phân loại genotype, virus PRRS hiện có 2 genotype là Châu Âu

và Châu Mỹ, trong type Châu Âu đã biết có 4 subtype không đồng nhất về kháng nguyên, lâm sàng và gen Trong hai genotype này khác nhau về trình

tự bộ gen khoảng 40%, tương đồng chỉ 60% Tuy nhiên, ngay ở các chủng trong mỗi type hay subtype cũng có sự khác nhau về trình tự gen lên tới

20% (Tian et al., 2007; Charerntantanakul, 2012)

Tính đa dạng di truyền của virus PRRS tương đối cao, một số tác giả

đã chứng minh một hiện tượng khác thường trong sự biến đổi hệ gen của virus PRRS : "sự phát sinh ra loài tương tự" ("quasispecies generation")

(Benfield et al., 2006)

Nghiên cứu phân tích tất cả các gen của virus PRRS mã hóa ở 6 protein cấu trúc và 13 protein không cấu trúc các tác giả đã xác định: các

chủng virus PRRS độc lực cao ở Trung Quốc và Việt Nam thiếu 30 acid amin không liên tục và đã mất đi 4 đoạn: một đoạn mất 1 axit amin bảo tồn Leucine (L) ở vị trí 482; đoạn thứ hai mất liên tục 29 axit amin ở vị trí từ

534 đến 562, 2 đoạn này trong protein nps2 , đoạn mất thứ 3 ở trong miền 5' untranslated, đoạn mất thứ 4 ở trong miền 3' untranslated Và còn có một

số đột biến điểm khác nữa (Tong et al., 2011) Sự mất đoạn này chỉ có ở

những chủng virus PRRS có độc lực cao như ở Trung Quốc và Việt Nam,

nó có thể được bảo tồn vì giữ vai trò chủ yếu về độc lực của virus PRRS

(Tian et al., 2007)

Sau khi nghiên cứu về dịch tễ học và phân tích hơn 300 chủng virus PRRS có độc lực cao ở Trung Quốc, các tác giả đã kết luận, virus PRRS có

sự tiến hóa từ chủng CH - 1a thành chủng virus có độc lực cao Hơn nữa

các nhà nghiên cứu còn cho thấy chủng virus có độc lực cao này tiếp tục có

sự mất đoạn nữa ở nsp2 (Tong et al., 2011) Nay đã phải tách ra gọi là

chủng PRRS độc lực cao Châu Á

1.1.4.2 Đặc điểm về miễn dịch học của virus PRRS

Sau khi bị nhiễm virus PRRS, lợn có đáp ứng miễn dịch ngay, tuy nhiên sự sản sinh kháng thể có những đặc điểm khác thường ở cả miễn dịch

dịch thể và miễn dịch tế bào

Các loại xét nghiệm: IFA (Immuno Fluorescent Assay), xét nghiệm IPMA (Immuno peroxidase Monolayer Assay), ELISA (Enzyme Linked Immunoabsorbent Assay) và xét nghiệm huyết thanh trung hòa virus (SVN- Serum Virus Neutralization) hoặc xét nghiệm Western immunoblot assay đều có thể phát hiện được kháng thể đặc hiệu kháng virus PRRS Sự xuất hiện kháng thể này sớm hay muộn có biến động khác nhau ở từng cá thể lợn và cả theo tuổi lợn cũng như sự tồn tại kháng thể này kéo dài cũng rất khác nhau, tóm tắt ở bảng 1.3:

Bảng 1.3 Sự phát hiện kháng thể đặc hiệu PRRS

(Yoon et al., 1995)

Phương pháp

xét nghiệm

Ngày phát hiện được sau nhiễm virus

Tuần lễ đạt đỉnh cao sau nhiễm virus

Ngày cuối cùng còn phát hiện được sau nhiễm virus

Hàm lượng kháng thể IgG và IgM đạt đỉnh cao khoảng 21-49 ngày

và 14-42 ngày sau nhiễm, tuy nhiên các kháng thể sớm này không tương thích với kháng thể trung hòa; kháng thể trung hoà lại xuất hiện chậm chạp (28-35 ngày sau nhiễm virus mới xuất hiện) cho nên giai đoạn đầu nhiễm bệnh này, trong máu lợn bệnh vẫn có kháng thể nhưng virus vẫn sinh sản mạnh Kháng thể đặc hiệu cùng song song tồn tại với virus trong máu và kéo dài dai dẳng, rồi virus tự giảm dần lúc đó kháng thể trung hòa mới xuất hiện và tăng dần Và virus vẫn còn tồn tại trong cơ thể lợn trong một thời gian dài nữa (Lopez and Osorio, 2004)

Nghiên cứu động thái của đáp ứng miễn dịch dịch thể ở lợn kháng lại virus PRRS đã cho thấy lợn xuất hiện kháng thể trực tiếp kháng lại nucleprotein 15kDa sớm nhất, tiếp theo là kháng thể protein M 19KDa rồi đến kháng thể kháng glycoprotein 5 (GP5) 26Kda Hầu hết các test chẩn đoán phát hiện các kháng thể chống lại các protein N của virus khoảng sau

1 tuần nhiễm bệnh và tồn tại nhiều tháng nhưng hầu như không có tác động đến sự bảo vệ cho lợn khỏi bị bệnh Các kháng thể đặc hiệu sinh ra ở giai đoạn đầu này không trung hòa được virus PRRS invtro cũng như khi thí nghiệm invivo dùng kháng thể này tiêm cho lợn gây miễn dịch thụ động, lợn vẫn không được bảo hộ khi công cường độc (Lopez and Osorio, 2004)

Sự xuất hiện sớm các kháng thể đặc hiệu không trung hòa, có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển bệnh Tai Xanh Các kháng thể không trung hòa

này vô tình tạo điều kiện cho virus PRRS tăng cường sinh sản trong đại thực bào Hiện tượng này miễn dịch học gọi là "sự tăng cường bệnh phụ thuộc vào kháng thể" (ADE : Antibody-Dependent Enhancement) Rốt cuộc đáp ứng kháng thể này lại trở thành có hại cho vật chủ Đáp ứng dịch thể không trung hòa như là " con ngựa thành Tơ-roa" của virus PRRS, che bọc cho virus và thúc đẩy sự tiếp thu phân tử virus vào trong đại thực bào (Mateu and Diaz, 2008) Vì vậy các test chẩn đoán phát hiện kháng thể đặc hiệu trong máu không liên quan đến kháng thể bảo vệ, nó không phải là kháng thể trung hòa virus Đó là một chiến lược virus dùng để xâm nhập gây bệnh

Để tìm kháng thể trung hòa trong máu lợn bằng thử nghiệm trung hòa virus như phương pháp thông thường không phát hiện được, phải bổ sung thêm bổ thể tươi và kéo dài thời gian ủ của hỗn hợp huyết thanh-virus, làm tăng độ mẫn cảm của phản ứng mới cho phép phát hiện được kháng thể trung hòa sớm hơn nhưng hiệu giá thấp Ngay cả đến thời gian 42 ngày sau nhiễm bệnh kháng thể trung hòa có trong máu vẫn còn thấp và vẫn có thể

có virus trong máu Vezina et al (1996) báo cáo đã phân lập được virus

PRRS từ máu lợn có kháng thể trung hòa Sự xuất hiện của các loại kháng thể khi lợn bị nhiễm virus PRRS được mô tả qua hình 1.5:

Hình 1.5 Đáp ứng miễn dịch của lợn sau khi nhiễm virus PRRS

(Lopez and Osorio, 2004)

Hình 1.5 cho thấy sự tương quan khác thường của virus PRRS với các phản ứng miễn dịch của lợn theo thời gian Ở giai đoạn nhiễm đầu, khi

có virus huyết lợn sản sinh kháng thể đặc hiệu không trung hòa, virus và các kháng thể này song song tồn tại cho đến 4 tuần sau nhiễm các tế bào sản sinh IFN-γ và kháng thể trung hòa virus mới phát triển

1.1.4.3 Vai trò của kháng thể trung hòa

Đã có nhiều nghiên cứu tập trung vào đánh giá vai trò của kháng thể trung hòa trong miễn dịch với virus PRRS Các nghiên cứu đã chế tạo kháng thể trung hòa và dùng kháng thể trung hòa tiêm cho lợn gây miễn dịch thụ động rồi công cường độc virus PRRS để xác định vai trò bảo vệ của kháng thể trung hòa Kết quả cho thấy:

Lợn có kháng thể trung hòa trong máu tuần hoàn ở hiệu giá 1/4 khi công cường độc, lợn vẫn bị virus huyết nhưng hiệu giá virus nhiễm trong máu thấp, và cũng xuất hiện chậm hơn so với lợn đối chứng Khi

tiêm cường độc, lợn miễn dịch sốt nhẹ, còn lợn đối chứng sốt cao (theo dõi 7 ngày)

Lợn có kháng thể trung hòa trong máu tuần hoàn ở hiệu giá 1/8 sau khi công cường độc, lợn không bị virus máu Mổ khám lợn sau công cường độc 7 ngày vẫn tìm thấy virus PRRS ở phổi, hạch lâm ba Tuy nhiên hiệu giá virus thấp hơn rõ rệt so với ở lợn đối chứng Virus PRRS vẫn còn ở tại

vị trí đầu tiên gây nhiễm và ở các hạch lâm ba Khi hiệu giá kháng thể giảm xuống dưới 1/8 lợn xuất hiện virus huyết Vậy có một tương quan giữa hiệu giá kháng thể trung hòa tuần hoàn trong máu và sự ngăn chặn virus huyết

Có thể coi 1/8 là ngưỡng bảo hộ của kháng thể trung hòa

Máu lợn có kháng thể trung hòa ở hiệu giá 1/16 và 1/32 khi công cường độc virus PRRS; 50% lợn được bảo vệ hoàn toàn (không tìm thấy virus ở trong cơ thể lợn kể cả lợn con trong bào thai) Còn ở một số lợn khác (có kháng thể trung hòa ở 1/16) vẫn tìm thấy virus cường độc trong một số cơ quan Điều đó cho thấy sự bảo vệ đầy đủ có liên quan đến ngưỡng virus (lượng virus) có trong cá thể lợn (Lopez and Osorio, 2004;

Lopez et al., 2007).

Rõ ràng sự bảo vệ, chống được gây nhiễm của virus PRRS phụ thuộc vào hàm lượng kháng thể trung hòa trong máu lợn

1.1.4.4 Các nghiên cứu về sản xuất vacxin

Hàng chục năm qua chúng ta đã có nhiều cố gắng làm khá nhiều vacxin thử nghiệm, vận dụng các kỹ thuật sinh học, virus học của từng phòng thí nghiệm theo nhiều hướng, để mong tìm ra vacxin có hiệu quả:

khái quát các biện pháp tiếp cận như sau đã được thử nghiệm:

Vacxin vô hoạt virus PRRS: dùng virus thực địa

Vacxin DNA, sử dụng các khung đọc mở, từ ORF1 cho đến ORF7 để chế tạo vacxin

Vacxin dưới đơn vị (subunit): dùng protein của virus để chế vacxin, ví

Đã chế tạo được vacxin dùng vi khuẩn lao (Mycobacterium

tubercelosis) chủng BCG tái tổ hợp biểu hiện GP5 và protein M của virus PRRS, vacxin này khi tiêm cho lợn và công cường độc cũng chỉ tác dụng bảo vệ được một phần như các vacxin trên

Cũng đã chế tạo được vacxin sống có đánh dấu virus để phân biệt

được động vật được tiêm vacxin và động vật bị nhiễm virus hoang dại, De Lina và cộng sự đã tạo một chủng vacxin Tai xanh nhược độc có nsp2 đã cắt bỏ epitop 15- mer và mang một epitop của dòng tế bào B có miễn dịch trội, không gây ảnh hưởng đến tính miễn dịch, sinh trưởng hay độc lực của virus đột biến Những lợn được tiêm vacxin này đã không sinh ra kháng thể với epitop đã chọn và bảo tồn gen kém, nsp2 có sự biến đổi cao ngay cả ở

vị trí đánh dấu Có lẽ với virus PRRS đánh dấu ở nsp2 là không tối ưu, mà

có thể đánh dấu ở miền bảo tồn M của virus sẽ tối ưu hơn

Với các số liệu đã biết, người ta giả thiết rằng, tất cả các protein cấu trúc của virus PRRS đều cần thiết cho sự gây bệnh của nó Cho nên định hướng cắt bỏ gen để tạo ra virus nhược độc, sẽ bị hạn chế bởi virus nhược độc bị thiếu gen (phải bổ sung gen đó bằng gen của dòng tế bào dùng nuôi

virus) Khi tiêm vacxin chủng nhược độc vào lợn, virus vacxin lại sinh sản trong tế bào không có gen bổ sung, gọi đó là vacxin "1 chu kỳ" Phương pháp này đã làm và tạo ra chủng ∆ORF2 và ∆ORF4, virus này có gây ra kháng thể trung hòa, làm giảm được số lượng virus công độc nhưng không giảm triệu chứng lâm sàng, thậm chí lại tăng cường sự gây bệnh (Kimman

et al., 2009)

Các tác giả cũng đã thử nghiệm chế tạo vacxin niêm mạc, nhằm gây miễn dịch niêm mạc để bảo vệ, phòng bệnh ngay ở cửa vào của virus PRRS như ở đường hô hấp, đường âm đạo, tương tự một số virus khác (poliovirrus, influenza virus, ở người) Đã dùng GP5và protein N của virus PRRS cho cộng hợp với độc tố cholera (một yếu tố gây miễn dịch niêm mạc mạnh) để chế tạo vacxin cho uống, khi uống vacxin này đã tăng cường được đáp ứng kháng thể trên bề mặt niêm mạc đường ruột, đường sinh dục; nhưng hiệu quả bảo vệ chưa được đánh giá; vacxin này sau khi tiêm bắp không bảo vệ được lợn (không chống được virus máu và bệnh ở đường hô hấp) (Charerntantanakul, 2012)

Các tác giả cũng đã khảo sát vacxin cùng với nhiều loại chất bổ trợ (adjuvant) khác nhau cho vacxin vô hoạt và cả vacxin sống, chỉ có IL - 12 làm chất bổ trợ có thể tăng cường được đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào của vacxin nhược độc Nhưng nếu dùng IL-4 thêm vào làm bổ trợ lại

có tác dụng ức chế Tóm lại, không có chất bổ trợ nào có tác động tốt hơn

so với tiêm vacxin nhược độc một mình (Charerntantantakul, 2012; Kimman, 2009)

Các tác giả đã khảo sát vai trò của đường sử dụng vacxin Tai xanh khác nữa như tiêm trong da, so với tiêm bắp và tiêm dưới da cũng không có

gì sáng sủa hơn (Martelli et al., 2007.)

Có 2 loại, vacxin nhược độc và vacxin vô hoạt (chết) đã được phép lưu hành trên thương trường ở Châu Mỹ và Châu Âu, Châu Á; tất cả chưa

có vacxin nào phòng chống được sự nhiễm bệnh, nghĩa là tất cả các loại vacxin đều chỉ có thể làm giảm bớt được sự tổn thất về kinh tế, không chống được sự xâm nhiễm của virus cường độc

Vacxin nhược độc được sử dụng rộng rãi hơn, tỏ ra có hiệu quả, giảm bớt được bệnh xảy ra, giảm nhẹ bệnh khi bị nhiễm, giảm thời gian nhiễm virus máu và thời gian tồn tại khu trú của virus Hiệu quả bảo vệ của vacxin nhược độc với đồng chủng cao hơn với dị chủng

1.2 TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VÀ CÁC NGHIÊN CỨU TẠI VIỆT NAM

1.2.1 Tình hình dịch bệnh

Từ tháng 3/2007, dịch lợn Tai xanh xuất hiện và gây thành dịch tại nhiều địa phương, làm tổn thất lớn về kinh tế cho người chăn nuôi, cụ thể: Năm 2007, dịch lợn Tai xanh đã xuất hiện tại 324 xã, thuộc 65 huyện của 18 tỉnh, thành phố Tổng số lợn mắc bệnh là 70.577 con, số lợn chết và

phải tiêu huỷ là 20.366 con, cụ thể:

Năm 2008, dịch Tai xanh đã xuất hiện tại 956 xã, phường, thuộc 103 huyện của 26 tỉnh, thành phố Tổng số lợn mắc bệnh là 309.586 con, số lợn chết và buộc phải tiêu huỷ là 300.906 con

Năm 2009, dịch xảy ra ở 69 xã thuộc 26 huyện của 13 tỉnh, thành phố: Bến Tre, Bình Dương, Đồng Nai, Tiền Giang, Vĩnh Long, Hưng Yên, Quảng Ninh, Bắc Giang, Quảng Nam, Gia Lai, Bạc Liêu, Bà Rịa - Vũng Tàu và Đắk Lắk với 7.030 lợn mắc bệnh và 5.847 lợn buộc phải tiêu huỷ Năm 2010, dịch Tai xanh đã xuất hiện tại 1.978 xã, phường, thị trấn thuộc 286 quận, huyện của 49 tỉnh, thành phố Tổng số lợn mắc bệnh là 812.947 con, số lợn chết và buộc phải tiêu huỷ là 442.699 con

Số lợn chết, tiêu hủy

1.2.2 Một số đặc điểm dịch tễ của bệnh Tai xanh tại Việt Nam

Dịch lợn Tai xanh lần đầu tiên xảy ra ở Việt Nam từ tháng 3/2007 đến nay và dịch thường xuất hiện vào dịp sau Tết âm lịch, khoảng tháng 3-4 hàng năm đối với các tỉnh phía Bắc và sau tháng 8 đối với các tỉnh phía Nam và có tính chất chu kỳ 2-3 năm một lần phát lại ở các tỉnh có ổ dịch

cũ, dịch đã xảy ra ở hầu hết các tỉnh trong cả nước, năm 2008 và năm 2010 dịch xảy ra nặng nhất và gây thiệt hại nghiêm trọng đối với đàn lợn, gây thiệt hại kinh tế, an sinh xã hội, ảnh hưởng đến công tác phát triển chăn

nuôi lợn của nước ta

Dịch xảy ra ở mọi lứa tuổi của lợn với đặc trưng làm cho lợn ốm sốt cao; lợn con theo mẹ và lợn nái chửa giai đoạn cuối chết nhanh, nhiều hơn

so với lợn thịt và lợn đực giống

Dịch xảy ra chủ yếu ở các hộ chăn nuôi nhỏ lẻ, phân tán, ở những địa phương tiêm vacxin phòng một số bệnh truyền nhiễm khác như bệnh dịch

tả lợn, tụ huyết trùng, phó thương hàn, đóng dấu (4 bệnh đỏ) đạt tỷ lệ thấp

Các đợt dịch cho thấy, lợn không chỉ mắc bệnh Tai xanh mà thường bị bội nhiễm những bệnh kế phát khác như: dịch tả lợn, phó thương hàn, tụ huyết trùng, liên cầu khuẩn lợn, suyễn lợn v.v… Đây là nguyên nhân kế

phát gây chết nhiều lợn, làm dịch lây lan

Dịch lây lan nhanh chủ yếu là do phát hiện chậm hoặc dấu dịch, người chăn nuôi bán lợn mắc bệnh, do không kiểm soát được vận chuyển lợn ốm

từ vựng có dịch sang vùng không có dịch

Virus gây bệnh: kết quả phân tích type virus gây bệnh tại Hàn Quốc cho thấy các virus gây bệnh Tai xanh ở Việt Nam thuộc cùng một loại, tuy nhiên virus gây bệnh năm 2010 có sự biến đổi hình thành một nhóm khác Kết quả phân tích đã cho thấy virus năm 2010 có sự tương đồng với 1 virus phân lập ở Trung Quốc năm 2009, virus này cũng đồng thời được phát hiện tại Lào và Căm-pu-chia thời gian qua Việc này cho thấy virus gây ra đợt

dịch năm 2010 có khả năng mới xâm nhập vào Việt Nam

Nguyên nhân chính là do chăn nuôi lợn ở nước ta chủ yếu là nhỏ lẻ nên khó kiểm soát dịch bệnh, nhận thức của người chăn nuôi, buôn bán, giết mổ lợn về phòng, chống dịch còn nhiều hạn chế Nhiều chủ gia súc chăn nuôi không tiêm phòng hoặc tiêm phòng các bệnh đỏ (dịch tả lợn, tụ huyết trùng, đóng dấu lợn và phó thương hàn lợn) đạt tỷ lệ thấp, hầu hết các hộ chăn nuôi không áp dụng các biện pháp an toàn sinh học Việc chấp hành Pháp lệnh Thú Y chưa triệt để, nhiều người chăn nuôi, buôn bán gia

súc vẫn cố tình vận chuyển, buôn bán gia súc bị bệnh

1.2.3 Nghiên cứu về bệnh PRRS ở Việt Nam

Ở Việt Nam dịch PRRS nổ ra vào năm 2007, tại tỉnh Hải Dương Trước sự nguy hiểm của dịch bệnh, nhiều cơ quan chuyên môn đã tổ chức họp để tìm ra biện pháp đối phó Tháng 8 năm 2007, Trung tâm khuyến nông Quốc gia và Báo Nông nghiệp Việt Nam phối hợp tổ chức Diễn đàn khuyến nông và công nghệ Tại diễn đàn này các nhà khoa học đã đề cập đến những thông tin về nguồn gốc của PRRSV, tổng kết thiệt hại do PRRS gây ra từ tháng 3 đến thời điểm đó và cùng bàn bạc biện pháp đối phó, phòng chống dịch Tại Hội thảo khoa học chuyên đề PRRS do Khoa Thú Y trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội tổ chức vào tháng 10 năm 2007 nhiều thông tin về PRRS đã được trình bày Về bệnh nguyên PRRSV được đề cập

đến qua các báo cáo của Nguyễn Bá Hiên (2007), Lê Văn Lãnh (2007) Về triệu chứng bệnh tích của PRRSV được thể hiện qua các báo cáo của Nguyễn Hữu Nam (2007), Phạm Ngọc Thạch (2007), Lê Văn Năm (2007) Tác giả Phạm Sỹ Lăng (2007) đã thông báo về tình trạng liên cầu khuẩn và các vi khuẩn thứ phát khi lợn mắc PRRS

Theo Nguyễn Hữu Nam và cs (2007) ; Bùi Quang Anh và cs (2007) những loại vi khuẩn gây bệnh kế phát ở phổi khi lợn mắc PRRS thường gặp

là: Mycoplasma hyopneumonia (suyễn lợn); Pasteurella multocida (tụ huyết trùng); Bordetella bronchiseptica (viêm teo mũi); Streptococcus suis

type 2 (liên cầu khuẩn) và Haemophilus parasuis (viêm đường hô hấp)

Theo Nguyễn Văn Thanh (2007) đường truyền lây của virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản qua thụ tinh nhân tạo là nguy hiểm nhất Nguyễn Ngọc Hải và cộng sự (2007) nghiên cứu về phương pháp chẩn đoán virus gây Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn bằng kỹ thuật RT-PCR đã đưa ra kết luận: quy trình RT-PCR có tính ổn định và độ tin cậy cao, hoàn toàn cho phép phát hiện được ARN của PRRSV trong mẫu nghiên cứu Trần Thị Bích Liên và Trần Thị Dân (2007) đã nghiên cứu xác định

tỷ lệ nhiễm và chủng PRRSV tại một số cơ sở chăn nuôi lợn ở miền Đông Nam Bộ và đưa ra kết luận: "bệnh Tai xanh" do PRRSV đã hiện diện tại một số cơ sở chăn nuôi lợn thuộc 2 tỉnh Đông Nam Bộ với tỷ lệ nhiễm chung là 36,78% (số mẫu huyết thanh xét nghiệm có kháng thể dương tính) và 85,71% (số trại và hộ chăn nuôi lợn có mẫu huyết thanh dương tính) Bùi Quang Anh và cs (2008) đã nghiên cứu về một số đặc điểm dịch

tễ của Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản tại một số trại lợn ở Việt Nam

và đi đến kết luận: lợn nái và lợn con theo mẹ bị mắc PRRS với tỷ lệ cao

Tỷ lệ chết của các loại lợn mắc PRRS cao hơn so với những nghiên cứu, đánh giá của quốc tế về PRRS

Theo Phạm Sỹ Lăng và cộng sự (2007), một số bệnh tích thường gặp của lợn mắc PRRS là phổi viêm tụ huyết hoặc xuất huyết, khí quản,

phế quản chứa nhiều bọt khí và dịch nhày Thận xuất huyết như đầu đinh ghim, não xung huyết, hạch hầu họng, amydale sưng, xung huyết, gan sưng, tụ huyết; lách sưng và nhồi huyết Hạch màng treo ruột xuất huyết và loét van hồi manh tràng

Từ năm 2007 đến nay, năm nào dịch cũng nổ ra rất trầm trọng và thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi lợn Vì vậy có không ít nghiên cứu về PRRS, tuy nhiên các nghiên cứu về sản xuất vacxin PRRS gần như chưa

có Các vacxin đang lưu hành tại Việt Nam là các vacxin nhập khẩu bao gồm: BSL PS100 của Singapore, Amervac – PRRS của Tây Ban Nha, Ingelvac PRRS của Hipra, Boerhinger do Đức sản xuất và một Vacxin PRRS xuất xứ từ Trung quốc

Như vậy việc đặt vấn đề nghiên cứu sản xuất vacxin PRRS tại Việt Nam là một nghiên cứu mới có tính ứng dụng thực tiễn cao

PHẦN II NỘI DUNG, ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

2.1.1 Nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của lợn khi sử dụng vacxin Tai xanh nhược độc

Nghiên cứu đường đưa vacxin thích hợp

+ Đường tiêm dưới da

+ Đường tiêm bắp

+ Đường nhỏ mũi

Thời gian xuất hiện đáp ứng miễn dịch sau khi sử dụng vacxin

Độ dài miễn dịch của lợn khi sử dụng vacxin

Khả năng truyền kháng thể của lợn mẹ qua sữa đầu cho lợn con Hiệu quả bảo hộ của vacxin khi công cường độc cho lợn

2.1.2 Nghiên cứu độ tuổi sử dụng vacxin thích hợp

2.1.3 So sánh hiệu quả của vacxin Tai xanh do Hanvet sản xuất với một

số vacxin phòng bệnh PRRS hiện có trên thị trường

2.2 Đối tượng, vật liệu sử dụng trong nghiên cứu

2.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Lợn được tiêm vacxin Tai xanh nhược độc chủng PRRS Hanvet1.vn

2.2.2 Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu

Lợn thí nghiệm: Sử dụng lợn lai hướng nạc, khỏe mạnh, ở các độ tuổi khác nhau, lợn nái mang thai ở ngày thứ 80 của thai kỳ Tất cả lợn sử dụng trong thí nghiệm đều được xét nghiệm và xác định âm tính với các bệnh: PRRS, Dịch Tả Lợn, Mycoplasma, Circo virus

- Vacxin Tai xanh nhược độc do công ty Hanvet sản xuất từ chủng virus nhược độc PRRS Hanvet1.vn Mỗi liều vacxin chứa ít nhất

105TCID50 chủng virus nhược đôc PRRS Hanvet1.vn trong chất bổ trợ

- Chủng virus PRRS cường độc phân lập tại Việt Nam được giữ giống tại Trung tâm kiểm nghiệm thuốc thú y trung ương I

- Một số loại vacxin phòng bệnh PRRS trên thị trường

- Tế bào dòng: Marc 145

2.2.3 Các loại môi trường, hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

- Các loại môi trường hóa chất phục vụ nuôi cấy tế bào (MEM, DMEM, M199, Trypsin, PBS…)

- Các loại hóa chất phục vụ cho phản ứng miễn dịch gắn enzyme IPMA (kháng kháng thể gắn enzyme peroxydaza, cơ chất AEC…), phản ứng trung hòa virus, phản ứng ELISA

- Các loại hóa chất dùng cho RT - PCR

2.2.4 Trang thiết bị máy móc

- Phòng thí nghiệm an toàn sinh học đạt 2+

- Hot Laminair an toàn sinh học cấp độ 2 (Mỹ)

- Máy ly tâm lạnh li tâm ống Eppendorf (Sorvall, Mỹ)

- Máy đo pH Meter Delta 320 (Mettler Toledo, Thuỵ Sĩ)

2.3 Thời gian nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành trong thời gian từ tháng 5/2013 – tháng 12/2014

2.4 Địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu và sản xuất sinh phẩm – Công ty Hanvet