nghiên cứu đa dạng di truyền và khả năng gây nhiễm của các chủng vi khuẩn bạc lá lúa

DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Liệt kê các yếu tố IS có mặt trong genom vi khuẩn Xoo chủng MAFF Bảng 2.2 Bản liệt kê 17 bản copy các thành viên trong gia đình avrBs3/pth 17 Bảng 2.3 Danh sách

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày … tháng … năm …

Tác giả luận văn

Nguyễn Ngọc Coóng

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng

và biết ơn sâu sắc tới thầy PGS TS Phan Hữu Tôn đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo,

Bộ môn Sinh học Phân tử và Công nghệ Sinh học Ứng dụng, Khoa Công nghệ Sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Trạm Bảo vệ thực vật Thuận Thành - Chi cục Bảo vệ thực vật Tỉnh Bắc Ninh đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./

Hà Nội, ngày tháng năm

Học viên

Nguyễn Ngọc Coóng

2.1.4 Quy luật và các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh 7

2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm của bộ genom Xanthomonas oryzae pv oryzae 10 2.2.3 Trình tự chèn trên bộ genom Xoo (Insertion sequence) 13

2.2.5 Những gen quy định tính độc của vi khuẩn Xoo (Pathogenicity-related genes) 15 2.3 Đa dạng các chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae 20

2.3.3 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng sinh học của vi khuẩn Xoo hiện

2.3.4 Nghiên cứu đa dạng sinh học của vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv

3.5.1 Phương pháp thu thập và phân lập các mẫu vi khuẩn gây bệnh bạc lá 26 3.5.2 Phương pháp xác định thành phần và sự phân bố của các chủng vi khuẩn

3.5.3 Phương pháp xác định khả năng gây nhiễm của các chủng bạc lá trên các

3.5.4 Phương pháp nghiên cứu đa dạng di truyền các chủng bệnh bạc lá bằng

4.1.3 Khả năng gây nhiễm của các chủng bạc lá trên các giống lúa địa phương 45 4.1.4 Nghiên cứu đa dạng di truyền các chủng bệnh bạc lá bằng chỉ thị DNA 50

4.2.2 So sánh với kết quả nghiên cứu của Phan Hữu Tôn và cs, 2012 57

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

BLB : Bacterial leaf blight – Bệnh bạc lá

DNA : Axit deoxyribonucleic - Là phân tử nucleic acid mang thông tin di truyền ERIC : Enterobacterial repetitive intergennis conversus – Là các yếu tố lặp lại

IRRI : International Rice Research Institute - Viện nghiên cứu lúa quốc tế

IS : Insertion sequence – Nhân tố di truyền nucleotide

PCR : Polymerase chain reaction - phản ứng chuỗi trùng hợp, kĩ thuật chỉ

thị phân tử nhằm nhân một đoạn DNA đã biết trước trình tự

RAPD : Random Amplified Polymorphic DNA - phương pháp phân tích đa dạng

DNA khuyếch đại ngẫu nhiên

REP : Repetitive extragenis palindromic – Các yếu tố di truyền thêm vào lặp lại RFLP : Restriction fragment length polymorphism – sự đa hình về chiều dài

: của những đoạn cắt giới hạn

SNPs : Single nucleotide polymorphisms - hiện tượng đa hình đơn

SSRs : simple sequence repeats - kỹ thuật chỉ thị phân tử nhằm nhân hoặc

lai các đoạn lặp DNA lặp đi lặp lại trong genome

Xac : Xanthomonas axonopodis pv.citri - Bệnh loét trên cây có múi

Xcc : Xanthomonas campetris pv.campestris – Vi khuẩn vàng lá đen gân

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Liệt kê các yếu tố IS có mặt trong genom vi khuẩn Xoo chủng MAFF

Bảng 2.2 Bản liệt kê 17 bản copy các thành viên trong gia đình avrBs3/pth 17

Bảng 2.3 Danh sách các gen chịu sự điều hòa bởi gen HrpX trong genom Xoo 19 Bảng 4.1 Danh sách các isolate phân lập được xác định chính xác là vi khuẩn

Bảng 4.5 Phản ứng của các chủng vi khuẩn với các giống mang gen kháng 46 Bảng 4.6 Hệ số tương đồng di truyền giữa các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá 55 Bảng 4.7 Kiểu phản ứng của các chủng vi khuẩn bạc lá trên dòng đẳng gen 58

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.2 Ảnh hiển vi điện tử quét tế bào vi khuẩn Xoo trong mạch dẫn của lá lúa 10

Hình 2.6 So sánh tổ chức di truyền nhóm gen hrp của 3 loài vi khuẩn Xoo, Xcc

Hình 4.3 Bản đồ phân bố của các chủng vi khuẩn Xoo ở Miền Bắc Việt Nam 44

Hình 4.7 Hình cây thể hiện mối quan hệ di truyền các chủng vi khuẩn gây bệnh

Hình 4.8 Bản dồ phân bố các chủng bệnh bạc lá miền Bắc Việt Nam 59

TÓM TẮT

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae gây ra là một trong

những bệnh nguy hiểm nhất đối với cây lúa miền Bắc Việt Nam Những năm gần đây bệnh không những gây hại trong vụ mùa mà còn gây hại nặng trong cả vụ xuân Để tạo giống kháng bệnh bạc lá bền vững thì trước hết phải có nguồn gen kháng bệnh phong phú, sau đó phải xác định được chính xác thành phần các chủng vi khuẩn bạc lá hiện có

ở mỗi vùng sinh thái, nghiên cứu xác định gen kháng bệnh hữu hiệu rồi quy tụ nhiều gen kháng vào một giống Trong nghiên cứu này chúng tôi thu thập 62 mẫu bệnh trên

20 giống ở 13 tỉnh thành thuộc miền Bắc Việt Nam Từ các mẫu bệnh thu thập, phân lập được 102 isolate và đã được kiểm tra bằng PCR sử dụng chỉ thị XORF và XOR Từ 102 isolate đã phân thành 12 chủng thông qua phản ứng kháng nhiễm đối với các dòng đẳng đơn gen, từ đó vẽ được bản đồ phân bố của các chủng vi khuẩn ở các vùng trồng lúa khác nhau Sử dụng 12 chủng lây nhiễm, đánh giá khả năng kháng của 50 mẫu giống

lúa địa phương có chứa các gen kháng Xa4, xa5 và Xa7 khác nhau Xác định được

chủng 1 và chủng 5 có độc tính mạnh nhất gây nhiễm trên nhiều giống thậm trí cả những giống có chứa gen kháng hữu hiệu, chủng 12 có độc tính nhẹ nhất Tuy nhiên,

trên nền gen khác nhau thì tính kháng của các gen Xa4, xa5 và Xa7 có trong giống là

không thay đổi Sử dụng 3 cặp mồi của 2 chỉ thị rep-PCR và IS-PCR, từ 36 isolate của

12 nhóm chủng Xoo với mức độ tương đồng di truyền 0.94 đã phân ra được 14 nhóm

chủng vi khuẩn khác nhau

Bacterial leaf blight (BLB) disease caused by Xanthomonas oryzae pv oryzae is

one of the most severe diseases in rice growing regions of Vietnam Recently, it causes

a great loss of yield and reduces grain quality To prevent this disease, the use of resistance varieties offers the most economical efficiency In order to develop durable resistant varieties, it is necessary to introduce high effective genes and to know the components, diversity and distribution of BLB pathogen strains In this study, we collected 62 infected samples from 20 rice varieties growing in 13 provinces of North Vietnam From these samples, 102 isolates of BLB were determined by by using DNA

marker Twelve Xoo strains were identified by artificial inoculation to NILs (near isogenic lines) The distribution of BLB strains was mapped 12 Xoo strains were used

to innoculate to 50 rice varieties containing diferent resistance genes Xa4, xa5 and

Xa7 As the results, two Xoo strains 1 and 5 had highest virulence, while strain 12 had

lowest virulence Different genetic background of the varieties not affect on resistance

ability of Xa4, xa5 and Xa7 genes Using rep-PCR and IS-PCR markers to determine genetic diversity of 36 isolates belonging 12 Xoo strains groups classified 14 Xoo strains

at 0,94 level of genetic similarity

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Bệnh bạc lá lúa do vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae (Xoo) gây ra

là một trong những bệnh phổ biến và gây thiệt hại nghiêm trọng đến sản xuất lúa trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng Theo ước tính bệnh có thể làm giảm năng suất lúa từ 6 - 60% (Srivastava and Rao, 1968)

Những năm gần đây ở miền Bắc Việt Nam, bệnh bạc lá lúa đã thực sự trở thành đối tượng gây hại chủ yếu trên cả lúa xuân và lúa mùa, chúng gây hại trên phạm vi rộng, mức độ ngày càng cao Trong khi đó, xu thế sử dụng các giống lúa cao sản có thời gian sinh trưởng ngắn và sự nhập nội các giống lúa có nguồn gốc

từ Trung Quốc không mang gen kháng với các chủng vi khuẩn bạc lá Việt Nam,

đã làm tăng nguy cơ bùng phát dịch bệnh Chính vì vậy việc nghiên cứu vi khuẩn gây bệnh một cách đầy đủ, đề ra phương án phòng ngừa có hiệu quả là một vấn

đề hết sức bức thiết

Để phòng trừ bệnh, biện pháp hiệu quả nhất là sử dụng các giống lúa chống chịu bệnh, có mang gen kháng hữu hiệu với các chủng vi khuẩn ở từng vùng sinh thái khác nhau Để chọn tạo được các giống có phổ kháng rộng, kháng bền vững với bệnh thì công việc trước tiên là phải xác định được thành phần, độc tính và phân bố của các chủng ở mỗi vùng Đây là khâu then chốt vô cùng quan trọng, từ đó làm cơ sở cho việc xác định gen kháng hữu hiệu và sử dụng các gen kháng trong các chương trình chọn tạo giống, đồng thời giúp ích cho công tác xác định cơ cấu giống kháng phù hợp khi đưa giống vào các vùng sản xuất

Ở nước ta, việc chọn và chuyển các gen kháng như Xa4, xa5, Xa7, Xa21

(là những gen kháng với hầu hết các chủng miền Bắc Việt Nam) đang là hướng được các nhà chọn tạo giống quan tâm, ưu tiên phát triển (Phan Hữu Tôn và Bùi Trọng Thủy, 2004) Mỗi gen có thể kháng tốt với chủng này nhưng lại bị nhiễm bởi chủng khác Do vậy, để chọn tạo giống kháng bệnh bền vững thì trước hết phải biết được thành phần và phân bố các chủng vi khuẩn ở mỗi vùng sinh thái Sau đó phải xác định được gen kháng hữu hiệu với mỗi chủng vi khuẩn Trên cơ

sở đó, xác định chuyển nhiều gen kháng vào mỗi giống hoặc chuyển gen kháng hữu hiệu đối với nhiều chủng vào một giống

Để phát hiện các chủng người ta thường lây nhiễm nhân tạo các chủng phân lập lên các dòng đẳng gen, giống chỉ thị có chứa gen kháng khác nhau Trên

cơ sở phổ kháng nhiễm rồi phân ra thành các chủng và nhóm chủng Tuy nhiên phương pháp này nhiều khi không chính xác do cơ chế xâm nhiễm và gây bệnh còn chịu nhiều ảnh hưởng của yếu tố môi trường

Theo Mew và cộng sự trên thế giới đã phát hiện đang tồn tại ở Nhật Bản có

12 chủng, Ấn độ có 9 chủng và Philippine có 6 chủng Ở Việt Nam, theo Phan Hữu Tôn và cs (2012) thì miền Bắc tồn tại 12 chủng bệnh bạc lá Tuy nhiên, thành phần và sự phân bố của các chủng vi khuẩn ở miền Bắc là hết sức đa dạng, có tính độc phong phú, còn nhiều tiềm năng phát hiện thêm các chủng vi khuẩn mới

Sự phát triển của sinh học phân tử và những hiểu biết về cấu trúc genom

vi khuẩn Xoo (khoảng 4.9 - 5.2 triệu Kb) đã chứng minh việc xác định thành phần và sự đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn Xoo, bằng phương pháp nghiên

cứu đa hình các đoạn DNA mang lại những kết quả chính xác mà các phương pháp thông thường không có được Có nhiều tác giả đã sử dụng chỉ thị phân tử rep-PCR và IS-PCR để đánh giá đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn

Việc ứng dụng chỉ thị phân tử DNA để xác định chính xác thành phần

và sự đa dạng di truyền các chủng Xoo và đánh giá khả năng gây nhiễm của

các chủng trên các dòng, giống chứa các gen kháng khác nhau là tiền đề trong chọn tạo giống kháng bệnh có ý nghĩa lớn cả về kinh tế và tính hiệu quả của phương pháp

Trên cơ sở đó, dưới sự hướng dẫn của PGS TS Phan Hữu Tôn, chúng tôi

thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đa dạng di truyền và khả năng gây nhiễm của các chủng vi khuẩn bạc lá lúa”

1.2 MỤC ĐÍCH VÀ YÊU CẦU

1.2.1 Mục đích

Xác định được thành phần, sự phân bố và đa dạng di truyền của các chủng

vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa miền Bắc Việt Nam và khả năng gây nhiễm của chúng trên các giống chứa gen kháng khác nhau

1.2.2 Yêu cầu

- Thu thập, phân lập và xác định được các isolate bệnh bạc lá

- Lây nhiễm các isolate bệnh bạc lá trên dòng đẳng gen để xác định thành phần chủng bệnh cũng như phân bố của chúng

- Lây nhiễm các chủng vi khuẩn bạc lá trên các dòng/giống lúa để đánh giá khả năng gây nhiễm (độ độc tính) của các chủng vi khuẩn

- Tiến hành được các phản ứng PCR dựa trên các chỉ thị phân tử đã được xác định để đánh giá đa dạng di truyền, phân biệt được giữa các chủng vi khuẩn gây bệnh

1.3 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

Xác định được thành phần, sự phân bố và độc tính của các chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá lúa ở các tỉnh miền Bắc Việt Nam góp phần định hướng cho các nhà nghiên cứu về vi khuẩn và chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá lúa

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả đề tài góp phần giải quyết được vấn đề khó khăn trong công tác phòng trừ bệnh bạc lá lúa trong sản xuất, bằng con đường sử dụng giống chống chịu bệnh Đây là giải pháp có hiệu quả về kinh tế và an toàn với môi trường,

sử dụng giống chống chịu bệnh sẽ giảm bớt chi phí sản xuất, giảm lượng thuốc hóa học gây ô nhiễm môi trường và tạo ra sản phẩm nông nghiệp có chất lượng cao, an toàn đối với người sử dụng Đồng thời xác định được sự phân bố của các chủng ở các địa phương làm cơ sở bố trí giống kháng bệnh hợp lý cho từng địa phương

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TỔNG QUAN VỀ BỆNH BẠC LÁ LÚA

2.1.1 Lịch sử phát hiện bệnh

Bệnh bạc lá lúa (Xoo) được phát hiện đầu tiên ở Nhật Bản khoảng năm

1884 - 1885 Trên cánh đồng lúa vùng Fukuoka, Nhật Bản, ban đầu các nhà khoa học Nhật bản cho rằng bệnh có nguồn gốc sinh lý do đất chua gây nên Năm

1908, Takaishi đã tìm thấy vi khuẩn trong giọt dịch và lây lại được trên cây lúa Dựa theo kết quả phân lập năm 1911, Bokura đã kết luận triệu chứng do vi khuẩn gây nên chứ không phải do sinh lý

Kết quả này cũng phù hợp với các kết quả của Takashi năm 1908 Từ năm

1950 trở đi, bệnh bạc lá lúa phát triển mạnh ở Nhật Bản và đến năm 1960 bệnh

đã lan ra khắp Nhật Bản, trừ miền bắc hòn đảo Hokaido (Tạ Minh Sơn, 1987) Bệnh bạc lá lúa đã trở thành một dịch bệnh phổ biến ở tất cả các vùng trồng lúa trên thế giới vào khoảng cuối thập kỉ 60 đến đầu thập kỉ 80 của thế kỷ

XX (Mew, 1987) Năm 1940, bệnh được phát hiện ở Ấn Độ Nhưng phải đến năm 1965, thì ở Ấn Độ người ta mới xác định được đúng nguyên nhân gây bệnh

là do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây ra Bệnh bạc lá lúa được phát hiện ở

Indonesia vào năm 1950 Khi nghiên cứu triệu chứng héo, Reitsma và Schure gọi

tên bệnh là Kresek và xác định do vi khuẩn Xanthomonas oryzae gây ra Vì vậy,

vi khuẩn gây bệnh này được đặt tên là Xanthomonas kresek Schure

Năm 1957, các nhà khoa học Trung Quốc phát hiện thấy bệnh trên các cánh đồng trồng lúa phía Tây và Nam Năm 1976, bệnh này được thông báo ở Pakistan Trong nửa cuối thập kỷ 70, bệnh xuất hiện ở hầu hết các nước Châu Á, trừ Tây Á (Ezuka and Kaku, 2000) Năm 1973, bệnh bạc lá lúa được thông báo xảy ra ở miền Bắc Châu Úc Năm 1979, người ta quan sát thấy bệnh trong các trại thí nghiệm ở Kogoni, Mali thuộc vùng phía tây Châu Phi Tháng 9 năm 1980, bệnh bạc lá lúa cũng đã xuất hiện trên một số giống lúa lùn Châu Á

Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện từ sau hòa bình lập lại (1945) trên các giống lúa địa phương cao cây Sau đó, do phong trào thâm canh lúa tăng cao đã làm bệnh bạc lá lúa phát triển mạnh trên diện rộng và phức tạp, khó phòng trừ và thường xuyên gây hại nặng ở vụ mùa Bệnh đã phát triển thành dịch lớn ở một số

tỉnh Đồng bằng sông Hồng trong vòng từ năm 1968 – 1975 Trong những năm gần đây, ở miền Bắc thiệt hại do bệnh bạc lá lúa có xu hướng tăng trở lại và gây

hại cả ở vụ xuân (Lê Lương Tề, 1980)

2.1.2 Tác hại do bệnh bạc lá lúa gây ra

Bệnh bạc lá có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của cây lúa, làm tăng cường độ hô hấp, giảm cường độ quang hợp vì lá bị cháy và làm cây mềm yếu, kéo dài thời gian trỗ, tỷ lệ hạt lép cao, gạo nát Vì vậy bệnh bạc lá gây thiệt hại lớn về năng suất (Tạ Minh Sơn, 1987)

Ở Việt Nam, bệnh đã gây hại từ lâu trên các giống lúa mùa cũ nhưng đặc biệt từ năm 1965-1966 tới nay có năm bệnh phá hại một cách nghiêm trọng đến các vùng đồng bằng trên các giống lúa mới nhập nội có năng suất cao ở vụ xuân và nhất là trong vụ mùa Mức độ tác hại của bệnh phụ thuộc vào giống, thời kỳ bị nhiễm của cây sớm hay muộn và mức độ bị nặng hay nhẹ (Đường Hồng Dật, 1988)

Năm 1996 diện tích bị nhiễm ở các tỉnh miền bắc, miền trung là 304.700

ha (gấp 2,5 lần so với vụ mùa năm 1995), các giống bị nhiễm gồm: Lúa lai, lúa thuần Trung Quốc, CR203 Tỷ lệ bị bệnh trên nhiều giống lên tới 90-100% với cấp 7 đến cấp 9 và gây cháy lá (theo viện BVTV, 1998) Còn năm 1997 bệnh phát sinh mạnh trong vụ đông xuân, diện tích bị bệnh tăng tới 29 lần, tỷ lệ bị bệnh trung bình là 20%, nơi cao là 70-90%, chủ yếu trên các giống lúa lai, lúa thuần Trung Quốc, CR203 Theo Tạ Minh Sơn thì cứ 1% chỉ số bệnh làm giảm năng suất 0,94 tạ/ha

Những năm gần đây, kéo theo sự phát triển của công nghiệp, nguồn nước

bị ô nhiễm và sự lạm dụng phân bón hóa học làm bệnh càng trở nên nguy hiểm Chúng gây hại trên cả vụ xuân lẫn vụ mùa, có những năm mất trắng, không có thu hoạch Điển hình là ở Nam Trường Nam Định (vụ mùa 2007) Sông Thao, Phú Thọ (vụ mùa 2008) hiện tượng cháy bạc lá diễn ra trên diện rộng

2.1.3 Triệu trứng bệnh

Theo Goto (1970), bệnh bạc lá có 3 kiểu triệu chứng điển hình là bạc lá, héo xanh (Kresek) và vàng nhợt Héo xanh và bạc lá là triệu chứng của sự nhiễm bệnh, có nguyên nhân là do độc tố của vi khuẩn tiết ra khi xâm nhiễm, còn vàng nhạt là biểu hiện bệnh về sau, là hậu quả của sự nhiễm vi khuẩn bạc lá Bệnh bạc

lá phát sinh, gây hại hầu hết các giai đoạn sinh trưởng, phát triển của cây lúa

Triệu chứng bệnh thể hiện rõ nhất ở giai đoạn sau đẻ nhánh đến trỗ và chín sữa, gây hại trên tất cả các bộ phận, chủ yếu là trên phiến lá, bông và hạt (Lê Lương

Tề, 2001)

- Trên mạ: Triệu chứng bệnh không thể hiện đặc trưng như trên lúa, do đó

rất dễ nhầm lẫn với các hiện tượng khô đầu lá do sinh lý Vi khuẩn hại mạ gây ra triệu chứng ở mép lá, mút lá với những vệt có độ dài ngắn khác nhau, có màu xanh vàng, nâu bạc, nặng nó làm cho lá mạ bị khô cháy

- Trên lúa: Triệu chứng bệnh thể hiện rõ rệt hơn, tuy nhiên có thể thay đổi

ít nhiều tuỳ theo giống và điều kiện ngoại cảnh Vết bệnh từ mép, mút lá lan dần vào trong phiến lá hoặc kéo dài theo đường gân chính, nhưng cũng có khi vết bệnh xuất hiện ngay giữa phiến lá rồi lan rộng ra Vết bệnh thường phân biệt rõ ràng với phần mô khoẻ, lan dần theo đường gợn sóng màu vàng, mô bệnh xanh tái, vàng lục, lá nâu bạc rồi khô xác (Lê Lương Tề, 2001)

Hình 2.1 Ảnh triệu chứng bệnh trên lá

Nguồn: http://iasvn.org/homepage/Thong-tin-khoa-hoc-0011l/trang-19.html

- Trên hạt: Bệnh quan sát thấy những vết không màu xung quanh có viền

nước, các vết bệnh còn thấy rõ khi hạt thóc còn non và xanh Khi chín vết bệnh chuyển sang màu vàng xám hoặc vàng nhạt

2.1.4 Quy luật và các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh, phát triển bệnh

Bệnh phát sinh phát triển thuận lợi khi nhiệt độ, ẩm độ cao, mưa bão nhiều

vì vậy ở Miền Bắc Việt Nam bệnh có thể phát sinh gây hại cả hai thời vụ: Vụ xuân phát sinh trong thời kỳ lúa đẻ nhánh tháng 3, tháng 4, cao điểm vào tháng 5, tháng 6, vụ mùa bệnh phát sinh sớm hơn khoảng tháng 8 và cao điểm ở tháng 9,

tháng 10 (Lê Lương Tề, 1998)

Mức độ gây hại của bệnh phụ thuộc vào giống, hầu hết các giống lúa đang trồng sản xuất có mức độ nhiễm trung bình đến nặng, điển hình là các giống lúa lai, giống nhập nội từ Trung Quốc: Tạp giao, Khang dân, Q5, Nhị ưu 838,…Năm

1970, trên diện tích lúa mùa giống NN8 bị bệnh ở mức độ 60 – 100% làm giảm năng suất từ 30 – 60%, theo báo cáo của phòng bệnh cây Viện bảo vệ thực vật (1970) thì tác hại của bệnh ngày càng lớn khi mức độ bị bệnh càng nặng Điều đáng lưu ý là mức độ gây hại còn phụ thuộc vào thời kỳ cây lúa bị nhiễm bệnh, nếu cây lúa bị bệnh ngay từ khi đẻ nhánh thì mức độ bị bệnh về sau thường rất nặng, ảnh hưởng rõ rệt đến năng suất, có thể làm giảm 41% trở lên, nếu bị bệnh bắt đầu từ thời kỳ đòng – trổ tác hại có thể vẫn còn lớn trung bình làm giảm năng suất cây lúa khoảng 30%, nhưng nếu bị bệnh vào thời kỳ cuối (chín sữa – chín chắc) mức độ gây hại ít hơn, dưới 10% (Lê Lương Tề, 1970)

+ Nhiệt độ: Theo tác giả Muko (1957), thì nhiệt độ thích hợp cho bệnh

phát sinh khoảng 25-30°C Bệnh phát triển thành dịch trong khoảng nhiệt độ 31°C, tối thích là 27-30°C, ngoài phạm vi nhiệt độ này hoặc là vi khuẩn không phát triển hoặc kém phát triển

22-+ Ẩm độ: Ngoài nhiệt độ, ẩm độ cũng có ảnh hưởng lớn đến sự phát sinh,

phát triển của bệnh Ẩm độ từ 79,3-92,8% làm tăng sự phát triển của bệnh, còn

ẩm độ từ 66,3-77% hạn chế sự phát triển của bệnh

+ Nguồn bệnh ban đầu: Theo Lê Lương Tề (1998), thì nguồn bệnh ban

đầu ở nước ta là hạt giống, tàn dư gây bệnh, viên keo vi khuẩn tồn tại ở cuối vụ, đều có thể là nguồn bệnh ban đầu

+ Phân bón: Phân bón có ảnh hưởng trực tiếp đến sinh trưởng, phát triển của cây trồng, đồng thời thông qua cây trồng có ảnh hưởng quan trọng đến sự phát sinh và gây hại của nhiều loài dịch hại Trong số các loại phân bón chủ yếu thì N và K có ảnh hưởng rõ rệt nhất đến bệnh bạc lá Theo Tagami và Mirzukami thì N20 là nhân tố quan trọng đối với sự phát sinh, phát triển bệnh là do nitơ thúc

đẩy sinh trưởng sinh dưỡng của cây trồng làm tăng ẩm độ trong ruộng vì vậy bệnh lây lan nhanh Do vậy mức bón nitơ tăng làm bệnh bạc lá tăng dẫn đến năng suất lúa giảm (Vũ Công Khải, 2000)

Ngoài ra, mức độ bệnh còn phụ thuộc vào địa thế đất đai Trên chân đất trũng, chua, khó thoát nước, đặc biệt ở những vùng đất hẩu, đất nhiều mùn nhiều bóng cây bệnh sẽ phát sinh sớm và mạnh hơn Những kết quả nghiên cứu của bộ môn Bệnh cây - trường Đại học Nông Nghiệp, Viện bảo vệ thực vật,…đã chứng minh những nhận định trên

2.1.5 Nghiên cứu về cách chuẩn đoán bệnh bạc lá

Hiện nay, đã có nhiều phương pháp khác nhau để chẩn đoán bệnh bạc lá Mỗi phương pháp đều có ưu và nhược điểm riêng của mình Có thể kể ra ở đây một vài phương pháp và kỹ thuật chẩn đoán phổ biến như sau:

- Phương pháp giọt dịch: Cắt những đoạn vết bệnh dài 3-5 cm, quấn

bông thấm nước thành từng bó nhỏ cho vào cốc nước vô trùng hoặc nước muối 0,85% ngập 2/3 cốc nước Sau 2-3 giờ nếu trên các mô lá xuất hiện các giọt dịch nhỏ màu hơi vàng trên đầu lá cắt, đó là biểu hiện lá bị bệnh

- Phương pháp ELISA: Bộ ELISA (xét nghiệm chất hấp thụ miễn dịch

trong liên kết enzyme) dựa trên khả năng nhận biết một chất protein nhất định hoặc liên kết kháng nguyên với mầm bệnh thực vật của một kháng thể Bộ dụng

cụ rất dễ sử dụng, một vài thí nghiệm có thể tiến hành ngay trên đồng ruộng có nghi ngờ dịch bệnh, chỉ mất 5 phút thử nghiệm Hơn nữa, ELISA không cần tới phòng thí nghiệm hay bất cứ đào tạo đặc biệt nào (Vũ Triệu Mân, 2003)

- Phương pháp thấm hút tế bào trực tiếp (Direct tissue blotting): Kỹ

thuật này cũng sử dụng các kháng thể nhất định để phát hiện sự hiện diện các mầm bệnh trong cây Trong phương pháp này, các mẫu tế bào mang bệnh được nén, để rút protein trên một loại giấy đặc biệt và kháng thể được đặt thêm vào Sau đó, sử dụng thêm thuốc thử màu xem phản ứng giữa hỗn hợp mầm bệnh và kháng thể Phản ứng màu cho thấy kết quả dương tính và vị trí các điểm chốt của mầm bệnh trong tế bào bị bệnh

(nguồn từ: Agbiotech Viêt Nam-www.agbiotech.com.vn)

- Sử dụng que DNA/RNA: Một bộ công cụ khác có thế sử dụng dự đoán

bệnh của cây trồng là que axit nucleic (hay DNA/RNA) Các que này là các phân đoạn axit nucleic sắp xếp trong một chuỗi bổ sung cho các chuỗi DNA hoặc

RNA của mầm bệnh Vì các chuỗi bổ sung lần nhau, nên các que có thể được sử dụng để xác định bệnh

(nguồn từ: Agribiotech Viêt Nam-www.agbiotech.com.vn)

- Phương pháp thấm hút nén (Squash blot method): Trong phương pháp

thấm hút nén, tế bào từ cây trồng bị nghi có bệnh bị nén vào một loại giấy đặc biệt gọi là màng Màng này được xử lý bằng một loại que có thể kết lại với DNA hoặc RNA của cây bị nghi có mầm bệnh trong tế bào Quá trình kết dính sẽ xảy

ra khi chuỗi bổ sung xuất hiện Sau khi bổ sung thêm vài chất vào màng, phản ứng màu cho thấy que và DNA/RNA mầm bệnh quyện vào nhau và bệnh được phát hiện Không có màu phản ứng nghĩa là thử nghiệm âm tính

(Nguồn từ: Ag biotech Viêt Nam-www agbiotech com.vn)

- Phương pháp sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi XOR theo Adachi et al., 1990: Nhận biết và phân biệt loài vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae,

sử dụng kỹ thuật PCR theo phương pháp của Adachi, N và Oku, T (2000), dùng

2 đọan mồi có trình tự chuỗi như sau: XOR-F 5'-GCA TGA CGT CAT CGT CCT GT-3' và XOR-R2 5'- CTC GGA GCT ATA TGC CGT GC-3' để nhân đoạn ADN nằm giữa 2 gen chịu trách nhiệm tổng hợp cấu tử 16S và 23S của ribosome vi khuẩn bạc lá lúa

2.1.6 Các biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá

Các biện pháp canh tác bao gồm vệ sinh đồng ruộng, diệt trừ cỏ dại, phun thuốc trừ bệnh, tăng cường chăm sóc bón phân đúng cách, thích hợp và điều chỉnh mực nước hợp lý và trồng giống kháng bệnh Ngoài ra, còn có biện pháp

xử lý hạt giống trước khi gieo Cho đến nay, biện pháp sử dụng giống kháng bệnh vẫn được coi là biện pháp có hiệu quả và khả thi nhất

2.2 VI KHUẨN XANTHOMONAS ORYZAE PV ORYZAE

2.2.1 Đặc điểm hình thái và cấu trúc

Vi khuẩn Xoo thuộc họ Pseudomonadaceae, có dạng hình gậy hai đầu hơi

tròn, có một lông roi ở một đầu, kích thước 1-2 x 0,5-0,9 µm Trên môi trường nhân tạo khuẩn lạc vi khuẩn có dạng hình tròn, màu vàng sáp, rìa nhẵn, bề mặt khuẩn lạc ướt, háo khí, nhuộm Gram âm Vi khuẩn không có khả năng phân giải nitrat, không dịch hoá gelatin, không tạo NH3, nhưng tạo H2S, tạo khí nhưng không tạo axít trong môi trường có đường Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn sinh

trưởng từ 26 - 300C, nhiệt độ tối thiểu 0 - 50C, tối đa 400C nếu cao hơn 530C sẽ làm vi khuẩn chết Vi khuẩn có thể sống trong phạm vi pH khá rộng từ 5,7 - 8,5 thích hợp nhất ở pH 6,8 - 7,2

Hình 2.2 Ảnh hiển vi điện tử quét tế

bào vi khuẩn Xoo trong mạch dẫn của

2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm của bộ genom Xanthomonas oryzae pv oryzae

Hiện đã có một số nghiên cứu về trình tự genom của các chủng vi khuẩn

Xoo Trong đó, gần đây nhất phải kể đến là công trình nghiên cứu về cấu trúc genom của các chủng phổ biến nhất hiện nay là: MAF311018 (Nhật Bản), KACC10331 (Hàn Quốc), PXO99A (Philippine) được công bố trên (website:

http://microbe.dna.affrc.go.jp).

2.2.2.1 Bộ genome Xoo chủng MAFF311018

Hình phía dưới trình bầy cấu trúc genome nhiễm sắc thể vi khuẩn Xoo

chủng MAFF311018 biểu hiện bằng tám vòng tròn Vòng ngoài cùng biểu hiện chiều dài của mỗi vùng gen bằng đơn vị 100kb, vòng thứ 2 và 3 biểu hiện vị trí của các gen theo các hướng phiên mã khác nhau tương ứng Những gen đã xác định rõ chức năng được ký hiệu màu vàng, gen chưa xác định rõ chức năng được

ký hiệu màu xanh Vòng tròn thứ tư biểu hiện vị trí tụ tập của các gen hrp và những gen gây độc avr ký hiệu màu xanh Vòng tròn thứ năm biểu hiện vị trí của

các trình tự gắn chèn Vòng thứ sáu biểu thị hàm lượng C + G của mỗi trung bình

20 kb của mỗi đoạn Vòng số bẩy biểu hiện vị trí của các gen mã hóa tạo ra tRNA và rRNA của vi khuẩn Cuối cùng là vòng số tám biểu hiện vị trí của các prophage cùng các gen của phage

Hình 2.4 Bản đồ genom vi khuẩn Xoo chủng MAFF311018

Theo đó genom của Xoo chủng MAFF 311018 gồm một nhiễm sắc thể

vòng dài 4.940.217 bp, với hàm lượng G+C trung bình chiếm 63,7% Bên trong không phát hiện thấy có chứa một thể plasmid nào Trong đó, phát hiện thấy có hai bản copy của operon rrn và thứ tự liền kề một số gen như sau: 16S-tRNAAla -tRNAIle -23S-5S Genom chứa tổng số 53 gen mã hóa tạo thành các tRNAs đại diện cho 43 loại tRNA khác nhau

Trong tổng số 4.372 khung đọc mở được phát hiện (ORFs) trong genom chủng MAFF311018 thì có 2.799 (64%) gen đã xác định được chức năng, 1.383 (32%) proteins được xác định tương đồng với nhiều protein điển hình của vi

khuẩn Xoo nhưng chưa biết rõ chức năng Có 190 gen (4%) được xác định là

không tương đồng rõ rệt với những gen đã được xác định và công bố trước đó của vi khuẩn

2.2.2.2 Cấu trúc genom chủng KACC10331

Theo Lee et al (2008), thì genom vi khuẩn Xoo chủng KACC10331 có

cấu trúc như sau: Tổng genom nhiễm sắc thể vòng dài 4.941.439 bp, với hàm lượng C + G chiếm 63.7% Genom có 4637 khung đọc mở, trong đó có 3340 (72.0%) có thể xác định được chức năng Khoảng 80% số gen trong đó được

phát hiện thấy trong các loài vi khuẩn X axonopodis pv citri (Xac) và

X.campestris pv campestris (Xcc) Tuy nhiên, 245 gen được xác định là chỉ đặc thù đối với Xoo, trong đó có 8 gen gây độc Đồng thời nhóm tác giả còn xác định được vị trí của cả những gen tạo phản ứng siêu mẫn (hrp), những gen sinh ra vỏ

polysaccharide, gen mã hóa tạo enzyme phân rã màng tế bào thực vật Điều này

giúp chúng ta hiểu rõ được cơ chế tương tác giữa vi khuẩn Xoo gây bệnh đối với

ký chủ họ hòa thảo

2.2.2.3 Genom chủng vi khuẩn PXO99A

Đây là công bố mới nhất về trình tự genom của vi khuẩn Xoo, được tiến hành bởi Steven L et al., tiến hành trên chủng vi khuẩn PXO99A của Philippine

và cũng là dạng phổ biến ở khu vực Nam và Đông Nam châu Á Được công bố

trên trang web http://www.biomedcentral.com/1471-2164/9/204, tháng 3 năm

2008 Theo đó, genom vi khuẩn gồm một nhiễm sắc thể dạng vòng dài 5,240,075

bp, hàm lượng các base nitơ G + C chiếm 63.6% Có 5,083 gen mã hoá cho các protein chức năng, hai operon RNA riboxom, 55 tRNA, được biểu diễn hình dưới Ngoài ra, còn có 87 vùng đặc thù chỉ có ở chủng vi khuẩn PXO99A, khám phá ra nhiều vùng gen liên quan đến khả năng gây độc hay mẫn cảm của vi khuẩn với tính kháng của cây trồng, có ít nhất 10 vùng trên nhiễm sắc thể được sắp xếp lại so với genom của hai chủng KACC10331 và PXO99A Trong đó, có

7 trong 10 vùng là do có sự gắn thêm vào của các trình tự chèn Nghiên cứu cũng

đã chỉ ra nhiều gốc tái bản tương đồng với cấu trúc ở các loài vi khuẩn thuộc họ

Xathomonadaceace , bởi sự gần gũi với các gen (dnaA, dnaB và gyrB) thường

thấy ở nguồn gốc các genom vi khuẩn và sự chênh lệch cao hơn về nồng độ của các base nitơ G so với C ở trong gen

Hình 2.5 Bản đồ cấu trúc nhiễm sắc thể chủng PXO99A

(Nguồn: www.biomedcentral.com/ /figure/F1?highres=y)

2.2.3 Trình tự chèn trên bộ genom Xoo (Insertion sequence)

Nhân tố IS (Insertion sequence) là nhân tố di truyền, tuy không có các đoạn tương đồng nhưng có thể lắp vào các vị trí rất khác nhau trên genom vi khuẩn, tạo cho nhân tố IS khả năng di động rộng rãi gọi là sự chuyển chỗ Các nhân tố IS gặp ở nhiễm sắc thể vi khuẩn, trên các plasmid gồm khoảng 800 –

1400 cặp nucleotit và không mang một phenotype nào ngoài chức năng cần cho

sự chuyển chỗ Chức năng này được xúc tác bởi enzym transposaza do yếu tố IS đọc mã, transposaza nhân ra một vùng xác định trong chuỗi kép DNA (DNA đích) và cắt rời 2 sợi Ở mỗi đầu của nhân tố IS tồn tại các cặp nucleotit lặp lại trực tiếp hoặc gián tiếp và cần cho quá trình chuyển chỗ IS đóng vai trò quan trọng trong định hướng và tái tổ hợp các đặc tính di truyền

Bảng 2.1 Liệt kê các yếu tố IS có mặt trong genom vi khuẩn Xoo chủng

MAFF 311018

Hiện đã xác định được tất cả có 611 trình tự chèn IS, chúng thuộc 25 kiểu

chèn xen khác nhau trong bộ genom Xoo, chiếm sấp xỉ 10% tổng chiều dài của

genom vi khuẩn Tỷ lệ này là khá cao nếu so sánh với các loài vi khuẩn gây bệnh

thực vật khác, đây có thể là một đặc điểm của vi khuẩn Xoo IS của vi khuẩn Xoo

phân bố khắp genome, chúng lặp lại liên tục trong nhiều locus Có một số vùng chứa nhiều IS có thể dài tới 30 kb Người ta đã xác định được đầy đủ trình tự của

386 IS và còn lại 225 IS đang được tiếp tục nghiên cứu Theo số liệu trình tự, người ta chia chúng ra thành 7 nhóm khác nhau, trong đó nhóm IS5 và ISNCY phổ biến hơn cả, mỗi IS có lần lượt từ 110 đến 63 bản copy Trong đó, có 6 trình

tự đặc thù là: ISXoo11, ISXoo12, ISXoo13, ISXoo14, ISXoo15 và ISXoo16

2.2.4 Nghiên cứu trình tự lặp lại (Repetitive sequence)

Là những cấu trúc được hình thành do sự lặp lại liên tiếp nhiều lần một đoạn trình tự trong gen Đây là hiện tượng khá phổ biến xuất hiện ở cả sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn, được ví như là các “gia đình” gen nhỏ nằm trong cấu trúc của genome Repetitive sequence là những trình tự bền vững được sao chép ổn định qua nhiều thế hệ với cấu trúc khá đa dạng thay đổi theo loài Đặc biệt, là có các trình tự Nu ở hai đầu rất đặc thù, thích hợp cho nghiên cứu đa dạng di truyền,

lập bản đồ và nhận dạng gen

Trong vi khuẩn trình tự lặp được phân thành 3 nhóm chính:

- Nhóm 1: Bao gồm các trình tự lặp lại có kích thước khoảng 35 - 40bp, chúng là các yếu tố di truyền thêm vào lặp lại, có chiều ngược xuôi giống nhau (REPs: repetitive extragenis palidromic), (Stem, 1988)

- Nhóm 2: Là các yếu tố lặp lại hình thành do sự chập lại của hai trình tự lặp kích thước 124 - 127bp (ERIC: Enterobachterial pepetitive intergenis conversus)

(Hulton et al., 1991) hay là đơn vị gen lặp lại (Shaples and Llyod, 1990)

- Nhóm 3: Là các trình tự hộp BOX, kích thước khoảng 154bp

(Versalovic et al., 1994)

Đây chính là cơ sở cho phương pháp dùng chỉ thị DNA dựa trên các trình

tự lặp lại để tiến hành phản ứng PCR, nghiên cứu đa dạng di truyền các chủng bệnh bạc lá, gọi chung là phương pháp REP - PCR

Transposon (Tn): Cũng thuộc các nhân tố di truyền di động, gây đột biến

và cũng được gọi là các “gen nhảy” Trái với nhân tố IS, các Tn đọc mã cho các tính trạng dễ nhận thấy về phenotype

2.2.5 Những gen quy định tính độc của vi khuẩn Xoo (Pathogenicity-related

genes)

a Nhóm gen hrp

Trong số các vi khuẩn gây bệnh cho thực vật thì những gen hrp mã hóa

cho hệ thống tiết dịch loại III (TTSS) là đóng vai trò quan trọng nhất Những gen này thường ổn định trong các vi sinh vật gây bệnh ở động vật và thực vật, chúng

tiêm những protein hữu hiệu vào tế bào kí chủ Nhóm gen hrp tìm thấy trong genom Xoo gồm 27 gen kí hiệu từ hpa2 đến hpaF và chúng có cấu trúc giống với cấu trúc của những gen này ở những vi khuẩn thuộc loài Xanthomonas, loại trừ

trường hợp ở vùng hrpE2 của gen hpaB và vùng hrpF Trong genom vi khuẩn

Xoo , thấy có 3 gen đặc thù được phát hiện giữa gen hpaB và hrpF Một gen định

vị tại phần sau của gen hpaB (hrpE2) và có cùng hướng phiên mã với operon

hrpE Hai gen còn lại cũng nằm ở vùng sau của hpaB (hrpE2), nhưng hướng

phiên mã theo chiều ngược lại Theo sơ đồ này có 4 tương đồng chuyển vị liên

tục nằm ở vùng giữa hpaB và hrpF là ISXo8, ISXo1, ISXo8 và ISXoo6

Hình 2.6 So sánh tổ chức di truyền nhóm gen hrp của 3 loài vi khuẩn

Xoo, Xcc và Xac

Nguồn: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=548351

A Tổ chức di truyền của những gen bình thường

B Những vùng biến động của nhóm gen hrp

Mỗi một gen có tên nằm trên hoặc dưới các mũi tên Bản đồ được biểu diễn dựa trên số liệu trình tự các Nucleotit được xác định trong ngân hàng gen (GenBank database) Trình tự được xác định trên cơ sở sử dụng các gen của

chủng X axonpodis pv citri 306 (kí hiệu AE008923) và gen của chủng

X.campestris pv campestris ATCC 33913 (kí hiệu AE008922)

b Nhóm gen avr

Protein không gây độc là một trong những chất hiệu ứng loại III, chúng kích thích khả năng kháng bệnh trong cây tương ứng có những gen kháng Bởi vậy, chức năng của nó được xác định mang tính đặc thù theo giống lúa và chủng

gây bệnh Chủng MAFF 311018 biểu hiện mức độ đặc thù theo kí chủ giống lúa

rất cao, nó chứa một số các gen không gây độc Vi khuẩn Xoo chứa rất nhiều bản copy các thành viên trong gia đình gen không gây độc avrBs3/pth, đây là một trong những nhóm gen không độc avr Trong genome vi khuẩn Xoo, nhóm tác

giả đã phát hiện có 17 bản copy phân bố và tụ tập tại 7 vùng genome khác nhau, được trình bày ở bảng dưới đây:

Bảng 2.2 Bản liệt kê 17 bản copy các thành viên trong gia đình avrBs3/pth

Mặc dù, chúng có trình tự rất khá giống nhau nhưng chúng hoàn toàn phân biệt được với nhau bởi sự khác nhau chủ yếu ở số lượng các đoạn lặp lại nằm ở vùng trung tâm Số lần lặp lại biến động từ 12,5 đến 31,5 và từ 2 đến 4

gen avr hầu hết nằm ở những vùng không gây độc và những yếu tố di động như

IS và những gen có liên quan đến phage được định vị ở những vùng bên cạnh Vị trí của những gen không gây độc này được trình bày ở hình dưới Riêng vùng

avr V, chúng bị ngắt quãng bởi một gen di động là ISXoo9 nằm ở đầu 3’ Hướng phiên mã của gen không độc avr ở vùng I, II và III là sợi anti-sense, nhưng đối

với vùng IV, VI và VII thì là sợi sense theo hướng ngược lại

Hình 2.7 Bản đồ vị trí các gen không độc avr/pth của vi khuẩn Xoo

Vị trí tương đối của mỗi vùng và chiều dài của mỗi gen như sau: Vùng I dài 1,228,783-1,246,335bp; II, 2,201,149-2,216,771 bp; III, 2,352,186-2,360,329 bp; IV, 2,383, 115-2,392, 653 bp; V, 2,999,333-3,001,924 bp; VI, 3,213,703-3,234,123 bp; và vùng VII dài 4,525,416-4,529,345 bp

c Gen điều hòa HrpX

Trong vi khuẩn Xanthomonas, sự biểu hiện của một số gen cấu trúc TTSS

và một số gen hiệu ứng được điều hòa bởi sản phẩm của các gen hrpG và hrpX, các gen sản phẩm này đều có mặt ở cả 2 loại vi khuẩn Xac và Xcc

Bảng 2.3 Danh sách các gen chịu sự điều hòa bởi gen HrpX

trong genom Xoo

Một số gen hoạt động phụ thuộc vào gen HrpX đều cùng chứa một trình tự

giống nhau là: TTCGC…N15…TTCGC, gọi là hộp PIP (PIP box) Hộp PIP này

là một chỉ tiêu để phán đoán liệu gen nào đó có bị điều khiển bởi gen HrpX hay

không Đặc biệt đối với những gen mã hóa tạo ra các protein hiệu ứng Trong vi

khuẩn Xoo, người ta đã phát hiện có 37 bản copy hộp PIP hoàn chỉnh hoặc gần

hoàn chỉnh có trình tự: TTCGN…N15…TTCGN, nằm ở vùng điều khiển của

gen Năm trong số đó nằm ở cụm tụ điểm của các gen hrp, số còn lại nằm rải rác

ở vùng khác trong genome

2.3 ĐA DẠNG CÁC CHỦNG VI KHUẨN XANTHOMONAS ORYZAE PV

ORYZAE

2.3.1 Tổng quan đa dạng sinh học

Theo Công ước Đa dạng sinh học, khái niệm “Đa dạng sinh học” (biodiversity, biological diversity) có nghĩa là: Sự khác nhau giữa các sinh vật sống ở tất cả mọi nơi bao gồm: Các hệ sinh thái trên cạn, trong đại dương và các

hệ sinh thái thuỷ vực khác, cũng như các phức hệ sinh thái mà các sinh vật là một thành phần; thuật ngữ này bao hàm sự khác nhau trong một loài, giữa các loài và giữa các hệ sinh thái

Có thể, coi thuật ngữ “đa dạng sinh học” lần đầu tiên được Norse and McManus (1980), định nghĩa, bao hàm hai khái niệm có liên quan với nhau là: đa dạng di truyền (tính đa dạng về mặt di truyền trong một loài) và đa dạng sinh thái (số lượng các loài trong một quần xã sinh vật) Hiện nay, có ít nhất 25 định nghĩa nữa cho thuật ngữ “đa dạng sinh học” Định nghĩa được đưa ở trên là định nghĩa được dùng trong Công ước Đa dạng sinh học

2.3.2 Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng sinh học

Nhìn chung, việc nghiên cứu đa dạng sinh học có ý nghĩa hết sức quan trọng trong việc phân lập và sử dụng một cách hiệu quả nhất các nguồn tài nguyên sinh học có lợi cũng như có được những biện pháp phòng tránh hữu hiệu nhất đối với các nguồn tài nguyên sinh học có hại trong sản xuất và đời sống của con người Đối với vi sinh vật gây bệnh, việc xác định chính xác thành phần và số lượng các chủng ở một vùng sinh thái nhất định có một ý nghĩa đặc biệt quan trọng Vì có xác định được đúng chủng loại mới xác định được khả năng kháng hữu hiệu của từng gen kháng đối với mỗi chủng, từ đó có chiến lược quy tụ nhiều gen kháng hữu hiệu vào một giống nhằm tạo ra tính kháng bền vững trong tương lai đối với từng vùng sinh thái nhất định Ngoài ra, việc xác định đúng thành phần chủng còn giúp công tác kiểm dịch thực vật ngăn chặn chủng ngoại xâm nhập vào và có thể mỗi chủng bị tiêu diệt bởi một số thuốc nhất định Từ đó, giúp nhà bảo vệ thực vật sử dụng thuốc hóa học để

phòng trừ bệnh một cách hợp lý

2.3.3 Các phương pháp nghiên cứu đa dạng sinh học của vi khuẩn Xoo hiện

nay trên thế giới

2.3.3.1 Phương pháp dùng chỉ thị phân tử DNA

Nhằm đánh giá mức độ sai khác về mặt di truyền ở cấp độ phân tử DNA

của các mẫu vi khuẩn và phân loại các chủng

J Yashitola et al (1997), đã thu thập 67 isolate từ năm 1994 đến 1995

trên 18 vùng của Ấn Độ Sử dụng phương pháp DNA (RFLP) với hai mẫu dò

(probe) là các trình tự lặp lại riêng biệt: Probe dựa vào trình tự gen avr Xa10 và

Probe dựa vào trình tự yếu tố chèn IS1112

Kết quả, với Probe avr Xa10 từ 67 Isolate tác giả đã phân ra 9 kiểu sai khác

phân tử dựa vào enzyme cắt giới hạn BamHI Probe IS 1112 phân ra 11 kiểu sai

khác phân tử dựa vào enzyme cắt giới hạn EcoRI Cuối cùng, các tác giả tổng hợp

cả hai Probe avr Xa10 và Probe IS 1112 thu được 15 kiểu sai khác phân tử

Tika B Adhikari et al (1999), đã sử dụng 2 phương pháp rep-PCR và

IS-PCR để tiến hành nghiên cứu đa dạng di truyền đối với 171 isolate phân lập được

ở 8 vùng sinh thái khác nhau tại Nepal Trong đó, tác giả sử dụng 3 mồi ERIC1R,

ERIC2 (trong cùng một phản ứng) cho rep-PCR và mồi J3 cho IS-PCR Mồi

ERIC1R và ERIC2 được thiết kế trên cơ sở những chuỗi lặp bảo thủ vùng liên gen

(enterobacterial repetitive intergenic consensus) có kích thước 124 - 127 bp Còn

mồi J3 được thiết kế trên cơ sở hai đoạn chèn ở trình tự IS1112, IS1113 Kết quả

phân lập được 31 kiểu sai khác phân tử (haplotype) từ 171 isolate nghiên cứu

Sử dụng 3 mồi REP là:

ERIC 1RF 5’ - ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC - 3’

ERIC 2F 5’ - AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG - 3’ BOXA 1RF 5’- CTACGGCAAGGCGACGCTGACG - 3’

Và một mồi IS:

J3F 5’ - GCTCAGGTCAGGTCGCCTGG - 3’

Tiếp nối thành công của Tika B Adhikari (1999), Jiajian et al (2007), đã

sử dụng phương pháp IS-PCR với mồi J3 trên 7 chủng vi khuẩn Xoo tồn tại tại

Trung Quốc Khi so sánh với DNA ladder và so sánh với trình tự genome của 2

chủng KACC10331 (Hàn Quốc) và MAFF311018 (Nhật Bản), các tác giả đã

phát hiện ra 3 locus mới trên trình tự chèn IS1112:

GCTTCAACCGCCGATTCGACC GGCGGCTTCAACTCTGGAT……

GCTTCAACCGCCGATTCGACCTGAAACAGATGCTGCCGCG…… ISXo2

957

Hình 2.8 Ba trình tự locus mới trên trình tự chèn IS1112

phát hiện tại Trung Quốc (2007)

Tại Pakistan Shazia Mannan (2007) cũng tiến hành phương pháp tương tự

đã phân 105 isolate thành thành 2 nhóm (A, B) bằng chỉ thị IS - PCR (IS 1113)

sử dụng mồi J1 [5’- CGAGTCCAGTCCAGCGAGCC - 3’] Bằng chỉ thị REP - PCR cho thấy mức độ đa hình rất cao, phân chúng thành 7 nhóm chủng khác nhau (group 1 đến group 7)

Trong một nghiên cứu khác T B Adhikari (1994) đã nghiên cứu chi tiết

về đa dạng di truyền chủng bệnh bạc lá tại khu vực Châu Á Tiến hành trên 308 isolate trong đó, có 76 isolate tại Trung Quốc, 17 isolate tại Malaixia, 45 isolate tại Nepal, 17 chủng tại Ấn Độ, 24 isolate tại Hàn Quốc, 34 isolate tại Indonexia

và 95 isolate tại Philippine Tiến hành nghiên cứu dựa trên các trình tự chèn

IS1112 và vùng avrXa10 Dùng các mẫu dò pJEL101 plasmid pUC18 với vùng

cắt giới hạn 2.4 kb của EcoRI - Him III để nhận dạng trình tự chèn IS1112 Dùng

mẫu dò pBS avrXa10 mang vùng cắt giới hạn HimIII (3.1kb) lấy ra từ plasmid

pBLuscripII Kết quả phân thành 5 nhóm chủng với khoảng biến động di truyền của các nhóm nằm trong khoảng 0.16 đến 0.51 và sự khác nhau giữa các nhóm là 0.48 đến 0.64

V S Gupta et al (2001), đã tiến hành nghiên cứu trên 16 isolate tại Ấn

Độ và 2 isolate của Philippine Dùng phương pháp RAPD - PCR với 6 mồi ngẫu nhiên (POA-3, POA-4, POA-10, POA-11, OPK-7, OPK-17) và phương pháp IS1112 - PCR dùng 2 mồi PJEL1 và PJEL2 để đánh giá đa dạng di truyền và xác định các chủng vi khuẩn Kết quả, đã phân loại thành 5 nhóm chủng ở mức tương đồng 0.57

Năm 2007 tại Sri Lanka, công trình nghiên cứu của K K S Penando đã

sử dụng phương pháp RAPD - PCR dùng các đoạn mồi ngẫu nhiên (OPD7, OPD20 và OPK) để phân tích đa dạng di truyền của 7 nhóm isolate Kết quả phân chúng thành 6 nhóm tại mức tương đồng 0.6

2.3.3.2 Phương pháp phân tích isozyme

Phương pháp phân tích isozyme là phương pháp phân tích các trạng thái khác nhau của một enzyme Xét về mặt di truyền, thì sự sản sinh các isozyme có thể do hiện tượng lặp đoạn locus gen; đột biến gen tạo nên các alen khác nhau, diễn ra trên các locus khác nhau hoặc do các trạng thái alen khác nhau của một locus gen gây ra

Tại Nigeria, A Onasanya và cộng sự đã sử dụng phương pháp phân tích isozyme để nghiên cứu đa dạng di truyền các chủng bệnh bạc lá thu thập tại các khu vực khác nhau ở Tây Phi

Năm 2007 đã tiến hành nghiên cứu, sử dụng phương pháp SDS-PAGE dùng marker enzyme glucose-6 phosphat hydrogenase để nghiên cứu đa hình trên

30 isolate Kết quả đã phân ra thành 2 nhóm A (46%) và B (54%) ở mức tương đồng 0.55

Năm 2008 các ông đã sử dụng 23 chỉ thị enzyme để tiếp tục nghiên cứu

trên 30 isolate đã nghiên cứu, kết quả cũng đã phân chúng thành 2 nhóm Xoo-A và

Xoo-B , tuy nhiên trong mỗi nhóm lại phân thành 2 nhóm nhỏ là Xoo-A1 (30%),

Xoo-A2 (20%) và Xoo-B1 (43%), Xoo-B2 (7%) Ngoài ra, dựa trên mối tương quan

giữa các chỉ thị và các nhóm chủng, có thể phân 23 chỉ thị isozyme trên thành 3

nhóm Nhóm 1 nhận diện tốt với nhóm chủng Xoo-A1, nhóm 2 với chủng Xoo-2, nhóm 3 với các chủng Xoo-B1 và Xoo-B2

2.3.4 Nghiên cứu đa dạng sinh học của vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv

oryzae tại Việt Nam

Những nghiên cứu về đa dạng vi khuẩn Xoo tại miền Bắc Việt Nam cho

đến nay vẫn thường chỉ sử dụng phương pháp lây nhiễm nhân tạo trên các dòng

lúa đẳng đơn gen (gen kháng bệnh bạc lá) Kết quả là có thể thiết lập được một phổ kháng nhiễm và dựa vào đây, các tác giả phân tích sự đa hình của các mẫu vi khuẩn, phân lập chúng vào những nhóm chủng có biểu hiện kháng nhiễm khác nhau đối với các dòng đẳng đơn gen Còn những nghiên cứu về đa dạng vi khuẩn

Xoo ứng dụng chỉ thị phân tử ADN thực thụ thì gần như chưa được tiến hành

hoặc mới chỉ sử dụng chỉ thị phân tử để xác định vi khuẩn Xoo mà thôi

Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, vào thập kỷ 90 có 4 nòi sinh

lý phổ biến ở miền Bắc nước ta (Nguyễn Văn Viết, 2005) Nhưng nghiên cứu gần đây của Phan Hữu Tôn và cộng sự, 2002 thì trên các mẫu bệnh thu thập được ở các tỉnh miền Bắc phân biệt được 154 isolate trong đó 64 isolate thuộc 16 chủng

vi khuẩn gây bệnh khác nhau Tuy trong kết quả nghiên cứu của tác giả có kết luận là tồn tại 2 chủng phổ biến kí hiệu là chủng 2 và chủng 3 ở vùng đồng Bằng Sông Hồng Song những chủng còn lại vẫn có tiềm năng gây nguy hiểm vì dù xuất hiện với tần xuất thấp hơn nhưng chúng vẫn có khả năng gây bệnh với các giống lúa Phan Hữu Tôn và cộng sự, 2012 đã kết hợp giữa phương pháp lây nhiễm nhân tạo với chỉ thị phân tử phân tử DNA đã cho ra kết quả là hiện tại miền Bắc Việt Nam đang tồn tại 12 chủng bệnh bạc lá Điều này cho thấy số lượng các chủng bạc lá ở miền Bắc nước ta đang tăng lên nhanh chóng và đa

dạng, đòi hỏi cần phải có những nghiên cứu chính xác các chủng vi khuẩn Xoo

đang tồn tại để lựa chọn được những gen kháng hữu hiệu, và từ đó có kế hoạch chọn tạo giống kháng bệnh bền vững

Năm 2008, nghiên cứu của Nguyễn Văn Viết, Đặng Thị Phương Lan, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, đã sử dụng phương pháp RAPD-PCR, dùng 10 đoạn mồi ngẫu nhiên: XPC15, PAG01, OPEF3, XPC9, XPC15, OPAF3

và PAG1 để nghiên cứu đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn Xoo tại miền Bắc Việt Nam, tiến hành trên 47 isolate phân lập Kết quả đã phân chia vi khuẩn Xoo

thành 13 nhóm; ở mức tương đồng 0.747 Trong đó, nhóm 2 và 3 phổ biến nhất (mỗi nhóm chiếm 14.89%), các nhóm 1, 4, 5, 7, 8, 9 chiếm tỉ lệ trung bình (6.38 - 8.51%), nhóm 10, 11, 12 và 13 chiếm tỷ lệ rất ít (Theo tập san của Cục Bảo vệ Thực vật, Số 4/2008)

2.3.5 Khả năng gây nhiễm của các chủng bạc lá ở Việt Nam

Theo kết quả nghiên cứu của Bùi Trọng Thuỷ và cộng sự, 2004 bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo đã xác định được tất cả các tổ hợp gen chứa gen

xa5 đều có khả năng kháng mạnh đối với 7 chủng vi khuẩn Xoo gây bệnh bạc lá lúa phổ biến ở các tỉnh miền bắc Việt Nam Trong đó, chủng Y9 là chủng có độc

tính rất cao, có thể lây nhiễm cho nhiều dòng lúa chứa các gen kháng bệnh bạc lá

khác nhau Gen xa5 là gen lặn chỉ thể hiện phản ứng kháng ở trạng thái đồng hợp

tử, do vậy rất có lợi cho công tác chọn các giống lúa thuần chống bệnh bạc lá nhưng ít có giá trị đối với chương trình tạo giống lúa lai

Các tổ hợp gen có chứa gen Xa7 như: Xa1/Xa7; Xa3/Xa7; Xa4/Xa7 và

xa5/Xa7 có khả năng kháng các chủng Y1, Y5, Y6, Y7,Y8 và Y10 Đây là những

chủng vi khuẩn có phạm vi phân bố rộng ở vùng đồng bằng Sông Hồng, khu IV

cũ và các tỉnh miền núi phía Bắc, nhưng có phản ứng nhiễm với chủng Y9, chủng

này phân bố ở Hà Nội, Hòa Bình, Tuyên Quang

Các tổ hợp gen Xa1/Xa10; Xa1/Xa11 và Xa10/Xa11 có phản ứng nhiễm với tất cả 7 chủng vi khuẩn Xoo phổ biến ở miền Bắc Việt Nam

PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Phòng thí nghiệm và Khu thí nghiệm đồng ruộng Bộ môn Sinh học Phân

tử và Công nghệ Sinh học Ứng dụng – Khoa Công nghệ Sinh học – Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Nguồn gen Cây trồng – Học viện Nông nghiệp Việt Nam

3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Thời gian tiến hành đề tài từ tháng 1/2015 đến tháng 12/2015

Thu thập mẫu được tiến hành từ vụ mùa 2014

3.3 VẬT LIỆU

62 mẫu bệnh thu từ các giống lúa ở các tỉnh: Hà Nội, Quảng Ninh, Hải Dương, Thái Bình, Bắc Ninh, Nam Định, Hưng Yên, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Tuyên Quang, Thanh Hóa, Nghệ An …

11 dòng đẳng gen IRBB chứa các gen kháng bệnh bạc lá khác nhau có nền gen chung là giống IR24 và 50 giống lúa địa phương chứa các gen kháng bệnh bạc lá

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

Nội dung nghiên cứu bao gồm các nội dung sau:

Nội dung 1: Thu thập và phân lập các mẫu bệnh bạc lá ở các địa điểm

khác nhau tại miền Bắc Việt Nam

Nội dung 2: Xác định thành phần và sự phân bố của các chủng vi khuẩn

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Phương pháp thu thập và phân lập các mẫu vi khuẩn gây bệnh bạc lá

3.5.1.1 Phương pháp thu thập mẫu bệnh bạc lá

Mẫu bệnh thu thập ở những vùng khác nhau đại diện cho khu vực sinh

thái Tiến hành lấy mẫu ở giai đoạn cây lúa làm đòng đến chín sữa, lấy những lá

có vết bệnh đang phát triển, biểu hiện bệnh rõ ràng Thực hiện cách lấy mẫu ngẫu nhiên, mẫu thu thập được bao gói, ghi chép đầy đủ các thông tin: Địa điểm, tên giống lúa, ngày tháng lấy mẫu và bảo quản phục vụ phân lập vi khuẩn

3.5.1.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn từ mẫu bệnh

Phân lập vi khuẩn theo phương pháp đơn khuẩn lạc trên môi trường Wakimoto như sau:

* Chuẩn bị môi trường

Thành phần 1lít môi trường Wakimoto

Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, cắt lát mỏng với 1,2 lít nước cất, đun sôi trong

15 - 20 phút, thu lấy dịch rồi lần lượt thêm các thành phần môi trường vào khấy đều cho tan hết (được 1 lít môi trường), chuẩn pH bằng 5,5-6,0 Hấp khử trùng ở 121ºC trong 20 phút

* Phương pháp phân lập vi khuẩn

Đầu tiên ngâm mẫu lá lúa bị bệnh trong cồn 70% trong vòng 10 giây, sau

đó ngâm mẫu lá lúa bị bệnh trong nước Javen 10% trong 5 phút, rồi rửa lại bằng nước cất vô trùng 2-3 lần Cắt những phần lá lúa bị bệnh thành những mảnh nhỏ 5x5mm, phần tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khoẻ của vết bệnh đang phát triển và cho vào cối sứ và nghiền nát bằng chày sứ Thêm vào phần lá đã nghiền trong cối 1ml nước cất khử trùng Hút phần dịch nghiền cho vào tube 1,5ml và pha loãng

100 lần rồi để yên 5-10 phút cho lắng bớt phần cặn Hút 50 µl dịch nghiền trải đều trên các đĩa petri chứa sẵn môi trường wakimoto Dùng que trải bằng thủy tinh trải phần dịch này khắp mặt môi trường trong đĩa petri Sau đó đặt ở 300C, 2

- 3 ngày có khuẩn lạc mọc lên Sau khi xuất hiện những khuẩn lạc rời, mỗi đĩa petri chọn 2 khuẩn lạc có hình dạng tròn, nhẵn bóng, lồi lên, có kích thước 1-2