đánh giá hiệu lực của vacxin cúm gia cầm chủng re 1 và re 5 do trung quốc sản xuất đối với virus h5n1 phân nhóm 2 3 2 1a trên đàn gà nuôi thí nghiệm

Trong điều kiện biến đổi của virus cúm gia cầm hiện nay, tiêm phòng vacxin vẫn được Bộ NN&PTNT coi là biện pháp khống chế chủ động dịch cúm bùng phát, làm giảm diện tích vùng lây nhiễm,

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGÔ QUANG TUYẾN

ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA VACXIN CÚM GIA CẦM CHỦNG RE-1 VÀ RE-5 DO TRUNG QUỐC SẢN XUẤT ĐỐI VỚI VIRUS H5N1 PHÂN NHÓM 2.3.2.1A TRÊN ĐÀN GÀ NUÔI THÍ NGHIỆM

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2016

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGÔ QUANG TUYẾN

ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA VACXIN CÚM GIA CẦM CHỦNG RE-1 VÀ RE-5 DO TRUNG QUỐC SẢN XUẤT ĐỐI VỚI VIRUS H5N1 PHÂN NHÓM 2.3.2.1A TRÊN ĐÀN GÀ NUÔI THÍ NGHIỆM

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS LẠI THỊ LAN HƯƠNG

HÀ NỘI, NĂM 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc Mọi sự giúp đỡ đã được cảm ơn

Hà Nội, ngày 10 tháng 01 năm 2016

Tác giả luận văn

Ngô Quang Tuyến

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và động viên của nhiều cá nhân và tập thể Nhân dịp này tôi xin cảm ơn Ban Giám hiệu, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Thú y, Học viện Nông Nghiệp Việt Nam đã tạo điều kiện cho tôi được theo học chương trình đào tạo Thạc sĩ tại học viện

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô TS Lại Thị Lan Hương giảng viên bộ môn Giải phẫu – Tổ chức, Khoa Thú y, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này

Tôi xin chân thành cảm ơn tới tất cả các Giảng viên, cán bộ công tác tại Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ sinh học Thú y, Khoa Thú y, Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam Đặc biệt là PGS.TS Nguyễn Thị Lan đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu

Tôi xin cảm ơn tới bạn bè, đồng nghiệp cùng gia đình đã giúp đỡ, động viên tôi hoàn thành chương trình học tập và thực hiện đề tài

Hà Nội ngày 10 tháng 01 năm 2016

Tác giả luận văn

Ngô Quang Tuyến

MỤC LỤC

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục bảng viii

Danh mục biểu đồ ix

Danh mục các chữ viết tắt x

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Khái niệm bệnh cúm gia cầm 3

1.2 Lịch sử bệnh cúm gia cầm 3

1.2.1 Lịch sử cúm gia cầm trên thế giới 3

1.2.2 Tình hình dịch cúm gia cầm ở Việt Nam 4

1.2.3 Các phân nhóm (clade) của virus cúm H5N1 ở Việt Nam 9

1.3 Virus cúm gia cầm 10

1.3.1 Hình thái và cấu trúc chung của virus cúm type A 10

1.3.2 Kháng nguyên của virus cúm gia cầm 11

1.3.3 Độc lực của virus cúm gia cầm 12

1.3.4 Khả năng biến chủng của virus cúm gia cầm 12

1.3.5 Sức đề kháng của virus cúm gia cầm 13

1.3.6 Nuôi cấy và lưu giữ virus cúm gia cầm 14

1.4 Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm 14

1.4.1 Loài vật mắc bệnh 14

1.4.2 Sự truyền lây 14

1.5 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ 15

1.6 Triệu chứng và bệnh tích bệnh cúm gia cầm 16

1.6.1 Triệu chứng 16

1.6.2 Bệnh tích 17

1.7 Phương pháp chẩn đoán bệnh cúm gia cầm 18

1.7.1 Chẩn đoán dựa vào đặc điểm dịch tễ, triệu chứng và bệnh tích 18

1.7.2 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm 18

1.8 Đáp ứng miễn dịch chống virus cúm gia cầm 18

1.8.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu 18

1.8.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu 19

1.9 Phòng chống bệnh cúm gia cầm 20

1.10 Sử dụng vacxin phòng chống bệnh cúm gia cầm 21

1.10.1 Các loại vacxin được dùng hiện nay 21

1.10.2 Tình hình sử dụng vacxin cúm gia cầm trên thế giới 22

1.10.3 Tình hình sử dụng vacxin cúm gia cầm tại Việt Nam 23

1.10.4 Những điểm chú ý khi sử dụng vacxin cúm gia cầm 24

1.11 Nghiên cứu trong nước về bệnh cúm gia cầm 24

1.11.1 Kết quả nghiên cứu nguồn gốc virus cúm gia cầm H5N1 tại Việt Nam 24

1.11.2 Kết quả nghiên cứu về sự lưu hành virus cúm gia cầm tại Việt Nam 24

1.11.3 Kết quả nghiên cứu các phân nhóm (clade) virus cúm H5N1 tại Việt Nam 25

CHƯƠNG II NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Đối tượng và nguyên liệu 26

2.2 Nội dung nghiên cứu 26

2.3 Phương pháp nghiên cứu 27

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu 27

2.3.2 Phương pháp mổ khám gia cầm 27

2.3.3 Phương pháp phát hiện kháng nguyên 28

2.3.4 Phương pháp phát hiện kháng thể 28

2.3.5 Phương pháp Real-time RT-PCR (Real-time

reverse-transcription polymerase chain reaction) 29

2.4 Bố trí thí nghiệm 32

2.5.Chỉ tiêu theo dõi và đánh giá 33

2.6 Xử lý số liệu 33

CHƯƠNG III KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 34

3.1 Kết quả kiểm tra đáp ứng miễn dịch của gà sau khi tiêm vacxin 34

3.1.1 Kết quả kiểm tra đáp ứng miễn dịch của gà sau khi tiêm vacxin Re-1 34

3.1.2 Kết quả kiểm tra đáp ứng miễn dịch của gà sau khi tiêm vacxin Re-5 36

3.1.3 So sánh đáp ứng miễn dịch của gà lô vacxin Re-1 và lô vacxin Re-5 38

3.1.4 So sánh đáp ứng miễn dịch của gà tiêm vacxin mũi 1 và mũi 2 đạt được trước công 40

3.2 Kết quả công cường độc 42

3.2.1 Kết quả công cường độc trên gà với lô vacxin Re-1 44

3.2.2 Kết quả công cường độc trên gà với lô vacxin Re-5: 47

3.2.3 So sánh kết quả công cường độc trên gà ở lô vacxin Re-1 và lô vacxin Re-5: 50

3.3 Kết quả định lượng virus bài thải sau khi công cường độc 52

3.3.1 Mức độ bài thải virus sau công cường độc của gà đối với thí nghiệm với vacxin Re-1 52

3.3.2 Mức độ bài thải virus sau công cường độc của gà đối với thí nghiệm với vacxin Re-5 54

3.3.3 So sánh kết quả bài thải virus sau công cường độc của lô vacxin Re-1 và lô Vacxin Re-5: 56

3.4 Kết quả kiểm tra đáp ứng miễn dịch sau công cường độc 57

KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 61

1 Kết luận 61

2 Đề nghị 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

PHỤ LỤC 64

DANH MỤC BẢNG

3.1 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của gà sau khi tiêm vacxin

Re-1 35

3.2 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của gà sau khi tiêm vacxin Re-5 37

3.3 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể H5N1 trước công bằng phản ứng HI 38

3.4 Kết quả kiểm tra đáp ứng miễn dịch của gà trước công cường độc 40

3.5 Kết quả công cường độc trên gà với lô vacxin Re-1 44

3.6 Kết quả công cường độc trên gà với lô vacxin Re-5 48

3.7 Tổng hợp kết quả sau công cường độc của lô tiêm vacxin Re-1 và lô tiêm vacxin Re-5 50

3.8 Mức độ bài thải virus sau công cường độc của gà đối với thí nghiệm với vacxin Re-1 52

3.9 Mức độ bài thải virus sau công cường độc của gà đối với thí nghiệm với vacxin Re-5 55

3.10 Tổng hợp kết quả bài thải virus sau công cường độc của hai nhóm vacxin Re-1 và Re-5 57

3.11 Hiệu giá kháng thể trước và sau công cường độc 58

DANH MỤC BIỂU ĐỒ

3.1 Phân bố mức hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của gà được

tiêm vacxin Re-1 35

3.2 Phân bố mức hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của gà được tiêm vacxin Re-5 37

3.3 Hiệu giá kháng thể trung bình sau tiêm vacxin 39

3.4 Tỷ lệ bảo hộ về mặt huyết thanh học sau tiêm vacxin 39

3.5 Biểu đồ hàm lượng kháng thể trung bình của gà sau khi tiêm vacxin 41

3.6 Biểu đồ tỷ lệ bảo hộ của gà về mặt huyết thanh học sau khi tiêm vacxin 41

3.7 Tỷ lệ chết theo ngày của gà trong thí nghiệm với vacxin Re-1 47

3.8 Tỷ lệ chết theo ngày của gà trong thí nghiệm với vacxin Re-5 50

3.9 Mức độ bài thải virus của gà ở thí nghiệm với vacxin Re-1 53

3.10 mức độ bài thải virus của gà ở thí nghiệm với vacxin Re-5 56

3.11 Hiệu giá kháng thể trung bình trước và sau công cường độc với lô vacxin Re-1 59

3.12 Hiệu giá kháng thể trung bình trước và sau công cường độc với lô vacxin Re-5 59

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN : Axit Deoxyribonucleic

A/H5N1 : virus cúm type A subtype H5N1

ARN : Axit Ribonucleic

CCĐ : Công cường độc

CEF : Chicken Embryo Fibroblast

CGC : Cúm gia cầm

Ct : Cycle threshold

DIVA : Differenciating Infected from Vacxination animals

ELISA : Enzyme Linking Immunosozbent Assay

FAO : Food and Agriculture Organization

GMT : Geometric Mean Titer

HA : Hemagglutination assay

HGKT : Hiệu giá kháng thể

HI : Hemagglutination Inhibition assay

HPAI : Highly Pathigenic Avian Influenza

IVPI : Intra Venous Pathogenicity Index

LPAI : Low pathogenic avian influenza

MA : matrix

MDCK : Madin Darby Canine Kidney cells

MHC : Majoz Histocompalibility Complex antigen

OIE : Office International Epizooties

PCR : Polymerase Chain Reaction

PBS : Isotonic Phosphate Buffered Saline

RT-PCR : Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

TCID50 : Tissue Culture Infectious Dose 50

WHO : World Health Organization

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Thực hiện công nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nước theo chủ trương đường lối của Đảng và Nhà nước, cùng với sự phát triển của đất nước và các ngành, các lĩnh vực khác nói riêng, ngành chăn nuôi nói chung cũng áp dụng các tiến bộ khoa học kỹ thuật tiên tiến và hiện đại vào lĩnh vực của nghành, vì vậy trong những năm gần đây đã phát triển nhanh về số lượng và chất lượng sản phẩm (thịt, trứng, sữa) đáp ứng nhu cầu ngày càng cao của xã hội và dần phù hợp với hội nhập toàn cầu hóa Trong đó chăn nuôi Gia cầm là nghề chăn nuôi truyền thống ở Việt Nam, sản phẩm gia cầm, đặc biệt là thịt gà là nguồn cung cấp thực phẩm luôn có vị trí trên thị trường tiêu thụ, đã góp phần thúc đẩy chăn nuôi phát triển, tạo thêm việc làm, tăng thu nhập cho người chăn nuôi Năm 2004 mặc dù gặp khó khăn về dịch cúm gia cầm H5N1 nhưng tổng đàn gia cầm của cả nước vẫn đạt trên 250 triệu con

Tuy nhiên, dịch bệnh luôn là mối đe dọa lớn và nó đã trở thành mối quan tâm hàng đầu của bất kỳ cơ sở chăn nuôi nào Bệnh cúm gia cầm gây ra bởi virus

cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, là một bệnh truyền nhiễm cấp tính rất nguy

hiểm đối với gà, vịt, ngan, ngỗng, gà tây, đà điểu, chim cút Các loài chim cảnh, chim hoang dã nhất là vịt trời, diệc, ngỗng trời được coi là những vật mang trùng khoẻ mạnh Đặc biệt nguy hiểm hơn khi bệnh có thể lây sang cả cho người Với đặc điểm lây lan rất nhanh và tỷ lệ chết rất cao trong quần thể gia cầm bị bệnh trong vòng 24-48 giờ sau khi bị nhiễm virus, gây tổn thất lớn cho ngành chăn nuôi nói riêng và cho sức khỏe con người nói chung Do tính chất nguy hiểm của dịch cúm tổ chức y tế thế giới (WHO), tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) đã xếp vào danh mục 15 bệnh nguy hiểm nhất của động vật và cảnh báo thế giới đang đứng trước nguy cơ xảy ra dịch cúm gia cầm và đại dịch cúm ở người

Ở nước ta từ tháng 12 năm 2003 đã xảy ra 5 đợt dịch cúm gia cầm lớn và cúm A/H5N1 trên người, phải tiêu huỷ hàng chục triệu gia cầm và gần một trăm người mắc bệnh, hàng chục người tử vong

Từ năm 2010 đến nay, dịch xảy ra lẻ tẻ ở nhiều tỉnh thành trong cả nước, không chấm dứt, thường xảy ra tại ổ dịch cũ và xung quanh ổ dịch Chính vì thế,

sự hiểu biết về cúm gia cầm cũng như tình hình diễn biến của dịch bệnh nguy hiểm này là một điều kiện tiên quyết để có thể giải quyết được nó

Dựa vào kết quả giải trình tự gen, virus cúm gia cầm type A chủng H5N1được chia thành 10 clade từ 0- 9 Tại Việt Nam đã từng xuất hiện các clade khác

nhau gây nên các đợt dịch

Các báo cáo dịch tễ của Cục Thú y cho thấy các clade ở phía Bắc thường

ít hoặc không xuất hiện tại các ổ dịch phía Nam Riêng clade 2.3.2.1A đã tồn tại

và gây bệnh cho gia cầm các tỉnh phía Bắc và duyên hải miền Trung từ nhiều năm nay Tuy nhiên sau thời gian dài lưu hành, virus cúm gia cầm H5N1 clade 2.3.2.1A đã có những biến đổi về gen, dần dần trở nên khác virus ban đầu Điều này có thể ảnh hưởng đến tính kháng nguyên của virus

Tiêm phòng vacxin được OIE, FAO, WHO khuyến cáo là biện pháp chủ động trong phòng chống cúm gia cầm Hiện nay Việt Nam sử dụng nhiều loại vacxin của nhiều nhà cung cấp nhưng chủ yếu dựa vào nguồn vacxin nhập khẩu

từ Trung Quốc Giai đoạn 2007-2010, Việt Nam sử dụng vacxin cúm gia cầm chủng RE-1 do Trung Quốc sản xuất khá hiệu quả trong việc không chế và làm giảm thiệt hại của dịch cúm Tuy nhiên từ năm 2010 Trung Quốc lại chuyển sang sản xuất vacxin cúm gia cầm RE-5 và Việt Nam hiện nay vẫn đang nhập khẩu cả

2 loại vacxin trên

Trong điều kiện biến đổi của virus cúm gia cầm hiện nay, tiêm phòng vacxin vẫn được Bộ NN&PTNT coi là biện pháp khống chế chủ động dịch cúm bùng phát, làm giảm diện tích vùng lây nhiễm, vì vậy việc đánh giá hiệu lực của các loại vacxin đối với các biến chủng mới của virus cúm gia cầm là khâu rất quan trọng trong công tác phòng chống dịch bệnh cúm gia cầm ở nước ta Do vậy

chúng tôi nghiên cứu đề tài: “ Đánh giá hiệu lực của vacxin cúm gia cầm chủng Re-1 và Re-5 do Trung quốc sản xuất đối với virus H5N1 phân nhóm 2.3.2.1A trên gà nuôi thí nghiệm”

2 Mục tiêu nghiên cứu

Đánh giá được hiệu lực của vacxin cúm gia cầm chủng Re-1 và Re-5 do Trung Quốc sản xuất đối với virus H5N1 phân nhóm 2.3.2.1A trên gà

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Khái niệm bệnh cúm gia cầm

Bệnh cúm gia cầm ( A vian Influenza-AI ) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do virus cúm type A thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra Đây là một tác nhân

gây bệnh dịch rất lớn, có tính chất khốc liệt trên gia cầm nói chung

Trước đây, bệnh được gọi là bệnh dịch tả gà ( Fowl plague ) nhưng từ hội

nghị Quốc tế lần thứ nhất về bệnh cúm gia cầm tại Beltsville ở Mỹ (1981) đã

thay thế bằng tên: bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao ( Highly pathogenic avian

influenza - HPAI ) ( Trần Hữu Cổn và Bùi Quang Anh, 2004), để chỉ các virus cúm typ A có độc lực mạnh, lây lan nhanh và gây tỷ lệ tử vong cao ở loài mẫn cảm Tổ chức thế giới ( OIE ) xếp HPAI vào danh mục 15 bệnh nguy hiểm nhất ở động vật

1.2 Lịch sử bệnh cúm gia cầm

1.2.1 Lịch sử cúm gia cầm trên thế giới

Bệnh cúm ở động vật nói chung và bệnh cúm gia cầm đã có từ lâu đời và

có ở khắp nơi trên thế giới Năm 412 trước công nguyên, Hyppocrates đã mô tả

về bệnh cúm Bệnh cúm gia cầm được Perroncito (Italy) mô tả đầu tiên vào năm

1878 với tên lúc đầu là dịch tả gà Đến năm 1901, Centanni và Savunozzi đã xác định căn nguyên siêu nhỏ gây bệnh Nhưng phải đến năm 1955 mới xác định được virus đó chính là virus cúm typ A (H7N1 và H7N7) gây chết gà, gà tây và các loài khác Chủng virus H5N1 được phát hiện đầu tiên trên gà tại Scotland vào năm 1959 Năm 1963, virus cúm gia cầm typ A đã được phân lập từ gà tây ở Bắc

Mỹ do loại thủy cầm di trú dẫn nhập vào Bệnh cũng được Beard mô tả tương đối

kỹ vào năm 1971, qua đợt dịch cúm lớn trên gà tây ở Mỹ Các năm tiếp theo bệnh cũng được tiếp tục phát hiện ở Nam Mỹ, Bắc Mỹ, Nam Phi, Trung Cận Đông, châu Âu, châu Úc và châu Á (Phạm Sỹ Lăng, 2004)

Năm 1997, ở Hồng Kông dịch cúm gà xảy ra do virus cúm type A subtype

H5N1 Toàn bộ gia cầm của lãnh thổ này đã bị tiêu huỷ vì bệnh đã gây tử vong cho người (Nguyễn Hoài Tạo và Nguyễn Tuấn Anh, 2004)

Từ cuối năm 2003-2005 đã có 11 nước và vùng lãnh thổ xuất hiện dịch cúm gia cầm H5N1 gồm Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Campuchia, Lào, Indonesia, Trung Quốc, Malaysia, Hồng Kông và Việt Nam Ngoài ra có 7 nước

và vùng lãnh thổ khác có dịch cúm gia cầm các chủng khác là Pakistan, Hoa Kỳ, Canada, Nam Phi, Ai Cập, Triều Tiên và Đài Loan Trong đợt dịch cúm này có khoảng 120 triệu gia cầm gồm gà, gà tây, gà sao, gà lôi, vịt, ngan, ngỗng, chim cút, bồ câu và một số loài chim hoang dã đã bị nhiễm bệnh và nằm trong vùng dịch phải tiêu hủy Hàng trăm người bị lây nhiễm, trong đó có trên 20 người bị chết (Vũ Thị Mỹ Hạnh và cs, 2008)

1.2.2 Tình hình dịch cúm gia cầm ở Việt Nam

Dịch cúm gia cầm do virus cúm type A subtype H5N1 (A/H5N1) bùng phát tại Việt Nam vào cuối tháng 12/2003 ở các tỉnh phía Bắc, sau đó đã nhanh chóng lan tới hầu hết các tỉnh/thành trong cả nước chỉ trong một thời gian ngắn Đây là lần đầu tiên dịch cúm gia cầm A/H5N1 xảy ra tại Việt Nam, có tới hàng chục triệu gia cầm bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề tới nền kinh tế quốc dân Tính đến tháng 10/2008, dịch cúm gia cầm liên tục tái bùng phát hàng năm tại nhiều địa

phương trong cả nước, có thể phân chia thành các đợt dịch lớn như sau:

* Đợt dịch thứ nhất: Từ tháng 12/2003 và 30/03/2004, dịch bệnh đã xảy ra

ở 2.574 xã, phường, 381 huyện, thị thuộc 57 tỉnh, thành phố Dịch cúm xảy ra nặng ở các tỉnh: Long An 185 xã, Tiền Giang 135 xã, An Giang 145 xã, Đồng Tháp 116 xã, Hà Tây 134 xã, Hải Dương 144 xã Dịch bệnh lây lan rất nhanh, chỉ trong vòng hai tháng đã xuất hiện ở 57/64 tỉnh/thành trong cả nước Tổng số gà

và thủy cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy hơn 43,9 triệu con, chiếm 17% tổng đàn gia cầm Đặc biệt, có 3 người được xác định nhiễm virus cúmA/H5N1vàcả3 đã

tử vong trong đợt dịch này (http://www.cucthuy.gov.vn)

* Đợt dịch thứ 2: Từ tháng 4 đến tháng 11/2004, dịch phát ra rải rác với quy

mô nhỏ ở các hộ gia đình chăn nuôi gia cầm, bệnh xuất hiện ở 46 xã, phường tại 32 huyện, quận, thị xã thuộc 17 tỉnh Thời gian cao điểm nhất là trong tháng 7, sau đó

giảm dần đến tháng 11/2004 chỉ còn một điểm phát dịch Tổng số gia cầm tiêu hủy được thống kê trong vụ dịch này là 84.078 con Trong đó, có gần 56.000 gà; 8.132 vịt;

và 19.950 con chim cút Và đã có tới 27 người mắc bệnh virus cúm A/H5N1, trong đó

có 9 ca tử vong (http://www.cucthuy.gov.vn)

* Đợt 3: Từ tháng 12/2004 cho đến tháng 15/12/2005, dịch cúm gà đã xuất hiện ở 670 xã tại 182 huyện thuộc 36 tỉnh, thành phố Số gia cầm bị tiêu hủy được Cục Thú y thống kê là 1,846 triệu con (gồm 470.000 gà, 825.000 thủy cầm

và 551.000 chim cút) Vào những tháng cuối năm 2005, dịch cúm gà xảy ra trong tháng 10/2005 lan nhanh trong gần 40 tỉnh thành và giảm dần trong tháng

* Đợt 5: bắt đầu và kéo dài trong suốt năm 2007 Dịch không tập trung mà

rải rác, lẻ tẻ ở khắp nơi và có thể chia nhiều đợt:

+ Từ 12/2006 đến 3/2007 dịch xảy ra trên 83 xã, phường của 33 quận, huyện thuộc 11 tỉnh Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 103.092 con,

trong đó có 13.622 gà; 89.472 ngan, vịt

+ Từ 5/2007 đến 8/2007, dịch xảy ra ở 167 xã, phường của 10 huyện, thị thuộc 23 tỉnh, thành Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu huỷ là 294.894 con (21.525 gà, 264.549 vịt và 8.775 ngan) Sau khi bị khống chế trong vòng 1 tháng, đến tháng 10/2007, dịch lại tái phát ở 15 xã, phường của 9 huyện, quận, thị trấn thuộc 6 tỉnh, thành phố

* Đợt 6: từ đầu năm 2008: xảy ra rải rác với 74 đàn gia cầm tại 57 xã, phường của 40 huyện thị thuộc 21 tỉnh phát dịch Tổng số gia cầm tiêu huỷ là

60.090 con, trong đó có 23.498 gà, 36.592 thuỷ cầm

+ Năm 2009, dịch cúm gia cầm đã xảy ra ở 68 xã, phường, thị trấn của 34

huyện, thị xã thuộc 17 tỉnh, thành với tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy

trên 127.000 con

+ Năm 2010, dịch cúm gia cầm xuất hiện ở 63 xã, phường của 37 huyện, quận thuộc 24 tỉnh, thành trên cả nước, làm hơn 75.000 gia cầm chết

+ Năm 2011, dịch cúm gia cầm đã xảy ra ở 82 xã, phường của 43 huyện,

quận thuộc 22 tỉnh, thành phố, với tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là

151.356 con

+ Năm 2012, dịch bệnh cúm gia cầm diễn biến phức tạp hơn với những biến đổi nhiều về cấu trúc gen và độc lực Năm 2012 tăng mạnh về số tỉnh/thành phố có dịch xảy ra, với 32 tỉnh/thành phố Tổng số 296 xã/phường của 112 huyện/quận có dịch Tổng số gia cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy là 616.109 con Tỉnh Quảng Ngãi xảy ra dịch mạnh nhất với 34 xã/phường của 8 huyện/thị xã với 12.220 con gia cầm mắc bệnh (chiếm 4,21%), số gia cầm buộc phải tiêu hủy là 105.515 con (chiếm 17,50%), sau đó là các tỉnh Hà Tĩnh, Nghệ An

+ năm 2013, tháng 1/2013 tại tỉnh Tây Ninh dịch cúm gia cầm xuất hiện tại hai hộ gia đình thôn Bàu Tép, xã Tiên Thuận, huyện Bên Cầu và ấp

Cỏ Đỏ, xã Bình Minh, tỉnh Tây Ninh Tổng số gia cầm chết và tiêu hủy tại Tây Ninh là 3.438 con Tháng 2/2013, tại Khành Hòa có trên 10.000 gà vịt bị bệnh cúm phải tiêu hủy Tháng 3/2013, dịch cúm gia cầm xảy ra ở Bình Định,

có trên 78.500 con vịt chết hoặc tiêu hủy Theo chi cục Thú y tỉnh Cà Mau, trong hai tháng đầu năm 2013 trên địa bàn tỉnh Cà Mau có ba ổ dịch cúm gia cầm tại xã Trần Hợi (huyện Trần Văn Thời), xã Tân Phú (huyện Thới Bình),

xã An Xuyên (Tp Cà Mau)… Cũng trong tháng 3 năm 2013, mặc dù tại tỉnh Đồng Tháp chưa xảy ra dịch cúm A/H5N1, nhưng qua kiểm tra 72 mẫu xét nghiệm gia cầm tại các chợ ở Đồng Tháp, nghành chức năng đã phát hiện 24 mẫu dương tính với virus cúm A/H5N1, chiếm tỷ lệ 33,3% Ngoài ra một trường hợp tử vong được xác định do nhiễm virus cúm này là một cháu bé 4 tuổi Tháng 4/2013, cơ quan thú y vùng 6 đã phối hợp với chi cục thú y Ninh

Thuận lấy mẫu chim yến chết để xét nghiệm, kết quả cho thấy trong một số mẫu chim chết tại Ninh Thuận có dương tính với virus cúm A/H5N1

+ năm 2014, đến ngày 4 tháng 3 năm 2014 cả nước còn 63 ổ dịch cúm gia cầm tại 22 tỉnh, toàn bộ số gia cầm trong đàn mắc bệnh đã được địa phương tiêu hủy Qua phân tích cho thấy trong năm 2014, virus cúm A/H5N1 nhánh 1.1 đã được phát hiện tại ổ dịch trên gà tại Long An, Kiên Giang và Cà Mau, hầu hết các ổ dịch trên gia cầm (gà, vịt, ngan) tại các tỉnh khác do virus cúm H5N1 nhánh 2.3.2.1C Từ 2/4 đến 15/4/2014, 5 tỉnh cuối cùng có ổ dịch bao gồm Khánh Hòa, Vĩnh Long, Hà Giang, Bình Thuận và Bến Tre các địa phương này đã công bố hết dịch

Các ổ dịch xảy ra chủ yếu trên đàn gia cầm nuôi tại các hộ gia đình và được chính quyền địa phương, cơ quan chuyên môn thú y phát hiện và xử lý kịp thời nên chưa có hiện tượng lây lan rộng Trung bình mỗi tỉnh có 3 ổ dịch xảy ra tại 2 huyện Riêng các tỉnh Khánh Hòa và Lào Cai có số lượng lớn gia cầm mắc bệnh phải tiêu hủy trên 10.000 con/tỉnh

Cuối tháng 4/2014 phát hiện ổ dịch trên 1 đàn gà tại huyện Tràng Định, tỉnh Lạng Sơn Tháng 6/2014 xuất hiện ổ dịch tại huyện Kỳ Anh, tỉnh

Hà Tĩnh trên 1 đàn vịt 1.900 con Huyện Bảo Thắng, tỉnh Lào Cai có báo cáo ngày 15/8/2014 phát hiện 1 đàn chim trĩ 558 con, đã nuôi được hơn 2 năm, chết rải rác 498 con Chi cục thú y Lào Cai đã tiến hành tiêu hủy ngay số chim trĩ còn lại (60 con) Từ 15/8 đến 22/8/2014 tại huyện Gio Linh, tỉnh Quảng Trị dịch cúm đã xảy ra trên đàn vịt của 2 hộ chăn nuôi gồm 1.550 con

từ 12 – 14 ngày tuổi, chết khoảng 350 con Ngày 23/8/2014 tại huyện Sơn Tịnh, tỉnh Quảng Ngãi phát hiện ổ dịch cúm H5N6 trên 1 đàn vịt 1.100 con, chết 200 con Ngày 13/9/2014 dịch cúm H5N6 xảy ra trên 1 đàn vịt của 1 hộ

xã Tịnh Đông, Tp.Quảng Ngãi, tỉnh Quảng Ngãi với số vịt măc bệnh là 1000 con và số chết là 300 con Tỉnh Quảng Nam là nơi công bố ổ dịch cuối cùng ngày 14/9/2014 trên đàn vịt với số mắc bệnh là 2.000 con, số chết là 600 con Ngày 09/12/2014 hiện tại cả nước có 3 hộ thuộc 03 xã, 03 huyện của tỉnh Vĩnh Long và Trà Vinh xảy ra dịch bệnh Tổng số gia cầm mắc bệnh : 987 con

và tổng số gia cầm tiêu hủy: 1107 con Ngày 13/12/2014 phát sinh một ổ dịch tại thôn Lâm Lộc Bắc, xã Tịnh Hà, huyện Sơn Tịnh, tỉnh Quảng Ngãi: Tổng đàn chim cút là 12.000 con, số chết là 2.965 con chim cút

+ 6 tháng đầu năm 2015, Theo báo cáo, Chi cục Thú y tỉnh Cà Mau đã phát hiện 01 hộ chăn nuôi gia cầm tại Ấp 3 của xã Khánh Hội thuộc huyện U Minh có gia cầm mắc bệnh cúm H5N1 Số gia cầm chết là 260 con trong tổng đàn 824 con gồm 675 con gà và 149 con vịt

Chi cục Thú y tỉnh Sóc Trăng đã phát hiện và phối hợp với chính quyền địa phương tiêu hủy đàn gà trên 2 tháng tuổi, 1100 con, bị mắc bệnh cúm gia cầm H5N1 tại Ấp 1, xã Đại Hải, huyện Kế Sách Ngày 23/02/2015 địa phương đã tiêu hủy đàn gà

Theo báo cáo của Chi cục Thú y tỉnh Vĩnh Long, địa phương đã phát hiện

ổ dịch cúm gia cầm trên đàn vịt 2 tháng tuổi, chưa tiêm phòng vắc xin, gồm 1600 con của 01 hộ chăn nuôi ở ấp Phước Trinh A, xã Bình Phước, huyện Mang Thít Ngày 13/3/2015 địa phương đã tiêu hủy đàn vịt

Ngày 12/3/2015, dịch Cúm gia cầm đã xảy ra tại 02 hộ chăn nuôi thuộc thôn 2, xã Hải Lĩnh, huyện Tĩnh Gia làm 353 con gia cầm mắc bệnh (250 con vịt,

103 con gà) Toàn bộ đàn gia cầm mắc bệnh tại 02 hộ chăn nuôi trên và gia cầm của 14 hộ xung quanh (670 con) đã được tiêu hủy

Ngày 02/4/2015 đã phát hiện 01 ổ dịch cúm gia cầm tại 01 hộ thuộc thôn Dinh, xã Nghĩa Xuân, huyện Quỳ Hợp Nghệ An Từ 02-04/4 toàn bộ đàn gia cầm mắc bệnh và một số đàn gia cầm có liên quan (tổng cộng 318 con) đã bị tiêu hủy Ngày 05/4/2015 đã phát hiện 01 ổ dịch cúm gia cầm H5N1 tại 01 hộ thuộc thôn Nhơn Phú, xã Nhơn Nghĩa, huyện Phong Điền, thành phố Cần Thơ Tổng đàn gồm 900 con gà, trong đó số gà mắc bệnh là 650 con, số chết là 399 con Ngày 08/4/2015 toàn bộ đàn gà mắc bệnh đã được tiêu hủy

Ngày 25/4/2015 đã phát hiện 01 ổ dịch cúm gia cầm tại 01 hộ thuộc thôn Phù Đê, xã Tượng Lĩnh, huyện Kim Bảng, tỉnh Hà Nam Tổng đàn gia cầm 1.606 con, tổng số gia cầm chết và tiêu hủy từ ngày 15/4-25/4/2015 là 1.606 con (bao gồm 1458 con vịt, 96 con gà và 25 con ngỗng) Đến nay chưa xuất hiện thêm ổ dịch mới nào(http://www.cucthuy.gov.vn)

1.2.3 Các phân nhóm (clade) của virus cúm H5N1 ở Việt Nam

Theo dõi phân bố về không gian của các chủng H5N1 tại nước ta nhiều năm qua cho thấy có 3 clade: clade 1; clade 2.3.2 và clade 2.3.4, ngoài ra trong năm 2008 đã phân lập được virus H5N1 clade 7 ở gà khỏe mạnh nhập lậu từ Trung Quốc và clade 5 chỉ xuất hiện trong năm 2006 Hiện clade 1 vẫn lưu hành phổ biến ở các tỉnh phía Nam Clade 2.3.4 hầu như đã biến mất từ năm 2010 Riêng clade 2.3.2 đã biến đổi và phát triển thành 2 nhánh phụ có sự khác biệt lớn

về kháng nguyên Nhánh phụ clade 2.3.2.1A lưu hành rộng khắp các tỉnh miền Bắc, trong khi nhánh phụ clade 2.3.2.1B mới chỉ phát hiện tại một số tỉnh thành như: Nam Định, Thái Bình, Bắc Ninh, Phú Thọ, Thái Nguyên, Nghệ An (http://www.cucthuy.gov.vn)

Tuy nhiên, Tại cuộc họp ban chỉ đạo quốc gia phòng chống dịch cúm gia cầm (CGC) (4/9/2012), Cục Thú y khẳng định, thời gian qua, Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung Ương đã giải trình tự gen đối với các mẫu virus CGC tại các tỉnh phía Bắc Kết quả cho thấy, đã phát hiện một nhánh virus mới là 2.3.2.1C Nhánh virus H5N1 mới này, tuy vẫn thuộc nhánh 2.3.2.1, nhưng đã có sự khác biệt với những virus 2.3.2.1 thuộc nhóm A và B gây bệnh năm 2011 và đầu năm

2012 Về độc lực, nhóm virus mới được đánh giá là có độc lực cao Theo báo cáo của Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung Ương, nhánh virus 2.3.2.1C nhiều khả năng đã xuất hiện từ khoảng tháng 7, tháng 8 năm 2012 Qua giám sát dịch tễ cho thấy ngay sau khi xuất hiện tại phía Bắc, virus này hiện đã lan rất nhanh trên diện rộng, phân bố ở khắp các tỉnh miền Bắc vào tới các tỉnh miền Trung Trong khi

đó, nhánh virus cũ là 2.3.2.1A hiện chỉ xuất hiện rải rác tại các tỉnh phía Bắc, còn nhánh 2.3.2.1B thì hiện đã không còn xuất hiện Kết quả phân tích cũng cho thấy, nhánh virus mới tương tự như virus CGC xuất hiện tại Trung Quốc trong thời gian gần đây Vì vậy rất nhiều khả năng, sự xuất hiện và lan nhanh của nó có sự liên quan đến tình trạng buôn lậu gia cầm loại thải từ Trung Quốc về các tỉnh (http://nongnghiep.vn)

1 3 Virus cúm gia cầm

Hình 1: Sơ đồ cấu trúc virus cúm type A

Căn nguyên gây bệnh là virus cúm type A thuộc họ Orthomyxoviridae,

bao gồm các nhóm virus cúm A, nhóm virus cúm B, nhóm virus cúm C và nhóm Thogovirus

1.3.1 Hình thái và cấu trúc chung của virus cúm type A

Virus có dạng hình cầu hoặc xoắn, đường kính khoảng 80-120 nm, phân

tử lượng khoảng 250 triệu Dalton Virus có vỏ bọc ngoài

Vỏ virus có bản chất là protein, lipid và hydrocarbon Protein bề mặt có cấu trúc từ glycoprotein, bao gồm protein gây ngưng kết hồng cầu HA

(hemagglutinin), protein enzym cắt thụ thể (neurominidase) và protein đệm MA

(matrix) Đó là những gai, mấu có độ dài 10-14nm, đường kính 4-5nm

Nucleocapsid bao bọc nhân của virus là tập hợp nhiều protein phân đoạn,

có cấu trúc đối xứng xoắn, độ dài 130-150nm Hệ gen của virus chỉ chứa duy nhất axit ribonucleic (RNA) một sợi, có cấu trúc là sợi âm, chia thành 8 phân đoạn, mã hoá cho các loại protein của virus là: HA, NA, PB1, PB2, M1, M2, NP,

PA, NS1, NS2 (Phạm Sỹ Lăng và cs, 2004)

HA: là một trimer có bản chất glycoprotein type I có chức năng bám dính

vào thụ thể tế bào

NA: là một tetramer, có nhiệm vụ cắt acid sialic, giúp HA gắn vào thụ thể

và giúp giải phóng RNA từ thể nội bào (endosome) và tạo hạt virus mới

M2: là tetramer có chức năng tạo khe H+ nhằm giúp cởi vỏ virus

M1: tập hợp (assembly) các thành phần của virus và gây ra hiện tượng

nảy chồi để giải phóng virus mới hình thành

PB1, PB2, NP và PA: có nhiệm vụ bảo vệ, sao chép, biên dịch RNA

NS2: kết hợp với M1 có nhiệm vụ chuyển RNA từ trong nhân tế bào

ra ngoài nguyên sinh chất

NS1: là protein không cấu trúc (không là đơn vị tạo thành hạt virus) được tổng hợp trong quá trình nhân lên của virus và có nhiệm vụ cắt xén RNA và kích thích sự phiên mã trong quá trình nhân lên của virus (Nguyễn

Tiến Dũng, 2008)

1.3.2 Kháng nguyên của virus cúm gia cầm

Yếu tố ngưng kết hồng cầu (Hemagglutinin viết tắt là HA) và enzym trung hoà (Neuraminidase viết tắt là NA) là những kháng nguyên có vai trò quan trọng

trong miễn dịch bảo hộ Có tất cả 16 biến thể HA (H1 đến H16) và 9 biến thể NA (N1 đến N9) HA được coi là yếu tố vừa quyết định tính kháng nguyên, vừa quyết định độc lực của virus cúm A (Nguyễn Tiến Dũng, 2008)

Mỗi một hợp thể kháng nguyên HA và NA tạo nên một subtype Về mặt huyết thanh học, giữa các subtype không hoặc rất ít có phản ứng chéo Đây là trở ngại cho việc nghiên cứu vacxin

Các kháng nguyên của virus có thể kích thích cơ thể sinh ra nhiều loại kháng thể, nhưng chỉ có loại kháng thể kháng HA mới có vai trò trung hoà virus cho bảo hộ miễn dịch Một số kháng thể khác, có tác dụng kìm hãm số lượng virus nhân lên Ví dụ, kháng thể kháng NA có tác dụng ngăn cản virus giải phóng, kháng thể M2 ngăn cản chức năng M2 không cho quá trình bao gói virus xảy ra Nhưng thông thường động vật và người chết rất nhanh trước khi hệ miễn dịch sản sinh kháng thể (Phạm Sỹ Lăng và cs, 2004)

1.3.3 Độc lực của virus cúm gia cầm

Đánh giá độc lực của virus cúm bằng phương pháp gây bệnh cho gà 4-6 tuần tuổi: tiêm vào tĩnh mạch cánh 0,2ml nước trứng đã được gây nhiễm virus với tỷ lệ pha loãng 1/10, sau đó đánh giá mức độ bệnh của gà để cho điểm

(chỉ số intra venous pathogenicity index - IVPI) Điểm tối đa là 3 và đó là

virus có độc lực cao nhất Theo quy định của OIE, virus cúm nào có chỉ số IVPI >1.2 trên gà 6 tuần tuổi, hoặc bất cứ virus cúm nào thuộc subtype H5 hoặc H7 có trình tự axit amin trùng với trình tự axit amin của chủng độc lực

cao, đều thuộc loại độc lực cao

Biến chủng virus cúm gây bệnh ở loài chim được phân chia theo tính gây bệnh với 2 mức độ độc lực khác nhau Loại virus có độc lực cao gọi là HPAI

(highly pathogenic avian influenza) thường gây chết 100% gia cầm nhiễm bệnh, sau vài giờ đến vài ngày gây nhiễm Người ta đã phân lập được 19 chủng cúm A thuộc loại HPAI từ loài lông vũ, trong đó, một số đã lây nhiễm và thích ứng gây

bệnh trên người Loại thứ hai có độc lực thấp, gọi là LPAI (Low pathogenic

avian influenza) thường nhiễm ở gia cầm nhưng không hoặc có rất ít biểu hiện lâm sàng và tỷ lệ chết cũng rất thấp Sự bội nhiễm vi khuẩn hoặc các bệnh khác cùng với cúm gà làm cho LPAI trở nên có độc lực hơn và gây bệnh ác liệt hơn Bằng chứng cho thấy các chủng có độc lực thấp LPAI trong quá trình lưu cữu trong thiên nhiên và đàn gia cầm, sẽ đột biến nội gen, hoặc biến đổi tái tổ hợp trở thành các chủng HPAI (Phạm Sỹ Lăng và cs, 2004) So với các virus phân lập trước đó, sự tăng độc tính này là hệ quả của sự gia tăng virus nhân lên trong các

cơ quan nội tạng và sự thích nghi ở diện rộng hơn của virus đối với các cơ quan nội tạng Sự thay đổi độc tính của các virus đang lưu hành có ảnh hưởng lớn tới dịch tễ học của virus và công tác khống chế

1.3.4 Khả năng biến chủng của virus cúm gia cầm

Đột biến điểm (hiện tượng lệch về kháng nguyên - antigen drift) là kiểu

đột biến thường xảy ra, đặc biệt là đối với kháng nguyên H và kháng nguyên N, tạo ra những sự thay đổi nhỏ về trình tự nucleotit của gen mã hoá Kết quả là tạo

ra các phân type cúm khác với phân type ở giai đoạn đầu ổ dịch

Đột biến do tái tổ hợp di truyền (đột biến thay đổi bản chất kháng nguyên

- antigenic shift) là sự tái tổ hợp di truyền xảy ra định kỳ trong đó có sự sắp xếp

lại các nucleotit do sự trộn lẫn 2 bộ gen của virus cúm khác nhau Điều đó đã tạo nên những sai khác cơ bản về bộ gen của virus đời con so với đời bố mẹ Do kiểu gen của virus type A gồm 8 đoạn gen nên từ 2 virus bố mẹ có thể xuất hiện 256

tổ hợp của các virus thế hệ sau (Nguyễn Tiến Dũng, 2008)

Từ đợt dịch cúm đầu tiên tại Việt Nam, virus cúm type A/H5N1 vẫn luôn tồn tại trong môi trường và đã có những biến đổi về mặt kháng nguyên

Theo Nguyễn Tiến Dũng và cộng sự (2004), virus cúm gây bệnh từ cuối năm 2003 đến nay chỉ là một loại duy nhất, có nguồn gốc từ virus cúm lưu hành

ở Trung Quốc, là virus A/Gs/Guangdong/1/96/H5N1 Sự xâm nhập của subtype

virus H5N1 gennotype Z - được WHO ký hiệu là nhánh 1 (clade 1) - từ Trung Quốc đã gây nên các ổ dịch lan tràn chưa từng thấy tại Việt Nam suốt từ Bắc đến Nam Tuy nhiên, đến năm 2007, một nhánh mới của subtype H5N1 là clade 2.3.4 (gennotype G) đã được nhận biết tại nước ta, dần thay thế cho clade 1 tại miền Bắc Trong khi đó virus cúm thuộc clade 1 vẫn tiếp tục gây bệnh tại các tỉnh phía Nam Và đến nửa sau năm 2010, clade 2.3.2 đã thay thế clade 2.3.4 và tiếp tục lưu hành cho đến nay

1.3.5 Sức đề kháng của virus cúm gia cầm

Vì có vỏ bọc là lipid nên virus cúm type A dễ bị bất hoạt bởi các chất hoá học như: formaldehyde, natri hypochlorite 5,52%, axit loãng, xút 2%…Các chất sát trùng thông thường có thể tiêu diệt virus nhanh như formol, virkon, vôi bột, crezin Virus không bền với nhiệt độ, ở 56-600C chỉ vài phút là virus mất độc tính Ở 1000C virus chết ngay, ở 40C trong nước niệu phôi gà virus tồn tại 2 tháng; ở -700C khi làm lạnh nhanh có thể bảo quản virus lâu dài Virus tồn tại trong môi trường pH tối ưu từ 6,5 - 7,9 Trong môi trường axit khả năng gây nhiễm giảm nhanh hơn trong môi trường kiềm Điểm đẳng điện của virus tương ứng với pH = 5,3 Dưới ánh nắng mặt trời chiếu trực tiếp virus chỉ sống được 40 giờ Tia cực tím có thể diệt virus dễ dàng

Trong tự nhiên virus có sức đề kháng cao và tồn tại lâu, virus có thể sống

105 ngày trong dịch tiết (mùa đông) Trong phân: 30 - 35 ngày ở 40C và 7 ngày ở

200C Thịt để tủ lạnh virus tồn tại được 23 ngày

1.3.6 Nuôi cấy và lưu giữ virus cúm gia cầm

Virus cúm gia cầm có thể được nuôi cấy trên phôi gà 9-11 ngày tuổi Ngoài ra có thể nuôi cấy trên tế bào như: tế bào xơ phôi gà CEF (Chicken Embryo Fibroblast) và tế bào thận chó MDCK (Madin- Darby- Canine- Kidney) với điều kiện môi trường nuôi cấy không chứa trypsin

Để bảo quản virus cúm gia cầm có thể giữ virus ở -700C hoặc đông khô sẽ giữ được đặc tính gây bệnh rất lâu (http://www.cucthuy.gov.vn)

Virus H5N1 phân bố rộng rãi và gây chết cho nhiều loài như chim, thủy cầm và động vật có vú (hổ, chó, mèo và người); gây chết cả chim hoang dã - là nơi lưu trữ tự nhiên quan trọng của virus cúm gia cầm

Bệnh có thể phát ra ở gà mọi lứa tuổi với tỷ lệ mắc bệnh và chết khác nhau, phụ thuộc vào loại mầm bệnh, lứa tuổi mắc và độc lức của virus Trong trường hợp virus gây bênh có động lực cao, gà có thể mắc và chết tới 100%

1.4.2 Sự truyền lây

Khi gia cầm nhiễm virus cúm, virus được nhân lên trong đường hô hấp và đường tiêu hoá Sự truyền lây được thực hiện theo 2 phương thức là trực tiếp và gián tiếp:

- Lây trực tiếp do con vật mẫn cảm tiếp xúc với con vật mắc bệnh thông qua các hạt khí dung được bài tiết từ đường hô hấp hoặc qua phân, thức ăn và nước uống bị nhiễm

- Lây gián tiếp qua các hạt khí dung trong không khí với khoảng cách gần hoặc những dụng cụ chứa virus do gia cầm mắc bệnh bài thải qua phân hoặc lây qua chim, thú, thức ăn, nước uống, lồng nhốt, quần áo, xe vận chuyển, côn trùng

Như vậy, virus cúm dễ dàng truyền qua những vùng khác do con người, phương tiện vận chuyển, dụng cụ chăn nuôi Ngoài ra, bệnh còn lây lan từ vùng địa lý này sang những vùng địa lý khác rất xa nhau, do các loài chim hoang dã có khả năng mang virus gây bệnh nhưng không bị bệnh vì vậy có thể gieo rắc mầm bệnh khắp nơi Đây chính là nguồn gốc gây ra những trận đại dịch cúm gia cầm qua các năm

Đối với gia cầm nuôi, nguồn dịch đầu tiên thường thấy là:

- Từ các loài gia cầm nuôi khác nhau ở trong cùng một trang trại hoặc trang trại khác liền kề (như vịt lây sang gà)

- Lây truyền qua trứng

- Từ gia cầm nhập khẩu

- Từ chim di cư, đặc biệt các loài chim nước di trú

- Từ người và các động vật có vú khác (Trần Hữu Cổn và Bùi Quang Anh, 2004)

1.5 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh của virus cúm A trong tế bào vật chủ

Virus cúm A kí sinh nội bào bắt buộc, quá trình xâm nhiễm và nhân lên của virus xảy ra chủ yếu ở các tế bào biểu mô đường hô hấp, đường tiêu hóa của cơ thể nhiễm có những nét đặc trưng như sau:

- Quá trình xâm nhiễm của virus cúm A được mở đầu bằng sự kết hợp của

H và thụ thể thích ứng của nó trên bề mặt các tế bào này, và cuối cùng là giải phóng hệ gen của virus vào trong bào tương của tế bào nhiễm

- Quá trình nhân lên của RNA virus cúm A chỉ xảy ra trong nhân của tế bào, đây là đặc điểm khác biệt so với các virus khác (quá trình này xảy ra trong nguyên sinh chất), và cuối cùng là giải phóng các hạt virus ra khỏi tế bào nhiễm nhờ vai trò của enzyme neuraminidase Thời gian một chu trình xâm nhiễm và giải phóng các hạt virus mới của virus cúm chỉ khoảng vài giờ (trung bình 6 giờ)

Sự tạo thành các hạt virus mới không phá tan tế bào nhiễm, nhưng các tế bào này

bị rối loạn hệ thống tổng hợp các đại phân tử, và rơi vào quá trình chết theo chương trình làm tổn thương mô của cơ thể vật chủ

- Sau khi được giải phóng vào trong bào tương tế bào nhiễm, hệ gen của virus sử dụng bộ máy sinh học của tế bào tổng hợp các protein của virus và các RNA vận chuyển phụ thuộc RNA (RNA-dependent RNA transcription) Phức hợp protein – RNA của virus được vận chuyển vào trong nhân tế bào

- Trong nhân tế bào các RNA hệ gen của virus tổng hợp nên các sợi dương từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus, từ các sợi dương này chúng tổng hợp nên RNA hệ gen của virus mới nhờ RNA-polymerase Các sợi này không được Adenine hóa ở đầu 5’- và 3’-, chúng kết hợp với nucleoprotein (NP) tạo thành phức hợp ribonucleoprotein (RNP) hoàn chỉnh và được vận chuyển ra bào tương

tế bào Đồng thời, các RNA thông tin của virus cũng sao chép nhờ hệ thống enzyme ở từng phân đoạn gen của virus, và được enzyme PB2 gắn thêm 10 - 12 nucleotide Adenin ở đầu 5’-, sau đó được vận chuyển ra bào tương và dịch mã tại lưới nội bào có hạt để tổng hợp nên các protein của virus

- Các phân tử NA và HA của virus sau khi tổng hợp được vận chuyển gắn

lên mặt ngoài của màng tế bào nhiễm nhờ bộ máy Golgi, gọi là hiện tượng “nảy

chồi” của virus NP sau khi tổng hợp được vận chuyển trở lại nhân tế bào để kết

hợp với RNA thành RNP của virus Sau cùng các RNP của virus được hợp nhất

với vùng “nảy chồi”, tạo thành các “chồi” virus gắn chặt vào màng tế bào chủ bởi

liên kết giữa HA với thụ thể chứa sialic acid Các NA phân cắt các liên kết này

và giải phóng các hạt virus trưởng thành tiếp tục xâm nhiễm các tế bào khác (http://d3.violet.vn)

1.6 Triệu chứng và bệnh tích bệnh cúm gia cầm

1.6.1 Triệu chứng

Thời kỳ ủ bệnh từ vài giờ đến 3 ngày Thể quá cấp tính (hay gặp): xảy ra

từ vài giờ đến 24 giờ Thể cấp tính từ 1 đến 4 ngày Thể á cấp tính (ít gặp) có thể tới 7 ngày Bệnh lây lan rất nhanh, gây chết ác tính, chết nhanh và nhiều Biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh khác nhau, nó phụ thuộc nhiều yếu tố: chủng virus gây độc, số lượng virus xâm nhập, loài cảm nhiễm, tuổi, giới tính, chế độ

dinh dưỡng, tình trạng miễn dịch của vật chủ trước khi nhiễm, môi trường, sự cộng nhiễm cùng với các virus, vi khuẩn khác

Triệu chứng điển hình của bệnh cúm thể độc lực cao ở gia cầm là:

- Chết cao đột ngột, tỷ lệ tử vong cao, có khi đến 100%

- Có các biểu hiện ở đường hô hấp như: hắt hơi, thở khò khè, viêm xoang, chảy nhiều nước mắt, nước mũi, dịch nhày màu xám hoặc đỏ xám

- Sưng phù đầu và mặt, mào, tích sưng phù màu tím sẫm

- Xuất huyết dưới da (đặc biệt dưới da chân), tím tái

- Triệu chứng tiêu hoá: ỉa chảy

- Triệu chứng thần kinh: run rẩy, chệnh choạng, co giật, mất thăng bằng, vận động xoay tròn

Trong một số trường hợp, bệnh bùng phát nhanh, trước khi gia cầm chết không thấy có biểu hiện lâm sàng (Trần Hữu Cổn và Bùi Quang Anh, 2004) Gia cầm bị nhiễm các chủng virus cúm có độc lực yếu hơn cũng có những triệu chứng tương tự, với mức độ nhẹ hơn và tỷ lệ chết thấp hơn

Các loài thuỷ cầm (vịt, ngan, ngỗng ) ít khi biểu hiện triệu chứng, nhưng nếu phát bệnh thì viêm xoang, viêm mí mắt, viêm đường hô hấp, tỷ lệ chết cao

1.6.2 Bệnh tích

Khi mổ khám gia cầm chết do cúm có thể thấy các bệnh tích đặc trưng:

- Mào, tích sưng to tím sẫm, phù mí mắt Phù keo nhày và xuất huyết dưới

da đầu, cơ đùi Xuất huyết thành dải, vệt dưới da chân

- Viêm cata và viêm tơ huyết niêm mạc khí quản, niêm mạc đường tiêu hoá Khí quản phù, chứa nhiều dịch nhầy

- Tăng sinh túi khí, viêm tơ huyết tương mạc của các cơ quan nội tạng như: màng bao tim, màng gan, màng ruột xuất huyết mỡ vành tim

- Ruột viêm cata và xuất huyết Nội tạng xuất huyết, có thể hoại tử

- Lách, gan, thận, phổi sưng to, hoại tử Viêm ống dẫn trứng, vỡ trứng non Bệnh gây ra do các chủng virus có độc lực cao thì thấy tụ huyết, xuất huyết ở da, gan, thận, tim, lách, phổi Những gia cầm chết đột ngột không có các bệnh tích này (Phạm Sỹ Lăng và cs, 2004)

1.7 Phương pháp chẩn đoán bệnh cúm gia cầm

1.7.1 Chẩn đoán dựa vào đặc điểm dịch tễ, triệu chứng và bệnh tích

Bệnh xảy ra dồn dập, nhanh chóng thành dịch Gà mọi lứa tuổi đều mắc

nhưng hay gặp nhất là gà từ 4 đến 6 tuần tuổi

Triệu chứng điển hình: thở khó, viêm tịt mũi, sưng đầu, phù mặt, thuỷ

thũng, xuất huyết, hoại tử mào, tích, xuất huyết dưới da thành vệt đỏ

Bệnh tích điển hình: thịt thâm, viêm dính phúc mạc, cơ quan nội tạng bị

teo, viêm xuất huyết và hoại tử buồng trứng, ống dẫn trứng viêm, vỡ trứng non

1.7.2 Chẩn đoán trong phòng thí nghiệm

Chẩn đoán virus học: nuôi cấy, phân lập virus trên trứng gà có phôi ấp 9-11 ngày hoặc trên môi trường tế bào thận chó MDCK Giám định virus trong

dịch nuôi cấy bằng các phản ứng ngưng kết hồng cầu - HA (hemagglutination), phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu - HI (Hemoglutination Inhibition assay) Giám định virus bằng kỹ thuật Real time RT-RCR (Real time reverse-

transcription polymerase chain reaction ) : cho phép xác định virus với lượng rất

nhỏ Khẳng định chắc chắn subtype H5 và H7 căn cứ vào Primer đặc thù

Chẩn đoán huyết thanh học: dùng phản ứng HI để phát hiện và xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh gia cầm

Ngoài ra có thể dùng phản ứng ELISA để phát hiện kháng thể

1.8 Đáp ứng miễn dịch chống virus cúm gia cầm

1.8.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu

Hệ thống miễn dịch không đặc hiệu là hàng rào phòng thủ đầu tiên chống lại bất cứ vật ngoại lai nào xâm nhập vào cơ thể Chức năng này được thể hiện qua các cơ chế:

- Các hàng rào vật lý, hoá học: gồm da, màng nhầy, khu hệ sinh vật thường trú, các lông mao, axit trong dạ dày và các men tiêu hoá protein

- Các yếu tố kháng khuẩn có trong dịch tiết của cơ thể: gồm các Enzym, Interferon γ, các yếu tố gây hoại tử mô bào, tế bào thực bào (Nguyễn Như Thanh

và Lê Thanh Hòa, 1997)

Khi virus cúm xâm nhập vào cơ thể kí chủ chủ yếu qua đường hô hấp,

được nhân lên trong tế bào trên bề mặt ống hô hấp, lớp tế bào này có tác dụng hạn chế sự lây truyền của virus vào các cơ quan khác, song lại làm tăng nguy cơ lây truyền virus sang các vật chủ khác khi virus tập trung ở đầu trên ống hô hấp

Ở ống hô hấp có các cơ chế bảo vệ, ngăn ngừa sự xâm nhập của virus cúm như lớp nhầy, lớp lông mao, và các thành phần ức chế là protease

Đáp ứng không đặc hiệu còn có sự tham gia của các tế bào giết tự nhiên (Natural Killer cell - NK) là nhóm tế bào lympho hạt lớn không đồng nhất: gồm

CD3- (CD: Cluster of Diffrenciation - cụm biệt hóa), CD16+, CD56+ có khả

năng giết tế bào nhiễm virus Tế bào NK có vai trò quan trọng phòng vệ sớm do hoạt động của các tế bào này đạt cao nhất sau 1-2 ngày nhiễm

Đại thực bào gồm đại thực bào tự do trong phế nang và màng bụng, đại thực bào cố định trong hạch lympho, lách, gan, tế bào mô và tế bào thần kinh đệm làm nhiệm vụ thực bào, cũng tham gia vào đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu

1.8.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu

1.8.2.1 Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào

Trong miễn dịch qua trung gian tế bào, có sự tham gia của các tế bào lympho T, B và các đại thực bào Tế bào T nhận biết kháng nguyên lạ sau khi

nó được các tế bào trình diện kháng nguyên xử lý và trình diện Tế bào B thành thục trong túi Fabricius nhận biết các kháng nguyên hoà tan và trình diện chúng trên bề mặt Các tế bào TCD4 nhận biết các tế bào có kháng

nguyên gắn với MHC (Major Histocompability Complex) lớp II, tiết ra các

lymphokin kích thích các tế bào B hoạt hoá thành tương bào sản xuất kháng thể tiêu diệt kháng nguyên Các tế bào TCD8 (T gây độc) có tác dụng gây dung giải các tế bào có mang kháng nguyên gắn với MHC lớp I Các tế bào T diệt tự nhiên có khả năng nhận biết nhiều loại kháng nguyên ngoại lai và kháng nguyên của chính cơ thể vật chủ đã bị biến đổi, đóng vai trò quan trọng trong tuần tra miễn dịch và tiêu huỷ các tế bào lạ (Nguyễn Như Thanh và Lê Thanh Hòa, 1997)

1.8.2.2 Đáp ứng miễn dịch dịch thể

Các globulin miễn dịch (Immuno globulin-Ig) hay kháng thể được tiết ra

bởi các tế bào lympho B (sau khi được hoạt hoá trở thành tương bào) là thành phần chính của miễn dịch dịch thể Kháng thể có trong các dịch của cơ thể và được định lượng trong huyết thanh hoặc huyết tương Ở gia cầm có các lớp Ig chính là IgM, IgY, IgG và IgA

Một đáp ứng miễn dịch điển hình của gia cầm bắt đầu bằng sự sản xuất IgM Sau đó đáp ứng miễn dịch chuyển sang sản xuất IgG Đây là kháng thể chính sinh ra trong miễn dịch thứ phát và chiếm ưu thế trong máu của gia cầm Kháng thể liên kết một cách đặc hiệu với kháng nguyên và trung hoà kháng nguyên, đặc biệt đối với các kháng nguyên là virus Những virus bị trung hoà không thể bám vào điểm tiếp nhận trên bề mặt của tế bào đích và bởi vậy bị ngăn cản tái tổ hợp (Nguyễn Như Thanh và Lê Thanh Hòa, 1997)

Trí nhớ miễn dịch và đáp ứng miễn dịch thứ phát: đáp ứng miễn dịch

tiên phát xuất hiện khi tiếp xúc lần đầu với kháng nguyên, có độ dài miễn dịch ngắn, kết quả là tạo ra một nhóm các tế bào lympho T nhớ có tác dụng làm cho đáp ứng miễn dịch khi phơi nhiễm lần sau với cùng loại kháng nguyên được tăng cường mạnh hơn Đáp ứng miễn dịch này có sự tham gia ngay từ đầu của các tế bào T nhớ Kháng thể được sản xuất ra nhanh hơn, nhiều hơn và đáp ứng miễn dịch kéo dài hơn so với đáp ứng miễn dịch tiên phát Cơ thể gia cầm tạo được trạng thái miễn dịch đối với kháng nguyên đó và trí nhớ miễn dịch được duy trì Đây chính là cơ sở của việc tiêm phòng vacxin cúm và nhắc lại sau một thời gian ở gia cầm

1.9 Phòng chống bệnh cúm gia cầm

Phòng chống dịch cúm gia cầm là chương trình tổng hợp của công tác giám sát, chẩn đoán bệnh, kiểm dịch vận chuyển, giết mổ gia cầm kết hợp với các biện pháp an toàn sinh học tăng cường, tiêu huỷ, tiêu độc, khử trùng các ổ dịch, đồng thời tuyên truyền, giáo dục người dân về dịch bệnh Tiêu huỷ toàn đàn gia cầm bị bệnh và đàn gia cầm có tiếp xúc với đàn bị bệnh là biện pháp bắt buộc

để tránh bệnh lây lan (Trần Hữu Cổn và Bùi Quang Anh, 2004)

Hiện nay, việc sử dụng vacxin được coi là cách để làm giảm thiệt hại do bệnh cúm gia cầm gây ra đối với ngành chăn nuôi gia cầm ở Châu Á Song điều

này có thể dẫn đến sự tiến hoá của các chủng virus đang lưu hành thành các chủng mới (Phạm Sỹ Lăng và cs, 2004) Do đó, sử dụng vacxin phải kết hợp chặt chẽ với giám sát sau tiêm phòng, giám sát lưu hành virus ở các đàn đã được tiêm phòng để có biện pháp xử lý kịp thời

- Vacxin vô hoạt đồng chủng: hiệu lực của vacxin này trong việc ngăn

ngừa bệnh và giảm thải lượng virus ra ngoài môi trường đã được chứng minh qua các thử nghiệm Tuy nhiên nhược điểm của các loại vacxin này là không phân biệt được gia cầm đã tiêm vacxin với những con tiếp xúc với mầm bệnh, trừ những con chưa tiêm phòng được nhốt riêng ở trong chuồng Ví dụ: Vacxin H5N1 của hãng Weike (Trung Quốc)

- Vacxin vô hoạt dị chủng: loại vacxin này có đặc điểm là chủng virus

vacxin có kháng nguyên H giống với chủng virus trên thực địa nhưng có kháng nguyên N dị chủng Đáp ứng miễn dịch sinh ra bởi nhóm kháng nguyên H đồng chủng, trong khi kháng thể chống N sản sinh ra bởi virus thực địa có thể coi như chất đánh dấu sự lây nhiễm trên thực địa Ví dụ: Vacxin vô hoạt dị chủng H5N2 của Intervet (Hà Lan), vacxin H5N2 của Weike (Trung Quốc)

Trong hai loại vacxin đồng chủng và dị chủng, mức độ bảo hộ lâm sàng và việc làm giảm thải trừ virus ra môi trường của vacxin đồng chủng cải thiện hơn,

do cùng một khối lượng vacxin thì vacxin đồng chủng có nhiều kháng nguyên hơn Việc lựa chọn vacxin dị chủng cho phép áp dụng chiến lược DIVA

(Differenciating Infected from Vacxination animals) nhằm phân biệt con nhiễm

bệnh tự nhiên với con tiêm vacxin (Tô Long Thành, 2007)

1.10.1.2 Vacxin tái tổ hợp

Vacxin tái tổ hợp cho phép phân biệt giữa động vật nhiễm bệnh và động vật được tiêm vacxin, vì chúng không sản sinh kháng thể chống lại kháng nguyên nucleoprotein phổ biến ở tất cả các virus cúm gia cầm Chỉ những động vật nhiễm bệnh trên thực địa mới tạo ra kháng thể nhóm A (nucleoprotein) và phát hiện ra kháng thể này qua phản ứng kết tủa ngưng kết kép trên thạch hoặc phản ứng ELISA Việc sử dụng các vacxin này cũng được giới hạn với những loài mà virus đích sẽ nhân lên hoặc chỉ giới hạn trong đàn gà có huyết thanh âm tính đối với virus đích Ví dụ: vacxin sống TROVAC (virus đậu tái tổ hợp cúm H5) của

Merial và H5N1 của Weike (Trung Quốc)

1.10.2 Tình hình sử dụng vacxin cúm gia cầm trên thế giới

Mặc dù có một số loại vacxin đã được nghiên cứu và thử nghiệm trong phòng thí nghiệm về khả năng ứng dụng ngoài thực địa nhưng chỉ có 2 loại vacxin được cấp giấy phép và được sử dụng đối với gia cầm: các loại vacxin cúm toàn thân vô hoạt và vacxin vector đậu gà tái tổ hợp với gen AI H5 nhận từ virus cúm của gà tây

Sử dụng vacxin đã được sử dụng trên thực địa chưa được các thông báo cụ thể, nhưng có một số nguồn thông tin cho rằng Mexico đã sử dụng 1 tỷ 300 triệu liều virus vô hoạt và 850 triệu liều vacxin tái tổ hợp đậu gà trong chương trình sử dụng vacxin chống bệnh cúm từ đầu tháng 1/1995 và đã thanh toán được bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao do virus H5N2 và tháng 6/1995, mặc dù virus H5N2 chủng độc lực thấp vẫn lưu hành Indonexia cũng sử dụng vacxin AI H5 vô hoạt

Từ năm 1995, Pakistan cũng sử dụng vacxin phòng cúm ở cả ổ dịch H7N3 thể độc lực cao Các vacxin vô hoạt chế từ chủng virus H9N2 độc lực thấp đã và đang được sử dụng ở một số nước châu Á, vùng Cận Đông và Đông Âu Gần đây, vacxin vô hoạt nhũ dầu H7 đã được dùng cho các vùng nguy cơ cao ở phía Bắc Italia và tại một công ty nuôi gà con một ngày tuổi ở Mỹ

Trung Quốc là nước sử dụng nhiều vacxin cúm nhất Trung Quốc đã có bản tường trình về kết quả của các loại vacxin đang được sử dụng tại nước này, bao gồm:

- Vacxin vô hoạt chủng H5, N-28: được phê chuẩn từ tháng 12/2003 và được sử dụng rộng rãi ở Trung Quốc trong các ổ dịch cúm gia cầm thể độc lực cao vào đầu năm 2004

- Vacxin vô hoạt virus cúm tái tổ hợp (subtype H5N1, chủng Re-1): được phê chuẩn tháng 1/2005 Vacxin được đánh giá là rất có hiệu quả trong tạo miễn dịch chống cúm với hiệu giá kháng thể cao và thời gian bảo hộ dài hơn Thuỷ cầm được tiêm vacxin này không bị nhiễm và bài thải virus cúm

- Vacxin sống virus đậu tái tổ hợp phòng cúm gia cầm H5: được phê chuẩn tháng 1/2005 và được nhiều nước sử dụng như Trung Quốc, Mexico sử dụng loại vacxin này có thể phân biệt được miễn dịch do tiêm phòng vacxin hay

bị nhiễm tự nhiên

- Hiện Trung Quốc đã và đang đưa vào sử dụng vacxin dạng vô hoạt nhũ dầu H5N1 chủng Re-5 và đã đưa ra thị trường một loại vacxin mới là Re-6

1.10.3 Tình hình sử dụng vacxin cúm gia cầm tại Việt Nam

Từ tháng 7/2005, “Dự án sử dụng vacxin nhằm khống chế và thanh toán bệnh cúm gia cầm” đã triển khai tại Việt Nam Nước ta đã tiến hành tiêm phòng thử nghiệm các loại vacxin cúm gia cầm ngoại nhập trên địa bàn tỉnh Nam Định

và Tiền Giang Sau đó đã triển khai tiêm phòng trên địa bàn cả nước và thực hiện liên tục qua các năm Mỗi năm có 2 đợt tiêm phòng vào tháng 4-5 và tháng 9-10, trước thời điểm dịch cúm gia cầm có nguy cơ bùng phát cao nhất Một số loại vacxin được sử dụng ở Việt Nam như:

- Vacxin nhũ dầu vô hoạt H5N2 (Trung Quốc): là loại vacxin dị chủng bất hoạt, sử dụng chủng virus A/Turkey/England/N28/73 (H5N2)

- Vacxin vô hoạt dạng nhũ dầu H5N1 (Trung Quốc): là loại vacxin đồng chủng bất hoạt, sử dụng chủng virus A/Harbin/Re-1/2003

- Vacxin Nobilis Influenza H5 (Hà Lan): đây là loại vacxin dị chủng, sử dụng chủng virus A/chicken/Mexico/232/94/CPA

- Vacxin Trovac AIV H5 (vacxin đậu-cúm dạng sống, đông khô): là vacxin chứa virus đậu gà sống làm vectơ có mang gen virus cúm gia cầm chủng

A, sử dụng chủng A/Turkey/Treland/1378/83

- Hiện Việt Nam đã và đang nhập, sử dụng vacxin dạng vô hoạt nhũ dầu H5N1 chủng Re-5 của Trung Quốc

- Nhưng hiện nay việc sử dụng vacxin đang gặp những khó khăn lớn do virus cúm gia cầm đã biến đổi gen và xuất hiện các nhánh virus mới

- Hiện Việt Nam đang thí nghiệm để đưa vào sử dụng một loại vacxin mới

là vacxin dạng vô hoạt nhũ dầu H5N1 chủng Re-6 của Trung Quốc

1.10.4 Những điểm chú ý khi sử dụng vacxin cúm gia cầm

Theo quan điểm của OIE, FAO, thì vacxin nên được sử dụng trong một chiến lược toàn diện phòng chống bệnh cúm gia cầm, bao gồm 5 bước là: an toàn sinh học, nâng cao nhận thức người dân, chẩn đoán và giám sát, loại bỏ gia cầm nhiễm bênh và sử dụng vacxin (Lê Văn Năm, 2007)

Trước khi sử dụng vacxin cần phải lưu ý những vấn đề sau:

- Vacxin sử dụng phải cùng subtype H và phải được chứng minh trên bản động vật là có đủ khả năng bảo hộ chống lại sự xâm nhập của virus thực địa

- Vacxin cần phải được sản xuất theo công nghệ đã tiêu chuẩn hoá để đảm bảo có một vacxin hiệu quả và phù hợp về chủng virus

- Cần có các hoạch định trước về bảo quản tốt vacxin, phân phối sử dụng vacxin hợp lý

- Đảm bảo được việc giám sát huyết thanh học và virus học để xác định virus cường độc có lưu hành trong đàn gia cầm được dùng vacxin hay không

- Phải có một kế hoạch loại trừ để phòng tránh việc sử dụng vĩnh viễn

1.11 Nghiên cứu trong nước về bệnh cúm gia cầm

1.11.1 Kết quả nghiên cứu nguồn gốc virus cúm gia cầm H5N1 tại Việt Nam

Dịch cúm gia cầm tại Việt Nam là do một loại virus duy nhất (cả về không gian và thời gian) gây ra, có nghĩa là dịch có nguồn gốc từ một ổ dịch ban đầu, sau

đó lây lan ra cả nước Virus cúm gia cầm tại Việt Nam có nguồn gốc từ virus cúm lưu hành tại Trung Quốc (Nguyễn Quang Dũng và cs, 2004)

1.11.2 Kết quả nghiên cứu về sự lưu hành virus cúm gia cầm tại Việt Nam

1 Virus cúm gia cầm H5N1 gây bệnh cho gia cầm Việt Nam có nguồn gốc

từ Trung Quốc và thuộc genotype Z

2 Trong các năm tiếp theo của ổ dịch, virus vẫn tiếp tục xâm nhập từ Trung Quốc vào Việt Nam, có thể thông qua đường nhập lậu gia cầm Loại virus xâm nhập về sau này, ngoài genotype Z có cả genotype G, loại virus chuyên lưu hành tại tại Quảng Tây và Hồ Nam (Trung Quốc)

3 Virus lưu hành tại Việt Nam luôn biến đổi cấu trúc di truyền Chỉ riêng đoạn gen tại vị trí tách (cleavage site) đã có 5 cấu trúc khác nhau

4 Sự biến đổi di truyền của virus cúm H5N1 tại Việt Nam đã xảy ra tại vị trí thụ thể của virus với tế bào

5 Các loại virus lưu hành tại phía nam đã phát triển thành một nhóm riêng (nhóm S) và khác với nhóm virus (nhóm N) lưu hành tại phía Bắc

6 Virus cúm H5N1 có tính kháng nguyên rất đa dạng từ khi xuất hiện tại Việt Nam và đã xuất hiện một chủng có tính kháng nguyên hoàn toàn khác và được phân vào nhóm kháng nguyên HA clade 2 hoặc genotype G

7 Đàn gia cầm của Việt Nam hiện không chỉ có virus H5N1 mà còn có rất nhiều virus cúm A thuộc nhiều subtype khác đang lưu hành với tỷ lệ khá cao (Trương Văn Dung, 2008)

1.11.3 Kết quả nghiên cứu các phân nhóm (clade) virus cúm H5N1 tại Việt Nam

- Ở khu vực nam bộ, clade 1 có thời gian tồn tại rất lâu suốt từ năm 2003

đến nay, chỉ phát hiện thấy 2 mẫu virus clade 2.3.4

- Ở phía Bắc, gần như luôn có sự thay đổi các của các clade virus cúm mới: năm 2007 clade 2.3.4 thay thế clade 1, và đến nửa sau năm 2010, clade 2.3.2 đã thay thế clade 2.3.4 và tiếp tục lưu hành cho đến nay Hiện nay, clade virus mới 2.3.2 đã biến đổi và phát triển thành 2 clade phụ có sự khác biệt lớn về kháng nguyên: clade phụ 2.3.2.1A lưu hành rộng rãi ở khắp các tỉnh Trong khi đó clade2.3.2.1B mới chỉ phát hiện tại một số tỉnh thành như: Nam Định, Thái Bình, Bắc Ninh, Phú Thọ, Thái Nguyên, Nghệ An (http://www.cucthuy.gov.vn) Đến khoảng tháng 7, tháng 8 năm 2012 đã xuất hiện nhánh virus 2.3.2.1C, sau khi xuất hiện tại phía Bắc, virus này hiện đã lan rất nhanh trên diện rộng, phân bố ở khắp các tỉnh miền Bắc vào tới các tỉnh miền Trung (http://nongnghiep.vn)

CHƯƠNG II NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng và nguyên liệu

- Gà 1 tuần tuổi đủ tiêu chuẩn thí nghiệm thuộc giống Lương Phượng

- Vacxin cúm gia cầm: H5N1 chủng Re-1 và Re-5 do Trung Quốc sản xuất

- Virus: virus H5N1 thuộc clade 2.3.2.1A

- Kháng nguyên chuẩn H5N1 để kiểm tra đáp ứng kháng thể trước và sau

khi công cường độc bằng phương pháp ngăn trở ngưng kết hồng cầu

(HI-Hemoglutination Inhibition assay).

- Kit Qiagen Rneasy Extraction cat (#) 74104 50 prep chiết tách RNA

- Kit Invitrogen Superscript One-step RT-PCR và primer/probe để kiểm tra

sự bài thải virus sau khi công cường độc bằng phương pháp Real time RT-PCR

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của gà được tiêm vacxin H5N1 chủng Re-1

và Re-5 của Trung Quốc qua kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh sau

khi tiêm phòng bằng phản ứng HI (Hemoglutination Inhibition assay)

- Đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin qua thí nghiệm công cường độc bằng virus cúm gia cầm H5N1 clade 2.3.2.1A

- Đánh giá độc lực của virus đối với gia cầm mẫn cảm (gà thuộc lô đối chứng)

- Đánh giá mức độ bảo hộ lâm sàng đối với gà được tiêm vacxin qua quan sát lâm sàng

- Đánh giá tác dụng giảm bài thải virus ra môi trường qua định lượng virus bài thải trong mẫu dịch ngoáy (swab) hầu họng bằng phản ứng Real-time

RT-PCR (Real-time reverse-transcription polymerase chain reaction)

- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của gà chống lại virus cường độc qua kiểm tra hiệu giá kháng thể trong huyết thanh gà sống sót sau khi công

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu và bảo quản mẫu

- Dịch ngoáy họng, khí quản: đưa tăm bông vào sâu trong họng rồi ngoáy thu lấy dịch nhày, sau đó từ từ rút tăm bông ra rồi đưa vào ống chứa dung dịch bảo quản, cắt que vừa với chiều dài của ống, đóng kín nắp

- Mẫu huyết thanh: lấy 3-5ml máu tĩnh mạch cánh gia cầm vào ống nghiệm, để nghiêng, chờ máu đông chắt lấy huyết thanh Mẫu huyết thanh có thể

để ở nhiệt độ 40C trong 1 tuần, nếu bảo quản lâu hơn nên giữ ở nhiệt độ -200C

- Mẫu tổ chức bệnh phẩm: lấy kéo cắt phần tổ chức cần lấy cho vào ống lưu mẫu hoặc túi nilon sạch, bảo quản lạnh Mẫu tổ chức có thể cho vào dung dịch bảo quản Bệnh phẩm sau khi cho vào dung dịch vận chuyển có thể bảo quản ở 40C từ 1-2 ngày, nếu bảo quản lâu hơn nên giữ ở nhiệt độ -200C

2.3.2 Phương pháp mổ khám gia cầm

Kiểm tra bên ngoài: thể trạng cơ thể, da, lông, các lỗ tự nhiên, khớp, các tổn thương

Mổ khám kiểm tra bên trong:

- Nhúng ướt lông gà bằng nước có pha dung dịch sát trùng Đặt gà nằm ngửa, dùng kéo hoặc dao cắt da giữa vùng bụng và bẹn hai bên chân, bẻ chân sang hai bên đồng thời kéo da bộc lộ hai cơ đùi Cắt da vùng giữa lỗ huyệt và xương lưỡi hái, một tay cầm hai chân, tay kia cầm phần da trên xương hái kéo ngược lên tới tận vùng diều bộc lộ cơ ngực Kiểm tra cơ ngực, cơ đùi, xương lưỡi hái về tình trạng khô cơ, xuất huyết, biến dạng v.v

- Dùng kéo hoặc dao rạch da từ phần diều lên tận phía dưới mỏ bộc lộ diều, thực quản, khí quản, tuyến thymus để kiểm tra bên ngoài

- Dùng kéo cắt ngang phần cơ giữa lỗ huyệt và xương lưỡi hái, cắt tiếp lên phía trên hai bên sụn sườn qua xương đòn, xương quạ, loại những tổ chức dính, nhấc bỏ xương lưỡi hái ra ngoài, bộc lộ xoang bụng và xoang ngực Quan sát các túi khí và phía ngoài các cơ quan nội tạng trong xoang bụng và xoang ngực

- Lấy máu tim và các tổ chức nội tạng cho nuôi cấy xét nghiệm

- Lấy gan, mật, lách ra để kiểm tra màu sắc, kích thước, hoại tử v.v

Kiểm tra tuyến tuỵ

- Cắt đứt phía trên dạ dày tuyến, lật toàn bộ dạ dày, ruột ra phía sau để kiểm tra sau tránh nhiễm bẩn dụng cụ và các tổ chức khác

- Kiểm tra toàn bộ cơ quan sinh dục (buồng trứng, ống dẫn trứng, dịch hoàn, ống dẫn tinh) Kiểm tra thận, ống dẫn niệu

- Kiểm tra túi Fabricius bên ngoài và bên trong về hình dáng, kích thước, màu sắc, dịch

- Dùng kéo mở một bên cạnh mỏ quan sát xoang miệng Cắt ngang mỏ trên, kiểm tra xoang Cắt dọc thực quản thẳng tới diều kiểm tra dịch, chất chứa và mùi bên trong Cắt dọc khí quản kiểm tra dịch, xuất huyết, hoại tử bên trong

- Kiểm tra xoang bao tim, dịch bên trong, mở tim kiểm tra cơ, các xoang

và van v.v Tách phổi khỏi các xương sườn kiểm tra về màu sắc, độ xốp

- Bộc lộ dây thần kinh cánh ở trước xương sườn thứ nhất, dây thần kinh hông ở trong cơ đùi hoặc trong xoang chậu dưới thận để kiểm tra

- Rạch khớp gối kiểm tra dịch, bẻ xương đùi kiểm tra độ cứng mềm, chẻ dọc xương đùi kiểm tra tuỷ

- Cắt đầu gia cầm ở đốt sống atlas, lột da, dùng kéo cắt xương sang hai bên từ lỗ chẩm đến cạnh trước xương đỉnh, lật hộp sọ bộc lộ não Dùng kéo cong

vô trùng tách màng não, cắt các dây thần kinh lấy não

- Dùng kéo rạch ruột rạch từ dạ dày tuyến xuống tận hậu môn, kiểm tra các tổn thương, hoại tử, xuất huyết

- Dùng dụng cụ vô trùng lấy mẫu bệnh phẩm cho xét nghiệm Xử lý hấp tiêu độc xác gia cầm (Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn, 2005)

2.3.3 Phương pháp phát hiện kháng nguyên

Phản ứng ngưng kết hồng cầu-HA (hemagglutination assay) dùng để kiểu

tra hiệu giá kháng nguyên và chuẩn độ kháng nguyên dùng trong phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (chi tiết xem phụ lục 1)

2.3.4 Phương pháp phát hiện kháng thể

Phát hiện kháng thể và xác định hiệu giá kháng thể bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu-HI (chi tiết xem phụ lục 2)

2.3.5 Phương pháp Real-time RT-PCR (Real-time reverse-transcription polymerase chain reaction)

*Chiết tách ARN bằng kit Rneasy Mini Kit Qiagen

- Cho 600µl dung môi RLT vào ống 1,5ml

- Lấy 200µl mẫu (dịch nổi) vào ống có chứa dung dịch RLT

- Lắc đều (Votex) trong 15 giây

- Cho 400µl cồn Ethanol 100% (cồn tuyệt đối)

- Chuyển cột lọc sang ống thu mới

- Rửa lần 2: lấy 500µl dung dịch RPE nhỏ vào cột lọc, ly tâm ở tốc đô

10000 vòng trong 15 giây

- Chuyển cột lọc sang ống thu mới

- Cho tiếp 500 µl dung dịch RPE vào cột lọc ly tâm 10000 vòng trong 15 giây

- Chuyển cột lọc vào ống thu mới

- Ly tâm cột lọc 12000 vòng/phút trong 2 phút

- Thu RNA: chuyển cột lọc sang ống 1,5ml mới

- Cho 50µl nước sạch RNase vào cột lọc Ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút

- Ly tâm 10000 vòng trong 1 phút

- Bỏ cột lọc, hút nước có chứa ARN sang ống 1,5ml (ống sạch Rnase) mới

- Cất mẫu ARN ở 40C trong ngày nếu chạy phản ứng PCR ngay và cất ở

-200C để lưu mẫu trong thời gian dài

*Tiến hành phản ứng Real-time RT-PCR

Khái quát Real-time PCR (Real-time polymerase chain reaction)