thu nhận và xác định đặc tính của enzyme chitosanase kỹ thuật từ vi khuẩn bacillus licheniformis nn1

KCTC 0377BP 9 2.5: Nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của chitosanase thu được từ một số vi 4.5: Hoạt tính của enzyme chitosanase trước và sau khi cô đặc 42 4.6: Hoạt tính, hàm lượng p

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ LƯƠNG

THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME

CHITOSANASE KỸ THUẬT TỪ VI KHUẨN

BACILLUS LICHENIFORMIS NN1

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2015

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

- -

NGUYỄN THỊ LƯƠNG

THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME

CHITOSANASE KỸ THUẬT TỪ VI KHUẨN

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa hề được sử dụng

Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cảm

ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được ghi rõ nguồn gốc

Hà nội, ngày tháng năm 2015

Học viên

Nguyễn Thị Lương

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng của bản thân, tôi còn nhận được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ của nhiều tổ chức và cá nhân

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy PGS.TS Ngô Xuân Mạnh,

bộ môn Hóa sinh – Công nghệ sinh học Thực phẩm, khoa Công nghệ Thực phẩm, học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình dìu dắt và hướng dẫn chuyên môn cho tôi trong thời gian thực hiện và hoàn chỉnh luận văn

Tôi xin cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Thực phẩm, khoa Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp

Đặc biệt, con xin bày tỏ tình cảm sâu sắc nhất đến bố mẹ và những người thân trong trong gia đình đã luôn luôn quan tâm, lo lắng và tạo điều kiện tốt nhất cho con trong quá trình học tập, để con hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này

Mặc dù đã rất cố gắng nhưng bản luận văn này không tránh khỏi những thiếu sót và hạn chế Vì vậy, tôi kính mong nhận được sự quan tâm và đóng góp ý kiến của quý thầy cô để bản luận văn này được hoàn thiện hơn

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà nội, ngày tháng năm 2015

Học viên

Nguyễn Thị Lương

2.1.3 Cấu tạo và khối lượng phân tử enzyme chitosanase 6

2.1.5 Tính đặc hiệu cơ chất của enzyme chitosanase 8 2.1.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH tới sự hoạt động của enzyme chitosanase 10 2.1.7 Ảnh hưởng của ion kim loại và các chất phản ứng khác tới sự hoạt động của

2.1.8 Ứng dụng của enzyme chitosanase và chitosan oligosaccharide 12

2.2.1 Nguồn thu nhận enzyme chitosanase đã dùng trong sản xuất chitosanase 15

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase 16

2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme chitosanase 20 2.3.1 Tình hình nghiên cứu enzyme chitosanase trên thế giới 20 2.3.2 Tình hình nghiên cứu enzyme chitosanase trong nước 21 PHẦN III VẬT LIỆU – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.3.1 Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1 25 3.3.2 Xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật 28 3.3.3 Phương pháp xác định hoạt tính enzyme chitosanase kỹ thuật 30

4.1 Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1

4.1.1 Kết quả thực nghiệm thăm dò đơn yếu tố 34

4.1.2 Mô hình hóa và tối ưu hóa quá trình nuôi cấy từ vi khuẩn Bacillus

4.1.4 Xác định đường cong động học sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus licheniformis

4.2 Xác định điều kiện thu nhận chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis

4.2.3 Tủa phân đoạn enzyme chitosanase bằng muối amoni sunphate 43

4.2.4 Quy trình thu nhận enzyme chitosanase kỹ thuật từ vi khuẩn Bacillus

DANH MỤC BẢNG

2.1: Các chủng vi sinh vật đại diện cho mỗi họ enzyme 4 2.2: Phân loại Chitosanase dựa vào sự phân cắt đặc hiệu của cơ chất 5 2.3: Khối lượng phân tử của một số enzyme chitosanase 7

2.4: Cơ chất đặc hiệu của enzyme chitosanase từ Bacillus sp KCTC 0377BP 9 2.5: Nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của chitosanase thu được từ một số vi

4.5: Hoạt tính của enzyme chitosanase trước và sau khi cô đặc 42 4.6: Hoạt tính, hàm lượng protein và hoạt tính riêng của enzyme chitosanase trước

4.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính của enzyme chitosanase 47 4.8: Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính của enzyme chitosanase 48 4.9: Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính enzyme chitosanase 49

DANH MỤC HÌNH

2.1: Cấu trúc protein 3D của enzyme chitosanase thu được từ Bacillus

3.1: Enzyme chitosanase thuỷ phân chitosan tạo các oligosaccharide 30 3.2: Phản ứng 3,5–dinitrosalicylic acid bị khử tạo thành 3–amino,5–nitrosalicylic acid 30 4.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quá trình sinh tổng hợp chitosanase từ vi khuẩn

Bacillus licheniformis NN1 34 4.2: Ảnh hưởng của pH tới quá trình sinh tổng hợp chitosanase từ vi khuẩn

Bacillus licheniformis NN1 35 4.3: Ảnh hưởng của nồng độ chitosan tới quá trình sinh tổng hợp chitosanase từ vi

4.4: Đường cong sinh trưởng và hoạt tính chitosanase của vi khuẩn Bacillus

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

COS Chitosan Oligosaccharide

DA Degree of deacetylation

DP Degree of polymerization DNS Acid dinitro salisylic

GlcNAc N-acetyl-D-Glucosamine

Chitosanase kỹ thuật là một enzyme ngoại bào thủy phân liên kết nội phân tử

cơ chất chitosan, được biết đến ứng dụng chủ yếu để sản xuất ra Chitosan – oligosaccharide (COS)

COS được ứng dụng giống chitosan nhưng do đặc tính dễ hoà tan trong nước

mà COS được ứng dụng nhiều trong y học và dược phẩm: COS giúp kích thích tiêu hoá thức ăn, tăng tính thèm ăn ở vật nuôi, tăng cường sức đề kháng, tăng khả năng miễn dịch, ngăn cản sự phát triển của tế bào ung thư… [7,8]

Enzyme chitosanase có thể thu nhận từ vi khuẩn, nấm, hay một số thực vật, động vật…nhưng enzyme chitosanase thu nhận từ chủng vi khuẩn là có hoạt tính cao hơn cả và đặc biệt có ưu thế trong sản xuất công nghiệp Hơn nữa, các vi sinh vật này lại có khả năng sinh sản, phát triển với một tốc độ cực kỳ lớn, do đó cho phép thu được một lượng enzyme trong thời gian ngắn một cách dễ dàng Mặt khác, môi trường nuôi cấy lại dễ kiếm, rẻ tiền… [7]

Trong các loại vi sinh vật thu nhận enzyme chitosanase kỹ thuật được sử

dụng hiện nay, thì vi khuẩn Bacillus licheniformis có ưu điểm là nguồn phổ biến và

giá thành có ý nghĩa kinh tế nhất

Trên thế giới cũng đã có khá nhiều đề tài nghiên cứu về enzyme chitosanase được tổng hợp từ các loài vi sinh vật Tuy nhiên, ở Việt Nam cho đến thời điểm này, những nghiên cứu về chitosanase và các loài vi sinh vật sản sinh ra nó còn tương đối hạn chế Do đó, để góp phần vào việc nghiên cứu và ứng dụng chitosanase,

chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thu nhận và xác định đặc tính của

enzyme chitosanase kỹ thuật từ vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1”

1.2 Mục đích – yêu cầu

1.2.1 Mục đích

Nghiên cứu tối ưu hóa quá trình nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1

để tổng hợp enzyme chitosanase kỹ thuật và xác định một số đặc tính của enzyme này

1.2.2 Yêu cầu

- Xác định được các điều kiện nuôi cấy và xây dựng được quy trình nuôi

cấy tối ưu vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1 có khả năng sinh tổng hợp enzyme

chitosanase cao

- Xác định được điều kiện thu nhận enzyme chitosanase kỹ thuật từ vi

khuẩn Bacillus licheniformis NN1

- Xác định được một số đặc tính của enzyme chitosanase kỹ thuật thu

nhận từ vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Hoạt tính của chế phẩm enzyme đặc trưng cho khả năng xúc tác phân giải chitosan thành các COS có phân tử thấp hơn Hoạt tính chitosanase được biểu thị bằng số đơn vị hoạt tính trong 1ml (hay 1g) chế phẩm [43]

2.1.2 Phân loại enzyme chitosanase

Dựa vào sự tương đồng của chuỗi amino acid và dựa vào sự phân cắt đặc hiệu cơ chất của enzyme chitosanase, ta có thể phân loại enzyme chitosanase theo 2 cách dưới đây:

2.1.2.1 Dựa vào sự tương đồng của chuỗi amino acid

Dưới đây là một số vị trí tác dụng của enzym chitosanase đã tìm thấy được

Bảng 2.1: Các chủng vi sinh vật đại diện cho mỗi họ enzyme

Họ

chitosanase

Các chủng vi sinh vật sinh

Họ 5 Streptomyces griseus HUT 6037

Các chitosanase của nhóm này còn có khả năng xúc tác phản ứng vận chuyển nhóm glycoside, ngoài ra còn thủy phân được cả carboxymethylcellulose (CMC)

Nguồn: [44]

2.1.2.2 Dựa vào sự phân cắt đặc hiệu cơ chất của enzyme chitosanase

Chitosanase có khả năng nhận dạng liên kết đặc trưng trong chuỗi chitosan để tiến hành phân cắt Vị trí đó là liên kết β–1,4 glucoside giữa các phân tử D–Glucosamine hoặc giữa D–Glucosamine và N–acetyl–D–Glucosamine

Tuy nhiên không phải bất kỳ enzyme chitosanase nào cũng tấn công vào bất

kỳ vị trí liên kết này, mà có một số chitosanase chỉ có khả năng tấn công vào vị trí β–1,4 glucoside giữa hai D–Glucosamine, còn một số chitosanase lại có khả năng tấn công vào liên kết này giữa hai D–Glucosamine và giữa D–Glucosamine với phần N–acetyl–D–Glucosamine còn lại Dưới đây là một số vị trí tác dụng của

enzym chitosanase đã tìm thấy được chia theo họ

Các liên kết đặc hiệu cho nhận của các enzyme chitinolytic và chitosanolytic

đã được điều tra bằng cách sử dụng cơ chất thông thường là acetylated chitosan 20–30%

Dựa theo sự phân cắt đặc hiệu của cơ chất chitosanase thì enzyme chitosanase được phân thành ba loại khác biệt theo đề nghị của Fukamizo và CS [ 12]

Bảng 2.2: Phân loại Chitosanase dựa vào sự phân cắt đặc hiệu của cơ chất

Chitosanase loại I: Bao gồm các enzyme chitosanase cắt các liên kết GlcNAc–GLcN và GlcN–GlcN

Chitosanase loại II: Bao gồm các enzyme chitosanase cắt các liên kết GlcN–GLcN

Chitosanase loại III: Bao gồm các enzyme chitosanase cắt các liên kết GlcN–GLcNAc và GlcN–GlcN

2.1.3 Cấu tạo và khối lượng phân tử enzyme chitosanase

Chitosanase hầu hết là các enzyme ngoại bào, có cấu tạo đơn phân tử, thủy phân liên kết β–1,4 glucoside giữa gốc Glucosamine và N–acetyl–D–glucosamine trong chuỗi N–acetylate Chitosan Chitosanase có khả năng tấn công chitosan nhưng không có khả năng tấn công chitin

Hình 2.1: Cấu trúc protein 3D của enzyme chitosanase

thu được từ Bacillus circulans MH-K1

Chitosanase cũng giống như mọi enzyme khác đều có bản chất là protein Chúng có khối lượng phân tử khoảng từ 30–70kDa và kích thước mỗi loại enzyme chitosanase thu được từ các nguồn khác nhau thì khác nhau Khối lượng phân tử của enzyme chitosanase thu được từ một số loài vi sinh vật khác nhau được trình bày ở Bảng 2.3

Bảng 2.3: Khối lượng phân tử của một số enzyme chitosanase

Bacillus cereus 47 kDa

Bacillus circulans 31 kDa

Bacillus megaterium P1 43 kDa

Bacillus sp KCTC 0377BP 45 kDa

Sphingomonas sp.CJ–5 45 kDa

Streptomyces griceus HUT 6037 34 kDa

B subtilis TKU007 25 kDa

Bacillus cereus D–11 20–50 kDa

Serratia marcescens TKU011 21 kDa

Pseudomonas sp TKU015 68 kDa

Nguồn: [24, 14, 37]

2.1.4 Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase

Fukamizo và cs (1999) đã xác định được các sản phẩm dị vòng thu được từ quá trình thuỷ phân chitosan đều là dạng α, điều đó cho thấy rằng chitosanase là một enzyme chuyển hoá

Cùng với những kết quả thu được khi quan sát dạng tinh thể học và các vùng biến đổi cho phép chúng ta kết luận rằng đầu Glu22 hoạt động như là nơi cho proton, trong khi đầu Asp4 hoạt hoá 1 phân tử nước sau đó tấn công vào vị trí C–1 của phân tử đường khử tại vị trí xúc tác

Cơ chế chuyển hoá này được duy trì liên tục trên thực tế là nhờ 2 đầu xúc tác có

khoảng cách 13.8Å, cao hơn những enzyme chuyển hoá khác gần 10Å [12]

Cơ chế xúc tác của chitosanase được thể hiện trong hình sau:

Hình 2.2: Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase

Sản phẩm phản ứng của enzyme chitosanase được nghiên cứu bằng cách sử dụng dung dịch chitosan và một vài COS làm cơ chất Phương pháp sắc kí lớp mỏng (TLC) (thin–layer chromatography) cho thấy rằng enzyme chitosanase đã giải phóng ra COS từ chitosan, phần lớn là các COS dài hơn (GlcN)2 bằng cách phân cắt nội phân tử Enzyme này không thể thuỷ phân được (GlcN)2 hoặc (GlcN)3 Còn (GlcN)4 và (GlcN)5 thì bền với hoạt tính xúc tác của enzyme này Tuy nhiên, chitosan oligosaccharide (GlcN)6 và (GlcN)7 được thuỷ phân hoàn toàn sau 15h ủ (GlcN)6 chủ yếu được phân cắt thành (GlcN)3 + (GlcN)3 và (GlcN)2 + (GlcN)4

nhưng (GlcN)2 + (GlcN)4 thì ít hơn nhiều [Rồi sau đó, (GlcN)4 → (GlcN)2 + (GlcN)2] Nó cũng cho thấy rằng (GlcN)7 được phân cắt thành (GlcN)3 + (GlcN)4 Kết quả này chỉ ra rằng để phản ứng xảy ra nhanh, cơ chất chitosan nên có chiều dài chuỗi phân tử bằng hoặc dài hơn (GlcN)6, sự phân cắt liên kết glycoside xảy ra tốt nhất tại trung tâm của mối liên kết hexameric và sinh ra (GlcN)3 là sản phẩm chủ yếu Thực tế, enzyme chitosanase thể hiện hoạt tính đối với chitosan cao hơn so với các oligosaccharide mạch ngắn hơn [43]

2.1.5 Tính đặc hiệu cơ chất của enzyme chitosanase

Trong số các cơ chất được thử nghiệm như: Chitosan, COS, dịch keo chitin, carboxymethyl cellulose (CMC) và peptidoglucan thì enzyme chitosanase thường

thể hiện hoạt tính cao nhất đối với cơ chất chitosan hoà tan (Bảng 2.4)

Mặc dù đã kéo dài phản ứng enzyme qua đêm nhưng nó vẫn không thể thuỷ

phân được (GlcNAc)6, chitin tinh thể và peptidoglycan nhưng nó lại có khả năng thuỷ phân được dung dịch keo chitin và CMC Độ bền của (GlcNAc)6 đối với hoạt động của enzyme chitosanase cho thấy rằng enzyme này không có hoạt tính chitinase Hoạt tính chitinase là khả năng phân cắt liên kết β–1,4 giữa GlcNAc – GlcNAc Hoạt tính nhỏ đối với cơ chất keo chitin có thể được giải thích là do enzyme chitosanase phân cắt β–1,4 của GlcN – GlcN, GlcN – GlcNAc và GlcNAc – GlcN, chúng được tìm thấy trong dung dịch keo chitin với DDA 10%

Bảng 2.4: Cơ chất đặc hiệu của enzyme chitosanase

từ Bacillus sp KCTC 0377BP

Chitosan oligosaccharide

Chitobiose………

Chitotriose………

Chitotetraose………

Chitopentaose………

Chitohexaose………

Chitoheptaose………

– – 15.0 16.8 20.0 23.8

Nguồn: [38]

Như đã nói ở trên, chitosan có tính đa dạng hoá học trong DDA của chúng Tính đa dạng của chitosan có thể tác động đến tính nhạy cảm của enzyme chitosanase Khi hoạt tính tương đối của chitosanase đối với cơ chất chitosan được thử nghiệm với các mức độ DDA khác nhau, người ta nhận thấy hoạt tính của chitosanase tăng lên cùng với sự tăng của giá trị DDA của chitosan

2.1.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH tới sự hoạt động của enzyme chitosanase

Nhìn chung, vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác thường tăng lên theo nhiệt độ nhưng chỉ tăng lên trong một giới hạn xác định mà ở đó phân tử enzyme vẫn còn bền và chưa bị biến tính Nhiệt độ thích hợp cho sự hoạt động của mỗi enzyme thường tương đối rộng Đối với chitosanase, người ta đã nghiên cứu và cho thấy rằng chúng có thể hoạt động trong khoảng 30 – 700C và đa số đều hoạt động tốt nhất trong khoảng nhiệt độ 50 – 600C Nhưng nhiệt độ mà ứng với hoạt tính enzyme cao nhất thường chỉ tồn tại một điểm và nhiệt độ đó là nhiệt độ tối ưu của enzyme (topt) Nhiệt độ tối ưu của chitosanase thu được từ các nguồn khác nhau thì cũng khác nhau và topt thường không cố định mà có thể thay đổi tuỳ theo cơ chất, pH môi trường, thời gian phản ứng…

– Độ bền pH và pH tối ưu cho sự hoạt động của enzyme chitosanase

Giá trị pH của môi trường ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzyme vì nó ảnh

hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, enzyme và độ bền của protein enzyme Đa số các enzyme bền trong giới hạn pH giữa 5 đến 9 Đối với enzyme chitosanase, pH thích hợp cho hoạt động của chúng thường vào khoảng 4.0 – 8.0 Tuy nhiên, pH tối ưu (pHopt) cho hoạt động của chitosanase thu được từ các nguồn khác nhau là khác nhau

Bảng 2.5: Nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của chitosanase thu được

2.1.7 Ảnh hưởng của ion kim loại và các chất phản ứng khác tới sự hoạt động của enzyme chitosanase

Theo các tài liệu nghiên cứu về vấn đề này, các ion như Mg2+, Mn2+ có khả năng làm tăng hoạt tính của enzyme chitosanase, trong khi đó các ion Hg2+, Cu2+,

Co2+, Zn2+ và Ag+ lại có thể ức chế hoạt tính của enzyme này Fe3+ kích thích hoạt tính chitinase nhưng lại ức chế mạnh hoạt tính chitosanase Các ion kim loại khác không gây ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme này Hoạt tính của enzyme chitosanase giảm khoảng 50% nếu thêm KCl 0.4M hoặc NaCl 0.4M vào hỗn hợp phản ứng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 12

Bảng 2.6: So sánh đặc tính của một số enzyme chitosanase được sản xuất từ vi sinh vật

Vi sinh vật

Khối lượng phân tử

Kiểu hoạt

Hoạt tính riêng (U/mg)

Cơ chất đặc hiệu (%DDA)

Sản phẩm

Aspergillus oryza IAM 2660 135 40 Endo Exo 5.5 5.5 17.2 38.8 Chitosan (70-100) Chitosan (90-100) Oligomer G1

Acinetobacter sp strain CHB101 37 30 Endo Endo 5-9 5-9 334 800 Chitosan (70-90) Glycol chitosan G2, G3

Nguồn: [43]

Chú thích:

(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) với enzyme tinh sạch

2.1.8 Ứng dụng của enzyme chitosanase và chitosan oligosaccharide

2.1.8.1 Ứng dụng của enzyme chitosanase

Cho đến nay, ứng dụng lớn nhất và chủ yếu nhất của enzyme chitosanase là để sản xuất COS từ chitosan Sản xuất COS từ chitosan bằng phương pháp enzyme có những ưu điểm vượt trội so với phương pháp hoá học Phương pháp enzyme là phương pháp sản xuất rất nhanh chóng, rẻ tiền, mang lại lợi ích kinh tế rất lớn, do enzyme chitosanase được phân lập từ những nguồn vi sinh vật rất phong phú trong tự nhiên

Hơn nữa, nếu kiểm soát được sự hoạt động của enzyme chitosanase (nhiệt độ, pH, thời gian…) sẽ tạo ra được các chitosan oligosaccharide theo mong muốn Điều này có ý nghĩa quan trọng khi sản xuất COS ở quy mô công nghiệp Từ đó, COS với những đặc tính ưu việt được ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như đã trình bày ở trên [20]

2.1.8.2 Ứng dụng của COS

Chitosan Oligosaccharide (COS) là sản phẩm thủy phân chitosan, nó có khả năng tan được trong nước Tên hóa học 2–amino–A–1,4–glucose polymer và công thức phân tử (C6H11O4N)n£ COS là một loại Oligosaccharide thu được từ sản phẩm thủy phân chitin hoặc chitosan bằng hóa chất hay enzyme Phương pháp hóa học sử dụng acid thủy phân cho năng suất thấp lại tốn kém nên phương pháp được sử dụng chủ yếu là enzyme chitosanase Enzyme chitosanase phân cắt liên kết β–1,4–glycoside của chitosan tạo ra COS Do đó cấu tạo của COS là một chuỗi phân tử được cấu tạo bởi một số đơn vị D–glucosamine (GlcN) (thường là từ 2 đến

10 đơn vị GlcN) Chiều dài chuỗi phân tử và mức độ deacetyl (DDA) được coi là 2 yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của COS COS dài hơn hexamer có khả năng ức chế vi sinh vật, chống ưng thư, tăng cường miễn dịch tốt hơn so với các COS ngắn Sự tăng mức độ deacetyl làm tăng hoạt tính sinh học của COS Bởi vậy, kiểm soát chặt chẽ chiều dài chuỗi phân tử và DDA là điều kiện tiên quyết để sản xuất COS có giá trị cao [18]

Ứng dụng COS trong y học

COS là chất có khả năng ngăn chặn sự tích lũy các chất béo bên trong các cơ quan cỏ thể sinh vật, đặc biệt là ở trong thận của những người sau khi uống rượu Quan trọng hơn COS ngăn chặn những tác động xấu của rượu lên gan ngăn chặn những ảnh hưởng xấu đến các bệnh về gan cho những người nghiện rượu

Không giống với chitosan, COS dễ đồng hóa bên trong cỏ thể và bên cạnh đó nó

có thể làm tăng sự đồng hóa của một số nguyên tố vi lượng như sắt, Canxi, Ứng dụng của Oligosaccharide cho phép giải quyết một số vấn đề về dinh dưỡng liên quan đến thiếu hụt một số nguyên tố vi lượng Nó loại bỏ một cách hoàn toàn Cholesterol và lipoprotein mật độ thấp từ mạch máu Bởi vậy việc bổ sung COS vào cơ thể của các bệnh nhân bị bệnh béo phì thì có kết quả tốt COS là cation dương vì vậy nó có thể liên kết với các ion Clcó trong mạch máu rồi thải ra ngoài làm giảm huyết áp

COS có nhiều đặc điểm nổi bật hơn so với chitin và chitosan Tỉ lệ hấp thụ Chitosan Oligosaccharide trong cơ thể người là 100%, hoạt tính và chức năng sinh học của nó cao hơn chitosan rất nhiều Do vậy nên đưa vào cơ thể hàng ngày để duy trì sức khỏe

COS còn có thể sử dụng để ức chế sự tiêu hóa các chất béo và nó đóng vai trò như một tác nhân vận chuyển và nó được sử dụng như là tác nhân làm giảm Cholesterol COS phá vỡ khối mỡ thể hiện là nó có thể cản trở sự hấp thụ chất béo bằng cánh tạo keo với chất béo trong ruột non

Có nhiều nghiên cứu đã chứng minh COS có chức năng tăng cường hệ thống miễn dịch, ngăn cản sự phát triển của tế bào ung thư, tạo thành các kháng thể trong gan và lá lách, kích thích sự tiêu hóa Canxi và các chất khoáng, kích thích sản sinh

ra các tế bào vi khuẩn có thể chữa bệnh như: Vi khuẩn lactic, làm giảm chất béo trong máu, giảm huyết áp và lượng đường trong máu, điều chỉnh Cholesterol, giảm cân và ngăn ngừa các bệnh ở người trưởng thành Ngoài ra COS còn được ứng dụng để cầm máu, chữa bỏng da, băng bó vết thương [16]

Trong công nghệ thực phẩm

COS được dùng trong các quá trình xử l í sản phẩm, để bảo quản rau quả, một

số loại trái cây tươi (cà chua, dâu tây, cam, bưởi ) Tạo gel, tạo độ mịn, bề dày cho sản phẩm, đặc biệt hơn COS có thể hút nước trong các sản phẩm nhằm tránh một số quá trình lên men xảy ra trong khi bảo quản Màng mỏng chitosan trên bề mặt có tác dụng ức chế hô hấp, giữ lại khí cacbonic, giảm thiểu lượng ethylene, diệt được một số loại nấm và kìm hãm quá trình biến màu của quả trong khi bảo quản, vận chuyển tiêu thụ

Nghiên cứu của Wenshui & Xia (2010) cũng sử dụng COS trong bảo quản nước táo đã kéo dài thời gian bảo quản ở 370C từ 9 ngày đến 70 ngày với nồng độ COS là 4g/l [22]

Chitosan tạo ra bột Chitofood thay thế hàn the độc hại nhưng đảm bảo sản phẩm vẫn dai, ngon Phụ gia này được dùng trong chế biến bảo quản các sản phẩm

từ nhóm thịt (giò, chả, thịt hộp, nem), thực phẩm tươi sống, thịt nguội, đồ uống, nước giải khát, sản phẩm sữa

COS là chất dinh dưỡng có lợi cho sức khỏe những nghiên cứu đã cho thấy rằng COS có khả năng liên kết với các chất béo và cholesterol, làm giảm cholesterol trong máu có tác dụng tốt đối với những người bị cao huyết áp, những người béo COS

có cấu trúc dạng sợi và có các thuộc tính giống như các cấu trúc dạng sợi như Cellulose nên có thể dùng cho những người ăn kiêng, thay thế thức ăn chứa nhiều calo

Trong nông nghiệp

COS được sản xuất dưới hai dạng rắn và lỏng Trong thành phần của nó chứa Cacbon và giàu Nitơ vì vậy nó trở thành nguồn cung cấp các chất này cho cây trồng

Nó có thể được dùng như một chất kích thích sinh trưởng được bón cho cây trồng

để cải thiện lượng rau, hoa, quả và nó có thể ngăn chặn sự nhiễm sâu bệnh, sinh ra các chất kháng khuẩn trong đất và làm phân bón sinh học Sản xuất phân bón và chất trừ sâu sinh học từ COS đang là lĩnh vực mới mẻ trong tương lai

Trong công nghệ sinh học và xử lý rác thải

Những nghiên cứu gần đây cho thấy COS có thể sử dụng là tác nhân đông tụ hiệu quả cho các hợp chất hữu cơ, nó đóng vai trò như một chiếc kìm liên kết các chất độc kim loại nặng Chitosan được dùng như một chất mang để tách và làm giàu các kim loại nặng trong môi trường nước Mức độ hấp thu của chitosan với các kim loại nặng thủy ngân, cadimin (Hg, Cd) đạt bão hòa sau 90 phút khuấy Hg hấp thụ trên chitosan đạt cao nhất 90%, Cd đạt 41% Khả năng hấp thụ của chitosan đối với các ion trên đạt cực đại và ổn định ở pH 4 ÷ 6 Ngoài ra, nó có khả năng hấp thụ các chất nhuộm cà nồng độ nhỏ của các phenol khác nhau trong công nghệ xử lý rác thải

2.2 Thu nhận và tinh sạch enzyme chitosanase

2.2.1 Nguồn thu nhận enzyme chitosanase đã dùng trong sản xuất chitosanase

Enzyme chitosanase được tìm thấy từ nhiều loài sinh vật khác nhau Người ta thường thu nhận enzyme chitosanase từ các loài vi sinh vật (vi khuẩn, nấm, virus,

xạ khuẩn), tế bào thực vật (lúa, đại mạch nảy mầm, chè, đu đủ, đậu tương, thầu dầu…), tế bào động vật (dạ dày, tụy tạng, tim, gan…).Tuy nhiên, hiện nay nguồn cung cấp enzyme chitosanase chủ yếu là từ vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm Nguồn vi sinh vật này chủ yếu được phân lập từ đất, nơi có xác của các loài giáp xác (tôm, cua…) phân hủy Dựa theo nguyên tắc ở đâu có cơ chất, thì ở đó có vi sinh vật phân giải cơ chất đó

2.2.2 Vi khuẩn Bacillus licheniformis

2.2.2.1 Đặc điểm hình thái của vi khuẩn Bacillus licheniformis

Vi khuẩn Bacillus licheniformis là trực khuẩn gram dương, sinh bào tử hình ô van

không phình, thuộc nhóm hai theo phân loại của Pries và Cs, [45] Các tế bào vi khuẩn này đứng riêng rẽ hoặc có thể sắp xếp với nhau tạo thành chuỗi Tế bào vi khuẩn ngắn, nhỏ

có thể thay đổi tùy theo chuỗi từ 1 – 5µm, đuờng kính từ 0.5 – 1µm

2.2.2.2 Đặc điểm sinh lý hóa sinh của vi khuẩn Bacillus licheniformis

Trong tự nhiên có thể phân lập Bacillus licheniformis ở khắp nơi từ đất, nước, cây

trồng, Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu của nó là 500C, nhưng nó cũng có thể tồn tại ở nhiệt độ cao hơn nhiều Tuy nhiên, nhiệt độ tốt nhất để tiết một số enzyme là 370C [45] Khi điều kiện môi trường khắc nghiệt nó sẽ chuyển sang dạng bào tử để chống chịu tốt hơn và quay

về trạng thái sinh dưỡng khi gặp điều kiện thuận lợi

Hiện nay hầu hết các quá trình lên men vi khuẩn đều được thực hiện bằng các phương pháp nuôi cấy chìm có sục khí, khả năng sinh sinh khối và sinh tổng hợp enzyme chitosanase của vi sinh vật phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường

2.2.2.3 Một số ứng dụng của Bacillus licheniformis

Hiện nay vi khuẩn này đang được chú ý và sử dụng cho mục đích công nghiệp như sản xuất enzyme, kháng sinh và các chất chuyển hóa Nó có khả năng sản sinh ra nhiều enzyme ngoại bào có liên quan tới các chu trình dinh dưỡng trong tự nhiên

Bacillus licheniformis cũng được ứng dụng là một thành phần quan trọng trong chất giặt tẩy Do nó có khả năng phát triển trong môi trường kiềm và sản sinh ra một protease

có thể tồn tại ở pH cao Protease có pH tối ưu ở khoảng 9 và 10, do vậy nó có thể loại bỏ protein bao gồm bụi bẩn trong quần áo [54]

Bacillus licheniformis được sử dụng để sản xuất kháng sinh Bacitracin Bacitracin

bao gồm một hỗn hợp của các polypeptide tuần hoàn do Bacillus licheniformis tạo ra nhưng nó lại được tạo ra để ức chế sự tăng trưởng của Bacillus licheniformis

Ngoài ra, Bacillus licheniformis cũng được sử dụng để sản xuất penicillinase,

pentosanases, proticin, citric acid

Hiện nay đã có rất nhiều những nghiên cứu trên thế giới thu nhận chitosanase từ

Bacillus sp như: Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus megaterium, Bacillus subtilis,

Bacillus thuringiensis, Bacillus alvei, và Bacillus licheniformis Theo Yasushi Uchida et

al (1994), Bacillus licheniformis UTK được phân lập từ đất cho thấy khả năng sinh

chitosanase ngoại bào Sau khi nuôi cấy và thu dịch thô enzyme, thực hiện các bước làm sạch đã thu được hai enzyme chitosanase C1, C2 có khối lượng khoảng 31 và 26kDa Nhiệt độ tối ưu khoảng 40 - 450C và pH tối ưu 4.6 - 4.9 [30]

Nghiên cứu gần đây của C Ekowati và cs., (2006) [10] cũng được thực hiện thu nhận chitosanase từ Bacillus licheniformis MB2 được phân lập từ suối nước nóng ở

Manado, Indonesia Cũng sau quá trình làm sạch thu được hai enzyme chitosanase Chitosanase thứ hai thu được có khối lượng phân tử khoảng 75kDa, nhiệt độ hoạt động tối

ưu là 700C và khoảng pH tối ưu là 6 – 7 [10]

2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp chitosanase

2.2.3.1 Ảnh hưởng của một số thành phần môi trường

Môi trường dinh dưỡng là môi trường sống và cũng là nơi vi sinh vật sinh trưởng, phát triển và thực hiện mọi hoạt động của một cơ thể sống Nhưng để duy trì phát huy những tính chất đặc trưng của vi sinh vật thì nó yêu cầu môi trường dinh dưỡng phải thích hợp Nói cách khác sự phát triển của vi sinh vật chịu ảnh hưởng rất lớn bởi thành phần dinh dưỡng trong môi trường

Thành phần môi trường dinh dưỡng của từng chủng vi sinh vật được xác định bằng thực nghiệm Việc chọn môi trường dinh dưỡng để nuôi cấy nhằm mục đích thu được một lượng sản phẩm tối đa do chủng sản xuất tạo thành là một quá trình lâu dài và vất vả, đòi

hỏi người làm công việc này phải có kiến thức sâu về sinh lý vi sinh vật Lựa chọn các chế

độ môi trương tối ưu có được xác định bằng hai cách: chọn lựa thực nghiệm lâu dài qua nhiều giai đoạn và sử dụng phương pháp toán học mô hình hóa thử nghiệm

Cách thứ nhất là phổ biến từ trước tới nay trong công tác nghiên cứu vi sinh vật học Trên cơ sở hiểu biết về sinh lý vi sinh vật người ta xác định tính chất thành phần môi trường, còn nồng độ của lượng thành phần được xác lập bằng hàng loạt thí nghiệm, trong đó một cấu tử của môi trường được thay đổi trong khoảng giới hạn, còn cấu tử khác giữ nguyên Cách này đáng tin cậy nhưng mất nhiều thời gian Cách thứ hai sử dụng phương pháp toán học kế hoạch hóa thực nghiệm cho phép xác định nhanh các chế độ và thành phần tối ưu của môi trường dinh dưỡng Việc tối ưu hóa quá trình gồm hai giai đoạn cơ bản Ở giai đoạn đầu làm thí nghiệm với các yếu tố nhằm xác định ý nghĩa của các yếu tố nghiên cứu, xác định phương hướng và mức độ biến đổi của mỗi yếu tố trong các thí nghiệm tiếp theo của bản thân quá trình tối ưu hóa

Cơ sở của việc kế hoạch hóa thực nghiệm theo yếu tố 2n là việc thể hiện tất

cả các tổ hợp có thể có giữa n các yếu tố nghiên cứu Mỗi yếu tố đều được kiểm tra đồng thời và không phụ thuộc lẫn nhau ở hai mức độ trên (+) và dưới (–) khi tối ưu hóa thành phần môi trường Trung tâm của thực nghiệm là mức trung bình, hay mức

cơ bản (0), tức là số trung bình cộng giữa mức trên và mức dưới của mỗi yếu tố

- Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Vi sinh vật cũng như tất cả các cơ thể sống khác cần nitơ trong suốt quá trình sống để xây dựng tế bào và tạo ra các sản phẩm sinh tổng hợp: Bởi lẽ các thành phần quan trọng của tế bào và sản phẩm sinh tổng hợp đều có chứa nitơ ( protein, axit nucleic, enzyme ) Chính vì vậy, trong môi trường nuôi cấy cần thiết có nitơ mà vi sinh vật có thể đồng hóa được Việc chọn nguồn nitơ là cần thiết để đảm bảo được hiệu suất sinh tổng hợp cao và có lợi về mặt kinh tế

- Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Sự sinh tổng hợp enzyme chitosanase được tổng hợp trong tế bào vi sinh vật chịu ảnh hưởng khá lớn của nguồn cacbon có mặt trong môi trường nuôi cấy Nếu môi trường chỉ chứa nguồn cacbon để đồng hóa như glucose, tinh bột tan thì vi

sinh vật phát triển về mặt sinh khối có nghĩa là lượng sinh khối thu được nhiều nhưng lượng enzyme chitosanase mà vi sinh vật có thể tiết ra môi trường là rất ít Muốn thu được enzyme cao thì phải có cơ chất để cảm ứng để vi sinh vật có thể sinh tổng hợp enzym để thủy phân nguồn cơ chất đó nguồn cacbon đóng vai trò là chất cảm ứng cho sinh tổng hợp chitosanase là Chitosan, Chitin

2.2.3.2 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

a Ảnh hưởng của nhiệt độ môi trường

Đa số vi sinh vật tổng hợp enzyme chitosanase là vi sinh vật ưa ẩm, nhiệt độ tối thích cho vi sinh vật phát triển và tổng hợp enzyme chitosanase nằm trong khoảng từ 30 – 450 C

Thông thường các vi sinh vật có nhiệt độ tối thích cho sự phát triển và sinh tổng hợp enzyme cao thì tính bền nhiệt của enzyme tạo thành cũng cao Điều này rất có lợi

vì hầu hết các quá trình thủy phân đều tỏa nhiệt Nếu enzyme bền nhiệt thì hiệu quả sử dụng enzyme cao hơn và không phải dự kiến các phương án làm giảm nhiệt độ môi trường [15]

b Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi cấy

Mỗi loài vi sinh vật đòi hỏi một độ pH nhất định và pH của môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển và khả năng sinh tổng hợp enzyme của vi sinh vật bởi lẽ ion H+ vàOH– trong môi trường tác động trực tiếp lên màng nguyên sinh chất làm thay đổi sự vận chuyển của cơ chất cảm ứng vào tế bào và vận chuyển enzyme ra ngoài môi trường

Mặt khác ion H+ vàOH- cũng ảnh hưởng đến hệ sinh vật của enzyme của vi sinh vật, tham gia vào hoạt động sống của vi sinh vật Thông thường nấm men, nấm mốc phát triển tốt trên môi trường axít, vi khuẩn phát triển tốt trên môi trường kiềm hoặc trung tính Các vi sinh vật sinh tổng hợp chitosanase được nghiên cứu chủ yếu

là các vi sinh vật ưa pH trung tính, có độ pH thích hợp từ 5.5 – 7

Bảng 2.7 Điều kiện nhiệt độ, pH và thời gian nuôi cấy của một số

chủng vi sinh vật sinh chitosanase

Thời gian (ngày)

2.2.4 Thu nhận chitosanase kỹ thuật

Chế phẩm enzyme kỹ thuật là chế phẩm enzyme đã được tinh chế sơ bộ để loại bỏ một số protein không hoạt động, protein không phải enzyme và enzyme tạp Thu nhận enzyme chitosanase kỹ thuật nhằm ứng dụng rộng rãi trong một số lĩnh vực công nghệ thực phẩm nói chung và công nghệ sản xuất enzyme nói riêng Enzyme kỹ thuật thu được từ lên men vi khuẩn trải qua các giai đoạn sau: Loại sinh khối của dịch nuôi cấy

Sau quá trình nuôi cấy vi khuẩn kết thúc, tiến hành ly tâm dịch nuôi cấy với tốc độ 6000 rpm ở 40C Enzyme chitosanase là enzyme ngoại bào nên loại bỏ kết tủa và thu lại phần dịch trong

Cô đặc dung dịch enzyme thô

Dịch chiết giữ lại được cô đặc ở nhiệt độ thấp để làm tăng nồng độ enzyme, hoặc được bổ sung tác nhân gây kết tủa protein enzyme để loại bỏ một số chất không mong muốn, sau đó hòa tan enzyme trong một thể tích nhỏ dung dịch đệm thích hợp Dung dịch được cât cô chân không ở nhiệt độ 40oC đến độ đặc còn ¼ thể tích ban đầu

Tinh sạch enzyme sơ bộ

Quá trình tinh sạch enzyme chính là quá trình loại bỏ đi các thành phần không phải enzyme mục tiêu có trong dịch lỏng, nó thường bao gồm các chất hòa tan và các protein tạp chất, việc loại bỏ chúng dựa trên sự khác nhau giữa enzyme mục tiêu và các thành phần khác về kích thước, hình dạng phân tử, khả năng hòa tan trong các dung môi, điện tích…

Một trong các phương pháp tinh sạch enzyme sơ bộ là phương pháp tủa protein-enzyme bằng dung môi hữu cơ và bằng muối: Các muối trung tính có thể dùng là (NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4 Tuy nhiên, các nghiên cứu đã nhận thấy muối (NH4)2SO4 là tốt nhất vì nó làm ổn định (làm bền) hầu hết các loại protein enzyme Đối với chitosanase thì phương pháp tủa muối là phương pháp thường được áp dụng phố biến trong quá trình làm sạch enzyme [17, 20, 10]

2.3 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về enzyme chitosanase

2.3.1 Tình hình nghiên cứu enzyme chitosanase trên thế giới

Chitosan là một loại polyme sinh học, được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm không chỉ vì nó có nhiều tính năng vượt trội ứng dụng trong công nghiệp mà quan trong hơn nó có những tác động tốt trên bệnh nhân ung thư Hai nước nghiên cứu nhiều về chitosan hiện nay là Trung Quốc và Nhật Bản Ngoài ra còn có Canada, Mỹ, Hàn Quốc… cũng đang tiến hành nhiều nghiên cứu Tuy nhiên quá trình nghiên cứu chitin/chitosan chỉ thực sự có hệ thống vào giữa thế kỷ 20, quy trình sản xuất chitosanase hiện nay chưa có trên quy mô công nghiệp chỉ tiến hành nghiên cứu trong viện và ở các trường đại học Dưới đây là sơ lược kết quả một số nghiên cứu về enzyme chitosanase trên thế giới đã đạt được:

Theo tác giả A Pelletieer and J Sygusch (1990), thuộc trường đại học Sherbrooke Canada, trong nghiên cứu: “Nghiên cứu sinh tổng hợp và tinh sạch, xác định đặc tính enzyme chitosanase từ chủng Bacillus megaterium P1” đã xác định ba loại enzyme sinh tổng hợp có khả năng thủy phân chitosan Enzyme có khối lượng 39.5 kDa, pH tối thích 4.5–6.5, và nhiệt độ 450C, hai enzyme còn lại có khối lượng 43kDa và 22kDa

Theo Yeon Jin Choi, Eun Jung Kim, Zhe Pion (2003), Đại học Quốc gia

Gyeongsans Hàn Quốc trong nghiên cứu: “Nghiên cứu trên chủng Bacillus sp

Strain KCTC 0377 Bp” đã kết luận: Chủng được nuôi cấy từ đất Khối lượng 45 kDa, hoạt độ enzyme bền ở 40–450C khi giữ ở nhiệt độ này 24h hoạt độ enzyme hầu như không đổi Nhưng qua 500 trong 5h và 550C trong 10 phút, 600C trong 5 phút enzyme bị vô hoạt, pH tối thích là 5

Theo San Lang Wang, Pe Yi Ye (2007), Đại học Tamkang trong nghiên cứu:

“Tinh sạch và xác định tính chất của chitosanase từ chủng Bacillus subtilis

TKU007” đã thu được enzyme được phân lập từ đất ở Đài Loan, enzyme có khối lựong 27 kDa, pH tối thích là 7, enzyme bền ở nhiệt độ 25–300C, nhiệt độ tối thích cho hoạt động của enzyme là ở 370C và bị bất hoạt ở 600C

Theo tác giả San Lang Wang, Shin Jen Chena and Chuan Lu Wang (2008), Viện công nghệ Lan Yang, Đại học Tamkang Trong nghiên cứu: “Tinh sạch và xác định tính chất của Chitosan và Chitosanase từ chủng vi khuẩn Pseudomonas sp TKU015 với việc sử dụng vỏ tôm như là một cơ chất” đã xác định: Hoạt tính tốt nhất của Chitosan và Chitosanase được xác định ở pH từ 4 đến 6 Nhiệt độ tối thích là

500C.Duy trì hoạt tính được từ 25 đến 400C và bất hoạt ở 700C

Theo tác giả: Ho Geun Yoon, Hee Yum Kim, Hye Kyung Kim, Hong Yon Choie (2000), Đại học Hanseo, Chungnam, Hàn quốc, với đề tài nghiên cứu:

“Enzyme chịu nhiệt Chiosanase từ chủng Bacillus Sp.Strain CK4” đã kết luận:

Enzyme có khối lượng 29 kDa, pH và nhiệt độ tối thích 6.5 và 600C, phân cắt cơ chất Chitosan, dịch keo Chitosan và glycol Chitosan Nhưng không phân cắt chitin Enzyme bền khi qua xử lí ở nhiệt độ 800C trong 30 phút và 700C trong 60 phút cũng như dưới tác nhân làm biến tính protein [10, 38, 24, 28]

2.3.2 Tình hình nghiên cứu enzyme chitosanase trong nước

Đối với Việt Nam, nghiên cứu về chitosan, COS, glucosamine và chitosanase mới được chú ý trong những năm gần đây và đang có những kết quả bước đầu

Năm 1998-2001 đề tài nghiên cứu “Hoàn thiện công nghệ sản xuất Chitin-Chitosan

và sản xuất một số chế phẩm công nghệ và dược học từ vỏ tôm, ghẹ” đã được nghiên cứu

và hoàn thành tại Đại học Thủy sản Nha Trang Căn cứ vào kết quả và tính ứng dụng của

đề tài, Bộ giáo dục và đào tạo đã giao cho trường Đại học Thủy sản Nha Trang thực hiện tiếp dự án thử nghiệm: “Sản xuất Chitin, Chitosan từ phế liệu sản xuất thủy sản (vỏ tôm,

vỏ ghẹ)” (2003) Kết quả thu được đã hoàn thiện quy trình sản xuất chitin, chitosan theo phương pháp hóa học với các mức deacetyl khác nhau, sản xuất thử nghiệm được 25 tấn chitin, 100kg chitosan với chất lượng tốt

Năm 2006, kết quả từ đề tài: “Nghiên cứu sử dụng các hoạt chất sinh học biển để thay thế các chất độc hại trong bảo quản nông thủy sản sau thu hoạch và chế biến thực phẩm” Trần Thị Luyến khoa Chế biến, Trường Đại học Thủy sản Nha Trang lần đầu tiên

đã đưa ra quy trình công nghệ sản xuất COS bằng phương pháp hóa học cùng với khả năng bảo quản nông thủy sản của chitosan, COS trên các đối tượng cam, quýt, cà chua, hành tím và dứa quả, thịt lợn, thịt bò, xúc xích

Ngoài ra còn rất nhiều những đề tài nghiên cứu tại các trường Đại học, các Viện nghiên cứu trong việc phân lập, tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chitosanase hoạt tính cao và các nghiên cứu ứng dụng các chế phẩm trong lĩnh vực bảo quản và chế biến nông sản, bảo vệ môi trường, y dược…như:

Đề tài: “Phân lập và tuyển chọn chủng sinh tổng hợp chitosanase để thu nhận chitooligosaccharide” – 2007 và “Nghiên cứu thu nhận hoạt chất sinh học chitooligosaccharide bằng enzyme chitosanase cho y dược Việt Nam” (2009) – Tác giả: Lê Thanh Hà, Bộ môn Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm Kết quả thu được đã tuyển chọn được các chủng sinh tổng hợp chitosanase cao và thu nhận được hoạt tính sinh học chitooligosaccharide bằng chế phẩm chitosanase thu được

Đề tài: “Bước đầu nghiên cứu thu nhận chế phẩm chitosanase kỹ thuật từ Streptomyces

griseus” – 2008 – Tác giả: Phạm Ngọc Hồng Thùy, Khoa Chế biến, Trường Đại học Nha Trang

Kết quả: tuyển chọn được các chủng sinh tổng hợp chitosanase cao

Đề tài: “Lựa chọn điều kiện nuôi cấy tối ưu để sản xuất chitosanase từ Streptomyces

griseus (Chủng NN2)” – 2009 và “Chọn lựa điều kiện nuôi cấy và thu nhận enzyme chitosanase từ

vi khuẩn Bacillus sp” - 2009, tác giả Ngô Xuân Mạnh, Khoa Công nghệ Thực phẩm, trường Đại

học Nông nghiệp Hà Nội Lựa chọn được các điều kiện nuôi cấy tối ưu để thu nhận chitosanase từ một số vi khuẩn

Đề tài: “Nghiên cứu công nghệ sản xuất enzyme chitinase và chitosanase tái tổ hợp” - 2010-2011, tác giả: Phí Quyết Tiến, Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học – Viện

Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Có thể nói chế phẩm chitosan, chitosanase và COS sẽ còn là một lĩnh vực mở rộng

và đang được quan tâm không chỉ của các nhà nghiên cứu mà còn của các nhà sản xuất trong nước và quốc tế

PHẦN III VẬT LIỆU – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Vi khuẩn Bacillus licheniformis (chủng NN1) được phân lập từ suối nước nóng

Kênh Gà (Gia Viễn – Ninh Bình) do bộ môn công nghệ vi sinh, khoa Công nghệ sinh học, học viện Nông nghiệp Việt Nam cung cấp

3.1.2 Môi trường nuôi cấy

Môi trường cấy truyền vi

Dụng cụ: Ống nghiệm, đĩa Petri, các loại bình tam giác, bình định mức, cốc

thủy tinh, ống đong, đũa thủy tinh, các loại pipet, que gạt, que cấy

Thiết bị: Buồng cấy vô trùng (BSC – ECO, xuất xứ Singapore), nồi hấp, tủ

định ôn, tủ sấy, cân điện tử Precisa, máy quang phổ U1600 (Shimadzu, xuất xứ Nhật Bản), máy ly tâm lạnh Mikro 220R (Hettich Zentrifugen, xuất xứ Đức), kính hiển vi quang học, máy khuấy từ IKA RH basic 2 (xuất xứ Đức), máy đo pH Orion

3 star (Thermo scientific, xuất xứ Mỹ), hệ thống sắc ký lỏng Protein FPLC (AKTA purifier, xuất xứ Thuỵ Điển) , bể ổn nhiệt (GFL, xuất xứ Đức), bếp điện (xuất xứ Việt Nam)

Hóa chất: Chitosan tinh khiết và dạng vảy, Amoni sunfate, NaCl , Na2SO3, NaOH, HCl, Na2SO3, agar, tinh bột tan, peptone, cao thịt, cao men, chitosan, manitol, acid dinitrosalicylic, acid citric, acid acetic, phenol, potassitum sodium tartrate, cồn Hóa chất được sử dụng là hóa chất chuẩn có độ sạch P và PA

3.1.4 Địa điểm nghiên cứu

Tiến hành nghiên cứu đề tài tại

Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ sinh học Thực phẩm, khoa Công nghệ Thực phẩm, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

Bộ môn công nghệ vi sinh, khoa công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

3.1.5 Thời gian nghiên cứu

Từ ngày 01/08/2014 đến ngày 25/7/2015

3.2 Nội dung nghiên cứu

- Xác định điều kiện và xây dựng quy trình nuôi cấy tối ưu vi khuẩn Bacillus

licheniformis NN1 có khả năng sinh tổng hợp enzyme chitosanase cao

- Xác định điều kiện và quy trình thu nhận enzyme chitosanase kỹ thuật

- Xác định một số đặc tính của enzyme chitosanase kỹ thuật thu nhận

3.3 Bố trí thí nghiệm

3.3.1 Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1

3.3.1.1 Giữ và bảo quản giống [4]

Sau khi thuần giống, giống được cấy truyền vào môi trường thạch nghiêng ở 370C để giữ giống Sau khi giống đã mọc tốt, bảo quản các ống giống trong tủ lạnh ở nhiệt độ 3 –

40C, sau 2 – 3 tuần phải cấy truyền lại một lần

3.3.1.2 Nuôi cấy [4]

Nuôi cấy quy mô phòng thí nghiệm: 150ml môi trường nuôi cấy được phân chia vào các bình tam giác 250ml hấp vô trùng Sau khi để nguội tiến hành cấy giống đã hoạt hóa với tỷ lệ tiếp giống 7% (hoạt hóa 1 vòng que cấy trong ống nghiệm với thể tích môi trường hoạt hóa 7 ml vào môi trường hoạt hóa ở chế độ vô trùng tiến hành trên máy lắc ở chế độ 200vòng/phút ở 370C) sau đó được đưa vào nuôi cấy trong tủ nuôi ở nhiệt độ 370C, sau 40h nuôi cấy tiến hành ly tâm và thu dịch trong Tiến hành xác định hoạt tính chitosanase

và nồng độ protein trong dịch thu được

3.3.1.3 Xác định điều kiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1 bằng bài toán quy hoạch thực nghiệm

Quá trình sinh tổng hợp chitosanase của vi khuẩn phụ thuộc vào nhiều yếu tố của quá trình nuôi cấy, trong đó các yếu tố nhiệt độ, pH và nồng độ cơ chất chitosan ảnh hưởng rõ ràng tới quá trình sinh tổng hợp chitosanase

Xét ảnh hưởng của đơn yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng tổng hợp chitosanase:

Ảnh hưởng của nhiệt độ:

Thí nghiệm được tiến hành bằng cách thay đổi nhiệt độ từ 25 – 500C (bước tăng t0 = 50Cvới pH bằng 7 và nồng độ chitosan 0.2%

Ảnh hưởng của pH:

Thí nghiệm được tiến hành bằng cách thay đổi pH từ 4 – 9 (bước tăng pH=1), với nhiệt độ đã chọn và nồng độ chitosan: 0.2%

Ảnh hưởng của nồng độ chitosan:

Thí nghiệm được tiến hành bằng cách thay đổi nồng độ chitosan từ 0.1 – 0.4% (bước tăng nồng độ chitosan = 0.1%), với nhiệt độ và pH đã chọn

Sau khi xác định được sự ảnh hưởng của các đơn yếu tố, xác định các mức cơ

sở và cùng khảo sát để giải bài toán quy hoạch thực nghiệm và điểm tối ưu cho vi khuẩn sinh tổng hợp enzyme cao

Tiến hành mô hình hóa và tối ưu hóa quá trình nuôi cấy vi khuẩn Bacillus

licheniformis NN1 nhằm tổng hợp chitosanase bằng phương pháp phản ứng bề mặt

(Response Surface Methodology – RMS)

Các yếu tố thí nghiệm bao gồm:

Dạng của mô hình:

Với k là yếu tố ảnh hưởng (k=3)

Cách bố trí thí nghiệm được trình bày dựa trên bảng ma trận thực nghiệm

(Bảng 3.1) Sau đó sử dụng phần mềm JMP7 giải bài toán mô hình tối ưu hóa điền

kiện nuôi cấy vi khuẩn Bacillus licheniformis (chủng NN1)

Trong đó: b0: Hệ số tự do

b1, b2, b3: Hệ số tuyến tính

b12, b13, b23: Hệ số tương tác đôi

b11, b22, b33: Hệ số bình phương

Tiến hành theo 3 yếu tố ảnh hưởng:

X1: Nhiệt độ (0C)

X2: pH

X3: Nồng độ cơ chất chitosan (%)

Hàm mục tiêu bao gồm:

Y: Hoạt tính enzyme chitosanase (U/ml)

3.3.1.4 Xác định đường cong động học sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1

Đường cong sinh trưởng của vi sinh vật biểu diễn sự biến đổi của số lượng tế bào vi sinh vật theo thời gian trong môi trường nuôi cấy tĩnh Tiến hành nuôi vi khuẩn trong môi trường lỏng (môi trường nuôi cấy) với các điều kiện tối ưu đã lựa chọn, với chế độ lắc 200 rpm Cứ sau 2 giờ ta hút dịch cho vào ống nghiệm, tiến hành đo hấp phụ quang ở bước sóng A620 nm đồng thời xác định hoạt tính enzyme chitosanase Từ đó ta xác định được đường cong sinh trưởng của vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1 chính là sự thay đổi của

độ hấp thụ quang học trong quá trình nuôi cấy Trên cơ sở đường cong sinh trưởng và hoạt tính chitosanase chọn lựa được thời gian nuôi cấy thích hợp

3.3.2 Xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm enzyme chitosanase kỹ thuật

3.3.2.1 Nuôi cấy vi khuẩn

Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn như mô tả mục 3.2.1.2 với các điều kiện nuôi cấy

đã xác định được Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành ly tâm, thu dịch trong và các bước xác định hoạt tính chitosanase và nồng độ protein trong dịch thu được

3.3.2.2 Cô đặc dung dịch enzyme thô bằng phương pháp cô đặc chân không

Dịch thu được sau khi ly tâm bước đầu thường chứa nhiều nước, protein và các hợp chất không mong muốn, nồng độ enzyme quan tâm thấp Do vậy, dich chiết cần được cô đặc ở nhiệt độ thấp để làm tăng nồng độ enzyme Bằng cách tiến cô đặc chân không để loại bỏ nước làm tăng nồng độ enzyme

Tiến hành cô đặc chân không bằng máy cất quay chân không đến khi còn

¼ thể tích dịch ban đầu

3.3.2.3 Tủa phân đoạn amoni sulphat

Dịch cô đặc ở mục 3.3.3.2 được tủa phân đoạn bằng muối amoni sunphate 0 – 30; 30 – 50; 50 – 70; 70 – 90% để tủa chitosanase

Kết tủa enzyme ở 40C: lấy 100ml dịch ezyme đã làm lạnh cho vào cốc thủy tinh, muối amoni sunphate được thêm vào dung dịch đến nồng độ 30%, để qua đêm,

ly tâm 6000 vòng/phút để thu cặn tủa Chú ý trong quá trình cho muối vào thì nên cho từ từ muối vào để tránh hiện tượng biến tính protein cục bộ và được thực hiện trên máy khuấy từ ở 40C trong 30 phút Kết tủa thu được đem hòa tan trong trở lại trong dung dịch đệm acetate pH = 5.5 ta được dịch enzyme phân đoạn 0-30% Sau

đó tủa tiếp dịch thu được sau ly tâm đến nồng độ 50% theo cách tương tự, hòa tan lại kết tủa trong dung dịch đệm acetate pH 5.5 ta được phân xuất 30-50% Làm tương tự đối với các phân đoạn 50-70% và 70-90%

Khối lượng ammonium sunfate được tính theo công thức:

M = a.V/1000 Trong đó: V: là thể tích enzyme đem kết tủa (ml)

a: là giá trị tra bảng khối lượng được trình bày ở phần phụ lục

Tiến hành xác định hoạt tính enzyme chitosanase và hàm lượng protein trong các phân đoạn 0-30%, 30-50%, 50-70%, 70-90%, lựa chọn phân đoạn nào có hoạt tính enzyme cao nhất

3.3.2.4 Loại muối

Chế phẩm enzyme thu được bằng phương pháp này chứa nhiều muối vì vậy cần loại muối bằng phương pháp thẩm tích (dialysis)

Cách tiến hành: Cho dung dịch protein vào túi cellophane, sau đó đặt cả túi

vào dung dịch đệm acetate pH 5.5 0.01M trong điều kiện 40C trong vòng 24h Màng cellophane là màng bán thấm, có kích thước lỗ cho các chất có phân tử nhỏ xuyên

và đi qua vào các dung dịch đệm loãng theo định luật khuếch tán Còn lại trong màng là các chất protein có phân tử lớn