thiết kế và ứng dụng các chỉ thị adn xác định các gen ứng viên liên quan đến tính chịu mặn ở một số giống lúa bản địa của việt nam đã giải mã hệ gen

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ THÙY LIÊN THIẾT KẾ VÀ ỨNG DỤNG CÁC CHỈ THỊ ADN XÁC ĐỊNH CÁC GEN ỨNG VIÊN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU MẶN Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA BẢN ĐỊA CỦA VIỆT NAM ĐÃ

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ THÙY LIÊN

THIẾT KẾ VÀ ỨNG DỤNG CÁC CHỈ THỊ ADN XÁC ĐỊNH CÁC GEN ỨNG VIÊN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU MẶN Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA BẢN ĐỊA CỦA

VIỆT NAM ĐÃ GIẢI MÃ HỆ GEN

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2015

H ỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ THÙY LIÊN

THIẾT KẾ VÀ ỨNG DỤNG CÁC CHỈ THỊ ADN XÁC ĐỊNH CÁC GEN ỨNG VIÊN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU MẶN Ở MỘT SỐ GIỐNG LÚA BẢN ĐỊA CỦA VIỆT NAM ĐÃ GIẢI MÃ HỆ GEN

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Người hướng dẫn khoa học:

TS Khuất Hữu Trung PGS TS Nguyễn Thị Phương Thảo

HÀ NỘI, NĂM 2015

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của TS Khuất Hữu Trung và PGS TS Nguyễn Thị Phương Thảo Các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo

vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn đã được cám

ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2015

Tác giả

Nguyễn Thị Thùy Liên

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được

sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết

ơn sâu sắc tới TS Khuất Hữu Trung, PGS TS Nguyễn Thị Phương Thảo đã tận tình

hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật, Khoa Công nghệ sinh học - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức bộ môn Kỹ thuật di truyền, Viện Di truyền Nông nghiệp đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii

1.5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 3

Phần 2 Tổng quan tài liệu 4

2.2 Nghiên cứu di truyền về giống lúa chống chịu mặn 4 2.2.1 Nghiên cứu di truyền số lượng về tính chống chịu mặn của cây lúa 4 2.2.2 Nghiên cứu di truyền phân tử về tính chống chịu mặn của cây lúa 5

2.3.2 Phương pháp tin sinh học xác định gen ứng viên chịu mặn 9 2.4 Chỉ thị adn trong xác định gen ứng viên liên quan đến tính chịu mặn 12

2.4.2 Phương pháp thiết kế chỉ thị phân tử 13 2.5 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn 14

2.5.3 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn trên thế giới 17 2.5.4 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn tại Việt Nam 19

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv

Phần 3 Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 22

3.5.1 Phương pháp thiết kế chỉ thị ADN xác định các gen ứng viên dựa trên

3.5.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm đồng ruộng 28 3.5.3 Phương pháp lai hữu tính – lai trở lại giữa các giống cho và nhận gen 28 3.5.4 Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 30

Phần 4 Kết quả và thảo luận 33

4.1 Kết quả xác định gen ứng viên chịu mặn 33 4.1.1 Kết quả phân tích thành phần nucleotide vùng CDS (Coding DNA

Sequence) và thành phần amino acid của các gen ứng viên SRWD5

4.1.2 Kết quả tầm soát và thiết kế mồi nhận dạng gen ứng viên SRWD5 chịu mặn 34 4.1.3 Kết quả phân tích thành phần nucleotide vùng CDS (Coding DNA

Sequence) và thành phần amino acid của các gen ứng viên RSS1 38 4.1.4 Kết quả tầm soát và thiết kế mồi nhận dạng gen ứng viên RSS1 chịu mặn 42 4.2 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong xác đinh, chọn lọc cá thể và con lai mang

4.2.1 Kết quả xác định cá thể mang gen ứng viên chịu mặn trong tập đoàn 36

4.2.2 Kết quả lai tạo và chọn lọc cá thể mang gen ứng viên chịu mặn ở các thế

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ADN : Axit Deoxyribonucleic

AFLP : Amplified Fragment Length Polymorphism - Đa hình chiều dài các

đoạn được nhân bản chọn lọc RAPD : Random Amplification of Polymorphic DNA - Đa hình ADN được

nhân bản ngẫu nhiên RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism – Đa hình chiều dài

mảnh phân cắt giới hạn STS : Sequence Tagged Site – Xác định vị trí trình tự đã được đánh dấu NCBI : National Center for Biotechnology Information – Trung tâm quốc

gia công nghệ thông tin về sinh học SNP : Single Nucleotide Polymorphisms – Đa hình nucleotide đơn

SSR : Simple Sequence Repeat - Sự lặp lại của trình tự đơn giản

Bp : Base pair – Cặp bazơ nitơ

cDNA : Complementary DNA – Thư viện ADN bổ trợ

NST : Nhiễm sắc thể

PCR : Polymerase Chain Reaction - Phản ứng chuỗi trùng hợp

QTL/ QTLs : Quantitative Trait Loci - Locus kiểm soát tính trạng số lượng TBE : Tris-Boric Acid-EDTA

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi

Bảng 4.2 Thống kê tỉ lệ (%) amino acid của gen/gen ứng viên SRWD5 34

Bảng 4.3 Thống kê số lượng và tỉ lệ nucleotit của các gen ứng viên SRWD5 ở

Bảng 4.4 Thống kê nucleotide vùng CDS (Coding DNA Sequence) gen/gen

Bảng 4.5 Thống kê tỉ lệ (%) amino acid của gen/gen ứng viên RSS1 40 Bảng 4.6 Bảng thống kê số lượng và tỉ lệ nucleotide của các gen ứng viên RSS1

Bảng 4.7 Kết quả lai tạo con lai ở các thế hệ F 1 , BC 1 F 1 và BC 2 F 1 48

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii

Hình 4.2 Ảnh dóng hàng, dóng cột so sánh trình tự một đoạn gen chịu mặn

RSS1 của một số giống lúa bản địa (đoạn thêm 15 Nu) 44 Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm PCR 36 giống lúa bản địa với chỉ thị

Hình 4.12 Hạt lai BC 2 F 1 (Bắc thơm 7 x Coi ba đất ) sau khi thu hoạch 53

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Nhiễm mặn là một nhân tố phi sinh học làm giảm năng suất tại nhiều vùng trồng lúa trên thế giới Cải tiến tính chịu mặn của lúa tại các vùng nhiễm mặn là mục tiêu quan trọng trong chương trình chọn tạo giống lúa Dựa vào trình tự của 36 giống lúa bản địa của Việt Nam đã được giải mã hệ gen đã xác định được 2 gen ứng viên liên quan

đến tính chịu mặn ở một số giống lúa bản địa của Việt Nam đã giải mã: SRWD5 (SRWD5 TOLERANCE) và RSS1(RICE SALT SENSITIVE 1) Dựa vào kết quả phân tích

thành phần nucleotide vùng CDS (Coding DNA Sequence) và thành phần amino acid của các gen ứng viên; kết quả tầm soát trình tự tương đồng của 36 giống lúa đã giải mã

và so sánh với locus gen có khả năng chịu mặn đã thiết kế được 2 chỉ thị ADN là SRWD5del200 và RSS1del15 đặc trưng cho từng gen ứng viên chịu mặn Thực hiện phép lai trở lại (MABC) của 2 tổ hợp lai: Bắc thơm 7 x Coi ba đất và TSL1x OM6377

đã lai tạo được tổng số 16 hạt lai BC1F1 và 54 hạt lai BC2F1 Sử dụng 2 chỉ thị ADN đã thiết kế để sàng lọc các cá thể từ thế hệ BC 1 F 1 đến thế hệ BC 2 F 1 xác định được 7 cá thể

BC 1 F 1 và 27 cá thể BC 2 F 1 mang gen ứng viên chịu mặn Kết quả nghiên cứu là cơ sở cho việc áp dụng các chỉ thị phân tử trong chương trình chọn tạo giống lúa chịu mặn

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ix

THESIS ABSTRACT

Salt tolerance is an important agronomic trait in Oryza sativa (rice) Salt is a

major abiotic stress that could be harmful to crops in agriculture In this study, based on the genome sequence data of 36 native rice varieties, we have identified two potentially

interesting candidate genes SRWD5 (SRWD5 TOLERANCE) and RSS1(RICE SALT

SENSITIVE 1) The nucleotide sequences of these candidate genes were similar to the

published sequences in Genbank SRWD5del200 and RSS1del15 markers were designed

to test for the presence of SRWD5 and RSS1 candidate genes, respectively This result

is very important serves as a basic for the application of molecular markers in salt

tolerance rice breeding program Based on screening for SRWD5 and RSS1 resistant to

candidate genes, two native resistant rice varieties Coi ba dat; OM6377 were used as the donor plants to transfer the resistant genes to commercial rice varieties Bac thom 7 and TSL1, respectively (Bac thom 7 x Coi ba dat and TSL1 x OM6377) The crossed

progenies were heterozygote for tested to determine the presence of SRWD5 and RSS1

candidate genes Result showed that 7 individual plants of BC 1 F 1 and 27 plants of

BC 2 F 1 carrying resistant gene were shown in heterozygote These lines are being used for further investigations

Keywords: Salt tolerance, marker design, SRWD5 TOLERANCE candidate gene, RSS1

candidate gene, native rice variety

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1

PHẦN 1 MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Lúa (Oryza sativa L.) là một trong những cây lương thực chính đảm bảo an

ninh lương thực, ổn định xã hội ở nhiều quốc gia trên thế giới Ở nước ta, lúa gạo không chỉ là nguồn lương thực tiêu dùng trong nước mà còn là mặt hàng xuất khẩu quan trọng Năng suất và sản lượng lúa luôn bị đe doạ bởi thiên tai, sâu bệnh và các yếu tố môi trường Trong đó, yếu tố đáng chú ý là hiện tượng đất nhiễm mặn Việt Nam với đường bờ biển dài 3.620 km trải dài từ Bắc vào Nam, hàng năm những vùng trồng lúa ven biển chịu ảnh hưởng rất nhiều do sự xâm thực của biển Theo báo cáo mới nhất của Cục trồng trọt đến đầu tháng 3/2015, tại Đồng bằng sông Cửu Long, xâm ngập mặn đã ảnh hưởng đến 620.000 ha/1.545.000 ha lúa đông xuân năm 2009 - 2010, chiếm 40% diện tích toàn vùng Hiện nước mặn đang xâm nhập sâu vào khu vực nội đồng ở các tỉnh ven biển ĐBSCL, có nơi vào sâu đến 60km Mức nhiễm mặn cao nhất tập trung ở các tỉnh Kiên Giang, An Giang, Sóc Trăng bởi ảnh hưởng thủy triều từ biển Tây theo kênh Long Xuyên - Rạch Giá và kênh Vĩnh Tế đổ vào vùng Thoại Sơn (tỉnh An Giang) và khu vực Đông Hồ (tỉnh Kiên Giang) dù trước đó các cửa đập ngăn mặn của vùng tứ giác Long Xuyên đã đóng lại Diện tích có nguy cơ bị xâm ngập mặn cao khoảng 100.000 ha/650.000 ha, chiếm 16% diện tích canh tác lúa của các tỉnh trên Đặc biệt, trong điều kiện khí hậu toàn cầu đang thay đổi, hiện tượng băng tan ở hai cực, nước biển dâng lên đe dọa các vùng đất canh tác thấp ven biển Như vậy, đất nhiễm mặn là một trong những yếu tố chính gây khó khăn cho chiến lược phát triển sản lượng lúa gạo, và ảnh hưởng xa hơn là mục tiêu đảm bảo an ninh lương thực thế giới sẽ khó hoàn thành Do đó, việc hạn chế mức độ gây hại của sự nhiễm mặn đến năng suất lúa gạo là một vấn đề cần được quan

tâm nghiên cứu

Để nhanh chóng tạo ra các giống lúa chịu mặn, hướng nghiên cứu ứng dụng

kỹ thuật chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa đang được sử dụng rộng rãi do

có thể rút ngắn thời gian chọn tạo, việc chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử hiệu quả hơn

và đáng tin cậy hơn chọn lọc kiểu hình (Liu et al., 2003; Pei et al., 2011; Miah et

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2

al., 2013)

Một trong các phương pháp hiện đại hiện nay đó là giải mã toàn bộ hệ gen,

so sánh, đánh giá sự giống nhau (tương đồng) của chuỗi ADN và protein, từ đó

có thể đưa ra dự đoán về chức năng cũng như cấu trúc của những gen mới phát hiện (Sequence alignment) ứng dụng trong nghiên cứu chọn tạo giống

(Thompson et al., 2007, Mueen et al., 2015) Tiếp cận theo định hướng nghiên

cứu mới này, việc “Thiết kế và ứng dụng các chỉ thị ADN xác định các gen ứng

viên liên quan đến tính chịu mặn ở một số giống lúa bản địa của Việt Nam đã giải

mã hệ gen” là rất cần thiết, nhằm đưa ra nguồn thông tin hữu ích để phục vụ cho

việc chọn ra các giống lúa có khả năng chịu mặn

Kết quả nghiên cứu sẽ cung cấp cơ sở dữ liệu và vật liệu cho các nghiên cứu khoa học tiếp theo về cây trồng chống chịu mặn, đồng thời góp phần vào công tác chọn tạo giống lúa có khả năng chịu mặn, phẩm chất gạo tốt, năng suất cao, phù hợp với điều kiện canh tác lúa vùng nhiễm mặn và cơ cấu sản xuất lúa vùng nhiễm mặn ở Việt Nam, giúp người nông dân trồng lúa vùng nhiễm mặn tăng thêm thu nhập, giảm đói nghèo

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

- Mục tiêu tổng quát là xác định các gen ứng viên liên quan đến tính chịu mặn ở một số giống lúa bản địa của Việt Nam đã giải mã, thiết kế các chỉ thị ADN chức năng để ứng dụng trong chọn tạo giống lúa chịu mặn

- Tạo được quần thể F1, BC1F1, BC2F1 của các tổ hợp lai và xác định được

cá thể trong quần thể F1, BC1F1, BC2F1 mang gen ứng viên chịu mặn

1.3 YÊU CẦU CỦA ĐỀ TÀI

- Xác định được các gen ứng viên liên quan đến tính chịu mặn ở một số giống lúa bản địa của Việt Nam đã giải mã;

- Thiết kế được các chỉ thi ADN đặc trưng cho từng gen ứng viên chịu mặn phục vụ công tác nghiên cứu, chọn tạo giống lúa chịu mặn

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3

1.4 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Vì thời gian hạn chế nên đề tài chỉ tập trung các nội dung thiết kế chỉ thị ADN nhận dạng gen ứng viên chịu mặn và ứng dụng trong lai tạo để chọn các cá thể mang gen ứng viên chịu mặn đến thế hệ BC2F1 Đề tài được thực hiện tại Bộ môn Kỹ thuật di truyền và khu ruộng thí nghiệm của Viện Di truyền Nông nghiệp từ tháng 6/2014 đến tháng 11/2015

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

- Kết quả đề tài sẽ cung cấp cơ sở dữ liệu và vật liệu cho các nghiên cứu khoa học về tính chịu mặn, đồng thời góp phần vào công tác nghiên cứu chọn tạo giống lúa có khả năng chịu mặn phù hợp với điều kiện canh tác lúa vùng nhiễm mặn ở Việt Nam

- Những thành công bước đầu trong thiết kế các chỉ thị ADN xác định các gen ứng viên liên quan đến tính chịu mặn sẽ mở ra khả năng ứng dụng rộng rãi trong công tác chọn tạo giống nói chung, không chỉ đối với khả năng chịu mặn mà còn đối với nhiều khả năng kháng khác, đáp ứng nhu cầu lương thực con người

- Những cá thể trong quần thể BC1F1, BC2F1 triển vọng được chọn lọc trong đề tài này sẽ trồng thử nghiệm, đánh giá, chọn ra các dòng lúa mang gen ứng viên chịu mặn để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 4

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TÍNH CHỐNG CHỊU MẶN CỦA CÂY LÚA

Đối với cây lúa, tính chịu mặn là một tiến trình sinh lý phức tạp, thay đổi theo các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của cây Tính trạng bất thụ của bông lúa khi bị stress do mặn được điều khiển bởi một số gen trội, nhưng các gen này không tiếp tục thể hiện ở các thế hệ sau Phân tích diallele về tính trạng chịu mặn, người ta ghi nhận cả hai hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính với hệ số di truyền thấp (19,18%) và ảnh hưởng của môi trường rất lớn (IRGSP, 2005)

Rất nhiều nghiên cứu cho rằng, yếu tố di truyền tính chịu mặn biến động rất khác nhau giữa các giống lúa Vì vậy, muốn chọn giống lúa chịu mặn có hiệu quả, cần nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền tính chịu mặn, từ đó loại bỏ ngay từ những thế hệ đầu những dòng không đáp ứng được yêu cầu của nhà chọn giống

Theo Aslam et al (1993), nghiên cứu di truyền số lượng tính chịu mặn cho thấy,

cả hai ảnh hưởng hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính đều có ý nghĩa trong di truyền tính chịu mặn

Hiện chúng ta có rất ít thông tin về kiểu hình chịu mặn ở giai đoạn trưởng thành của cây lúa Greenway and Munns (1980) chỉ rõ: “Hầu hết các thí nghiệm đều được tiến hành trên giai đoạn mạ với quy mô quần thể hạn chế

và chỉ số Na/K thường được dùng như một giá trị chỉ thị Cây lúa nhiễm mặn

có xu hướng hấp thu Na nhiều hơn cây chịu mặn Ngược lại, cây chịu mặn hấp thu K nhiều hơn cây nhiễm Ngưỡng chịu NaCl của cây lúa là EC = 4 dS/m” Trong quá trình bị nhiễm mặn, nồng độ ion K+ trong tế bào được điều tiết tương thích với cơ chế điều tiết áp suất thẩm thấu và khả năng tăng trưởng tế bào Nhiều loài thực vật thuộc nhóm halophyte và một phần của nhóm glycophyte thực hiện hoạt động điều tiết áp suất thẩm thấu làm cản trở ảnh hưởng gây hại của mặn Hoạt động này sẽ giúp cây duy trì một lượng lớn K+

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 5

khác nhau giữa các giống lúa Vì vậy, muốn chọn giống lúa chịu mặn có hiệu quả, cần nghiên cứu sâu về cơ chế di truyền tính chịu mặn, từ đó loại bỏ ngay từ những thế hệ đầu những dòng không đáp ứng được yêu cầu của nhà chọn giống Nghiên cứu di truyền số lượng tính chịu mặn cho thấy, cả hai ảnh hưởng hoạt động của gen cộng tính và gen không cộng tính đều có ý nghĩa trong di truyền tính chịu mặn

Bằng những thí nghiệm đánh giá tính chịu mặn giai đoạn mạ của cây lúa trong dung dịch dinh dưỡng Yoshida có độ mặn tương đối cao (EC = 12 dS/m) trong môi trường kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh, người ta thấy rằng, tính trạng chiều dài chồi, hàm lượng Na và K ở trong chồi, khối lượng khô của chồi và rễ thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa giống chịu

và giống nhiễm, tính trạng này chủ yếu được điều khiển do hoạt động của một nhóm gen cộng tính Hệ số di truyền tính chống chịu thông qua các tính trạng này rất thấp

Theo Mishra et al (1990), trong giai đoạn trưởng thành của cây lúa, tính

trạng chiều cao cây, năng suất, trong điều kiện mặn được điều khiển bởi nhóm gen cộng tính”

Do ảnh hưởng rất lớn của môi trường bên ngoài, sự thể hiện di truyền là rất thấp trong các tính trạng Bằng phương pháp lai diallel đầy đủ, Gregorio and Senadhira (2002) cho rằng: “có thể tìm ra một số cặp lai tốt phục vụ cho chương trình ưu thế lai Nghiên cứu về di truyền số lượng tính chịu mặn thông qua lai diallel 6 x 6, năng suất thể hiện hoạt động của một nhóm gen cộng tính không có

ý nghĩa trong điều kiện bình thường, nhưng trở nên có ý nghĩa trong điều kiện xử

lý mặn Năng suất lúa bị giảm là do ảnh hưởng của mặn Trong một số giống lúa,

ưu thế hoạt động của gen cộng tính đối với năng suất là điều kiện thuận lợi cho chọn lọc giống cho môi trường mặn”

Nghiên cứu về các thông số di truyền Mishra et al (1990) cho rằng,

chiều dài bông và khối lượng hạt chịu tác động rất ít bởi các yếu tố môi trường, nếu như chọn giống chịu mặn dựa vào hai tính trạng này sẽ không hiệu quả Khối lượng bông, số hạt chắc trên bông, chiều cao cây có hệ số path rất cao trong môi trường mặn Chính ba tính trạng này đóng góp phần lớn trong việc tăng năng suất lúa trong môi trường mặn

2.2.2 Nghiên cứu di truyền phân tử về tính chống chịu mặn của cây lúa Bản đồ QTL (Quantitative Trait Loci) được áp dụng trong trường hợp

những tính trạng mục tiêu do đa gen điều khiển (tính chịu mặn, hạn, lạnh, ) Di

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 6

truyền số lượng truyền thống không thể phát hiện QTL trên những loci riêng biệt gắn với tính trạng số lượng đang nghiên cứu, vị trí của nó trên nhiễm sắc thể và liên kết của nó với những gen khác Bản đồ di truyền phân tử với mật độ cao số lượng marker phủ trên toàn bộ nhiễm sắc thể trong hệ gen cây trồng có thể cung cấp cho chúng ta công cụ có khả năng nghiên cứu tính trạng di truyền số lượng phức tạp, định vị gen trên những nhiễm sắc thể và xác định các gen mục tiêu liên kết với gen khác

Teng (1994) đã sử dụng quần thể cận giao tái tổ hợp (RI) thế hệ F8 bao gồm 324 cá thể thuộc tổ hợp lai giữa IR29/Nona Broka để nghiên cứu di truyền tính chịu mặn của cây lúa Các dòng RI được thanh lọc mặn trong nhà lưới ở điều kiện EC = 15 dS/m và điều kiện đồng ruộng Phân tích RFLP với 5 enzyme phân

cắt hạn chế (DraI, EcoRV, HindIII, ScaI, XbaI) cho thấy trong 266 RFLP

marker, có 117 RFLP marker thể hiện đa hình (43,98%), phủ trên hệ gen cây lúa với mật độ 15 cM/quãng RG100 và RZ323 được ghi nhận cho đa hình rõ nhất

Có 13 marker định vị gần RG100 và RZ323 trên nhiễm sắc thể số 3 cũng được sử dụng để xem xét liên kết gen Phân tích ANOVA một chiều chứng minh Nona Broka mang allele kháng liên kết với RG100 và RZ323 tại các loci số lượng Khi phân tích ANOVA hai chiều, tác giả phát hiện thêm RZ323 (trên nhiễm sắc thể

số 3) và RG333 (trên nhiễm sắc thể số 8) liên kết với QTL chịu mặn Các cá thể tái tổ hợp mang allele từ Nona Broka ở locus RZ323 và từ IR29 ở locus RG333

có kiểu hình sống sót lâu hơn trong môi trường mặn so với những tổ hợp khác Bản đồ QTL (trên cơ sở AFLP và STS marker) cho thấy gen chủ lực điều khiển tính trạng chịu mặn định vị trên nhiễm sắc thể số 1 (saltol) Bên cạnh gen chủ lực, 3 QTL được ghi nhận có quan hệ với tính trạng hấp thu K cao, 4 QTL có quan hệ với tính trạng hấp thu Na thấp và 3 QTL có quan hệ với tính trạng tỷ số Na/K thấp Những QTL này định vị trên nhiễm sắc thể số

1, 3, 4, 10 và 12

2.3 GEN ỨNG VIÊN

Gen ứng viên là các gen với các đa hình phân tử về mặt di truyền liên kết với locus hoặc QTLs chính, hoặc là các gen với các đa hình phân tử về mặt thống kê liên kết với các biến thể của tính trạng đang được nghiên cứu (Pflieger

et al., 2001)

2.3.1 Các bước xác định gen ứng viên

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 7

Gen ứng viên có thể được xác định bởi một số phương pháp, bao gồm kiến thức đã biết về con đường sinh học, các nghiên cứu liên kết gen, nghiên cứu biểu hiện gen, và nghiên cứu liên kết trên toàn bộ hệ gen Các bước xác định gen ứng viên bao gồm: Chọn, sàng lọc và xác nhận gen ứng viên

Hình 1.1 Tóm tắt các bước xác định gen ứng viên

2.3.1.1 Chọn gen vứng viên

a Chọn gen ứng viên chức năng

Gen ứng viên trước tiên được đề xuất dựa trên các nghiên cứu phân tử và sinh lý (gen ứng viên chức năng) hoặc dựa trên dữ liệu liên kết của locus đang được xác định (tất cả các gen liên kết chặt chẽ, có thể là gen ứng viên vị trí) Các thí nghiệm sơ bộ tạo thuận lợi cho sự lựa chọn gen ứng viên Việc xây dựng các thư viện cDNA riêng biệt tương ứng với các cơ quan khác nhau, các giai đoạn phát triển hoặc các phản ứng với stress kèm theo việc sàng lọc các thư viện này hỗ trợ việc tách biệt gen ứng viên Công nghệ cDNA và oligonucleotide microarray cũng cho một hứa hẹn lớn trong việc xác định gen ứng viên và điều chỉnh sự biểu hiện của mRNA hoặc sự biểu hiện của các đa hình trong DNA hệ gen Các đột biến biểu hiện các kiểu hình đặc biệt cũng là nguồn khác của gen ứng viên

b Chọn gen ứng viên vị trí

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 8

Phương pháp này kết hợp phân tích toàn hệ gen và gen ứng viên, trong đó việc xác định gen ứng viên chủ yếu dựa trên thông tin liên kết vật lý trong đoạn nhiễm sắc thể xác định QTL Cách tiếp cận này tập trung vào vùng lân cận của QTLs đã biết, và gen ứng viên được tìm ra từ hàng chục đến hàng trăm thành viên gen có trong các vùng nhiễm sắc thể mục tiêu

Bản đồ các marker cho các gen đã biết chức năng có thể hỗ trợ việc chọn gen ứng viên vị trí Sự lựa chọn này được hoàn thành bởi đánh giá mức độ gần của liên kết với các locus của tính trạng Phương pháp này được ứng dụng rộng

rãi trong việc tách các dòng gen kháng bệnh ở thực vật Phân tích bản đồ so sánh

cũng hỗ trợ việc chọn lựa các gen ứng viên vị trí Bởi các loài có quan hệ họ hàng thường bảo tồn các cấu trúc hệ gen Việc bảo tồn các trình tự, thứ tự và phân bố gen giữa các loài cũng hỗ trợ lựa chọn gen ứng viên vị trí giả định Giải trình tự hệ thống của các dòng cDNA cung cấp một số lượng expressed sequence tags (ESTs) mà rất hiệu quả cho phân tích bản đồ so sánh Bản đồ liên kết của marker EST đã được xây dựng ở ngô và lúa

2.3.1.2 Sàng lọc gen ứng viên

Một khi đã chọn một gen ứng viên, bước tiếp theo các nhà nghiên cứu phải lựa chọn đa hình nào sẽ là hữu ích nhất để xác định vị trí của gen ứng viên trên bản đồ di truyền liên kết giữa marker của gen ứng viên và locus đang được xác định và để tính toán mối tương quan thống kê giữa đa hình của gen ứng viên và biến thể kiểu hình trong một tập các cá thể không cùng phả hệ Trong thực vật, hai phương pháp đang được sử dụng là: vị trí bản đồ di truyền của các gen ứng viên chức năng giả định và các locus mục tiêu liên quan trong tính trạng nghiên cứu cần được so sánh

2.3.1.3 Xác nhận gen ứng viên

Khi gen ứng viên và đa hình thích hợp được chọn, các nhà nghiên cứu thường tiếp tục kiểm tra vai trò của gen này trong các mẫu bệnh và mẫu không bệnh được chọn ngẫu nhiên Việc chọn lọc thành các nhóm riêng biệt giúp cho cách tiếp cận gen ứng viên có thể trả lời câu hỏi: Liệu có 1 alen của một gen ứng viên biểu hiện thường xuyên hơn trong nhóm bệnh hay nhóm không bệnh?

Để xác nhận gen ứng viên, phân tích sinh lý bao gồm đo mức độ biểu hiện của gen ứng viên ở mức độ mRNA (bằng RT-PCR số lượng hoặc northern blotting) hoặc mức độ protein hoặc bằng xác định hoạt động enzyme của gen ứng

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 9

viên (Pflieger et al., 2001)

Chuyển gen là cách cuối cùng để xác định một gen ứng viên cho một tính trạng đơn gen Tuy nhiên, trong một số trường hợp và đặc biệt là các tính trạng phức tạp, nó không cung cấp bằng chứng không thể chối cãi rằng gen ứng viên xác định sự thay đổi tính trạng Trong những trường hợp này, bằng chứng có thể chỉ thu được thông qua tái tổ hợp tương đồng

2.3.2 Phương pháp tin sinh học xác định gen ứng viên chịu mặn

Với sự bùng nổ về thông tin di truyền và thông tin về gen chức năng, các phương pháp xác định gen gây bệnh đã nhanh chóng phát triển Cơ sở dữ liệu bây giờ là rất cần thiết cho quá trình lựa chọn các gen ứng viên kháng bệnh Khi trình tự hệ gen được giải mã, việc xác định gen ứng viên trở nên dễ dàng hơn, tuy nhiên cũng chỉ với các gen đơn Việc phân tích di truyền các tính trạng phức tạp vẫn còn là nhiệm vụ khó khăn, và hầu hết các gen quy định các bệnh do nhiều yếu tố vẫn chưa được phát hiện

Ngày nay, cơ sở dữ liệu đã trở thành một nguồn cốt lõi cho cho các nhà săn gen Các hệ thống thu hồi như Trung tâm Quốc gia về Thông tin công nghệ sinh học của Entrez, hệ thống thu hồi trình tự và hệ thống thu hồi của Maarten cung cấp một sự truy cập dễ dàng và nhanh chóng vào một tập hợp các cơ sở dữ liệu thường xuyên được sử dụng Trọng tâm chính của các hệ thống thu hồi là để lấy một tập hợp các cơ sở dữ liệu nhằm đáp ứng các thắc mắc của người sử dụng Tích hợp các dữ liệu dựa trên bối cảnh di truyền, chẳng hạn như trong trường Đại học California, trình duyệt gen SantaCruz và Ensembl, từng bước hình thành nên giao diện (ví dụ như EnsMart) mà trích xuất dữ liệu dựa trên vị trí nhiễm sắc thể, biểu hiện gen và bản chất gen Việc làm giàu các gen ứng viên sử dụng các giao diện cơ sở dữ liệu, tuy nhiên phụ thuộc nhiều vào kỹ năng hoạt động của các nhà nghiên cứu Phương pháp khác đã được phát triển một cách hệ thống để phát hiện

bộ dữ liệu cho hầu hết các gen ứng viên kháng bệnh

Để xác định gen ứng viên kháng bệnh bằng các nguồn dữ liệu khác nhau, một số phương pháp đã được phát triển, chẳng hạn như Gene2Diseases (G2D) Phương pháp này tạo ra khả năng kết hợp các dạng kiểu hình với các dạng chức năng thông qua các dạng hóa học Phương pháp G2D gần đây đã được mở rộng với dữ liệu gắn trình tự được biểu hiện (expressed sequence tag - EST) Hệ thống mới này làm cho đầu vào kiểu hình cũng đã được cải thiện, nghĩa là làm giảm

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 10

những kiến thức lâm sàng có trước cần thiết để được nhập vào Phiên bản mới của G2D thực hiện tốt hơn, chủ yếu là vì nhiều cơ sở dữ liệu hơn được sử dụng với bộ dữ liệu lớn hơn

2.3.2.1 Phân tích microarray

Gần đây, phân tích microarray về phản ứng với stress mặn của nhiều loài cây trồng đã được thực hiện, đánh giá trên nuôi cấy tế bào, cả cây hoặc từng cơ quan riêng biệt Một số nền tảng dựa trên microarray là có sẵn cho nghiên cứu phiên mã ARN vô sinh căng thẳng liên quan đến stress phi sinh học của cây

trồng Kim et al (2013) đã kiểm tra ảnh hưởng của nồng độ muối cao trên phản

ứng biểu hiện gen ở để hiểu rõ hơn các quy định di truyền của sự tăng trưởng và

sự trao đổi chất trong môi trường độ mặn cao Thí nghiệm sử dụng các giống lúa

đột biến chịu mặn cao Salt10 và Salt23 và giống gốc không có khả năng chịu

mặn Dongjin Sự biểu hiện gen được đánh giá bằng RNA, tách chiết từ mẫu lá ở các giai đoạn xử lý muối khác nhau Kết quả, quan sát được 8.275 gen ứng viên liên quan đến chịu mặn Trong đó, quan sát được 342 ortholog gen và 74 pathway gen gắn với sinh tổng hợp phản ứng với muối Cuối cùng, xác định được 6 gen biểu hiện một cách khác biệt giữa các giống chịu mặn tốt và chịu mặn kém bằng cách so sánh gen pathway và gen ortholog Trong số 6 gen, 3 gen là up-regulated và 3 gen là down-regulated

Juexin Wang et al (2011) đề xuất một quy trình hoàn chỉnh để lựa chọn và

cung cấp một nhóm gen đóng vai trò quan trọng trong kiểm soát mặn từ phân tích

dữ liệu microarray thông qua sử dụng t-test và lựa chọn tính năng lặp đi lặp lại bởi SVM-RFE (Support Vector Machine Recursive Feature Elimination) Sử dụng dữ liệu từ GSE14403 từ GEO (Gene Expres-sion Omnibus) của NCBI để phân tích khả năng chịu mặn ở từng kiểu gen chịu mặn Dữ liệu microarray được

xử lý bằng thuật toán RMA Tiến hành thí nghiệm trên kiểu giống lúa FL478, Pokkali và IR63731, IR29 Các giống gieo trong cát, tưới dung dịch (NaCl và CaCl2 5:nồng độ 1mol) trong 3 ngày (EC = 7.4 dS/m) Sau 30 ngày, nghiên cứu

sử dụng Affymetrix Rice Genome Array (GP2025 từ GEO) để phân tích dữ liệu microarray thể hiện bởi các gen từ mô rễ, giải thích các gen chọn lọc bằng cách

sử dụng kiến thức từ ngân hàng gen và cơ sở dữ liệu từ Gene Ontology Kết quả chọn lọc và phân tích được top 10 gen ứng viên đóng vai trò quan trọng trong phản ứng ở các điều kiện mặn

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 11

Bằng cách phân tích các dữ liệu microarray, Ji Huang et al (2008) đã thấy

có một gen mã hóa protein tên là WD40 lặp đi lặp lại, được quy định bởi stress mặn ở lúa và đặt tên là SRWD1 (Salt responsive WD40 protein 1) Các dữ liệu tìm kiếm được bốn gen bổ sung (SRWD2– SRWD5) để phân tích phát sinh loài, tất cả 5 gen SRWD ở lúa đã được quy định bởi stress muối

Kawasaki et al (2001) đã sử dụng kĩ thuật microarray để theo dõi sự thể

hiện của phân tử transcript và từng quá trình thể hiện gen điều khiển tính chống chịu mặn trong cây lúa Trên cơ sở thư viện cDNA ly trích từ rễ lúa và bộ marker EST của hệ gen cây lúa chịu mặn pokkali, người ta đã áp dụng kỹ thuật microarray để kiểm soát những transcript trong việc so sánh với nghiệm thức không xử lý mặn, thời gian thay đổi từ 15 phút đến 1 tuần lễ trong điều kiện gây mặn nhân tạo Vật liệu được sử dụng là giống lúa pokkali (chuẩn kháng) và giống IR29 (chuẩn nhiễm) Nhóm tác giả này tập trung xem xét phản ứng đối với stress do mặn trong quần thể lai có 1782 transcript dẫn suất từ rễ của cây bị xử lý mặn (NaCl ở nồng độ 150mM) Kết quả này cho thấy một tiến trình điều tiết gen chức năng với nhiều mức đồ khác nhau của transcript Trong giai đoạn đầu tiên, đáp ứng của IR29 chậm hơn so với pokkali Sau 3-6 giờ xử lý mặn, mức độ phong phú của transcript thay đổi nhanh trong Pokkali, còn IR29 có sự suy giảm trong vòng 3 giờ đầu gây nên cái chết của giống này ngay sau đó

2.3.2.2 Phân tích cDNA

cDNA được nghiên cứu để xác định các gen mà các gen này biểu hiện một

cách khác biệt trong phản ứng với stress mặn Nghiên cứu của Zahra et al (2013)

đã xây dựng hai thư viện cDNA từ mRNA của mẫu chồi trong điều kiện mặn ở giai đoạn I (24h) và II (10 ngày) đối với giống lúa At354 (một giống đã cải tiến tính chịu mặn, nhưng chưa xác định gen) Tổng số 3192 và 960 dòng cDNA được sàng lọc từ giai đoạn I và II tương ứng Sau đó, các dòng cDNA được lai khác biệt với mẫu dò được chuẩn bị từ mẫu chồi của At354 trong điều kiện ức chế mặn và đối chứng (không bị ức chế mặn) Các dòng cDNA được xác định là biểu hiện một cách khác biệt được tái khẳng định bằng RNA dot blot method RT-PCR (relative reverse transcription polymerase chain reaction) được thực hiện để so sánh mức độ biểu hiện của các gen được xác định Giải trình tự và tìm kiếm tương đồng liên tiếp đã xác định 14 gen up-regulated và 17 gen down-regulated trong giai đoạn I Tương tự, 11 gen up-regulated và 2 gen down-regulated được xác định trong giai đoạn II Những gen này có thể cho phép khám

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 12

phá con đường mới cho việc thao tác chịu mặn ở lúa

Nghiên cứu xác định số lượng các biểu hiện của gen SalT –gen được cho

rằng có khả năng chịu mặn, mô tả các vùng promoter của gen này và xác định

được các yếu tố cis- có thể sẽ tham gia vào việc biểu hiện gen có khả năng chịu mặn Kết quả đã tìm được promoter Os01g0348900-SalT không duy trì mối quan

hệ trực tiếp với khả năng chịu mặn nhưng với cơ chế cho phép thích nghi với

điều kiện này (Letícia C Benitez, Luciano C da Maia et al., 2013)

Gen SalT mã hóa muối cho một nhóm các protein carbonhydrate (lectin)

Một số tác giả cho thấy sự gắn kết của lectin để loại đường có vai trò quan trọng trong việc kích thích phản ứng với stress phi sinh học, điều chế tín hiệu trong

màng tế bào và tế bào chất (Van Damme et al., 2004) Ở lúa gen này đã được

phân lập và đặc trưng ở cây trồng chịu mặn, xác nhận sự tham gia của mình trong

việc thích ứng với điều kiện của cơ chế thẩm thấu (Zhang et al., 2000)

2.4 CHỈ THỊ ADN TRONG XÁC ĐỊNH GEN ỨNG VIÊN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU MẶN

2.4.1 Chỉ thị ADN

Chỉ thị phân tử (chỉ thị ADN) là các chỉ thị chọn lọc trực tiếp dựa trên cấu trúc phân tử ADN Số lượng các chỉ thị ADN là rất lớn, cây trồng có khoảng

108 - 1010 nucleotide trong ADN tổng số và vì thế, nếu giữa 2 cá thể chỉ cần có

sự sai khác nhỏ thì giữa chúng sẽ có một số lượng khổng lồ các chỉ thị ADN để phân biệt sự sai khác đó Theo lý thuyết, một chỉ thị ADN lý tưởng phải đáp ứng đầy đủ các yêu cầu sau:

- Cho đa hình cao

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 13

ADN (chỉ thị RFLP, RADP, SSR…)

2.4.2 Phương pháp thiết kế chỉ thị phân tử

Mồi là một chuỗi oligonucleotide sợi đơn ngắn (kích thước thường từ 18 –

24 nucleotide) Có hai loại mồi được sử dụng cho chẩn đoán bệnh cây:

- Mồi chung (universal/degenerate primers): được thiết kế trên các vùng bảo thủ cao, có khả năng phát hiện các đối tượng khác hẳn nhau (thường các đối tượng của một chi, một họ)

- Mồi đặc hiệu (specific primers): được thiết kế trên các vùng có thể phân biệt được loài, thậm chí dưới loài như chủng/nòi/type sinh học…

Có được các mồi tốt là bước quan trọng nhất trong chẩn đoán bệnh cây Có

2 cách để có thể nhận được các mồi tốt

- Tham khảo và lựa chọn từ các nghiên cứu đã được công bố

- Tự thiết kế mồi

Để tự thiết kế mồi dựa trên các chuỗi gen sẵn có trên Genbank, người ta cần

sử dụng một phần mềm có khả năng căn trình tự đa chuỗi (multiple sequence alignment), chẳng hạn ClustalX, Bioedit, MEGA 6 Ngay sau khi các chuỗi ADN

đã được căn trình tự, chúng ta có thể thiết kế các mồi chung hay mồi đặc hiệu tùy theo yêu cầu

Các chú ý khi thiết kế mồi

- Độ dài mồi: Nên nằm trong khoảng 18-22 nucleotide Độ dài này đủ dài

để đảm bảo tính đặc hiệu và đủ ngắn để mồi gắn đễ dàng vào khuôn

- Nhiệt độ tách chuỗi (Tm = Melting Temperature): Tm là nhiệt độ mà tại

52-580C

- Nhiệt độ gắn mồi (Ta = annealing temperature): Ta được tính dựa trên Tm Taquá cao làm mồi khó gắn vào khuôn dẫn tới năng xuất PCR thấp Ta quá thấp làm mồi dễ gắn không đặc hiệu vào khuôn dẫn tới tạo các sản phẩm không đặc hiệu Ta

của 2 mồi xuôi và ngược dòng nên tương đương Có nhiều cách tính Ta:

Ta = 0.3 x Tm(mồi) + 0.7 Tm (sản phẩm) – 14.9

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 14

Đầu 3’ không nên có nhiều hơn 3 gốc liên tục G/C

Việc lựa chọn chiều dài mồi và nhiệt độ nóng chảy của chúng dựa vào một số lý do Nhiệt độ nóng chảy của mồi được định nghĩa là nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ của mồi mà sẽ anneal khuôn ADN và cao hơn nhiệt độ làm mồi rời khỏi khuôn ADN Nhiệt độ nóng chảy cần tăng lên theo độ dài của mồi Mồi quá ngắn

sẽ làm anneal một số vị trí trên khuôn ADN dài, dẫn đến các bản sao không đặc hiệu Nói cách khác, chiều dài của mồi bị giới hạn bởi nhiệt độ làm nóng chảy

nó Nhiệt độ nóng chảy quá cao, nghĩa là trên 80°C, có thể gây ra một số vấn đề

do ADN polymerase ít hoạt động ở nhiệt độ này Chiều dài tối ưu của mồi vào khoảng 30 đến 40 nucleotide với nhiệt độ nóng chảy vào khoảng 60°C đến 75°C

Có một số cách để tính nhiệt độ nóng chảy (Tm) của mồi (A, G, C và T tương ứng là số nucleotide của mồi [Na+] là nồng độ Na+ trong PCR)

Các chuỗi lặp

Mồi không nên chứa nhiều chuỗi lặp kép (ví dụ TATATATA) hoặc chuỗi lặp đơn (ví dụ TTTT) vì có thể gây ra hiện tượng bắt cặp nhầm (misprime) Trong một mồi, chỉ nên có tối đa 4 chuỗi lặp Các chuỗi lặp cũng không nên xuất hiện nhiều lần trong 1 mồi

Độ ổn định đầu 3’

Tận cùng đầu 3’ (khoảng 5 nucleotide) không nên chứa toàn gốc G hoặc C

vì có giá trị ∆G cao dễ dẫn tới bắt cặp không đặc hiệu vào khuôn Trái lại nếu đầu 3’ chứa quá nhiều gốc T hoặc A sẽ khó bắt cặp

Vùng thiết kế mồi của khuôn

Vùng thiết kế mồi của khuôn không nên chứa quá nhiều cấu trúc thứ cấp Nếu các cấu trúc thứ cấp này ổn định ở nhiệt độ gắn mồi thì mồi sẽ không thể bắt cặp được

2.5 ỨNG DỤNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG CHỌN TẠO GIỐNG LÚA CHỊU MẶN

Từ lâu, các nhà chọn giống đã quan tâm đến các chỉ thị hình thái liên kết với một số tính trạng nông học quan trọng và sử dụng chúng như một phương tiện hữu ích trong quy trình chọn tạo giống mới Ở đây, thay vì phải đánh giá kiểu hình của cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong muốn, người ta chỉ cần đi tìm những cá thể riêng biệt mang các chỉ thị hình thái

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 15

liên kết với các gen đó Tuy nhiên các chỉ thị hình thái vốn có số lượng không nhiều, còn những chỉ thị “may mắn” (liên kết với gen quan tâm) lại càng hiếm gặp, vì thế giá trị thực tiễn của chỉ thị hình thái trong chọn giống gặp nhiều hạn chế Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chỉ thị phân tử, các nhà chọn giống bắt đầu quan tâm mạnh mẽ hơn tới vấn đề “chọn giống nhờ chỉ thị phân tử” (Marker assisted selection - MAS) với ý đồ sử dụng các chỉ thị phân tử liên kết với các gen mong muốn trong chọn tạo giống mới So với chỉ thị hình thái, chỉ thị phân tử có những ưu thế sau:

- Kiểu gen của các locus chỉ thị phân tử có thể được xác định tại bất kỳ giai đoạn nào và ở bất cứ mức độ nào: tế bào, mô hay toàn bộ cơ thể, trong khi kiểu hình của phần lớn các chỉ thị hình thái chỉ có thể phân biệt được trong những giai đoạn nhất định và thường ở mức độ toàn bộ cơ thể

- Số lượng các chỉ thị phân tử là cực kỳ lớn, trong khi số lượng các chỉ thị hình thái rất hạn chế

- Các alen khác nhau của chỉ thị phân tử thường không liên kết với các hiệu ứng có hại, trong khi việc đánh giá các chỉ thị hình thái thường hay đi kèm với những hiệu ứng kiểu hình không mong muốn

- Các alen của các chỉ thị phân tử phần lớn là đồng trội, vì thế cho phép phân biệt mọi kiểu gen ở bất kỳ thế hệ phân ly nào, còn các alen của các chỉ thị hình thái thường tương tác theo kiểu trội - lặn, do đó bị hạn chế sử dụng trong nhiều tổ hợp lai

- Đối với chỉ thị hình thái, các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc đánh giá các cá thể phân ly ở trong cùng một quần thể phân ly, còn đối với chỉ thị phân tử, hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất hiếm gặp

2.5.1 Các giả thuyết mô hình MAS

Trong những năm gần đây, một vài mô hình MAS đã được các nhà khoa học đưa ra và được phân tích cặn kẽ Theo một số mô hình, chỉ cần tiến hành lai trở lại qua 4 thế hệ, chứ không cần đến 6 thế hệ, ngay cả khi quần thể chọn lọc có kích thước nhỏ và các giữ liệu về chỉ thị phân tử bị hạn chế Hơn thế nữa, Frisch

M (1999) đã đưa ra chiến lược “chọn lọc hai giai đoạn” để áp dụng trong trường hợp chưa biết các thông tin về bản đồ liên kết của các chỉ thị phân tử

Theo Robert Koebner (2003), những tính toán dựa trên cơ sở máy tính

để so sánh các chiến lược chọn lọc 2 bước, 3 bước và 4 bước (stage) về tỷ lệ kiểu

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 16

gen bố mẹ phục hồi (recurrent parent genotype - RPG) cho thấy:

- Với chiến lược lấy mẫu 4 bước và quần thể từ 50 - 100 cá thể, tỷ lệ kiểu gen giống bố mẹ (RPG) có thể đạt 96% với độ tin cậy 90% Trong khi chọn giống truyền thống phải cần tới 6 thế hệ và với rủi ro lớn hơn

- Việc tăng số lượng chỉ thị để đánh giá kiểu gen ở mỗi thế hệ có rất ít tác dụng Khi ngưỡng 1 chỉ thị/20cM đạt được, việc thêm chỉ thị nữa là không cần thiết (ngoại trừ các chỉ thị xung quanh locus quan tâm) Tỷ lệ tái tổ hợp chứ không phải số lượng chỉ thị là yếu tố hạn chế trong việc giảm các cản trở liên kết Điều đó cho thấy, việc lấy mẫu quần thể lớn hơn với ít chỉ thị hơn có tác dụng hơn việc làm ngược lại Bert Collard & David Mackill (1998) đưa ra khái niệm chọn lọc giống lúa dựa trên chỉ thị phân tử (Marker assisted selection - MAS) là sử dụng chỉ thị ADN liên kết chặt với locus mục tiêu để thay cho chọn lọc đánh giá kiểu hình với giả định chỉ thị ADN (ADN markers) có thể dự đoán kiểu hình một cách đáng tin cậy

Theo Mackill (2006): MAS ứng dụng trong chọn tạo giống lúa có những ưu điểm nổi bật là:

- Đặc biệt với những tính trạng khó đánh giá thanh lọc dựa trên kiểu hình

- Tiết kiệm thời gian và nguồn lực trong quá trình chọn lọc

- Rất quan trọng với một số tính trạng như chất lượng hạt

- Có thể chọn lọc sớm, trước khi gieo trồng, có thể chọn ngay ở thế hệ phân ly F2 hoặc F3

- Không bị ảnh hưởng của môi trường

- Có thể phân biệt giữa đồng hợp và dị hợp và chọn lọc từng cây

Chọn tạo giống lúa ứng dụng chỉ thị phân tử gồm đánh giá nguồn vật liệu di truyền trước khi thực hiện một chương trình chọn giống Trong một số trường hợp thuận lợi, đôi khi các nhà chọn giống chỉ cần lai trở lại 3 thế hệ là có thể đạt được mục tiêu của mình

2.5.2 Điều kiện để ứng dụng MAS

Theo E Francia (2005), sự thành công của hệ thống chọn giống nhờ MAS phụ thuộc vào các yếu tố:

- Bản đồ di truyền với một số lượng hợp lý các chỉ thị đa hình tại các

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 17

vùng tương đồng để định vị chính xác QTLs hay gen quan tâm

- Mối liên kết chặt giữa chỉ thị và các gen kháng hay các QTLs

- Sự tái tổ hợp thích hợp giữa các chỉ thị và phần còn lại của bộ gen

- Khả năng đánh giá một số lượng lớn cá thể trong một thời gian và giá thành hiệu quả

Có 2 kiểu chỉ thị có thể ứng dụng trong MAS:

- Chỉ thị phân tử được định vị ngay trong phạm vi gen quan tâm Đây là trường hợp lý tưởng nhất cho MAS, nhưng rất khó tìm thấy loại chỉ thị này

quan hệ này tìm thấy khi gen và chỉ thị có khoảng cách vật lý gần nhau Chọn lọc dựa trên chỉ thị này gọi là LD-MAS (linkage disequilibrium - MAS)

Như vậy, chỉ thị phân tử làm tăng thêm hiệu quả sàng lọc trong các chương trình chọn giống với các ưu điểm sau:

- Khả năng chọn lọc ngay từ giai đoạn cây con đang nẩy mầm trong khi nhiều dấu hiệu chỉ có thể sàng lọc khi chúng được biểu hiện ở những giai đoạn muộn hơn trong quá trình sống nếu chỉ sử dụng phương pháp chọn giống cổ điển (ví dụ: chất lượng quả và hạt, tính bất dục đực, khả năng phản ứng chu kỳ quang)

- Khả năng sàng lọc những dấu hiệu mà việc đánh giá các đặc tính này khó khăn, đắt tiền, tốn thời gian (ví dụ như hình thái rễ, tính kháng nhiễm đối với các dịch hại hoặc đối với những nòi, những bệnh đặc hiệu, hay tính kháng những điều kiện gây sốc sinh học như hạn, mặn, thiếu muối, các chất độc)

- Khả năng phân biệt trạng thái đồng hợp tử hay dị hợp tử của nhiều locus trong cùng một thế hệ mà không cần kiểm tra thế hệ sau

- Khả năng chọn lọc đồng thời vài đặc tính trong cùng một thời gian, do vậy mà có thể đưa vào cùng lúc vài gen có giá trị về mặt nông học, ví dụ đưa vào cùng một lúc nhiều gen kháng dịch hại khác nhau Trong trường hợp này, các phương pháp sàng lọc kiểu hình các cá thể thông qua sự lây nhiễm (đồng thời hoặc thậm chí lần lượt từng thể gây bệnh hay từng côn trùng gây hại) rất khó đạt được kết quả Nhưng nếu áp dụng công nghệ chỉ thị phân tử có thể kiểm tra sự có mặt hay vắng mặt của từng alen kháng (hay nhiễm) khác nhau ở từng cá thể riêng biệt

2.5.3 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn trên thế giới

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 18

Sự phát triển của marker phân tử và bản đồ gen cây lúa trong những năm gần đây đã được ứng dụng vào mục đích xác định các QTL điều khiển tính chống chịu mặn của cây, hiện diện trên các nhiễm sắc thể khác nhau Các nghiên cứu của Gregorio (1997) và Niones (2004) đã lập được bản đồ gen rất chi tiết cho

QTL “Saltol” hiện diện trên nhiễm sắc thể số 1, quyết định tới khoảng 40 - 65%

tính chống chịu mặn của lúa

Mohammadi et al (2008) thí nghiệm 33 SSR marker đa hình trên đoạn Saltol của nhiễm sắc thể số 1 nhằm xác định mức độ liên kết và hữu dụng của các marker này trong chọn giống chịu mặn Các SSR marker này được dùng để thử nghiệm trên 36 giống lúa được phân loại thành 5 nhóm: rất chịu, chịu, chịu mặn trung bình, nhiễm mặn và rất nhiễm mặn qua thanh lọc mặn nhân tạo Trong số

33 marker, 6 marker: RM10745, RM1287, RM8094, RM3412, RM493 và

RM140 liên kết chặt với đoạn Saltol ở vị trí 10.8-12.28 Mb Đoạn Saltol có thể

nằm trong vị trí có chứa các marker RM8094, RM3412, RM493 Các giống lúa: IR70023, IR65858, IR69588, IR74105, IR71832, IR74099, Cherivirrupo và IR66946-3R-178-1-1 (FL478) có sản phẩm PCR giống như sản phẩm PCR của Pokkali khi được nhân bản bởi marker RM 8094 và cho tính chịu rất tốt hoặc tốt đối với mặn Do đó, marker RM8094 thể hiện liên kết thuận và chặt chẽ với tính

kháng mặn ở giai đoạn mạ Mohammadi et al (2008) càng khuyến cáo việc sử

dụng hai marker RM8094 và RM10745 trong xác định kiểu gen của cây lúa chịu

mặn có mang đoạn QTL Saltol trong các chương trình lai tạo giống lúa chịu mặn

Những năm cuối thế kỷ 20, các nhà chọn tạo giống đã sử dụng những biến đổi di truyền để tạo ra những giống lúa có tiềm năng năng suất cao, chất lượng gạo tốt, kháng một số sâu bệnh chính và chống chịu với những điều kiện bất lợi như khô hạn, ngập úng, mặn Trong chiến lược chọn tạo giống lúa chịu mặn, Viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI), từ năm 1977-1980 đã tiến hành chọn được những dòng lúa chịu mặn tốt như IR42, IR4432-28-5, IR4595-4-1, IR463-22-2, IR9884-54-3 Năng suất đạt 3,6 tấn/ha trung bình cho tất cả 25 thí nghiệm Những giống lúa cải tiến này cho năng suất cao hơn những lúa cổ truyền 2 tấn/ha

Năm 1993, IRRI phát triển giống lúa IR66946, một giống lúa chịu mặn khá tốt từ tổ hợp lai của Pokkali/IR29 Từ đó hướng lai tạo tập trung vào lai chuyển gen chịu mặn từ Pokkali và một số giống lúa mùa địa phương có tính chịu mặn bằng phương pháp hồi giao vào các nguồn giống lúa cao sản thích nghi với từng

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19

vùng sinh thái trồng lúa riêng biệt Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp lai tạo truyền thống là mất nhiều thời gian Thông thường thì 6-8 lần hồi giao cần được thực hiện, tương đương với 3 - 4 năm lai tạo Một khó khăn khác thường gặp trong lai tạo giống mới là đôi khi có mối liên kết khá chặt chẽ giữa tính trạng chịu mặn với các tính trạng xấu, không mong muốn, thường được lai chuyển vào con lai cùng lúc Các gen điều khiển tính trạng không mong muốn này ảnh hưởng xấu đến biểu hiện của con lai Do đó, lai tạo cho tính trạng chịu mặn trong vài trường hợp mất đến 10 hoặc 15 năm để phát triển một giống lúa mới

Ngoài ra, việc lai tạo giống lúa chịu mặn còn gặp khó khăn do bản chất đa gen của tính trạng chịu mặn Biểu hiện tính chịu mặn của một giống lúa bị ảnh hưởng rất lớn của điều kiện ngoại cảnh Theo Islam (2004) thì hệ số di truyền của tính chịu mặn thấp (<19,18%), nên tính chịu mặn của các dòng con lai thường không cao như bố mẹ có gen sẵn có

Để khắc phục một phần nhược điểm của phương pháp lai tạo truyền thống, người ta kết hợp với các phương pháp sinh học phân tử

Xu et al (1996) đã chuyển gen hvaI của lúa mạch vào giống lúa

Nipponbare Cây lúa chuyển gen và không chuyển gen sau 3 tuần tuổi được xử lý mặn 2 vòng: lần đầu với 200 mM NaCl trong 10 ngày, tiếp theo là không xử lý mặn 10 ngày; lần hai xử lý mặn 30 ngày với 50 mMNaCl Tác giả ghi nhận là cây lúa chuyển gen có tốc độ sinh trưởng và phục hồi tốt hơn cây lúa không chuyển gen khi bị xử lý mặn và không xử lý mặn

2.5.4 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn tại Việt Nam

Nguyễn Thị Lang và cs, (2002) đánh giá tính chịu mặn của 62 giống lúa cổ truyền, với Pokkali là giống chuẩn kháng và giống IR29 là giống chuẩn nhiễm đã thu được các giống chịu mặn là: Nếp áo Già, Trắng Điệp, Móng Chim, Móng Chim Rơi và Nếp Bờ Giếng

Đặng Minh Tâm và Nguyễn Thị Lang (2003) đã nuôi cấy mô 10 giống, bao gồm lúa mùa địa phương và cao sản chống chịu mặn khá (cấp 3-5) Kết quả cho thấy: trong môi trường có chứa NaCl ở mức 1,0 và 1,5% cho tỷ lệ tái sinh cao

Đỗ Hữu Ất (2004) đã nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong cải tạo một số giống lúa địa phương vùng đồng bằng ven biển Bắc Bộ Kết quả gây đột biến nguồn Coban (Co60) đã cho ra những biến dị có lợi cho chọn giống Các giống lúa CM1, CM5 là những giống tạo ra cho vùng mặn, kết hợp được những

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20

đặc tính chịu mặn, kháng đổ ngã, kháng bệnh và cho năng suất cao

Ngô Đình Thức (2006) cũng đã ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô và nuôi cấy túi phấn trong chọn tạo giống lúa chịu mặn đạt được kết quả khả quan Tác giả tạo được 8 dòng biến dị soma từ OM576, IR64, Basmati và VD20 có khả năng chịu mặn ở cấp 5 khi thanh lọc ở giai đoạn mạ với EC = 12 dS/m

Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long từ năm 2009 đến nay đã bước đầu tìm 30 dòng lúa có triển vọng chịu mặn là những dòng lúa kế thừa, được phát hiện chịu mặn qua nhiều lần thanh lọc trong phòng thí nghiệm và nhà lưới

Một số giống lúa mới của Viện Lúa đồng bằng sông Cửu Long xác định có khả năng kháng mặn khá cao như: OM6976, OM6677, OM5464, OM5629,

OM5166, OM 5451, OM 4059 và OM 6164 đã và đang được khảo nghiệm ở một số tỉnh như Sóc Trăng, Kiên Giang, Bến Tre, Bạc Liêu Kết quả khảo

nghiệm ban đầu ghi nhận khá khả quan, trong đó giống lúa OM5464 đang được đề nghị nhân rộng và trình Bộ Nông nghiệp và PTNT công nhận là giống

lúa sản xuất thử trong năm 2010

Vũ Thị Thu Hiền và cs (2012) áp dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử kết hợp với lai trở lại để cải tiến khả năng chịu mặn của giống lúa Việt Nam thích ứng với nước biển dâng Sử dụng giống lúa có khả năng chịu mặn cao

là FL478 là giống cho QTLsaltol để chuyển vào giống lúa nhận gen là giống Bắc

thơm số 7 Tổng số 368 chỉ thị SSR nằm rải rác trên 12 NST được sử dụng để sàng lọc, kết quả xác định được 89 chỉ thị đa hình giữa hai giống bố mẹ (chiếm

24%) trong đó 8 chỉ thị trong vùng saltol và 81 chỉ thị ở các vùng khác Tiếp theo

88 chỉ thị đa hình được sử dụng để phân tích kiểu gen ở mỗi thế hệ lai trở lại Qua

ba thế hệ chọn lọc và tiến hành cho tự thụ đến thế hệ BC3F3 đã thu được 3 dòng có

mang vùng gen Saltol và 100% nền di truyền của giống nhận gen Ba dòng mang QTLSaltol này được đánh giá khả năng chịu mặn nhân tạo và các đặc điểm nông

học khác Kết quả cho thấy các dòng chịu mặn triển vọng đều thể hiện năng suất thực thu cao hơn giống BT7 đối chứng và sẵn sàng cho việc phát triển thành giống lúa Bắc thơm 7 chịu mặn cho các vùng đồng bằng ven biển Việt Nam

Trần Long và cs (2015) sử dụng phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân

tử kết hợp lai hồi giao (Marker Assisted Backcrossing) như là một kỹ thuật cao trong chọn tạo giống góp phần chọn tạo giống lúa chịu mặn, năng suất cao Tổng

số 500 chỉ thị SSR nằm rải rác trên 12 NST được sử dụng để sàng lọc đa hình các

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21

giống bố mẹ, trong đó có 52 chỉ thị trong vùng gen Saltol Chỉ tìm được 63/500

chỉ thị đa hình, được sử dụng để sàng lọc cá thể của các quần thể hồi giao BC1F1,

BC2F1 và BC3F1 Qua ba thế hệ chọn lọc, đã thu được một dòng BC3F1 -

P284-112-291 có chứa vùng gen Saltol và 100% nền di truyền của giống nhận gen và

bốn dòng BC3F1 khác P307-305-21, 195, 198,

P284-112-213 chỉ có một locus dị hợp tử trong số 63 chỉ thị sàng lọc Tiếp tục đánh giá tính chịu mặn của các dòng BC3F2 đến BC3F5 trong điều kiện nhân tạo và trực tiếp trên vùng đất mặn để chọn các dòng chịu mặn triển vọng Đánh giá đặc tính nông sinh học và yếu tố cấu thành năng suất các dòng chọn giống cho thấy có 6 dòng cho năng suất cao hơn giống bố mẹ là B291-1-3, B291-1-9, B291-2-10, B291-2-

2, B291-1-3a, B291-2-5 sẽ được tiếp tục đánh giá tính chịu mặn và phát triển dòng chọn giống ở thế hệ tiếp theo Các kết quả đã chứng tỏ tính hữu hiệu của phương pháp chọn tạo giống bằng chỉ thị phân tử liên kết gen kháng thông qua các thế hệ lai hồi giao

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22

PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

Các nội dung nghiên cứu bao gồm thiết kế chỉ thị ADN nhận dạng gen ứng viên chịu mặn và ứng dụng các chỉ thị ADN đã thiết kế để chọn lọc các cá thể mang gen ứng viên chịu mặn đến thế hệ BC2F1 được tiến hành tại bộ môn Kỹ thuật di truyền và khu ruộng thí nghiệm của Viện Di truyền Nông nghiệp

3.2 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 6 năm 2014 đến tháng 12 năm 2015

3.3 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.3.1 Nguồn vật liệu

- Cơ sở dữ liệu trình tự genome của các giống lúa chịu mặn trong tập đoàn 36 giống lúa bản địa của Việt Nam đã được giải mã thuộc đề tài “Nghiên cứu giải mã genome một số giống lúa địa phương của Việt Nam”

- Các giống lúa nền ưu tú (Bắc thơm số 7, TSL1)

Bảng 3.1 Danh sách 36 giống lúa bản địa đã giải mã

1 Tám xoan Bắc Ninh 19 Coi ba đất

2 Tám xoan Hải Hậu 20 OM5629

3 Tẻ Nương 21 Nếp bồ hóng Hải Dương

4 Nàng thơm chợ đào 22 Tan ngần

9 Một bụi đỏ 27 Kháu điển lư

10 Nàng cờ đỏ 2 28 Nếp mèo nương

12 Chiêm nhỡ Bắc Ninh 2 30 Hom râu

14 Kháu mặc buộc 32 OM3536

H ọc viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23

3.3.2 Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm

3.3.2.1 Dụng cụ thí nghiệm

Máy li tâm eppendorf, máy đo pH HANNA, máy nhân bản gen (PCR), bộ máy điện di đứng CBS, bộ máy điện di ngang CBS, bộ chụp ảnh gel, tủ sấy memmert, cân phân tích, nồi hấp, tủ bảo quản mẫu 4°C, pipetman, ống eppendorf,…

3.3.2.2 Hóa chất

a Hoá chất tách chiết ADN

Hoá chất tách chiết ADN bao gồm các loại như: Tris HCl, EDTA, SDS, NaCl, CTAB, Chloroform, isopropanol, isoamyl alcohol, Ethanol của các hãng Sigma, Merck, Prolabo, ICN và Labscan