nghiên cứu sinh trưởng, phát triển và biến dị của cây cúc in vitro sau khi xử lý ethyl methane sunfonate (ems)

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Nghiên cứu sinh trưởng, phát triển và biến dị của cây cúc in vitro sau khi xử lý Ethyl Methane Sunfonate EMS Nghiên cứu tác động của xử lý EMS đến khả năng sống, sự

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ LIÊN

NGHIÊN CỨU SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN

VÀ BIẾN DỊ CỦA CÂY CÚC IN VITRO SAU KHI XỬ LÝ

ETHYL METHANE SUNFONATE (EMS)

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2015

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ LIÊN

NGHIÊN CỨU SINH TRƯỞNG, PHÁT TRIỂN

VÀ BIẾN DỊ CỦA CÂY CÚC IN VITRO SAU KHI XỬ LÝ

ETHYL METHANE SUNFONATE (EMS)

Chuyên ngành : Công nghệ sinh học

Mã số : 60.42.02.01

Người hướng dẫn khoa học:

PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh

HÀ NỘI, NĂM 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào

Tôi cũng xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn

đã được cảm ơn, các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều được chỉ rõ

nguồn gốc

Hà Nội, ngày … tháng năm 2015

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Liên

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn, tôi đã nhận được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè, đồng nghiệp và gia đình

Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng

và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thị Lý Anh đã tận tình hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo, Viện Sinh học nông nghiệp đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức ở Trung tâm NCƯDKHKT Nông nghiệp Giống cây trồng Thanh Hóa đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận văn./

Hà Nội, ngày … tháng….năm 2015

Học viên

Nguyễn Thị Liên

1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

2.1.4 Tình hình sản xuất hoa cúc trên thế giới và trong nước 6

2.3.3 Giới thiệu về hóa chất Ethyl methane sulfonate (EMS) 13

2.4.1 Vai trò của đột biến thực nghiệm trong công tác chọn tạo giống cây trồng 15

2.4.3 Thành tựu đạt được trên thế giới và Việt Nam với xử lý đột biến bằng EMS 16

3.1 Đối tượng nghiên cứu 19

3.4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự tạo biến dị

và khả năng sinh trưởng của các dạng chồi in vitro 19 2.4.2 Nội dung 2: Nghiên cứu, đánh giá sự sinh trưởng và khả năng phục hồi

3.4.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý EMS đến khả năng tạo cây

4.1.1 Ảnh hưởng của xử lý EMS đến khả năng sống, sinh trưởng của chồi in

vitro giống cúc Vàng chanh và Vàng pha lê 24 4.1.2 Đánh giá sự sinh trưởng và khả năng phục hồi của các dạng chồi xử lý

4.1.3 Ảnh hưởng của xử lý EMS đến khả năng tạo cây hoàn chỉnh của các chồi

DANH MỤC BẢNG

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của xử lý EMS đến khả năng sống, sinh trưởng của chồi in

vitro giống cúc Vàng chanh 24

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của xử lý EMS đến khả năng sống, sinh trưởng của chồi in

vitro giống cúc Vàng pha lê 25

Bảng 4 3: Ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự phát sinh hình thái và sinh trưởng

của các dạng chồi in vitro giống Vàng chanh sau 6 tuần 30

Bảng 4.4 : Ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự phát sinh hình thái và sinh trưởng

của các dạng chồi in vitro giống Vàng pha lê sau 6 tuần 31

Bảng 4.5 : Ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự tạo biến dị và sinh trưởng của các

dạng chồi in vitro giống Vàng chanh ở lần cấy chuyển 1 sau 6 tuần 34

Bảng 4.6 : Ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự tạo biến dị và sinh trưởng của các

dạng chồi in vitro giống Vàng chanh ở lần cấy chuyển 2 sau 6 tuần 35

Bảng 4.7: Ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự tạo biến dị và sinh trưởng của các

dạng chồi in vitro giống Vàng chanh ở lần cấy chuyển 3 sau 6 tuần 36

Bảng 4.8: Ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự tạo biến dị và sinh trưởng của các

dạng chồi in vitro giống Vàng pha lê ở lần cấy chuyển 1 sau 6 tuần 38

Bảng 4.9 : Ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự tạo biến dị và sinh trưởng của các

dạng chồi in vitro giống Vàng pha lê ở lần cấy chuyển 2 sau 6 tuần 39

Bảng 4.10 : Ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự tạo biến dị và sinh trưởng của các

dạng chồi in vitro giống Vàng pha lê ở lần cấy chuyển 3 sau 6 tuần 40

Bảng 4.11: Khả năng ra rễ của chồi sau xử lý EMS của giống cúc Vàng chanh 42

Bảng 4.12: Khả năng ra rễ của chồi sau xử lý EMS của giống cúc Vàng pha lê 44

DANH MỤC ĐỒ THỊ

Đồ thị 4.1: Ảnh hưởng của xử lý EMS đến khả năng sống của giống cúc Vàng

chanh và Vàng pha lê 26

Đồ thị 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ EMS xử lý đến khả năng tạo biến dị của giống cúc Vàng chanh và Vàng pha lê 28

Đồ thị 4.3: Ảnh hưởng của xử lý EMS đến khả năng bật chồi của giống cúc Vàng chanh và Vàng pha lê 51

Đồ thị 4.4: Ảnh hưởng của xử lý EMS đến khả năng nhân chồi in vitro của giống cúc Vàng chanh và Vàng pha lê 51

Đồ thị 4.5: Tỷ lệ dạng A giống Vàng chanh qua 3 lần cấy chuyển 37

Đồ thị 4.6: Tỷ lệ dạng C giống Vàng chanh qua 3 lần cấy chuyển 37

Đồ thị 4.7: Tỷ lệ dạng D giống Vàng chanh qua 3 lần cấy chuyển 37

Đồ thị 4.8: Tỷ lệ dạng E giống Vàng chanh qua 3 lần cấy chuyển 37

Đồ thị 4.9 : Tỷ lệ dạng G giống Vàng chanh qua 3 lần cấy chuyển 37

Đồ thị 4.10: Tỷ lệ dạng A giống Vàng pha lê qua 3 lần cấy chuyển 41

Đồ thị 4.11: Tỷ lệ dạng C giống Vàng pha lê qua 3 lần cấy chuyển 41

Đồ thị 4.12: Tỷ lệ dạng D giống Vàng pha lê qua 3 lần cấy chuyển 41

Đồ thị 4.13: Tỷ lệ dạng E giống Vàng pha lê qua 3 lần cấy chuyển 41

Đồ thị 4.14: Tỷ lệ dạng G giống Vàng pha lê qua 3 lần cấy chuyển 41

Đồ thị 4.15: Sự tăng trưởng chiều cao, khả năng tạo rễ và chiều dài rễ giống cúc Vàng chanh trong giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh 43

Đồ thị 4.16: Sự tăng trưởng chiều cao, khả năng tạo rễ và chiều dài rễ giống cúc Vàng pha lê trong giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh 44

Đồ thị 4.17: Ảnh hưởng của xử lý EMS đến chiều cao chồi in vitro của giống cúc Vàng chanh và Vàng pha lê 52

Đồ thị 4.18: Ảnh hưởng của xử lý EMS đến khả năng tạo lá của giống cúc Vàng chanh và Vàng pha lê 52

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1: Sự kết cặp nhầm chuyên biệt do đột biến cảm ứng alkyl hóa 14

Hình 4.1: Phân dạng các biến đổi hình thái chồi tái sinh 28

Hình 4.2: Hình ảnh chồi in vitro giống Vàng chanh cấy chuyển lần 3 53

Hình 4.3: Hỉnh ảnh chồi in vitro giống Vàng pha lê cấy chuyển lần 3 53

Hình 4.4: Chồi in vitro cúc Vàng chanh trong giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh 53

Hình 4.5: Chồi in vitro cúc Vàng pha lê trong giai đoạn tạo cây hoàn chỉnh 54

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Nghiên cứu sinh trưởng, phát triển và biến dị của cây cúc in vitro sau khi xử

lý Ethyl Methane Sunfonate (EMS)

Nghiên cứu tác động của xử lý EMS đến khả năng sống, sự sinh trưởng và sự hình

thành các dạng biến dị của cây cúc in vitro, nhằm tìm kiếm phương pháp hữu hiệu để

tạo nguồn nguyên liệu cho công tác chọn tạo giống cây cúc Trong thí nghiệm, các đoạn

thân mang mắt ngủ của cây in vitro (giống Vàng chanh và Vàng pha lê) được xử lý với

nồng độ EMS khác nhau (nồng độ EMS: 0%EMS, 0.25%EMS, 0.5%EMS, 0.75%EMS, 1%EMS) Khả năng sống và tái sinh của mẫu cấy giảm dần khi tăng nồng độ EMS xử

lý Sau xử lý, thu được sáu dạng chồi in vitro ( A, B, C, D, E, G) khác biệt nhau về hình

thái Tỷ lệ các dạng chồi biến dị hình thái tỷ lệ thuận với nồng độ EMS xử lý Tính ổn

định của các dạng chồi in vitro được đánh giá qua ba lần cấy chuyển trên môi trường

nhân MS + 1 mg/l BA Sau ba lần cấy chuyển, các dạng chồi sống sót đều chuyển về dạng A (dạng đối chứng) Khả năng tạo cây hoàn chỉnh của các chồi sống sót sau 3 lần

cấy chuyển in vitro ở các nồng độ xử lý EMS khác nhau là không giống nhau Chiều dài

rễ và số rễ tỷ lệ nghịch với nồng độ EMS xử lý

THESIS ABSTRACT

Study on growth, development and variation of in vitro chrysanthemum after

Ethyl Methane Sulfonate(EMS) treatment

The study on the effects of EMS treatment on the survival, growth and variation

formation of in vitro chrysanthemum was conducted in order to identify sufficient

method of creating material source for the selection of chrysanthemum varieties In the

experiment, stem segments carrying dormant buds of in vitro plantlets (Vang Chanh and

Vang Pha Le cultivars) were treated with various EMS concentrations(0%, 0.25%, 0.5%, 0.75% and 1%) The viability and regeneration ability of explants decreased with

increasing concentration of EMS treatment After treatment, six types of in vitro buds

(A, B, C, D, E and G) were obtained and morphologically differedfrom each other The rate of variable buds was proportional to the concentration of EMS treatment.The

stability of in vitro buds was assessed after three times of subcultures on propagated

medium MS + 1mg/L BA After three transplanting times, all survived buds turned into A-type bud (control type) In addition, there were differences in the ability to grow into plantlets of the survived buds after three transplanting times at different EMS concentrations Root length and root quantity was inversely proportional to the concentration of EMS treatments

PHẦN 1

MỞ ĐẦU

1.1 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cùng với sự phát triển của xã hội đời sống của con người ngày càng được nâng cao, thị hiếu yêu cầu và thẩm mĩ của con người cũng không ngừng phát triển Trong nông nghiệp cùng với những yêu cầu ngày càng cao về lương thực, thực phẩm thì cây hoa cũng đã trở thành một nhu cầu không thể thiếu trong đời sống con người Sản xuất hoa đã trở thành một ngành thương mại cao, mang lại lợi ích lớn cho nền kinh tế của các nước

Đa số các giống hoa cúc được trồng ở nước ta phải nhập từ nước ngoài, nên chi phí sản xuất cao, không chủ động trong sản xuất, năng suất chất lượng sản phẩm chưa đáp ứng được nhu cầu, thị hiếu của người tiêu dùng Đặc biệt các giống này chưa thích ứng với điều kiện sinh thái của nước ta Vì vậy, việc phát triển cây hoa có giá trị này không chỉ là việc nhân nhanh các giống nội nhập hay tìm ra những biện pháp kỹ thuật nhằm nâng cao năng suất chất lượng mà còn phải tạo ra được những giống hoa cúc mới đáp ứng nhu cầu thị trường và phù hợp với điều kiện sinh thái của Việt Nam

Phương pháp chọn tạo giống bằng gây tạo đột biến được nghiên cứu, phát triển từ giữa thế kỷ 20 và ngày càng phát triển rộng rãi mang lại những thành tựu to lớn trong công tác chọn tạo giống cây trồng Theo báo cáo của Tổ chức Năng lượng nguyên tử quốc tế, tính đến năm 2013 đã có 3.200 giống cây trồng đột biến thuộc trên 200 loài khác nhau được công nhận và ứng dụng trong sản xuất (IAEA, 2013) Hơn thế nữa, việc gây tạo đột biến nhân tạo kết hợp với nuôi cấy mô tế bào thực vật

in vitro đã trở thành công cụ hữu hiệu giúp giảm thiểu chi phí và thời gian chọn tạo

giống cây trồng mới Kỹ thuật xử lý đột biến in vitro đã gây tạo và làm tăng tần số

xuất hiện đột biến với các tính trạng có giá trị kinh tế ở các loài thực vật nói chung

và cây hoa nói riêng, góp phần không nhỏ cho việc cải tiến giống cây trồng (Okamura, 2006; Shu, 2009; IAEA, 2009, 2013) Bằng phương pháp chọn lọc và lai tạo thông thường để tạo một giống cây trồng mới ổn định về năng suất, có chất

lượng cao phải mất 6-10 thế hệ, nhưng nếu áp dụng phương pháp đột biến in vitro

chỉ cần 3-6 thế hệ Phương pháp này được đánh giá là một trong những thành tựu của thế kỷ 20 ( Đào Thị Thanh Bằng và cs., 1997)

Hiện nay trên thế giới việc nghiên cứu sử dụng các tác nhân như Ethyl

methane sulphonate (EMS) để gây đột biến in vitro cho nhiều loại cây trồng được

nhiều tác giả quan tâm và mang lại hiệu quả cao trong công tác chọn tạo giống cây

trồng mới (Arani and Majidi, 2004; Tulmann et al., 2004; Luan và cs., 2007; Shin et

al., 2007; Nguyễn Thị Lý Anh và cs., 2009) Trong khi đó ở Việt Nam việc nghiên

cứu xử lý đột biến in vitro trong chọn tạo giống cây trồng nói chung và cây hoa nói

riêng còn nhiều hạn chế Để gia tăng tần xuất xuất hiện biến dị nhằm tạo nguồn nguyên liệu phong phú cho chọn tạo giống hoa cúc mới, chúng tôi tiến hành đề tài:

“ Nghiên cứu sinh trưởng, phát triển và biến dị của cây cúc in vitro sau khi xử

lý Ethyl Methane Sunfonate (EMS) ”.

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

+ Xác định được ảnh hưởng của các nồng độ xử lý EMS trong in vitro đến khả

năng sống và tái sinh chồi của mẫu cấy đối với cây hoa cúc

+ Đánh giá được đặc điểm sinh trưởng, các biến dị của các giống hoa cúc sau xử lý

EMS trong điều kiện nuôi cấy in vitro ở giai đoạn nhân chồi, tạo cây hoàn chỉnh

+ Xác định được nồng độ xử lý EMS thích hợp đối với cây hoa cúc

1.3 PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu các đặc điểm sinh trưởng, sự biến dị trong điều kiện in vitro của

2 giống hoa cúc Vàng chanh và Vàng pha lê được xử lý bằng EMS tại Viện Sinh học Nông nghiệp, Học Viện Nông nghiệp Việt Nam

1.4 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI, Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI

1.4.1 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học của đề tài

- Đây là đề tài đầu tiên tiến hành nghiên cứu xử lý tác nhân đột biến hóa học

(EMS) cho cây hoa cúc trong điều kiện in vitro ở nước ta Kết quả nghiên cứu của

đề tài sẽ cung cấp các dẫn liệu khoa học có giá trị về ảnh hưởng của tác nhân đột

biến hóa học (EMS) cho cây hoa cúc trong điều kiện in vitro thông qua việc xác định được khả năng sống, sự sinh trưởng và sự thay đổi tỷ lệ các dạng biến dị in

vitro qua các lần cấy chuyển mẫu Trên cơ sở đó tìm được nồng độ xử lý EMS trong

in vitro hiệu quả cho cây hoa cúc

- Kết quả nghiên cứu có thể làm tài liệu tham khảo có giá trị cho việc nghiên cứu, giảng dạy về ứng dụng công nghệ sinh học trên cây hoa cúc và lĩnh vực chọn tạo giống cây trồng đột biến

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Các dòng hoa cúc thu được sau xử lý EMS sẽ là nguồn nguyên liệu di truyền khởi đầu cho các nghiên cứu tiếp theo về chọn tạo giống hoa cúc đột biến mới.

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CÂY CÚC

2.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Cây hoa Cúc có tên khoa học là Chrysanthemum, được định nghĩa từ

Chiysos (vàng) và themum (hoa) bởi Linne năm 1973, thuộc lớp hai lá mầm

(dicotyledoneae), phân lớp cúc (asteridae), bộ cúc (asteraleae), họ cúc (asteraceae), chi Chrysanthemum (Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến, 1998) Theo điều tra hiện nay, chi chrysanthemum ở Việt Nam có 5 loài và trên thế giới có 200 loài Các giống thuộc chi này đều được sử dụng làm hoa, cây cảnh Chi Chrysanthemum được trồng phổ biến như một loài hoa trồng chậu hay hoa cắt cành

Họ Cúc Asteraceae là một trong những họ lớn nhất của ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta), thực vật hạt kín (Asgniospermatophyta) (Takhtajan, 1987) Qua hai cuộc hội thảo quốc tế về họ Asteraceae năm 1967 và 1994 mang tên “Sinh học

và hóa học của họ cúc” đã có sự thống nhất tương đối về hệ thống học của họ Asteraceae Họ cúc trên thế giới xếp trong 2 phân họ, 13 tông (Kere Bremer, 1994), Việt Nam có khoảng 1550 chi với 23000 loài (Takhtajan, 1987; Lê Kim Biên, 2007) Tuy nhiên, có rất nhiều số liệu khác nhau về số lượng loài hoa cúc Theo GS.TS Khoa học Nguyễn Nghĩa Thìn (2016) thì họ cúc có 2500 loài và 1100 chi Hoa Cúc có nguồn gốc từ Trung Quốc, Nhật Bản và một số nước Châu Âu

Ở Nhật Bản, cây hoa cúc được di chuyển từ Trung Quốc sang, nó được đánh giá rất cao và được mệnh danh là “Hoàng thất quốc hoa”

Ở Việt Nam Hoa Cúc được du nhập vào từ thế kỷ 15, đến đầu thế kỷ 19 đã hình thành một số vùng chuyên nhỏ cung cấp cho dân Một phần để chơi, một phần phục vụ việc cúng lễ Hiện nay hoa Cúc được trồng khắp nước ta nó có mặt ở mọi nơi và trở thành một loại hoa không thể thiếu trong các dịp lễ, tết, hoa trang trí thường ngày

2.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây hoa cúc

* Rễ:

Rễ của cây hoa Cúc là loại rễ chùm, phần lớn phát triển theo chiều ngang, phân bố ở tầng đất mặt từ 5-20cm Kích thước các rễ trong bộ rễ Cúc chênh lệch nhau không nhiều, số lượng rễ rất lớn do vậy khả năng hút nước và dinh dưỡng rất mạnh

Cúc chủ yếu trồng bằng nhân vô tính nên các rễ không phát sinh từ mầm rễ của hạt

mà từ những rễ mọc ở mấu của thân (gọi là mắt) ở những phần ngay sát mặt đất

* Thân :

Cây thuộc thân thảo nhỏ, có nhiều đốt giòn dễ gãy càng lớn càng cứng, cây dạng đứng hoặc bò Kích thước thân cao hay thấp, to hay nhỏ, cứng hay mềm phụ thuộc vào từng giống và thời vụ trồng Những giống nhập nội thân thường to, mập, thẳng và giòn, ngược lại những giống Cúc dại hay giống cổ truyền Việt Nam thân nhỏ mảnh và cong Thân có ống tiết nhựa mủ trắng, mạch có bản ngăn đơn

* Lá :

Thường là lá đơn không có lá kèm, mọc so le nhau, bản lá xẻ thùy lông chim, phiến lá mềm mỏng có thể to hay nhỏ, màu sắc xanh đậm hay nhạt phụ thuộc vào từng giống Mặt dưới phiến lá bao phủ một lớp lông tơ, mặt trên nhẵn, gân hình mạng Trong một chu kì sinh trưởng cây có từ 30-50 lá trên thân

* Hoa , Quả :

Hoa Cúc chủ yếu có 2 dạng :

Dạng lưỡng tính: Trong hoa có cả nhị đực và nhuỵ cái

Dạng đơn tính : Trong hoa chỉ có nhị đực hoặc nhụy cái, đôi khi có loại vô tính (không có cả nhụy, nhị, hoa này thường ở phía ngoài đầu) Mỗi hoa gồm rất nhiều hoa nhỏ gộp lại trên một cuống hoa, hình thành hoa tự đầu trạng mà mỗi đầu trạng là một bông hoa Trong thực tế tuỳ theo mục đích sử dụng mà người ta để một bông trên một cành hay nhiều bông trên một cành

Màu sắc của hoa Cúc rất khác nhau, hầu như có tất cả các màu tự nhiên: Trắng, vàng, đỏ, tím, hồng, nâu, xanh Trong đó, trên mỗi bông hoa có thể có một màu duy nhất, có thể có vài màu riêng biệt hoặc có rất nhiều màu pha trộn, tạo nên một thế giới màu sắc vô cùng phong phú và đa dạng

Tuỳ theo cách sắp xếp của cánh hoa mà người ta phân ra thành nhóm hoa kép (có nhiều vòng hoa sắp xếp trên bông) và nhóm hoa đơn (chỉ có một vòng hoa trên bông) Những cánh hoa nằm ở phía ngoài có màu sắc đậm hơn, xếp nhiều tầng, sít nhau, chặt hay lỏng tuỳ từng giống, cánh hoa có nhiều hình dáng khác nhau: cong hoặc thẳng, có loại cánh ngắn, có loại cánh dài, cuốn ra ngoài hay cuốn vào trong Đường kính của bông hoa phụ thuộc vào giống, giống hoa to có đường kính 10-12cm, loại trung bình 5-7cm và loại nhỏ 1-2cm

Hoa có 4-5 nhị đực dính vào nhau làm thành 1 ống bao xung quanh vòi nhụy, bao phấn nở phía trong theo khe nứt dọc, khi phấn nhị đực chín, bao phấn nở tung

hạt phấn ra ngoài nhưng lúc này nhụy chưa đến tuổi trưởng thành, chưa có khả năng tiếp nhận hạt phấn vì vậy sự thụ phấn, thụ tinh không thành, dẫn đến quả không hạt, muốn có hạt giống phải thụ phấn nhờ sâu bọ hoặc thụ phấn nhân tạo cho hoa

Quả bế, đóng, chứa một hạt, quả có chùm lông do đài tồn tại để phát tán hạt, có phôi thẳng mà không có nội nhũ (Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc, 2005)

2.1.3 Yêu cầu ngoại cảnh của cây cúc

* Ánh sáng

Cúc là loại cây trồng ngắn ngày ưa sáng và lạnh nên quang chu kỳ ảnh hưởng rất lớn đến sự phân hóa mầm hoa và chất lượng hoa cúc Hầu hết các giống hoa cúc thuộc loại cây cần ánh sáng ngày dài trên 13 giờ, còn trong thời gian trỗ hoa, cây chỉ cần ánh sáng ngày ngắn từ 10 -11 giờ và nhiệt độ không khí thấp trên dưới 200C Thời gian chiếu sáng dài cây cúc sinh trưởng mạnh, cây cao, hoa to và đẹp Bởi vậy cúc rất thích hợp với thời tiết thu đông Hiện nay, một số giống cúc mới nhập nội có thể ra hoa trong điều kiện ngày dài điển hình là CN 93, CN 98, CN01, tím hè,… rất thích hợp trồng vào vụ hè, do đó có thể sản xuất cúc quanh năm thay vì chỉ trồng vào mùa đông như trước đây

* Ẩm độ

Ẩm độ đất từ 60 – 70%, độ ẩm không khí 55 – 60% thuận lợi cho cúc sinh trưởng Nếu độ ẩm trên 80% cây sinh trưởng mạnh nhưng lá dễ mắc phải một số bệnh nấm Đặc biệt vào thời kỳ thu hoạch hoa cúc cần thời tiết khô ráo, thoáng mát, nếu độ ẩm không khí quá cao làm cho nước đọng trên các tuyến mật gây thối hoa và sâu bệnh phát sinh phát triển, cây dễ bị đổ non, chất lượng hoa giảm sút, gây khó khăn trong việc thu hoạch

* Dinh dưỡng

Đối với cây hoa nói chung và hoa cúc nói riêng phân bón phải đảm bảo đầy

đủ, cân đối Nếu thiếu phân cây sẽ còi cọc, hoa nhỏ, dễ bị sâu bệnh phá hoại nhưng

nếu bón thừa phân cây sẽ vống cao, dễ bị đổ, khả năng chống chịu kém Các loại phân mà cúc cần bao gồm: phân vô cơ như phân đạm, lân, kali; phân hữu cơ như phân bắc, phân chuồng, phân vi sinh,… và các loại phân vi lượng như Cu, Fe, Zn, Mn…(Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc, 2005)

2.1.4 Tình hình sản xuất hoa cúc trên thế giới và trong nước

2.1.4.1.Tình hình sản xuất hoa cúc trên thế giới

Hiện nay ngành sản xuất hoa nói chung và sản xuất hoa cúc nói riêng trên thế giới đang phát triển mạnh và mang tính thương mại cao Là một ngành mang lại lợi nhuận kinh tế cao cho đất nước và người sản xuất Đến đầu thế kỷ 18, cây hoa cúc là cây hoa quan trọng nhất đối với Trung Quốc, Nhật Bản Ở Hà Lan, cúc là cây quan trọng thứ hai sau hoa hồng Hàng năm kim ngạch giao lưu buôn bán hoa cúc trên thị trường thế giới ước đạt tới 1.5 tỷ USD (Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc, 2003) Hoa cúc là một trong năm loại hoa cắt cành phổ biến trên thế giới Cây cúc thu hút người tiêu dùng ở màu sắc phong phú: trắng, vàng, xanh, tím, đỏ, hồng, da cam,… Không những vậy, hình dáng và kích cỡ hoa rất đa dạng cùng với khả năng

có thể điều khiển cho ra hoa tạo nguồn hàng hóa quanh năm đã khiến cho hoa cúc trở thành loài hoa được tiêu thụ đứng thứ hai trên thị trường thế giới (sau hoa hồng) (Đặng Ngọc Chi, 2006)

Trong các nước Châu Âu, Hà Lan có thể xem là nước đứng đầu thế giới về sản xuất và xuất khẩu hoa nhằm phục vụ cho thị trường tiêu thụ rộng lớn với hơn 80 nước trên thế giới bao gồm hoa cắt, hoa trồng thảm, trồng chậu và trang trí Trong

đó, diện tích trồng hoa cúc của Hà Lan chiếm 30% tổng diện tích trồng hoa tươi Trung bình 1 năm 7 tỷ bó hoa tươi và 600 triệu chậu hoa cảnh các loại với tổng kim ngạch xuất khẩu là 2 tỷ USD/năm

Tiếp đến là Mỹ, ngành trồng hoa có thể xem như là một phần trong nền kinh

tế Mỹ, chiếm khoảng 10 tỷ USD Ở Mỹ các loại hoa truyền thống là cúc, cẩm chướng và hoa hồng Hiện nay, một lượng lớn hoa cắt được nhập khẩu vào Mỹ từ các nước Trung và Nam Mỹ, Hà Lan, các nước vùng biển Caribe

Theo tổ chức sáng kiến thương mại Anh, năm 2007, Colombia là nước xuất khẩu hoa lớn thứ hai thế giới sau Hà Lan với kim ngạch xuất khẩu 700 triệu USD, 85% hoa của Colombia được xuất khẩu cho thị trường Châu Âu với các loại hoa chính là cúc, hoa hồng cẩm chướng

Ở Châu Á, Nhật Bản dẫn đầu về sản xuất và tiêu thụ hoa cúc Hàng năm, Nhật Bản tiêu thụ khoảng 4.000 triệu Euro để phục vụ nhu cầu hoa trồng (Jo

Wijnads, 2005) Người dân Nhật Bản yêu thích hoa cúc và hoa cúc trở thành loài hoa quan trọng nhất tại Nhật Bản chiếm tới 36% sản phẩm nông nghiệp Mỗi năm sản xuất khoảng hơn 200 triệu cành hoa phục vụ cho nhu cầu trong nước và xuất khẩu Diện tích trồng hoa cúc chiếm 2/3 tổng diện tích trồng hoa Năm 2008, diện tích trồng hoa cúc ở Nhật Bản là 16.800 ha, giá trị sản lượng đạt 2.599 triệu USD Tuy vậy, hàng năm Nhật Bản vẫn phải nhập một lượng lớn hoa cúc từ Hà Lan và một số nước trên thế giới như Trung Quốc, Đài Loan, Colombia,…

Tại Trung Quốc, ngành sản xuất hoa phát triển mạnh trong 15 năm gần đây với diện tích hằng năm tăng 24%, giá trị sản lượng tăng 38,8% Năm 2006, diện tích hoa Trung Quốc đạt 722.000 ha với giá trị sản lượng 55,62 tỷ nhân dân tệ Hoa cúc

là 1 trong 10 loại hoa cắt quan trọng sau hoa hồng và cẩm chướng, chiếm khoảng 20% tổng số hoa cắt trên thị trường bán buôn ở Bắc Kinh và Côn Minh Vùng sản xuất hoa cúc chính là Quảng Đông, Thượng Hải, Bắc Kinh bao gồm các giống ra hoa mùa Hè, Thu, Đông sớm và Xuân muộn với các loại cúc đơn với các màu được

ưa chuộng như đỏ, vàng, trắng (Nguyễn Thị Kim Lý, 2001)

2.1.4.2.Tình hình sản xuất hoa cúc ở Việt Nam

Ở Việt Nam, hoa cúc được trồng rộng rãi ở một số thành phố lớn như Hà Nội, Hải Phòng, Đà Lạt, TP Hồ Chí Minh và một số tỉnh lân cận như Vĩnh Phúc , Hưng Yên, Hải Dương……Nếu xét về cơ cấu chủng loại cho tất cả các loại hoa thì trước những năm 1997 diện tích hoa hồng nhiều nhất chiếm đến 31% nhưng từ

1998 trở lại đây diện tích hoa cúc đã vượt lên chiếm 42%, trong khi đó hoa hồng chỉ còn 29,4% Riêng ở Hà Nội tổng giá trị sản lượng hoa cúc năm 1999 đạt 41,3 tỷ đồng, tốc độ tăng trưởng hàng năm khoảng 10% (Nguyễn Xuân Linh và cs, 2000)

Theo số liệu của tổng cục thống kê năm 2006, diện tích trồng hoa cây cảnh của nước ta khoảng trên 13.000 ha Trong đó diện tích trồng hoa cúc chiếm 25 – 30%, chỉ đứng thứ hai sau hoa hồng

Theo số liệu thống kê của Tổng cục Hải quan, trong thời gian từ 17/12/2006 đến 16/1/2007, lượng hoa xuất khẩu của Việt nam đạt gần 2,6 triệu cành với kim ngạch 500 nghìn USD Số lượng doanh nghiệp tham gia xuất khẩu hoa trong thời gian này gồm 5 doanh nghiệp Trong đó, công ty TNHH Agrivina là doanh nghiệp đạt kim ngạch xuất khẩu cao nhất, chiếm tới 95% tổng kim ngạch xuất khẩu hoa cắt cành của Việt Nam Cụ thể trong khoảng 2,5 triệu cành hoa với các chủng loại hoa Cúc, cẩm chướng, hồng, địa lan, lily, đồng tiền mà doanh nghiệp này xuất khẩu thì

hoa cúc vẫn chiếm ưu thế xuất khẩu nhiều nhất với 1,5 triệu cành ( chiếm 61% tổng lượng hoa xuất khẩu của doanh nghiệp)

Theo chương trình phát triển sản xuất hoa của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, đến năm 2010 Việt Nam sẽ xuất khẩu 1 tỷ cành hoa các loại trong đó hoa hồng, hoa cúc và phong lan chiếm 85% Theo chương trình này, diện tích trồng hoa của cả nước sẽ đạt 8000ha cho sản lượng 4,5 triệu cành/lượng hoa (C.T, 2004)

Để đáp ứng nhu cầu tiêu thụ hoa trong nước cũng như trên thế giới đòi hỏi các nhà sản xuất hoa Việt Nam phải có kế hoạch đầu tư và phát triển một cách thích hợp, đặc biệt là trong công tác chọn tạo giống và nhân giống…công nghệ đóng gói

và bảo quản để nâng cao năng suất chất lượng

Như vậy, có thể thấy hoa cúc là một loại hoa có tiềm năng phát triển rất lớn

và có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc phát triển ngành sản xuất hoa của nước

ta nói riêng và của thế giới nói chung

2.2 CÁC NGHIÊN CỨU VỀ NHÂN GIỐNG IN VITRO CÂY HOA CÚC

Trong những thập niên gần đây, CNSH là một trong những ngành khoa học

có nhiều thành tựu to lớn đặc biệt là trong lĩnh vực trồng trọt Đây là một lĩnh vực

đã, đang và sẽ được đầu tư khá lớn ở hầu hết các nước trên thế giới Cây giống nuôi cấy mô tế bào giờ đây không còn xa lạ với các nông hộ

Trong lĩnh vực nhân giống cây trồng, công nghệ nuôi cấy mô tế bào đã cho phép sản xuất nhiều loại cây trồng (khoai tây, bắp cải, củ kiệu), các cây công nghiệp (bông, hông, tếch,…), các loại cây thuốc quý (sa nhân, sâm, …), nhiều loại hoa, cây cảnh (cúc, hồng, phong lan, lay ơn, …), các loại cây ăn quả có giá trị kinh tế cao ( nho, chuối, cam, chanh) (Nguyễn Văn Uyển và cs, 1998)

Hoa cúc là một tron những cây trồng quan trọng đối với các nhà sản xuất hoa, cho nên nhân giống cúc bằng phương pháp nuôi cấy tế bào đã nhanh chóng trở

thành đối tượng nghiên cứu ngay từ khi kỹ thuật in vitro ra đời

Năm 1952, Morell và Martin (các nhà khoa học Pháp), lần đầu tiên đã tạo được những cây hoa cúc sạch bệnh bằng nghiên cứu mô phân sinh đỉnh Cũng theo phương pháp này, Mori (1991), Astami (1972), Paluran (1974), Sussex (1998) đã thu được những giống cúc sạch bệnh virus Năm 1974, Asjes và cs đã chứng minh rằng có thể dùng nhiều bộ phận của cây hoa cúc để làm vật liệu nuôi cấy mô và ông

đã sử dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy đỉnh chồi (meristem) để tạo ra giống sạch bệnh Kenneth và Torres (1990) đã nuôi cấy thành công từ đoạn thân và lá của

giống cúc màu tím trên môi trường MS

Để hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro cây hoa cúc, các nhà khoa học đã

tìm hiểu ảnh hưởng của các yếu tố môi trường nuôi cấy nhân tạo cũng như các ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh như nhiệt độ, ánh sáng Năm 1990, Lunnegent và Woulday đã cấy đoạn thân cúc cao 1-2 cm và cho phát triển trong môi trường nuôi cấy có BA thì chúng hình thành 2-3 chồi không có rễ bất định, còn trong môi trường

có 0.1 -0.3 mg/l IBA thì chúng hình thành các chồi và có rễ bất định Năm 1990, Robert và Smith đã nhận xét rằng bảo vệ rễ bằng chất đệm cellulose sorbarords trong môi trường nuôi cấy dạng lỏng đã làm giảm thiệt hại trong quá trình đưa cây

ra ngoài, nếu cho vào một lít môi trường ra rễ dạng lỏng 0.5-4 mg paclobutrazok sẽ làm giảm độ héo của cây khi ra ngoài môi trường tự nhiên

Nhân giống in vitro cây hoa cúc đã và đang là phương pháp phổ biến nhất

trong kỹ thuật nhân giống hoa cúc Những năm gần đây, ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy

mô tế bào đã phổ biến rộng rãi hơn Một trong những hướng ứng dụng đó là tạo nguyên liệu cho xử lý đột biến nhằm chọn tạo những giống mới Tái sinh cây cúc

in vitro trong giai đoạn mô sẹo cũng được chú trọng vì mô sẹo là một nguyên liệu rất tốt cho các thí nghiệm xử lý đột biến

Ở nước ta, do điều kiện chiến tranh kéo dài nên các ngành khoa học nói chung và công nghệ nuôi cấy mô tế bào nói riêng đã phát triển chậm hơn so với thế giới Tuy nhiên, chúng ta cũng đạt được nhiều thành tựu đáng kể, nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào đã được xây dựng tại các viện: Viện CNSH, Viện CNSH nhiệt đới thành phố Hồ Chí Minh, Viện nghiên cứu Đà Lạt,… Ngoài ra, nhiều trường đại học cũng đã bắt đầu chú ý xây dựng các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào để cho sinh viên có thể tiếp cận với công nghệ hiện đại và có khả năng ứng dụng lớn này Nhiều tỉnh, thành phố cũng đã xây dựng các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô tế bào, thực hiện những nghiên cứu và chuyển giao công nghệ nuôi cấy mô tế bào trên các đối tượng có giá trị kinh tế của địa phương như Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Bình Định,…

Hiện nay, công nghệ sinh học nói chung, nuôi cấy mô tế bào nói riêng đã thu được nhiều thành tựu đáng kể trong thực hiện nhân nhanh các loại cây: Cà phê, cỏ ngọt, chuối (Trung tâm công nghệ sinh học), dứa (Viện nghiên cứu dầu và cây dầu, Viện khoa học Việt Nam), mía đường (trung tâm công nghệ sinh học, Viện nghiên cứu dầu và Trung tâm thực nghiệm), cây vani (Viện nghiên cứu dầu và cây có dầu), nho không hạt (Trung tâm công nghệ sinh học), dâu tằm, măng cụt, lúa, khoai tây

và các loại cây có củ khác Đối với các giống hoa, ngoài phong lan và cúc là hai đối

tượng thường được nhân giống bằng kỹ thuật in vitro, hiện nay có nhiều loài hoa

được nghiên cứu nhân nhanh bằng công nghệ này, chủ yếu phụ thuộc vào giá trị của các loại hoa chứ không phải phụ thuộc vào mức độ dễ thành công như trước đây: rẻ quạt (Viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt), Cẩm chướng (Đại học tổng hợp Đà Lạt), cúc chùm Hà Lan, loa kèn, hoa chuông ( Mai Văn Chung, Phùng Văn Hào, 2006), (Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc, 2003), (Trần Khắc Hạnh và cs, 2004), (Trần Thị

Lệ, Lê Dũng, 2005), (Chu Bá Phúc và cs, 1999), (Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, 2005), (Nguyễn Quang Thạch và cs, 2004)

Ngoài việc ứng dụng để nhân nhanh các giống cây trồng, nuôi cấy mô tế bào còn được sử dụng để lựa chọn các dòng lúa phù hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam, chọn tạo dòng thuốc là và lúa (Trung tâm công nghệ sinh học), nuôi và dung hợp protoplast thực vật (Trung tâm công nghệ sinh học) (Nguyễn Văn Uyển, 1998)

Hiện nay, Công nghệ sinh học đang là một trong hai mũi nhọn về công nghệ được Đảng và nhà nước chú trọng, đầu tư phát triển Đẩy mạnh và phát triển công nghệ sinh học sẽ góp phần thực hiện nhanh chóng công cuộc công nghiệp hóa, hiện đại hóa đất nước Hy vọng trong tương lai chúng ta sẽ đạt được những thành tựu to lớn hơn nữa về công nghệ nuôi cấy mô tế bào nói riêng và công nghệ sinh học nói chung

Kỹ thuật tạo giống in vitro cây hoa cúc bắt đầu được quan tâm ở nước ta từ

đầu thập niên 90 của thế kỷ XX Đối với cây hoa cúc, đã có nhiều nghiên cứu xây

dựng các quy trình kỹ thuật nhân giống in vitro ( Đào Thanh Bằng và cs, 2005), (Mai

Văn Chung, 2004), (Nguyễn Xuân Hải, Nguyễn Thị Kim Lý, 2004), ( Trần Khắc Hạnh và cs, 2004), (Nguyễn Thị Diệu Hương, Dương Tấn Nhựt, 2004), (Nguyễn Thị Kim Lý, 2001) Tuy nhiên các đề tài này hầu hết mới chỉ thành công trên phương diện thí nghiệm chứ chưa được ứng dụng vào thực tế sản xuất Năm 1992, Trung tâm hoa cây cảnh và bộ môn nuôi cấy tế bào thực vật của Viện di truyền nông nghiệp đã tiến hành nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống một số loại hoa cúc bằng

phương pháp nuôi cấy in vitro (Nguyễn Xuân Linh, 1998) Trung tâm này cũng đã

tiến hành nghiên cứu về thu nhập nguồn gen trong và ngoài nước, khảo sát chọn lọc, đánh giá một cách có hệ thống về đặc điểm nông sinh học, đặc điểm kinh tế, xây dựng các biện pháp kỹ thuật, cung cấp cho sản xuất các giống cúc CN97, CN98 và một số giống khác (Nguyễn Xuân Linh, Nguyễn Thị Kim Lý, 2005)

Nguyễn Quan Thạch (1998) đã nghiên cứu xây dựng và hoàn chỉnh quy trình

nhân giống nuôi cấy mô cho một số giống cúc đang được phổ biến ở nước ta như CN93, cúc vàng Đài Loan, cúc hồng Đài Loan, cúc đỏ Hà Lan (Nguyễn Đức Thành, 2000)

Trung tâm kỹ thuật rau quả Hà Nội cũng đã thu nhập nguồn gen và chọn được giống cúc vàng Đài Loan có giá trị kinh tế, đã vào sản xuất, giống cúc này đã nhanh chóng trở thành cây trồng chủ lực trong vụ đông xuân của miền Bắc nước ta (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

Từ năm 1996-2000, Nguyễn Thị Kim Lý đã tiến hành nghiên cứu, tuyển chọn và nhân giống cây cúc trên vùng đất trồng hoa ở Hà Nội (Nguyễn Thị Kim Lý, 2001) Theo hướng xử lý, tạo các dòng đột biến, phòng Công nghệ sinh học của Viện nghiên cứu hạt nhân Đà Lạt từ 1999-2000 đã tiến hành xử lý tia gâm trên nhiều giống cúc khác nhau với liều lượng từ 1-1.5krad, đã tạo ra nhiều biến dị di truyền về màu sắc, dạng hoa, dạng cây và thời gian sinh trưởng từ đó đã chọn ra một số giống cúc mới đang được trồng thử nghiệm tại Đà Lạt Năm 2003, Đỗ Quang Minh, Nguyễn Xuân Linh (Viện di truyền Nông nghiệp) cũng đã tiến hành

xử lý các chồi cúc in vitro bằng tia gama theo các liều chiếu từ 0.5-3 krad, từ đó

phân lập và chọn lọc các đột biến có lợi làm vật liệu khởi đầu cho công tác chọn tạo giống hoa

Bên cạnh những nghiên cứu về kỹ thuật tạo giống in vitro, nhiều nhà khoa

học đã nghiên cứu tìm điều kiện chăm sóc thuận lợi để tăng năng suất cây cúc sau giai đoạn nuôi cấy Năm 1998, Nguyễn Xuân Linh và cs đã đề xuất các biện pháp

về bón phân chăm sóc, đặc biệt là thời vụ trồng cúc Dựa vào phản ứng của cây với điều kiện nghiên cứu, các tác giả đã chỉ ra những giống cúc thích hợp cho vụ xuân

hè (tháng 2-4), vụ hè thu (tháng 5-6) là các giống CN93, CN98, vụ đông xuân (tháng 11-2) là các giống cúc vàng Đài Loan…(Nguyễn Xuân Linh, 1998)

Đặng Tố Nga (1999) đã nghiên cứu thời vụ trồng giống cúc Singapo tại Thái Nguyên và kết luận cúc chỉ thích hợp vụ đông (Nguyễn Xuân Linh, 1998)

Nguyễn Quang Thạch, Đặng Văn Đông (2002) đã nghiên cứu các đặc điểm sinh học, kinh tế của cây hoa cúc từ đó đề ra biện pháp kỹ thuật thích hợp với từng giống cúc

2.3 TẠO GIỐNG ĐỘT BIẾN BẰNG XỬ LÝ EMS

2.3.1 Đột biến tự nhiên và đột biến nhân tạo

Đột biến là những biến đổi di truyền hợp thành cơ sở di truyền của tính biến

dị, nó là hiện tượng thường xuyên gắn liền với sự sống và tiến hóa của sinh vật Tác động của các đột biến rất đa dạng, nó có thể gây ra những biến đổi bất kỳ tính trạng

nào với những mức độ khác nhau, từ những biến đổi rõ rệt, đến những sự sai lệch rất nhỏ khó nhận thấy Một số đột biến được biểu hiện ra kiểu hình có thể quan sát được, nhưng cũng có những đột biến chỉ ảnh hưởng đến sức sống Sự thay đổi kiểu hình do đột biến có thể biểu hiện ra ở các giai đoạn sinh trưởng khác nhau như phôi, hạt, cây con, cây trưởng thành

Căn cứ vào sự biến đổi cấu trúc di truyền người ta có thể phân ra làm các loại đột biến khác nhau như: Đột biến gen là những sự biến đổi rất nhỏ trên một đoạn ADN, thường liên quan đến 1 hay 1 số cặp nucleotide; đột biến cấu trúc nhiễm sắc thể như tái sắp xếp, lặp đoạn, mất đoạn…Các đột biến này có thể gọi là sai hình nhiễm sắc thể

Trong các dạng đột biến nêu trên dạng làm biến đổi cấu trúc nhiễm sắc thể thường dẫn đến những biến đổi có hại đối với cơ thể sinh vật Vì vậy, các nhà chọn giống chú trọng chủ yếu đến dạng đột biến gen, dạng này liên quan đến sự biến đổi cấu trúc của gen dẫn tới sự xuất hiện alen mới

Sự phát sinh đột biến có thể do tự phát (đột biến tự nhiên): đột biến xuất hiện trong tự nhiên do tác động của tập hợp các yếu tố (vật lý, hóa học,…) có trong môi trường sống và do những biến loạn về trao đổi chất trong tế bào Đột biến có thể do tác động của con người (đột biến nhân tạo) bằng cách xử lý các tác nhân đột biến như các tác nhân vật lý (tia X, tia gamma, bức xạ cực tím UV, bức xạ, neutron,…) các tác nhân hóa học (các chất đồng phân có tính base và những hợp chất có liên quan, chất kháng sinh, những tác nhân alkyl hóa, acridines, azides, hydroxylamine, nitrous acid,…)

Trong điều kiện tự nhiên, tần số xuất hiện đột biến thay đổi tùy thuộc vào từng loại cây trồng và của từng gen riêng biệt, tuy nhiên tần số đột biến rất thấp (khoảng 10-6) và khó phát hiện, số đột biến có lợi cho sản xuất và đời sống lại càng thấp hơn (Nguyễn Hữu Đống và cs, 1997) Ngày nay các nhà chọn giống không thể trông chờ vào việc sử dụng các dạng đột biến tự phát Vì vậy, việc nghiên cứu đột biến nhân tạo được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu, nhằm tăng tần suất xuất hiện đột biến với các tính trạng có giá trị kinh tế ở các loài thực vật nói chung và cây trồng nói riêng Mặc dù còn nhiều hạn chế nhưng đột biến thực nghiệm đã và đang đóng góp rất lớn cho việc cải tiến giống cây trồng trên thế giới

2.3.2 Nguyên lý tạo giống đột biến bằng hóa chất

Một số tác nhân hóa học, đặc biệt là các chất có khả năng oxy hóa, ethyl hoặc methyl hóa cao tác động lên cơ thể sinh vật sẽ có tác dụng oxy hóa, ethyl hóa

các bazơ có đạm có trong nucleotit, làm thay đổi cấu tạo hóa học của chúng và gây nên đột biến gen Phương pháp xử lý phụ thuộc vào cây, bộ phận xử lý và tác nhân

xử lý Ngoài ra, nó còn phụ thuộc vào thời kỳ sinh trưởng và phát dục của cây Các tác nhân hóa học có đặc điểm chung sau (Nguyễn Văn Hiển, 2000):

- Có khả năng thẩm thấu cao

- Có đặc điểm làm thay đổi keo nguyên sinh

Ngày nay, người ta đã phát hiện hơn 400 hóa chất có thể sử dụng gây đột biến Căn cứ vào cấu trúc hóa học, tác dụng của các tia mà người ta chi chúng làm 5 loại: - Nhóm 1: oxy hóa khử

- Nhóm 2: gồm các chất đồng phân với bazo tham gia trong thành phần ADN

ở vị trí Thimine, thay thế nucleotide này bằng nucleotide khác và gây đột biến

- Nhóm 3: Các chất có tác dụng kìm hãm sự tổng hợp Guanin và Thimin tạo ra các nucleotide không bình thường trong thành phần ADN gây nên hiện tượng đột biến

- Nhóm 4: Alkyl hóa, các chất này có tác dụng Alkyl hóa ADN dẫn tới đứt mạch ADN hoặc làm sai lệch trật tự các bazo trong mạch gây ra đột biến

- Nhóm 5: Acridin, đây là nhóm thuốc nhuộm tác động lên ADN làm rối loạn quá tình tái sinh mã gây hiện tượng thiếu hoặc thừa nucleotide trong phân tử ADN dẫn đến đột biến

2.3.3 Giới thiệu về hóa chất Ethyl methane sulfonate (EMS)

EMS là hợp chất hóa học gây đột biến nằm trong nhóm các hợp chất alkyl hóa, nhóm này gồm phần lớn các chất hóa học được dùng phổ biến cho mục đích chọn giống hiện nay như EI, EMS, NEU, NMU… quá trình alkyl hóa là sự thay thế hydro có trong bazo nito bằng một gốc alkyl có trong các chất alkyl hóa ( như –

C2H5 có trong EMS) (Lê Duy Thành, 2001)

EMS có tên khoa học là Ethylmethane sulphonate, công thức hóa học: CH3 –

Kỹ thuật lớn của đột biến gen bằng tác động của EMS đòi hỏi sự dịch chuyển của nhóm methyl hoặc ethyl để các bazo chẳng hạn như trong sự cặp đôi của chúng phải là kết quả của sự dịch chuyển Cho ví dụ, nhóm ethyl (CH3 – CH2 - ) ở vị trí N7

và ở vị trí O6 chắc chắn là hai hiệu quả tác động của EMS 7-ethylguanine tin chắc rồi sẽ cặp đôi với Thymine làm sai lệch sự cặp đôi theo nguyên tắc bán bảo toàn G – C ( Guanin – Cytozin) (Eldon John Gardner và cs, 1984)

Trong các tác nhân gây đột biến bằng hóa học EMS là chất được sử dụng phổ biến và cho hiệu quả cao Dung dịch hóa chất gây đột biến này phải được chuẩn

bị trước khi dùng và nó được tồn trữ như dung dịch gốc “stock” Tốc độ thủy phân của hợp chất này được đo bằng phương pháp bán thời gian “hafl life” Qua các kết quả nghiên cứu người ta cho thấy tốc độ thủy phân của EMS phụ thuộc rất lớn vào nhiệt độ Trong nước cất ( pH = 7) ở nhiệt độ 200C hafl life của EMS là 93 giờ, ở

300C là 26 giờ và 370C là 10 giờ (Bùi Chí Bửu, 2007) Vì vậy, để đảm bảo hoạt tính của chất gây đột biến chỉ nên chuẩn bị dung dịch trước khi xử lý không quá 30 phút

và giữ trong bóng tối suốt thời gian xử lý (Đào Thanh Bằng, 1997)

Người ta còn phát hiện rằng dimethylsulphoxide (DMSO) là một chất mang

có chức năng thúc đẩy hiện tượng phát sinh đột biến gen của EMS Xử lý chất này làm giảm sự sinh trưởng 30 – 40% có khả năng tạo nên đột biến ở tần suất tối hảo cho cây trồng thuộc nhóm mễ cốc (Bùi Chí Bửu, 2007)

Hình 2.1: Sự kết cặp nhầm chuyên biệt do đột biến cảm ứng alkyl hóa (Trần

Thượng Tuấn, 2005)

Để gây đột biến cho cây trồng có thể xử lý hóa chất EMS trên các bộ phận

như hạt, chồi, củ, phôi trong thời gian đang phát triển Tuy nhiên, đối với mỗi giống

bộ phận của cây trồng có sự cảm ứng khác nhau với hóa chất gây đột biến Các kết quả nghiên cứu cho thấy, khi tăng nồng độ của tác nhân đến mức độ nhất định thì khả năng sống của cây cũng tăng, sau đó nếu tiếp tục tăng thì khả năng sống của đối tượng lại giảm xuống Vì vậy, đối với từng giống, từng bộ phận cây trồng cần phải xác định nồng độ, thời gian tác động hợp lý mới có thể mong muốn đem lại hiệu quả di truyền cao

2.4 TẠO GIỐNG ĐỘT BIẾN THỰC NGHIỆM

2.4.1 Vai trò của đột biến thực nghiệm trong công tác chọn tạo giống cây trồng

Ngày nay với sự phát triển không ngừng của khoa học kỹ thuật, nhiều phương pháp chọn tạo giống đã và đang được quan tâm phát triển Bằng các phương pháp truyền thống như lai tạo hay chọn lọc, để tạo ra một giống cây trồng năng suất cao, ổn định cần ít nhất từ 6-10 thế hệ Trong khi đó chọn giống bằng phương pháp đột biến nhân tạo chỉ cần 3-6 thế hệ (Nguyễn Hữu Đống, 1997) Đồng thời sử dụng phương pháp này có thể giải quyết những vấn đề mà nhiều phương pháp khác không thể thực hiện được như khi biến dị tự nhiên về một đặc tính mong muốn không có sẵn trong nguồn vật liệu di truyền; khi có sẵn một gen cần thiết song do mối liên kết chặt chẽ với các gen khác làm cho gen đó không sử dụng được; khi tạo đặc tính mong muốn không thể thực hiện được bằng phương pháp lai; khi muốn thay đổi một hoặc một số tính trạng riêng biệt nhằm khắc phục nhược điểm của giống mà không làm thay đổi những tính trạng khác của giống (Trần Duy Quý, 1997)

Với phương pháp đột biến thực nghiệm, sử dụng các tác nhân lý hóa gây đôt biến đã làm tăng sự sai khác di truyền trong quần thể Việc xử lý đột biến thực nghiệm có thể tạo ra những đột biến mang tính nhảy vọt đáng kể Do đó có thể tạo

ra giống mới khác xa giống cũ (Phạm Văn Duệ, 2005)

Với các thành tựu mới về vật lý, hóa học, con người đã sử dụng các tia phóng xạ (tác nhân lý học) và các chất hóa học (tác nhân hóa học) như colchicine, EMS,… trong công tác chọn giống cây trồng và đã thu được các thành tựu đáng kể

Từ những kết quả thu được chứng tỏ đây là mtooj trong những phương pháp có hiệu quả nhất để tạo ra giống mới Nhiều nhà khoa học đã đánh giá: một trong những thành tựu xuất sắc của thế kỷ 20 là khám phá ra phương pháp tạo giống bằng cách gây đột biến thực nghiệm

Theo một số tài liệu thì tác nhân gây đột biến hóa học có hiệu quả hơn tác

nhân vật lý Nếu dưới ảnh hưởng của chiếu tia ở các cây nông nghiệp xuất hiện 15% biến đổi di truyền có khả năng sống thì tác nhân hóa học cho phép thu nhận từ 30-60% Hơn nữa tác nhân gây đột biến hóa học thường làm xuất hiện những biến

10-dị đặc biệt hơn (Trần Thượng Tuấn, 2005)

2.4.2 Xử lý đột biến thực nghiệm in vitro

Khi sử dụng các phương pháp cải tạo giống truyền thống như kết hợp phương pháp lai, sinh sản sinh dưỡng với phương pháp gây đột biến, các nhà sản xuất đã tạo ra hàng loạt giống cây trồng có năng suất cao, chất lượng tốt, đáp ứng nhu cầu của xã hội Tuy nhiên vẫn còn nhiều hạn chế như thời gian tác động không lâu (khoảng 10 năm), cây bị tác động mạnh về sinh lý, sinh hóa, nhu cầu về giống tốt rất lớn trong khi số lượng cung cấp lại hạn chế

Với sự phát triển của công nghệ tế bảo thực vật hiện nay, việc kết hợp xử lý đột biến nhân tạo và nuôi cấy mô trở thành một trong những hướng tạo giống cây trồng quan trọng Vật liệu xử lý có thể là các cơ quan đang trong giai đoạn phát triển mạnh: đỉnh chồi, callus… Tác nhân gây đột biến có thể là tác nhân vật lý hay hoá học

Xử lý đột biến chiếu xạ kết hợp nuôi cấy mô đã được nhiều nhà khoa học chứng minh là phương pháp nhanh chóng tạo ra các biến dị mong muốn, tạo nguồn vật liệu phong phú cho chọn giống và lai tạo giống Đồng thời kỹ thuật này có thể giải quyết vấn đề khó khăn: thể khảm sau xử lý chiếu xạ Broetjes và cs năm 1976

đã đưa ra giả thuyết rằng tái sinh in vitro có thể loại bỏ thể khảm Vì vậy kỹ thuật

này càng có ý nghĩa hơn đối với cây nhân giống vô tính, nhờ tiềm năng nhân nhanh trong thời gian ngắn, rút ngắn chu trình chọn lọc đột biến

Xử lý đột biến in vitro sẽ giảm tác động không tốt của các tác nhân gây đột

biến tới môi trường, con người và động vật

2.4.3 Thành tựu đạt được trên thế giới và Việt Nam với xử lý đột biến bằng EMS

* Trên thế giới

Các tác giả Tulman Neto et al (2004), đã nghiên cứu ảnh hưởng gây đột biến

của EMS lên giống cúc Dendranthema grandiflora Tzvelev Các tác giả tiến hành thí

nghiệm trên cuống nhỏ non của giống cúc cv Ingrid (màu hồng thẫm) được xử lý với dung dịch EMS nồng độ 0,77% trong 1h và 45 phút, sau đó ngâm trong nước 15 phút

và làm sạch bề mặt Tiếp theo đó, mẫu được cấy trên môi trường MS + 1 g/l

hydrolyzed casein, 1 mg/l 6-benzyl laminopurine (BAP) và 2 mg/l indole-3-acetic acid(IAA) Ước lượng có khoảng 910 mẫu thu được xử lý từ EMS cuống hoa cho kết quả ra hoa Thí nghiệm thu được khoảng 40 dạng đột biến (chiếm khoảng 5,2%) cho màu sắc cánh hoa khác nhau( màu hồng cam, màu hồng nhạt, màu đồng, màu trắng, màu vàng và màu cam) Hầu hết chúng (89,6% tổng số) là đồng dạng về kiểu hình Chen Wei et al (2004) nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý EMS lên các phôi

tiểu bào tử in vitro họ cải bắp ( Brassia napus) cho thấy: Khi xử lý các tiểu bào tử của B.napusin in vitro ở các nồng độ 0; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; và 3,0 mM/l và các

khoảng thời gian 12, 24 và 36 giờ), kết quả chỉ ra rằng số lượng hầu hết các sản phẩm phôi tiểu bào tử đều giảm xuống, tăng dần ở các nồng độ xử lý và các khoảng thời gian xử lý Sản phẩm phôi giảm còn một nửa ở nồng độ 2,5 mM/l và khoảng thời gian 24 giờ Ở mức này, các tiểu bào tử bị đột biến có giá trị rất quan trọng

trong xử lý đột biến EMS trong in vitro B.napus

Tác giả Luan et al (2007), đã sử dụng EMS nhằm gây đột biến tăng tính chịu

mặn của các giống Khoai lang (Ipomoea batatas L.) Mẫu mô lá được sử dụng đem

xử lý EMS ở nồng độ 0,5% trong thời gian 0; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; và 3,0 ; sau đó tráng lại bằng nước cất vô trùng 4 lần Mẫu được nuôi cấy trên môi trường MS + 200mM NaCl nhằm chọn lọc các dòng tế bào đột biến và các dòng này sẽ được cấy chuyển 5 lần (20 ngày 1 lần)/ Sau đó các dòng chọn được cấy chuyển sang môi trường tạo phôi vô tính MS + 4 mg/l ABA + 10 mg/l GA Sau 15 ngày cấy chuyển sang môi trường MS + 0,05 mg/l ABA + 0,2 mg/l ZT Các giống như ML1, ML2 và ML3 được phục tráng từ các dạng phôi vô tính thích hợp với xử lý EMS nồng độ 0,5% trong 2

và 2,5 giờ Các giống chọn tạo được có đặc tính chịu mặn hơn hẳn các giống gốc

* Ở Việt Nam

Năm 1998, các tác giả thuộc Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long đã gây đột biến thành công giống lúa thơm Jasmine 85 bằng xử lý hóa chất EMS trong nuôi cấy mô Thí nghiệm được thực hiện từ vụ hè thu năm 1998 đến năm 2001 Đặc điểm: Lúa Jasmine 85 có nguồn gốc từ Hoa Kỳ là giống đặc sản xuất khẩu của Hoa

Kỳ được thế giới ưa chuộng Khi trồng ở Việt Nam, lúa bị nhiễm sâu bệnh nên chi phí cao, không cạnh tranh với các nước khác, thị trường nội địa cũng khó tiêu thụ Sau khi xử lý, thế hệ M1, các cá thể được trồng ở ruộng vào thời điểm có dịch rầy, phần lớn đều bị cháy rầy Từ 59 cá thể này, kỹ sư Phạm Thị Hường tiếp tục chọn lọc đến thế hệ M5, tuyển chọn một số dòng đã thuần đưa vào so sánh năng suất,

trong đó có 4 dòng OM 3566 – 14, OM 3566 – 15, OM 3566 – 16 và OM 3566 – 70

có triển vọng

Năm 2008, Viện sinh học Nông nghiệp, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội triển khai xử lý đột biến bằng EMS trên đối tượng hoa cẩm chướng Kết quả cho thấy khi tăng nồng độ EMS đã làm giảm khả năng sống, tăng tỷ lệ các chồi biến dị

Sau quá trình xử lý thì thu được 5 dạng chồi in vitro và đã đánh giá được sự sinh

trưởng và tạo cây hoàn chỉnh của các dạng chồi đó (Vũ Hoàng Hiệp, 2008)

Tuy nhiên nghiên cứu về xử lý EMS trong in vitro cho cây hoa cúc chưa tìm

thấy ở các tài liệu được công bố Chính vì vậy trong đề tài này chúng tôi bước đầu

thử nghiệm những tác động của EMS lên cây hoa cúc Chrysanthenum sp

PHẦN III

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Cây hoa Cúc (Chrysanthemum) gồm 2 giống:

− Giống cúc Vàng Chanh

− Giống cúc Vàng Pha Lê

3.2 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

− Đoạn thân invitro mang mắt ngủ: đọan thân được cắt thành từng đoạn nhỏ

mang mắt ngủ có độ dài khoảng 0,7cm-1cm

− Ngọn invitro: ngọn được cắt có độ dài khoảng 1cm-1,5cm

− Dung dịch EMS được pha ở các nồng độ: 0.25%; 0.5%; 0.75%; 1%

3.3 ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

3.3.1 Địa điểm

Viện Sinh học Nông nghiệp – Học Viện Nông Nghiệp Việt Nam (tầng 3 nhà B)

3.3.2 Thời gian

Từ tháng 11/2014 tới tháng 10/2015

3.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự tạo biến dị

và khả năng sinh trưởng của các dạng chồi in vitro

Thí nghiệm 1: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự tạo biến dị và

khả năng sinh trưởng chồi in vitro giống cúc Vàng chanh

Các mẫu sau khi được xử lý EMS trong thời gian 1 giờ được đưa vào môi trường nhân nhanh chồi: MS + 1mg/l BA

Công thức Nồng độ EMS xử lý Môi trường nhân nhanh

Thí nghiệm 2: Nghiên cứu sự ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự tạo biến dị và

khả năng sinh trưởng chồi in vitro giống cúc Vàng pha lê

Các mẫu sau khi được xử lý EMS trong thời gian 1 giờ được đưa vào môi trường nhân nhanh chồi: MS + 1mg/l BA

Công thức Nồng độ EMS xử lý Môi trường nhân nhanh

Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng sinh trưởng, phục hồi của các chồi cúc Vàng

chanh sau xử lý qua các lần cấy chuyển(3 lần)

Các chồi phát sinh từ mẫu cấy được cấy chuyển 6 tuần 1 lần trên môi trường nhân nhanh chồi: MS +1 mg/l BA

Thí nghiệm 3a: Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự sinh trưởng, phục hồi

của các dạng chồi in vitro giống Vàng chanh ở lần cấy chuyển 1 sau 6 tuần

Thí nghiệm 3b: Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự sinh trưởng, phục hồi

của các dạng chồi in vitro giống Vàng chanh ở lần cấy chuyển 2 sau 6 tuần

Thí nghiệm 3c: Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự sinh trưởng, phục hồi

của các dạng chồi in vitro giống Vàng chanh ở lần cấy chuyển 3 sau 6 tuần

CT1(Đối chứng):

Thí nghiệm 4: Đánh giá khả năng sinh trưởng, phục hồi của các chồi cúc Vàng pha

lê sau xử lý qua các lần cấy chuyển(3 lần)

Các chồi phát sinh từ mẫu cấy được cấy chuyển 6 tuần 1 lần trên môi trường nhân nhanh chồi: MS +1 mg/l BA

Thí nghiệm 4a: Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự sinh trưởng, phục hồi

của các dạng chồi in vitro giống Vàng pha lê ở lần cấy chuyển 1 sau 6 tuần

Thí nghiệm 4b: Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự sinh trưởng, phục hồi

của các dạng chồi in vitro giống Vàng pha lê ở lần cấy chuyển 2 sau 6 tuần

Thí nghiệm 4c: Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự sinh trưởng, phục hồi

của các dạng chồi in vitro giống Vàng pha lê ở lần cấy chuyển 3 sau 6 tuần

CT1(Đối chứng):

3.4.3 Nội dung 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý EMS đến khả năng tạo cây hoàn chỉnh của các chồi sau xử lý EMS

Thí nghiệm 5 : Đánh giá khả năng ra rễ của các chồi in vitro giống Vàng chanh

qua 3 lần nhân ở môi trường ra rễ: MS + 0.5 mg/l NAA + 0.5 g/l than hoạt tính

Thí nghiệm 6: Đánh giá khả năng ra rễ của các chồi in vitro giống Vàng pha lê

qua 3 lần nhân ở môi trường ra rễ: MS + 0.5 mg/l NAA + 0.5 g/l than hoạt tính

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

• Thí nghiệm sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật hiện hành (theo O.L.Gamborg và G.C.Phillip, 1995)

• Sử dụng môi trường cơ bản MS (Murahige & Skoog, 1962: 5 g/l agar, 30 g/l saccarose và 100 mg/l inositol), có bổ sung một số chất điều tiết sinh trưởng tùy từng giai đoạn thí nghiệm, pH môi trường 5,8 – 6,0

• Môi trường nuôi cấy hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút ở áp suất 1 atm

• Điều kiện thí nghiệm: Các thí nghiệm tiến hành trong điều kiện nhân tạo, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm luôn được giữ ổn định:

+ Cường độ ánh sáng: 2000 – 4000 Lux

+ Thời gian chiếu sáng: 16h sáng/8h tối

+ Độ ẩm: 70 – 80%

+ Nhiệt độ: 25 ± 2oC

Bình được sử dụng : bình trụ miệng hẹp 250ml

Mỗi công thức thí nghiệm bố trí 10 bình, mỗi bình cấy 5 mẫu và bố trí với 3 lần nhắc lại Bố trí thí nghiệm hoàn toàn ngẫu nhiên

3.5.2 Phương pháp xử lý đột biến in vitro

Đoạn thân của cây in vitro được cắt thành các mẫu có kích thước khoảng 0.7-

1.0 cm chứa 01 mắt ngủ, đem ngâm vào bình chứa dung dịch EMS được pha theo nồng độ đã định Sau đó đưa các bình này vào máy lắc đặt trong bóng tối trong thời gian 1 giờ Các mẫu sau khi xử lý đem rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 lần sau đó đặt vào các đĩa petri có giấy thấm Sau khi được làm sạch các mẫu được nuôi cấy trên môi trường nhân nhanh MS + 1 mg/l BA Mỗi công thức tiến hành lặp lại 3 lần,

số lượng mẫu là 50 mẫu/1 lần nhắc lại

Nhằm đảm bảo hiệu lực của hóa chất chúng tôi pha hóa chất trước khi xử lý

30 phút Để tiện cho việc tính toán và đảm bảo dung lượng mẫu thí nghiệm mỗi

công thức xử lý 50 mẫu in vitro cho một lần nhắc lại, tiến hành 3 lần nhắc lại

Dung dịch EMS sau khi dùng xong được xử lý bằng NaOH 1N để làm mất hoạt tính trước khi loại thải

3 5.3 Phương pháp theo dõi

Thí nghiệm nhân nhanh, chỉ tiêu theo dõi được quan sát và đo đếm định kỳ 2 tuần 1 lần

Thí nghiệm tạo cây hoàn chỉnh, quan sát và đo đếm định kỳ 1 tuần 1 lần

Các chỉ tiêu theo dõi

Chiều cao cây: tính từ gốc lên đến đỉnh lá

∑ Số mẫu tạo chồi x 100

∑ Số mẫu theo dõi

Chiều dài rễ TB (cm/cây) =

Liều gây chết 50% mẫu thí nghiệm ( LD50: Lethal dose)

∑ Số mẫu theo dõi

∑ Chiều cao các cây

∑ Số cây theo dõi

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 KẾT QUẢ

4.1.1 Ảnh hưởng của xử lý EMS đến khả năng sống, sinh trưởng của chồi in

vitro giống cúc Vàng chanh và Vàng pha lê

4.1.1.1 Ảnh hưởng của xử lý EMS đến khả năng sống, sinh trưởng của chồi in vitro giống cúc Vàng chanh

Các mẫu sau khi được xử lý EMS được đưa vào môi trường nhân nhanh: MS + 1mg/l BA Sau 6 tuần nuôi cấy thu được kết quả tại bảng 4.1 và bảng 4.2

Số liệu bảng 4.1 và bảng 4.2 cho thấy: Xử lý EMS sai khác rõ rệt so với công thức không xử lý ở tỷ lệ mẫu sống, tỷ lệ mẫu bật chồi và số chồi trung bình/mẫu còn chiều cao trung bình/chồi và số lá trung bình/chồi không thật sự rõ ràng Hơn thế, nồng độ EMS khác nhau và các giống khác nhau thì mức độ ảnh hưởng khác nhau,

cụ thể như sau:

Về tỷ lệ mẫu sống: Khi xử lý EMS thì tỷ lệ mẫu sống ở cả hai giống đều giảm mạnh Công thức không xử lý có tỷ lệ mẫu sống cao nhất (đạt 99.33% ở giống cúc Vàng chanh và đạt 98.67% ở giống cúc Vàng pha lê), sau đó đến công thức xử lý 0.25% EMS (đạt 88.00% ở giống cúc Vàng chanh và đạt 81.33% ở giống cúc Vàng pha lê) Công thức xử lý 1% EMS có tỷ lệ mẫu sống thấp nhất (16.00% ở giống cúc Vàng chanh và 14.67% ở giống cúc Vàng pha lê) Ở cả hai giống cúc Vàng chanh và cúc Vàng pha lê thì các công thức hoàn toàn khác nhau về tỷ lệ sống ở độ tin cậy 95%

Bảng 4.1: Ảnh hưởng của xử lý EMS đến khả năng sống, sinh trưởng của chồi

in vitro giống cúc Vàng chanh (sau 6 tuần)

Công thức Tỷ lệ sống

(%)

Tỷ lệ bật chồi (%)

Số chồi / mẫu

Chiều cao chồi (cm)

Số lá /chồi

Các ký tự khác nhau theo sau các giá trị trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa

0.05 Giá trị a, b, c, d, e biều thị mức độ ảnh hưởng theo thứ tự a>b>c>d>e

Về tỷ lệ mẫu bật chồi: Cũng tương tự như tỷ lệ sống, tỷ lệ bật chồi của các mẫu giảm dần ở các công thức từ không xử lý đến xử lý 1% EMS Các công thức khác nhau ở hai giống đều khác nhau ở mức ý nghĩa 5% Ở các công thức của cả hai giống đều thấy tỷ lệ bật chồi luôn luôn thấp hơn tỷ lệ sống của chính công thức đó, điều này chứng tỏ xử lý EMS không những làm tăng tỷ lệ chết mà còn làm giảm sức bật chồi của những mẫu còn sống

4.1.1.2 Ảnh hưởng của xử lý EMS đến khả năng sống, sinh trưởng của chồi in vitro giống cúc Vàng pha lê

Bảng 4.2: Ảnh hưởng của xử lý EMS đến khả năng sống, sinh trưởng của chồi

in vitro giống cúc Vàng pha lê (sau 6 tuần)

Công thức Tỷ lệ sống

(%)

Tỷ lệ bật chồi (%)

Số chồi/

mẫu

Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi

Các ký tự khác nhau theo sau các giá trị trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt thống kê ở mức ý nghĩa

0.05 Giá trị a, b, c, d, e biều thị mức độ ảnh hưởng theo thứ tự a>b>c>d>e

Về số chồi/mẫu: Tỷ lệ số chồi/mẫu gần như giảm dần ở các công thức từ không xử lý đến xử lý 1% EMS ở cả hai giống, tuy nhiên ở giống cúc Vàng chanh chỉ có công thức 0.25% EMS cao hơn công thức 0.5% EMS (hơn 0.1%) và ở giống Vàng Pha lê công thức 0.75% EMS cao hơn công thức 1%EMS (hơn 0.45%) song không khác nhau về mặt thống kê ở ý nghĩa 0.05 Các công thức còn lại ở mỗi giống đều khác nhau ở mức ý nghĩa đó

Chiều cao chồi và số lá/chồi của cả hai giống Vàng chanh và Vàng pha lê

ở các công thức khác nhau ở mức ý nghĩa 0.05, không tuân theo quy luật tăng hay giảm dần Ở giống Vàng chanh, chiều cao chồi đạt cao nhất ở công thức 0.25%EMS

là 1.43cm cao hơn đối chứng (hơn 0.19cm), thấp nhất là công thức 1%EMS (chỉ cao 1.02cm) Ở giống cúc Vàng pha lê, riêng chỉ có công thức 0.25%EMS có chiều cao chồi cao hơn đối chứng (hơn 0.04cm), các công thức còn lại có chiều cao chồi thấp hơn đối chứng, công thức 1%EMS có chiều cao chồi thấp nhất đạt 1.05cm (thấp hơn đối chứng 0.36cm) Số lá/chồi ở giống Vàng chanh đạt cao nhất ở công thức

0.25%EMS là 6.73 lá cao hơn đối chứng (hơn 1.36 lá), công thức 1%EMS có số lá thấp nhất (chỉ có 5.15 lá) Tương tự, ở giống Vàng pha lê công thức 0.25%EMS có

số lá đạt cao nhất đạt 5.38 lá và cao hơn so với đối chứng (hơn 1.5 lá), công thức 1%EMS có số lá thấp nhất (chỉ có 4.26 lá)

Để thấy rõ hơn ảnh hưởng của xử lý EMS, chúng tôi vẽ đồ thị biểu diễn mối quan hệ của các nồng độ xử lý tới tỷ lệ chết qua các công thức của hai giống

Đồ thị 4.1: Ảnh hưởng của xử lý EMS đến khả năng sống của giống cúc Vàng

chanh và Vàng pha lê (sau 6 tuần)

Từ đồ thị 4.1 tính được liều gây chết 50% mẫu thí nghiệm đối với từng giống trong thời gian xử lý 1 giờ như sau:

LD50, Vàng chanh = 0.475%;

LD50, Vàng pha lê = 0.45%

Đồ thị 4.1 cho thấy khi nồng độ EMS tăng thì tỷ lệ mẫu chết cũng tăng Từ công thức không xử lý đến công thức xử lý 0.25%EMS thì tỷ lệ chết tăng chậm còn đến công thức xử lý 0.5%EMS thì tỷ lệ chết tăng đột ngột (đường đồ thị đứng hơn) Trên đồ thị, đường biểu diễn tỷ lệ chết của giống Vàng pha lê luôn luôn ở trên đường biểu diễn của giống Vàng chanh chứng tỏ giống Vàng pha lê có sức sống yếu hơn giống Vàng chanh Tuy nhiên, với thời gian xử lý 1 giờ thì sự chênh lệch nồng

độ gây chết 50% mẫu thí nghiệm giữa hai giống thấp (0.025%)

Từ đồ thị, chúng tôi xác định được hệ số tương quan giữa nồng độ xử lý với

tỷ lệ mẫu chết: |R| Vàng chanh = 0.979, |R| Vàng pha lê = 0.985 Như vậy, nồng độ EMS xử lý có tương quan rất chặt chẽ với tỷ lệ mẫu chết

4.1.1.3 Ảnh hưởng của xử lý EMS đến sự phát sinh hình thái và khả năng sinh trưởng của các dạng chồi in vitro

Các chồi thu được sau xử lý không đồng nhất về hình thái và khả năng sinh trưởng Để đánh giá mức độ tác động của xử lý EMS với các nồng độ khác nhau, chúng tôi đã phân chia các dạng chồi ở từng công thức theo hình thái và đo đếm các dạng chồi về các chỉ tiêu như chiều cao chồi, số lá/chồi, tỷ lệ % các dạng chồi Kết quả được ghi ở bảng 4.3 và bảng 4.4

Phân dạng các biến đổi hình thái chồi tái sinh

Dạng A: Chồi phát triển bình thường, lá xẻ thùy, lá màu xanh

Dạng B: Lá xẻ thùy, lá màu vàng

Dạng C: Lá mọng nước, xẻ thùy ít, lá màu xanh nhạt

Dạng D: Lá mọng nước, lá nhỏ, không xẻ thùy màu xanh đậm

Dạng E: Lá mọng nước, lá to, lá không xẻ thùy

Dạng G: Cụm chồi mọng nước

Dạng A: Chồi phát triển bình

thường, lá xẻ thùy, lá màu xanh Dạng B: Lá xẻ thùy, lá màu vàng

Dạng C: Lá mọng nước, xẻ thùy ít, lá màu xanh nhạt

Hình 4.1: Phân dạng các biến đổi hình thái chồi tái sinh

Từ bảng 4.3 và bảng 4.4 cho thấy việc xử lý tác nhân gây đột biến ở các mức

độ khác nhau ảnh hưởng rất rõ đến sự phát sinh hình thái, sự sinh trưởng của các dạng hình thái Về tỷ lệ các dạng hình thái: Ngược với quy luật giảm dần vể tỷ lệ sống, tỷ lệ bật chồi thì tỷ lệ xuất hiện các chồi biến đổi hình thái lại tăng dần khi nồng độ xử lý EMS tăng dần ở các công thức Điều này là hợp lý thể hiện rõ sự ảnh hưởng của việc xử lý tác nhân đột biến Ở cả hai giống, công thức không xử lý 100% chồi tạo thành đều ở dạng bình thường, các công thức sau tỷ lệ các dạng hình thái tăng cao và ở công thức 0.75%EMS và 1%EMS là rất cao Mối quan hệ giữa nồng độ EMS xử lý thể hiện rõ qua đồ thị 4.2

Đồ thị 4.2: Ảnh hưởng của nồng độ EMS xử lý đến khả năng tạo biến dị của

giống cúc Vàng chanh và Vàng pha lê

Từ đồ thị 4.2 xác định được mối tương quan giữa nồng độ EMS xử lý và tỷ

lệ biến dị với hệ số tương quan là |R| Vàng chanh = 0.989, |R| Vàng pha lê = 0.982 Như vậy, tỷ lệ biến dị phụ thuộc rất chặt vào nồng độ EMS xử lý

Tỷ lệ biến dị nói chung tăng khi nồng độ EMS tăng nhưng tỷ lệ từng dạng biến dị không theo quy luật tăng hay giảm dần:

Dạng B: Ở cả hai giống, dạng B xuất hiện từ công thức xử lý 0.25%EMS đến công thức xử lý 0.75%EMS Giống Vàng chanh và Vàng pha lê đều cao nhất dạng