tình trạng ô nhiễm vi khuẩn trong thịt (bò, lợn) bán tại một số chợ trên địa bàn thành phố hưng yên

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận văn “Tình trạng ô nhiễm vi khuẩn trong thịt bò, lợn bán tại một số chợ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VŨ THU TRANG

TÌNH TRẠNG Ô NHIỄM VI KHUẨN TRONG THỊT (BÒ, LỢN) BÁN TẠI MỘT SỐ CHỢ

TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HƯNG YÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

VŨ THU TRANG

TÌNH TRẠNG Ô NHIỄM VI KHUẨN TRONG THỊT (BÒ, LỢN) BÁN TẠI MỘT SỐ CHỢ

TRÊN ĐỊA BÀN THÀNH PHỐ HƯNG YÊN

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Luận văn “Tình trạng ô nhiễm vi khuẩn trong thịt (bò, lợn) bán tại một số chợ trên địa bàn thành phố Hưng Yên” là

công trình nghiên cứu của riêng tôi Những số liệu, kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn này là trung thực, khách quan và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ trong quá trình thực hiện luận văn này đã được cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều được chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Vũ Thu Trang

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành bản luận văn, tôi luôn nhận được sự giúp đỡ của nhiều tổ chức và cá nhân Nhân dịp này, tôi xin cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Khoa Thú y, Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm đã tạo điều kiện cho tôi được theo học chương trình đào tạo sau đại học tại trường

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo và tập thể cán bộ Chi cục Thú

y tỉnh Hưng Yên đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện và hoàn thành đề tài

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến người hướng dẫn khoa học là PGS.TS Nguyễn Bá Hiên - Học viện Nông nghiệp Việt Nam đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn

Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới gia đình, đồng nghiệp, bạn bè đã đồng hành, đóng góp công sức, động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn

Hưng Yên, ngày tháng năm 2015

Tác giả luận văn

Vũ Thu Trang

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii

MỤC LỤC

Trang

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục bảng iv

Danh mục hình v

Danh mục chữ viết tắt vi

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tình hình nghiên cứu về ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam và trên thế giới 3

1.2 Một số hiểu biết về vi khuẩn E coli 10

1.3 Một số hiểu biết về vi khuẩn Salmonella 13

1.4 Một số hiểu biết về vi khuẩn Staphylococcus aureus 23

CHƯƠNG II NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Đối tượng, địa điểm nghiên cứu 27

2.2 Nội dung 27

2.3 Nguyên liệu 28

2.4 Phương pháp nghiên cứu 29

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

3.1 Thực trạng vệ sinh thú y trên địa bàn thành phố Hưng Yên 36

3.2 Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu vi sinh vật trên mẫu thịt buôn bán tại các chợ trên địa bàn Thành phố Hưng Yên 42

3.3 Một số biện pháp hạn chế ô nhiễm vi khuẩn trong thịt động vật 65

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 69

1 Kết luận 69

2 Đề nghị 70

TÀI LIỆU THAM KHẢO 71

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv

DANH MỤC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Một số bệnh do sử dụng thực phẩm bị ô nhiễm vi sinh vật 3

Bảng 1.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm trong nước từ 2005– 2014 6

Bảng 1.3 Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam 6

Bảng 2.1 Môi trường chính dùng để phân tích các chỉ tiêu VSV 29

Bảng 3.1 Số lượng điểm tiêu thụ thịt gia súc trên địa bàn thành phố

Hưng Yên 36

Bảng 3.2 Số lượng thịt tiêu thụ hàng ngày trên địa bàn thành phố Hưng Yên 37

Bảng 3.3 Kết quả điều tra về ý thức chấp hành pháp luật của người kinh doanh thịt 38

Bảng 3.4 Kết quả điều tra dụng cụ chuyên dùng bày bán thịt 40

Bảng 3.5 Số lượng mẫu thịt lấy tại các quầy kinh doanh 43

Bảng 3.6 Mức độ ô nhiễm TSVKHK trong các mẫu thịt lợn 44

Bảng 3.7 Mức độ ô nhiễm TSVKHK trong các mẫu thịt bò 45

Bảng 3.8 Tỷ lệ từng loại khuẩn lạc trong các loại mẫu 48

Bảng 3.9 Kết quả xác định số lượng E.coli trong các mẫu thịt lợn 50

Bảng 3.10 Kết quả xác định số lượng E.coli trong các mẫu thịt bò 51

Bảng 3.11 Kết quả xác định đặc tính sinh hóa của các mẫu E coli phân lập được 55

Bảng 3.12 Kết quả xác định Salmonella trong các mẫu thịt lợn 56

Bảng 3.13 Kết quả xác định Salmonella trong các mẫu thịt bò 57

Bảng 3.14 Kết quả xác định đặc tính sinh hóa của các chủng Salmonella 60

Bảng 3.15 Kết quả xác định số lượng Sta.aureus trong các mẫu thịt lợn 61

Bảng 3.16 Kết quả xác định số lượng Sta.aureus trong các mẫu thịt bò 62

Bảng 3.17 Kết quả xác định đặc tính sinh hóa các mẫu Sta aureus

phân lập được 65

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Biểu đồ đánh giá mức độ ô nhiễm tổng số vi khuẩn hiếu khí

trong các loại thịt 47

Hình 3.2 Biểu đồ đánh giá mức độ ô nhiễm tổng số vi khuẩn hiếu khí theo địa điểm lấy mẫu 47

Hình 3.3 Biểu đồ đánh giá mức độ ô nhiễm E.coli trong các loại thịt 53

Hình 3.4 Biểu đồ đánh giá mức độ ô nhiễm E.coli theo địa điểm lấy mẫu 53

Hình 3.5 Biểu đồ đánh giá mức độ ô nhiễm Samonella trong các mẫu thịt 58

Hình 3.6 Biểu đồ đánh giá mức độ ô nhiễm Samonella theo địa điểm lấy mẫu 59

Hình 3.7 Biểu đồ đánh giá mức độ ô nhiễm Sta.aureus trong các mẫu thịt 63

Hình 3.8 Biểu đồ đánh giá mức độ ô nhiễm Sta.aureus theo địa điểm lấy mẫu 64

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ATTP : An toàn thực phẩm

C perfringens : Clostridium perfringens

CFU : Colony Forming Unit

HACCP : Hazard Analysis and Critical Control Point Real-Time PCR : Real-Time Polymerase Chain Reaction

Sta aureus : Staphylococcus aureus

TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam TSVSVHK : Tổng số vi sinh vật hiếu khí WHO : World Health Organization VSATTP : Vệ sinh an toàn thực phẩm VSV : Vi sinh vật

WTO : World Trade Organization

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1

Thành phố Hưng Yên là trung tâm của tỉnh Hưng Yên bao gồm nhiều Sở, Ban ngành và các cơ quan Nhà nước, bên cạnh đó còn có nhiều sinh viên của các trường Đại học, Cao đẳng và một số lao động khác đến làm việc vì vậy số lượng thực phẩm có nguồn gốc từ động vật tiêu thụ hàng ngày tương đối lớn

Hiện nay hoạt động buôn bán, kinh doanh thịt gia súc, gia cầm trên địa bàn thành phố diễn biến rất phức tạp Lĩnh vực này bị buông lỏng quản lý, thả nổi cho các hộ tư nhân tự do kinh doanh, các cơ sở giết mổ nhỏ lẻ, phân tán, tự phát triển, nằm xen kẽ trong các khu dân cư gây khó khăn rất lớn cho công tác vệ sinh thú y, vệ sinh an toàn thực phẩm Đặc biệt khi bùng phát dịch bệnh (như dịch cúm gia cầm, lở mồm long móng, dịch tai xanh ở lợn) xảy ra, rất khó khăn cho công tác quản lý, gây khó khăn cho công tác phòng chống dịch bệnh Đây là một trong những nguyên nhân làm dịch lây lan rộng gây nguy hiểm đến tính mạng con người trong cộng đồng

Cho đến nay Hưng Yên chưa có quy hoạch tổng thể về hệ thống các cơ sở kinh doanh, buôn bán thịt gia súc, gia cầm sạch đảm bảo vệ sinh thú y, vệ sinh an toàn thực phẩm với số lượng lớn Việc buôn bán, kinh doanh vận chuyển thịt gia súc, gia cầm vẫn diễn ra tại các chợ cóc, chợ tạm, lòng đường, vỉa hè, phân tán một cách tự phát, không qua kiểm dịch của cơ quan Thú y nên chưa đảm bảo vệ

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2

sinh thú y, vệ sinh an toàn thực phẩm, nguy cơ lây nhiễm các dịch bệnh từ động vật sang người rất cao và gây ô nhiễm môi trường xung quanh nhất là trong các khu dân cư tập trung

Để đảm bảo điều kiện vệ sinh thú y đảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm cũng có nghĩa là phải quản lý giám sát được các nguy cơ gây ô nhiễm từ quá trình chăn nuôi, giết mổ, chế biến đến quá trình lưu thông tiêu thụ trên thị trường Trong đó đảm bảo các tiêu chuẩn vệ sinh thú y trong quá trình chăn nuôi là một khâu có ý nghĩa hết sức quan trọng đối với việc cung cấp những sản phẩm có chất lượng cho thị trường và nguyên liệu cho ngành công nghiệp chế biến thực phẩm

Xuất phát từ tình hình thực tế chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tình

trạng ô nhiễm vi khuẩn trong thịt (lợn, bò) bán tại một số chợ trên địa bàn thành phố Hưng Yên”làm luận văn thạc sĩ của mình, với hy vọng đóng góp

phần nhỏ cho công tác đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm ở thành phố Hưng Yên nói riêng, trong cả nước nói chung

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Đánh giá thực trạng vệ sinh thú y và ô nhiễm một số vi khuẩn trong thịt (lợn, bò) bán trên thị trường thuộc địa bàn Thành phố Hưng Yên;

- Đánh giá được mức độ an toàn vệ sinh thực phẩm (Thông qua chỉ tiêu kiểm tra vi sinh vật);

- Kết quả của đề tài góp phần cảnh báo về vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm cho người tiêu dùng đồng thời giúp cơ quan chức năng có biện pháp quản

lý và làm tốt công tác vệ sinh an toàn thực phẩm, bảo vệ sức khỏe cộng đồng

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nghiên cứu về ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam và trên thế giới

1.1.1 Khái quát về ngộ độc thực phẩm

Ngộ độc thực phẩm được hiểu là tất cả các trường hợp bệnh gây ra cho người tiêu dùng sau khi ăn (uống) thực phẩm bị ô nhiễm vi sinh vật, ký sinh trùng, hóa chất độc, kim loại nặng và các chất tồn dư vượt quá giới hạn cho phép

Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm có thể chia thành hai loại: ngộ độc thực phẩm do hoá chất, chất tồn dư và các yếu tố sinh vật (vi khuẩn, virus, nấm, nguyên sinh động vật, giun sán)

Bảng 1.1 Một số bệnh do sử dụng thực phẩm bị ô nhiễm vi sinh vật STT Tên các vi khuẩn gây bệnh Triệu chứng gây ngộ độc trên lâm sàng

1 Bacillus cereus Viêm ruột, dạ dày, đau bụng, tiêu chảy,

buồn nôn

2 Campylobacterfetus Viêm ruột, dạ dày, buồn nôn, đau bụng

quặn, đi ngoài ra máu

3 Clostridium perfringens Viêm ruột, dạ dày, ỉa chảy, đau bụng, phân

lỏng hoặc toàn nước, có khi lẫn máu

4 E.coli

Viêm ruột, dạ dày, tiêu chảy, đau bụng dữ dội, rất ít nôn mửa, có loại gây triệu chứng giống hội chứng lỵ, bệnh tả, đi ngoài ra máu

5

Salmonella

(Typhymurium, Enteritidis,

Choleraesuis luôn gây bệnh)

Viêm ruột, dạ dày, sốt, tiêu chảy, nôn mửa, nhức đầu, đau bụng quặn

6 Shigella (luôn gây bệnh) Viêm ruột, dạ dày, tiêu chảy, phân có

máu, sốt trong trường hợp nặng

7 Staphylococcus aureus (gây

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 4

Hoá chất gây ngộ độc bao gồm các hoá chất sử dụng trong công nghiệp và nông nghiệp như các kim loại nặng, thuốc trừ sâu, hormone, chất kích thích sinh trưởng, kháng sinh… Sự tồn lưu, tích luỹ các chất này trong cơ thể người và động vật là nguyên nhân làm biến đổi một số chức năng sinh lí, gây rối loạn trao đổi chất ở mô bào, gây các biến dị di truyền, gây ung thư

Hầu hết các bệnh sinh ra từ thực phẩm có nguồn gốc bệnh nguyên là vi khuẩn Các vi sinh vật gây ô nhiễm thực phẩm bao gồm tập đoàn vi khuẩn

hiếu khí tuỳ tiện, Coliforms, E coli, Proteus, Clostridiumperfringens Sự có

mặt và số lượng của chúng trong thực phẩm được coi là tiêu chí đánh giá chất lượng vệ sinh thực phẩm

1.1.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm trên thế giới

Vệ sinh an toàn thực phẩm (VSATTP) đang là vấn đề nóng bỏng, không chỉ tại những nước kém phát triển, mà ngay cả các nước phát triển, ngộ độc do lương thực, thực phẩm luôn là vấn đề bức xúc và hết sức gay cấn WHO cho rằng lương thực thực phẩm chính là nguyên nhân gây ra khoảng 50% các trường hợp

tử vong đối với con người trên thế giới hiện nay Đặc biệt, những năm gần đây tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm trong khu vực và trên thế giới đang diễn biễn phức tạp trong xu thế toàn cầu hoá với nhiều nguy cơ gây ô nhiễm thực phẩm cho người tiêu dùng như môi trường ô nhiễm, thiên tai lũ lụt, dịch bệnh gia súc gia cầm, gian lận thương mại trong sản xuất sữa nhiễm Melamin, thịt lợn nhiễm Dioxin, hàm lượng hocmon tăng trưởng cao, rượu sản xuất chứa Methanol nồng độ cao, rau quả nhiễm hoá chất bảo vệ thực vật, hoá chất bảo quản, nhiễm vi sinh vật gây bệnh, thực phẩm quá hạn sử dụng; dịch tả xuất hiện rải rác khắp nơi

Tại Nhật Bản, hàng năm trung bình 100.000 dân thì có 20 - 40 trường hợp ngộ độc thực phẩm Trong 10 năm, từ 1991 đến 2000 đã xảy ra 14.549 vụ ngộ độc thực phẩm với 368.313 người mắc, trong đó có 72 người tử vong

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 5

Tại Mỹ, theo Trung tâm phòng ngừa và kiểm soát bệnh tật Hoa Kỳ, hàng năm có tới 76 triệu người ngộ độc thực phẩm, trong đó có 325.000 người nhập viện cấp cứu và khoảng 5 ngàn người tử vong, với mức chi phí khắc phục trung bình tới hàng chục tỷ USD mỗi năm

Ở các nước phát triển, tuy có hệ thống quản lý thực phẩm tiên tiến nhưng các vụ ngộ độc vẫn xảy ra như: Canada với dân số trên 16 triệu người, hàng năm cũng có khoảng 20.000 trường hợp bị ngộ độc do ăn uống, Ở Pháp có khoảng 10 vạn người, nước Mỹ cũng thông báo có trường hợp ngộ độc thực phẩm chiếm khoảng 5% dân số (khoảng 10 triệu trường hợp/năm), gây tổn thất vài tỷ đô la Mỹ hàng năm Ở Việt Nam theo thống kê của ngành y tế, số người

bị ngộ độc thực phẩm và các bệnh tiêu chảy, bệnh dịch đường tiêu hóa do ô nhiễm gây ra lên đến khoảng 4.500.000 người

Báo cáo gần đây nhất của Ủy ban châu Âu về ngộ độc thực phẩm ở người cho thấy: trong năm 2007 có 5.609 vụ ngộ độc thực phẩm, tăng 2,2% so với năm

2006 Tương tự như các năm trước đó, Salmonella là nguyên nhân phổ biến nhất

trong số các nguyên nhân đã được xác định Trong số 22 báo cáo từ 22 nước

châu Âu, có 2.201 vụ ngộ độc do Salmonella, trong đó 26,8% số vụ đã được xác

nhận chắc chắn Trong số 590 vụ đã được xác nhận này, có 8.922 bệnh nhân bị

mắc, trong đó có 1.773 người phải nhập viện và 10 người đã bị chết S enteritidis

là serovar phổ biến nhất có liên quan, còn trứng và các sản phẩm từ trứng là các

nguồn gây ngộ độc chủ yếu (Letellier A et al., 2009)

1.1.3 Tình hình ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam

Theo thống kê của Cục VSATTP, từ năm 2005 đến 2014 cả nước có 1.624

vụ ngộ độc thực phẩm với 50.197 người mắc, 453 người chết Tính trung bình từ năm 2005 đến 3/2015, mỗi năm có khoảng 176 vụ ngộ độc thực phẩm xảy ra với khoảng 5.427 người mắc và khoảng 49 người chết Số liệu về ngộ độc thực phẩm trên thực tế còn cao hơn rất nhiều so với số liệu Cục VSATTP công bố vì ở nước

ta chưa có hệ thống dự báo và điều tra một cách hiệu quả và chính xác sự nhiễm

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 6

Việc giảm thấp số vụ và số người ngộ độc thực phẩm luôn là mục tiêu hàng đầu của tất cả các quốc gia, nhằm bảo vệ sức khỏe người dân, đồng thời tránh được những khoản tiền tiêu tốn vô ích đối với ngân sách nhà nước và gia đình Ở nước ta, mục tiêu này đã được đặt ra cụ thể cho từng năm và cho cả giai đoạn 5 năm Ví dụ năm 2005 phải giảm 30% vụ ngộ độc hàng loạt và phải giảm 30% số tử vong do ngộ độc thực phẩm

Bảng 1.3 Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam

Năm

Nguyên nhân (%) VSV Hóa chất Độc tố tự nhiên Không rõ

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 7

(Nguồn: Bộ Y tế, 2014)

Vi sinh vật có thể dễ dàng xâm nhập qua đường ăn uống bởi chúng có mặt

ở khắp nơi trong đất nước, không khí, quần áo, phân người và gia súc, ở trong họng, mũi, vết thương, tay của người bệnh…

Để đảm bảo chất lượng VSATTP, cần phải thường xuyên tuyên truyền giáo dục pháp lệnh VSATTP đến từng cơ sở, từng tổ chức, cá nhân sản xuất, kinh doanh thực phẩm, tăng cường quản lý, thực hiện thanh tra liên ngành về ATVSTP “từ trang trại đến bàn ăn” Có như vậy mới có thể thiết lập được một thị trường thực phẩm an toàn

1.1.4 Nguyên nhân gây hư hỏng thịt và đường xâm nhập của vi khuẩn vào thịt

Sự hư hỏng của thịt chủ yếu do hai quá trình diễn ra song song: quá trình

tự phân giải của thịt (các phản ứng sinh hóa) và quá trình ôi thiu (sự phân hủy của vi sinh vật)

Quá trình tự phân giải là chuỗi các phản ứng sinh hóa do các men vốn

có trong thịt gây nên Nguyên nhân do thịt động vật sau khi giết mổ không được treo thoáng và bảo quản ngay mà xếp chồng chất, mặt ngoài thịt đã se nhưng bên trong nhiệt độ vẫn cao (28 - 30°C) và pH > 7 tạo điều kiện thuận lợi cho các men proteaza và peptidaza hoạt động một chiều theo hướng phân giải tạo các sản phẩm NH3, H2S, Indol…gây mùi chua khó chịu, bề mặt thịt có màu sẫm, phần sâu bên trong thịt có mùi ôi

Quá trình ôi thiu chủ yếu do vi sinh vật gây nên, có sự tham gia của các men Vi sinh vật có men phân giải hỗn hợp hoạt động phân giải gluxit tạo axit lactic, axit butyric, axit axetic, CO2… Sau đó, nấm men mốc, nấm mốc hấp thụ các axit này tạo môi trường trung tính thuận lợi cho các vi sinh vật gây thối hoạt động mạnh, phân giải protein tạo ra các axit béo, NH3, H2S, CO2, các axit amin độc Đầu tiên là ôi thiu bề mặt, thịt bở, màu nâu nhạt, có mùi ammoniac, bề mặt

có vi khuẩn, nấm men, nấm mốc Sau đó, vi khuẩn sẽ xâm nhập sâu vào trong khối thịt, thịt có màu lục

Đường xâm nhập của vi khuẩn vào thịt: Thịt là môi trường lý tưởng cho

sự phát triển của vi khuẩn Vi khuẩn xâm nhập vào thịt theo hai con đường:

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 8

nhiễm nội sinh và nhiễm ngoại sinh

Nhiễm nội sinh: Do con vật mắc bệnh, mầm bệnh ở các cơ quan tổ chức, nội tạng theo máu đến xâm nhập vào thịt Một số trường hợp do hậu quả của suy nhược cơ thể, làm việc quá sức, đói cũng làm vi sinh vật trong đường ruột lan tràn vào thịt và các tổ chức khác qua đường máu Trên thực tế, thịt của động vật

ốm, bệnh dễ hư hỏng hơn thịt của động vật khỏe

Nhiễm ngoại sinh: Thịt bị nhiễm bẩn từ bên ngoài vào trong quá trình giết

mổ, bảo quản và vận chuyển Vi sinh vật ở da, lông, móng, dao mổ, các dụng cụ chứa, từ công nhân giết mổ, từ môi trường đất, nước, không khí…có thể nhiễm vào thịt

1.1.5 Nguyên nhân nhiễm khuẩn vào thịt

- Nguyên nhân khách quan

Do bản thân động vật: Trên cơ thể động vật sống chứa rất nhiều loại vi khuẩn, nhất là trên da, niêm mạc, các xoang thông với môi trường bên ngoài và

đường tiêu hóa Các giống vi khuẩn chủ yếu là: E coli, Salmonella, Streptococcus,

Clostridium… Những vi khuẩn này có thể nhiễm vào thịt trong quá trình giết mổ và bảo quản

Nhiễm khuẩn từ nước: Nước đóng vai trò quan trọng trong hoạt động giết

mổ và sản xuất chế biến thực phẩm Mọi công đoạn giết mổ đều dùng nước để làm sạch Vì vậy chất lượng vệ sinh của nguồn nước sử dụng trong giết mổ liên quan chặt chẽ đến chất lượng vệ sinh thân thịt Nước sạch là điều kiện quan trọng

để hạn chế lây nhiễm vi sinh vật vào thịt và ngược lại nước bẩn sẽ làm giảm chất lượng vệ sinh thịt

Nhiễm khuẩn từ không khí: Trong không khí thường mang nhiều bụi và hơi nước, bám trên đó là vô số các loại vi sinh vật Chất lượng không khí phụ thuộc vào các thành phần có trong không khí Ở khu vực chuồng nuôi, khu vực giết mổ, khu chế biến, không khí có thể chứa một lượng lớn vi sinh vật từ phân, nước thải, nền chuồng xâm nhập vào Độ sạch bẩn của không khí được đưa vào khu vực sản xuất ảnh hưởng trực tiếp đến mức độ nhiễm khuẩn trong thịt và sản phẩm thịt Không khí ô nhiễm thì thực phẩm dễ bị nhiễm khuẩn

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 9

Nhiễm khuẩn từ đất: Đất là môi trường tồn tại, phát triển thích hợp cho

nhiều loại vi khuẩn Do vậy, nấm mốc, nấm men, các giống vi sinh vật E coli,

Clostridium , Proteus, Bacillus, Streptococcus…có mặt trong đất thường thấy ở

thực phẩm (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001)

- Nguyên nhân chủ quan

Nhiễm khuẩn trong quá trình giết mổ và bảo quản: Thịt của động vật khỏe mạnh nói chung thường chứa rất ít hoặc không chứa vi sinh vật Thịt bị nhiễm khuẩn chủ yếu là do trong quá trình giết mổ không đảm bảo vệ sinh Trong quá trình pha lọc thịt, do thao tác kỹ thuật không đảm bảo dẫn đến thịt

bị nhiễm khuẩn từ bề mặt của con vật, lông, da, sừng, móng và hệ tiêu hóa (Trần Đáng, 2001)

Nhiễm khuẩn từ dụng cụ giết mổ: Dụng cụ sử dụng trong quá trình giết

mổ và pha lọc thịt như dao phóng tiết, bàn mổ, khay đựng, giá treo, móc, dụng cụ bao gói cũng góp phần trong việc vấy nhiễm Khi phóng tiết bằng dao nhiễm khuẩn hoặc nhúng lợn còn sống vào nước, tim còn co bóp, vi khuẩn sẽ vào mạch máu, lâm ba đến các bắp thịt (Kishima et al., 2008)

Nhiễm khuẩn từ công nhân giết mổ: Tay chân, quần áo của công nhân không đảm bảo vệ sinh, đặc biệt là những người mắc bệnh truyền nhiễm là nguồn lây nhiễm vi sinh vật gây bệnh sang thịt

Một nguồn lây nhiễm vi khuẩn khác là do các loại động vật truyền lây như ruồi, nhặng, côn trùng… Ở những khu giết mổ kém vệ sinh thì sự lây nhiễm này rất lớn

Bên cạnh đó, stress do vận chuyển từ xa, nhốt chật, cắn nhau cũng làm giảm sức đề kháng của cơ thể, tạo điều kiện cho vi khuẩn đường tiêu hóa xâm nhập qua màng nhầy ruột vào hệ tuần hoàn, đến các cơ và tổ chức khác trong

cơ thể

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 10

1.2 Một số hiểu biết về vi khuẩn E coli

1.2.1 Đặc tính sinh học

Trực khuẩn Escherichia coli là một vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn đường

ruột Enterobacteriaceae, có nhiều trong tự nhiên, trong đường ruột của người và động vật Trong đường ruột, E coli có nhiều ở ruột già nên còn gọi là vi khuẩn

ruột già

Từ ruột, E coli theo phân ra đất, nước và khi gặp điều kiện phát triển

thuận lợi, chúng có thể trở thành nguyên nhân gây ra một số bệnh ở người và động vật

1.2.1.1 Hình thái

E coli là một trực khuẩn Gram âm, hình gậy ngắn, kích thước 2 –3 x 0,6µ

Trong cơ thể có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ đôi khi xếp thành chuỗi ngắn

Có khi trong môi trường nuôi cấy thấy có những trực khuẩn dài 4 – 8µ, những

loại này thường gặp trong canh khuẩn già

Mặc dù có lông nhưng một tỷ lệ lớn các E coli không di động

Vi khuẩn không sinh nha bào, có thể có giáp mô

1.2.1.2 Đặc tính nuôi cấy

E coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện, có thể phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường

– Thạch thường: Sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, không

trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính 2 – 3mm Nuôi lâu, khuẩn lạc

trở thành gần như nâu nhạt và mọc rộng ra Có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng R (Rough) và M (Mucous)

– Nước thịt: Phát triển tốt, môi trường rất đục, có cặn màu tro nhạt lắng xuống đáy, đôi khi có màu xám nhạt trên mặt môi trường, môi trường có mùi phân thối

– Thạch máu: Có chủng dung huyết β, có chủng dung huyết α

– Môi trường EMB: Khuẩn lạc màu tím đen, có ánh kim màu xanh lá cây

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 11

– Môi trường Macconkey: Khuẩn lạc màu hồng cánh sen, tròn nhỏ, hơi lồi, không nhày, rìa gọn, không làm chuyển màu môi trường

– Môi trường SS: Khuẩn lạc màu đỏ

– Môi trường BGA: Khuẩn lạc dạng S, màu vàng nhạt

1.2.1.3 Đặc tính sinh hóa

– Chuyển hóa đường:

E coli lên men có sinh hơi các loại đường: lactose, fructose, glucose, levulose, galactose, xylose, ramnose, maniton, mannitol Không lên men adonit, inozit

Tất cả các E coli đều lên men đường lactose nhanh và sinh hơi, tuy nhiên cũng có một vài chủng E coli không lên men lactose

– Các phản ứng khác:

Sữa: đông sau 24 – 72 giờ ở 37oC

Gelatin, huyết thanh đông, lòng trắng trứng đông: không tan chảy

Nghiệm pháp IMVIC: + + - -

Có men decacboxylaza với lyzin, denitin, acginin và glutamic

1.2.2 Cấu trúc kháng nguyên

Cấu trúc kháng nguyên của E coli rất phức tạp, có đủ ba loại kháng

nguyên O, H và K Kháng nguyên K cũng có nhiêu loại L, A, B nên có nhiều type huyết thanh khác nhau

Dựa vào cấu tạo kháng nguyên O, E coli được chia làm nhiều nhóm, căn

cứ vào cấu tạo kháng nguyên O, H, K, E coli lại chia làm nhiều type, mỗi type

đều được ghi thứ tự các yếu tố kháng nguyên O, H, K

1.2.3 Một số yếu tố độc lực

– Độc tố: Loại E coli có giáp mô (kháng nguyên K) gây ngộ độc mạnh

hơn loại không giáp mô

– Nội độc tố đường ruột: Gồm 2 loại chịu nhiệt và không chịu nhiệt Cả hai loại này đều gây tiêu chảy

Loại chịu nhiệt ST (Heat Stable Enterotoxins): gồm các loại STa, STb

ST kích thích Guanylate cyclase làm tăng GMP vòng dẫn tới tăng bài xuất

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 12

Na+, HCO3–, H2O đồng thời cũng cản trở quá trình hấp thu các yếu tố này Do

đó gây ỉa chảy

Loại không chịu nhiệt LT (Heat Labile Enterotoxins): gồm các loại LT1, LT2 LT kích hoạt hệ thống Adenylate cyclase làm tăng bài xuất Na+, Cl–, H2O

từ tế bào vào xoang ruột, đồng thời cản trở quá trình hấp thu các yếu tố trên từ bên ngoài vào tế bào, dưới tác động của một số yếu tố khác gây nên tình trạng

ỉa chảy

1.2.4 Đặc tính gây bệnh

Cơ chế gây ngộ độc: khi cơ thể bị nhiễm một số vi khuẩn kèm theo độc tố của chúng

E coli gây bệnh được chia thành sáu nhóm như sau:

– Enteropathogenic E coli (EPEC): là nhóm E coli gây bệnh đường ruột Gồm các type thường gặp O26: B6, O44, O55: B5, O112: B11, O124, O125: B5,

O142, thường gây tiêu chảy cho trẻ em dưới 18 tháng

– Enterotoxigenic E coli (ETEC): là nhóm E coli sản sinh độc tố đường

ruột (LT, ST), gây bệnh ở mọi lứa tuổi

– Enteroinvasive E coli (EIEC): là nhóm E coli xâm nhập và kí sinh nội bào Những E coli thuộc nhóm này có 1 số đặc tính sinh hóa gần giống Shigella

30% các chủng phân lập được không lên men lactose, đa số không di dộng

Thường gặp các type O125, O167, O144…

– Enterohaemorrhagic E coli (EHEC) – Verotoxin producing E coli

(VTEC): gây xuất huyết ruột và tiết niệu do nhóm vi khuẩn sản sinh độc tố tế bào thường gây bệnh cho trẻ em dưới 5 tuổi

– Enteroodherent aggregative (EA – AggEC): là nhóm vi khuẩn E coli

gây kết tập đường ruột

– Necrosis E coli: là nhóm vi khuẩn gây hoại tử tế bào

Gần đây người ta phát hiện chủng E coli mới ký hiệu là E coliO157: H7

Chủng này đã gây ra những vụ ngộ độc lớn trên thế giới trong những năm gần đây (Sheikh AA et al., 2012)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 13

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển và tồn tại của E coli trong thực phẩm

– Nhiệt độ:

E coli phát triển được ở nhiệt độ 7 – 48oC, tối ưu ở 37oC

ETEC phát triển được ở nhiệt độ 4 – 5oC

EPEC phát triển được ở nhiệt độ 4 – 5oC và dưới 44oC

Một số chủng có nhiệt độ tối ưu 30oC

– Sức đề kháng nhiệt: E coli có thể chịu được 60oC trong 0,1 phút, 55oC

trong 5 phút và –20oC trong 9 tháng Đặc biệt, E coliO157: H7 đề kháng với

lạnh âm

– Chiếu xạ: Liều chiếu xạ diệt vi khuẩn E coli là 3Kgy

– pH: E coli phát triển trong giá trị pH từ 4,4 – 9,0

– Nước hoạt động: aw = 0,95

– Thành phần bổ sung: phụ thuộc nhiệt độ, pH bảo quản

Vi khuẩn E coli có thể sống trong thực phẩm có bổ sung 6% NaCl ở nhiệt

độ 15 – 35oC, pH = 5,6 – 6,8, 200mg NaNO2/ 1 lít ở 10 – 15oC, 400mg NaNO2/ 1 lít ở 20oC

– Cạnh tranh với các vi khuẩn khác: E coli có khả năng cạnh tranh với vi khuẩn gây thối rữa mạnh hơn Salmonella và cạnh tranh với vi khuẩn lên men lactic

1.3 Một số hiểu biết về vi khuẩn Salmonella

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 14

người và động vật (Letellier A et al., 2009)

1.3.1.1 Hình thái

Theo Nguyễn Như Thanh và cs., (2001) vi khuẩn Salmonella là những

trực khuẩn ngắn, hai đầu tròn, có kích thước 0,4-0,6 x 1,0-3,0 µm, bắt màu Gram

âm, không hình thành nha bào và giáp mô Đa số loài Salmonella có lông (flagella) từ 7-12 chiếc xung quanh thân (trừ S gallinarum-pullorum)

Lông giúp cho vi khuẩn có khả năng di động Lông có hình tròn, dài, xuất phát từ màng cytoplasma Do có cấu trúc từ các sợi protein hình xoắn nên có thể co giãn và di động nên lông của chúng rất khó nhuộm Nếu nhuộm bằng phương pháp Haschem thì có thể nhìn thấy chúng dưới kính hiển vi điện tử Lông có tính kháng nguyên và do các gen mã hóa tổng hợp protein riêng quy định

Ngoài ra, trên bề mặt màng ngoài của vi khuẩn Salmonella đều có các cấu trúc sợi nhỏ hơn, còn gọi là Fimbriae hay Pili Theo Takeshi et al (2009)

Fimbriae tạo cho vi khuẩn khả năng bám dính (adhesion) lên các tế bào biểu mô ruột và xâm nhập vào lớp niêm mạc

1.3.1.2 Tính chất nuôi cấy

Salmonella là vi khuẩn vừa hiếu khí, vừa kỵ khí không bắt buộc, dễ nuôi cấy Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp là 37oC, nhưng có thể phát triển được ở nhiệt độ

từ 6- 42oC Nuôi cấy ở 43oC có thể loại trừ được tạp khuẩn mà Salmonella vẫn

phát triển được (Phạm Song and Nguyễn Hữu Quỳnh, 2008) pH thích hợp cho vi khuẩn phát triển là 7,6 tuy nhiên, vi khuẩn vẫn phát triển được ở pH từ 6-9

Khi nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường BPW (Buffered Pepton Water) và môi trường RV (Rappaport Vassiliadi), sau vài giờ nuôi cấy thấy môi trường vẩn đục nhẹ, sau 18 đến 24 giờ thấy canh trùng đục đều, trên mặt môi trường có màng mỏng, đáy ống nghiệm có cặn

Hiện nay có rất nhiều loại môi trường chọn lọc được các nhà vi sinh vật

thú y sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và phân lập vi khuẩn Salmonella như

môi trường thạch DHL (Deoxycholate Hydrogen sulfide Lactose agar) Sau 24 giờ nuôi cấy vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc tròn, lồi, bóng láng (dạng S),

có màu vàng nhạt Các chủng sinh H2S thì giữa khuẩn lạc có màu đen

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 15

Môi trường thạch MacConkey: Vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc tròn lồi, trong không màu, nhẵn bóng

Trên môi trường thạch CHROMTMSalmonella, sau 24 giờ nuôi cấy, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc trơn, tròn, bóng láng (dạng S) và có màu tím hồng

Trong môi trường thạch TSI (Triple Sugar Iron), vi khuẩn Salmonella do

sản sinh alkaline nên phần thạch nghiêng có màu đỏ (pH=7,3), đáy ống nghiệm màu vàng (pH=6,8) do vi khuẩn chỉ lên men đường Glucose Phần giữa ống nghiệm có màu đen do vi khuẩn sản sinh ra khí H2S Nếu để lâu (quá 24 giờ), màu đen môi trường thường làm át phản ứng tạo axit ở phần đáy ống nghiệm (không nhìn thấy màu vàng)

Trong môi trường LIM (Lysine Indole Motility), vi khuẩn không làm chuyển màu môi trường, môi trường có màu tím nhạt

Môi trường Malonate, vi khuẩn không phát triển nên không làm thay đổi

màu môi trường

Môi trường thạch thường: Sau 24 giờ nuôi cấy, hình thành những khuẩn lạc lớn, hình thái rất khác nhau, trung bình đường kính từ 2- 3mm Khuẩn lạc có thể tròn, mặt hơi lồi, rìa bề mặt và rìa hình khía răng cưa Một số serotyp đôi khi

hình thành các khuẩn lạc dạng nhầy như: S.paratyphi B

Trên môi trường thạch Endo: Vi khuẩn Salmonella hình thành khuẩn lạc

màu trắng hồng, tròn trơn, nhẵn bóng trông như những hạt sương long lanh trên màu hồng nhạt của môi trường

Trên môi trường thạch Brilliant green: Salmonella hình thành khuẩn lạc

màu trắng hồng, sáng, bao bọc xung quanh bởi môi trường màu đỏ sáng

Trên môi trường thạch XLD: khuẩn lạc màu đen bóng, hơi lồi

1.3.1.3 Đặc tính sinh hoá

Theo (Van T et al., 2012) giống vi khuẩn Salmonella được chia thành 7

phân nhóm, mỗi phân nhóm có khả năng lên men một số loại đường nhất định và

không đổi Phần lớn phân loài S enterica subsp enterica gây bệnh cho động vật

máu nóng Chúng lên men và sinh hơi: Glucoza, Mannit, Mantoza, Galactoza, Dulcitol, Arabonoza, Sorbitol Cũng ở nhóm này, hầu như các chủng vi khuẩn

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 16

Salmonella đều không lên men Lactoza và Saccaroza

Đa số các vi khuẩn thuộc giống Salmonella không làm tan chảy gelatin,

không phân giải urê, không sản sinh Indol Phản ứng MR, catalaza dương tính

(trừ S choleraesuis, S gallinarum-pullorum có MR âm tính) Phản ứng Oxidaza

âm tính Phản ứng sinh H2S dương tính (trừ S paratyphi A, S typhisuis, S

choleraesuis) (Wegener H.C et al., 2003)

1.3.1.4 Sức đề kháng của vi khuẩn Salmonella

Vi khuẩn Salmonella mẫn cảm với nhiệt độ và các chất sát trùng mạnh Ở

nhiệt độ 50oC trong 1 giờ, 70oC trong 20 phút, 100oC trong 15 phút hoặc ánh sáng mặt

trời chiếu thẳng trong 5 giờ có thể diệt được vi khuẩn (Bahnson P.B et al., 2006).

Các chất sát trùng thông thường dễ phá hủy vi khuẩn hoàn toàn như: Phenol 5%, Formon 1/500 diệt vi khuẩn trong 15- 20 phút

Theo Bahnson P.B et al (2006) vi khuẩn Salmonella sống được lâu trong

điều kiện lạnh, chúng có thể sống trong bột thịt 8 tháng, nhưng ở điều kiện môi trường có độ pH ≤ 5 chúng chỉ sống được trong thời gian ngắn

Vi khuẩn Salmonella tồn tại trong chất độn chuồng tới trên 30 tuần, có thể

sống ở trong đất với độ sâu 0,5m trong thời gian 2 tháng Ở sàn gỗ, tường gỗ trong điều kiện ít ánh sáng là 87 ngày, máng gỗ 108 ngày Trong nước tù

đọng, đồng cỏ ẩm thấp S typhimurium có thể tồn tại trên 7 tháng Trong xác súc vật chết, Salmonella có thể sống trên 100 ngày, trong thịt ướp muối từ 6-8 tháng (Nguyễn Như Thanh et al., 2001)

1.3.2 Khả năng gây bệnh của Salmonella

Có những Salmonella chỉ gây bệnh cho người (như S.typhi, S.paratyphi A,

B,C) Có loại vừa gây bệnh cho người vừa gây bệnh cho động vật (như các loại

Salmonella gây nhiễm khuẩn nhiễm độc thức ăn) Có loại chỉ gây bệnh cho động

vật (như S typhi suis) Vi khuẩn Salmonella theo thức ăn và nước uống xâm

nhập vào đường tiêu hóa gây nên biểu hiện toàn thân: sốt li bì, nhịp tim giảm, huyết áp giảm, đây là dấu hiệu đặc trưng của bệnh thương hàn

Nhiễm độc thức ăn do Salmonella gây viêm dạ dầy - ruột thường gặp hơn

và tỷ lệ mắc lớn hơn nhiều so với bệnh thương hàn Ở các nước công nghiệp

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 17

nguyên nhân gây chứng viêm dạ dày- ruột chủ yếu là do Campylobacter và

Salmonella spp (Phạm Song and Nguyễn Hữu Quỳnh, 2008)

Theo Phạm Sỹ Lăng và cs (2011) vi khuẩn Salmonella gây ngộ độc thực phẩm chủ yếu do hai loại vi khuẩn S.enteritidis và S typhimurium Quá trình gây

ngộ độc thực phẩm diễn ra cần có hai điều kiện:

+ Thức ăn phải nhiễm số lượng lớn vi khuẩn sống (vì tính chất gây ngộ độc của vi khuẩn yếu)

+ Vi khuẩn vào cơ thể sản sinh một số lượng lớn độc tố

Nguồn truyền nhiễm thường là do thịt bị ô nhiễm Salmonella, nhưng cũng

có thể là do trứng vịt, trứng ngỗng, trứng gà bị nhiễm vi khuẩn Vi khuẩn

Salmonella bị nhiễm vào cơ thể với số lượng khoảng 102- 103 vi khuẩn thì các triệu chứng cấp tính sẽ xuất hiện: nôn, ỉa chảy đột ngột kèm theo sốt cao Các dấu hiệu lâm sàng là do nội độc tố gây ra Bệnh thường khỏi sau 2 - 4 ngày, khi khỏi, người lành bệnh thường không mang vi khuẩn, rất hiếm trường hợp bị nhiễm trùng huyết

và mung mủ cục bộ

1.3.3 Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Salmonella

Cấu trúc kháng nguyên của vi khuẩn Salmoenlla hết sức phức tạp, bao gồm

3 loại chính:

Kháng nguyên O (O- Antigen): Kháng nguyên thân

Kháng nguyên H (H- Antigen): Kháng nguyên lông

Kháng nguyên K (K- Antigen) hay kháng nguyên vỏ

* Kháng nguyên thân O (O- Antigen)

Kháng nguyên O nằm ở thành tế bào vi khuẩn, có cấu trúc Lipopolysaccharide (LPS) là thành phần chính cấu tạo nên lớp màng ngoài của thành tế bào vi khuẩn gram âm Kháng nguyên O chịu nhiệt (Heat-stable) và kháng cồn, bị biến tính khi sử lý bằng formaldehyde Kháng nguyên O gồm 2 nhóm chính:

- Polysaccharid không có nhóm hydro, không mang tính đặc trưng của kháng nguyên và chỉ tạo sự khác biệt về hình thái khuẩn lạc từ dạng S (Smooth)

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 18

sang dạng R (Rough) và dẫn đến giảm độc lực của vi khuẩn (Kishima et al., 2008)

- Polysaccharid nằm ở ngoài có nhóm hydro quyết định tính kháng nguyên

và đặc trưng cho từng serotyp

Kháng nguyên O được xem như là một nội độc tố (Endotoxin) mà nó được cấu tạo bởi nhóm hỗn hợp glyco- polypeptid có thể tìm thấy ở màng ngoài của vỏ bọc vi khuẩn

Kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella có 67 loại chính, được chia thành hơn 50 nhóm, số còn lại đóng vai trò phụ (Sheikh et al., 2012)

* Kháng nguyên lông H (H- Antigen)

- Kháng nguyên H (H-Antigen) là protein nằm trong thành phần lông của

vi khuẩn, là loại kháng nguyên không chịu nhiệt (Heat labile), rất kém bền vững

so với kháng nguyên O, bị phá hủy ở nhiệt độ 60oC sau 1 giờ, dễ phá hủy bởi cồn

và axit yếu (Nguyễn Phùng Tiến và cs., 2000)

- Kháng nguyên H gồm có 2 pha:

Pha 1: có tính đặc hiệu, gồm 28 loại kháng nguyên được biểu thị bằng chữ mẫu

La tinh thường: a,b,c,d, ,z

Pha 2: Không có tính đặc hiệu, gồm 6 loại được biểu thị bằng chữ số Ả rập: 1, 2, 3, 4, 5, 6 hay la tinh thường: e,n,x,

Tuy nhiên, trong từng tế bào vi khuẩn riêng biệt, luôn luôn chỉ xuất hiện từng pha, bởi vậy mà trong chẩn đoán, để đạt được một công thức kháng nguyên

hoàn chỉnh cho Salmonella phải thay đổi pha Có các loài Salmonella như S

typhisuis , hoặc S enteritidis thì chỉ tạo 1 pha

Kháng nguyên H không quyết định yếu tố độc lực của vi khuẩn, cũng như không có ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phòng bệnh, nhưng nó có ý nghĩa quan trọng trong việc xác định giống loài của vi khuẩn

* Kháng nguyên vỏ (K- Antigen) (hay Vi- Antigen)

Theo Letellier et al (2009) kháng nguyên vỏ chỉ có ở một số loài như S

typhi, S paratyphi S dublin cũng có thể mang kháng nguyên vỏ Kháng nguyên

K có thể làm che các kháng nguyên thân O Cũng theo tác giả, nếu đun sôi huyễn

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 19

dịch của các loài Salmonella này trong 10 đến 12 phút sẽ phá hủy được kháng

nguyên vỏ

Trong 3 kháng nguyên chủ yếu trên, kháng nguyên O và kháng nguyên H

là 2 loại kháng nguyên có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán

1.3.4 Các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Salmonella

1.3.4.1 Các yếu tố không phải là độc tố

* Kháng nguyên O

Chất lượng thành phần hóa học, cấu trúc kháng nguyên O đều ảnh hưởng

tới độc lực của vi khuẩn Salmonella Cụ thể là: S typhimurium nếu thay đổi

thành phần kháng nguyên từ công thức 1, 4, 12 sang 1, 9, 12 thì vi khuẩn từ dạng

có độc lực chuyển sang dạng không có độc lực (Wegener et al., 2003)

Kháng nguyên O là yếu tố độc lực giúp vi khuẩn chống lại khả năng phòng vệ của vật chủ, giúp vi khuẩn phát triển trong tế bào tổ chức, chống lại sự thực bào của đại thực bào

Kháng nguyên O khích thích các cơ quan đáp ứng miễn dịch hình thành kháng thể đặc hiệu ngưng kết với kháng nguyên tương ứng Cơ chế phòng vệ này giúp cơ thể vật chủ chống lại quá trình tái xâm nhập của vi khuẩn

Đến nay, người ta đã xác định được trên 3000 serotyp kháng nguyên O

của Salmonella, thành phần kháng nguyên của vi khuẩn S choleraesuis gồm: O6,

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 20

vệ giúp vi khuẩn chống lại tác động ngoại cảnh và hiện tượng thực bào (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001)

* Yếu tố bám dính

Theo (Kishima et al., 2008) khả năng bám dính của vi khuẩn

Salmonella lên tế bào nhung mao ruột là bước khởi đầu quan trọng trong quá trình gây bệnh Hiện tượng bám dính của vi khuẩn lên bề mặt tế bào vừa mang tính chất lý hóa, vừa mang tính chất sinh học

* Yếu tố xâm nhập

Theo (Cortez et al., 2006) khả năng xâm nhập vào tế bào có nhân hoặc lớp niêm mạc của đường ruột là đặc tính của một số chủng Salmonella có độc lực Các biến chủng Salmonella không có khả năng xâm nhập vào tế bào

thường là các chủng không có độc lực

Sau khi tiếp cận tế bào vật chủ, vi khuẩn Salmonella tác động làm tăng

hàm lượng Ca++ nội bào, hoạt hóa Actin Depolimeriring Enzyme, làm thay đổi cấu trúc, hình dạng các sợi actin, biến đổi màng tế bào, dẫn đến hình thành giả túc bao vây tế bào vi khuẩn dưới dạng các không bào chứa vi khuẩn Sau đó vi

khuẩn Salmonella xâm nhập được vào trong tế bào, tồn tại, tiếp tục nhân lên với

số lượng lớn, phá vỡ tế bào vật chủ, sản sinh độc tố đường ruột (Enterotoxin) và gây tiêu chảy cho vật chủ (Phạm Sỹ Lãng và cs., 2011)

tố bất lợi của môi trường xung quanh Hầu hết các chủng Salmonella có khả

năng kháng lại một hoặc nhiều loại kháng sinh

1.3.4.2 Các yếu tố là độc tố

Nếu như các yếu tố gây bệnh không phải là độc tố là những tác nhân gián

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 21

tiếp, quan trọng trong quá trình sinh bệnh của vi khuẩn Salmonella, thì các yếu tố

gây bệnh là độc tố lại là tác nhân trực tiếp quyết định quá trình sinh bệnh Các

yếu tố gây bệnh là độc tố của Salmonella bao gồm: nội độc tố (Endotoxin), ngoại

độc tố đường ruột (Enterotoxin) và độc tố tế bào (Cytotoxin)

* Độc tố đường ruột (Enterotoxin)

Độc tố đường ruột của vi khuẩn Salmonella có hai thành phần chính: Độc

tố thẩm xuất nhanh RPF (Rapid Permeability Factor) và độc tố thẩm xuất chậm DPF (Delayed Permeability Factor) (Nguyễn Phùng Tiến và cs., 2000)

Độc tố thẩm xuất nhanh có cấu trúc thành phần giống với độc tố chịu nhiệt

của vi khuẩn E coli (Heat-stabile toxin: ST)

Yếu tố thẩm xuất nhanh giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô

của ruột, và thực hiện khả năng thẩm xuất sau 1- 2 giờ, kéo dài 48 giờ và làm trương tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary cell) ST có khả năng chịu được nhiệt độ 100oC trong 4 giờ, bền vững ở nhiệt độ thấp, có thể bảo quản ở -20oC Cấu trúc phân tử gồm nhiều polysaccharide và một số chuỗi polypeptide

Độc tố thẩm xuất nhanh (RPE) kích thích lên hệ thống men Guanylate Cyclase trong tế bào biểu mô ruột, chuyển GTP thành GDP Trong tế bào, GDP tăng cao làm cho nồng độ ion Ca++ cũng tăng cao, dẫn đến ngăn cản hấp thu chất điện giải và nước ở trong xoang ruột Do vậy, lượng nước trong ruột tăng cao, kích thích niêm mạc ruột, tăng co bóp, làm gia súc ỉa chảy

Theo Phạm Sỹ Lãng và cs (2011) 72,7% các chủng Salmonella phân

lập được từ lợn sau cai sữa bị ốm, chết nghi phó thương hàn sản sinh độc tố chịu nhiệt

+ Yếu tố thẩm xuất chậm của Salmonella có cấu trúc, thành phần giống độc tố không chịu nhiệt của vi khuẩn E coli (Heat Labile Toxin: LT), và thực

hiện chức năng thẩm xuất chậm từ 18- 24 giờ, có thể kéo dài 36- 48 giờ Độc tố thẩm xuất chậm (DPF) bị phá hủy ở 70oC trong vòng 30 phút và ở 56oC trong vòng 4 giờ Cấu trúc phân tử gồm 3 chuỗi polypeptid và một số hợp chất khác

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 22

Phân tử lượng 40.000- 50.000 dalton

Độc tố thẩm xuất chậm của Salmonella làm thay đổi quá trình trao đổi

nước và chất điện giải, dẫn đến tăng cường bài xuất nước và chất điện giải từ mô bào vào lòng ruột, cản trở sự hấp thu, gây thoái hóa lớp tế bào villi của thành ruột, gây tiêu chảy

Theo Phạm Song và Nguyễn Hữu Quỳnh (2008) đã kết luận: 81,81% số

chủng S typhimurium phân lập từ lợn mắc bệnh tiêu chảy sản sinh độc tố không

chịu nhiệt (LT) có khả năng gây tích nước trong ruột non của lợn thí nghiệm

tố của vi khuẩn Cấu trúc nội độc tố gần giống với cấu trúc của kháng nguyên O

Cấu trúc nội độc tố biến đổi sẽ dẫn đến sự thay đổi độc lực của Salmonella Các đột biến gen ở vùng lõi, vùng ưa nước làm cho Salmonella không còn độc lực

(Tô Liên Thu, 2004)

Lipit A có ái lực với màng tế bào, với lipit khác và với Protein Điều đó chứng tỏ lipit A chính là trung tâm hoạt động của nội độc tố Vùng đa đường Polysaccharid, chỉ giữ vai trò là vật mang các lipit không hòa tan

Nội độc tố là LPS được tiết ra từ vách tế bào vi khuẩn khi bị dung giải Trước khi thể hiện độc tính, LPS cần phải liên kết với các yếu tố liên kết tế bào hoặc các receptor bề mặt các tế bào như: Tế bào lâm bao cầu B, lâm bao cầu T, tế bào đại thực bào, tiểu cầu, tế bào gan lách

Rất nhiều các cơ quan trong cơ thể vật chủ chịu sự tác động của nội độc tố LPS: Gan, thận, cơ, hệ tim mạch, hệ tiêu hóa và hệ thống miễn dịch với các biểu hiện bệnh lý như: Tắc mạch máu, giảm trương lực cơ, thiếu oxy mô bào, toan

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 23

huyết, rối loạn tiêu hóa, mất tính thèm ăn

* Độc tố tế bào (Cytotoxin)

Đặc tính chung của Cytotoxin là có khả năng ức chế tổng hợp Protein của

tế bào có nhân và làm trương tế bào CHO (Chinese Hamster Ovary cell) Đa phần độc tố của chúng bị phá hủy bởi nhiệt độ

Theo Wegener et al., 2003) làm tổn thương tế bào biểu mô là đặc tính

quan trọng của Cytotoxin Có ít nhất là 3 dạng Cytotoxin:

+ Dạng 1: Không bền vững với nhiệt và mẫn cảm với Trypsin Độc tố này

có trọng lượng phân tử khoảng 56- 78 kDa, nó tác động theo cơ chế là ức chế tổng hợp Protein của tế bào Hela và làm teo tế bào

+ Dạng 2: Có nguồn gốc từ Protein màng ngoài tế bào vi khuẩn, có cấu

trúc và chức năng gần giống với các dạng độc tố tế bào do Shigella và các chủng Enterotoxigenic E coli (ETEC) sản sinh ra Dạng độc tố này cũng có ở hầu hết các serovar Salmonella gây bệnh

+ Dạng 3: Dạng này có liên quan với Hemolysin Dạng độc tố này tác động lên tế bào theo cơ chế dung giải các không bào nội bào.Trong phòng thí nghiệm, độc tố này gây chết tế bào Vero, tế bào Hela và tế bào CHO

Trên đây là 3 loại độc tố gây bệnh chính của vi khuẩn Salmonella, chúng là

các tác nhân trực tiếp, quyết định khả năng gây bệnh của vi khuẩn

Một số serotyp như: S choleraesuis, S typhimurium, S enteritidis, S

dublin, S gallinarum, S pullorum có mang các plasmid có kích thước lớn (khoảng từ 50- 100 kb) Chính những plasmid này có mang các yếu tố di truyền quyết định khả năng sản sinh các yếu tố độc lực gây bệnh cho người và gia súc

với tỷ lệ ốm và chết cao (Van et al., 2012)

1.4 Một số hiểu biết về vi khuẩn Staphylococcus aureus

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24

Sta aureus hình cầu, không di động, không sinh nha bào và không có vỏ, không có lông, không di động

Trong bệnh phẩm, canh khuẩn, Sta aureus thường xếp thành từng đôi,

từng đám nhỏ hình chùm nho

Khi nhuộm phương pháp Gram, vi khuẩn bắt màu Gram dương

1.4.1.2 Đặc tính nuôi cấy

Tụ cầu vàng sống hiếu khí hoặc kỵ khí tùy tiện, nhiệt độ thích hợp 32 – 37oC,

pH thích hợp 7,2 – 7,6 Dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy thông thường

– Môi trường nước thịt: Sau khi cấy 5 – 6h, vi khuẩn đã làm đục môi

trường, sau 24h môi trường đục rõ hơn, lắng cặn nhiều, không có màng

– Môi trường thạch thường: Sau khi cấy 24h, vi khuẩn hình thành khuẩn lạc tương đối to dạng S (Smouth), màu vàng thẫm, mặt khuẩn lạc hơi ướt, bờ đều nhẵn

– Môi trường thạch máu: Vi khuẩn mọc rất tốt, sau khi cấy 24h, vi khuẩn hình thành những khuẩn lạc dạng S, có hiện tượng dung huyết

– Môi trường thạch Sapman: Vi khuẩn lên mên đường mannitol làm pH thay đổi, môi trường Sapman lúc này trở nên vàng

–Môi trường Gelatin: Cấy vi khuẩn theo đường cấy chích sâu, nuôi ở nhiệt

độ 20oC, sau 2 – 3 ngày, gelatin vị tan chảy ra trông giống dạng hình phễu

– Kháng nguyên polysaccarit ở vách tế bào là một phức hợp mucopeptit –

axit teichoic Kháng nguyên này khi gặp kháng thể tương ứng sẽ gây nên phản ứng ngưng kết

– Kháng nguyên protein hay protein A là thành phần ở vách và ở phía ngoài

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 25

1.4.3 Một số yếu tố độc lực

– Độc tố dung huyết: có 4 loại chính:

Dung huyết tố anpha (α): Gây dung giải hồng cầu thỏ ở 37oC Dung huyết

tố này cũng gây hoại tử da và gây chết Đây là một ngoại độc tố, bản chất là protein, bền với nhiệt độ Là một kháng nguyên hoàn toàn, gây hình thành kháng thể kết tủa và kháng thể trung hòa dưới tác dụng của focmon và nhiệt độ nó biến thành giải độc tố có thể dùng làm vacxin

Dung huyết tố beta (β): Gây dung giải hồng cầu cừu ở 4oC, dung huyết tố này kém độc hơn dung huyết tố α

Dung huyết tố denta (δ): Gây dung giải hồng cầu người, thỏ, cừu, ngựa và gây hoại tử da

Dung huyết tố gamma (γ): Khác với các loại trên, loại này không tác động lên hồng cầu ngựa

– Nhân tố diệt bạch cầu (Leucocidin): Dưới tác động của nhân tố này, bạch cầu mất tính di động, mất hạt và nhân bị phá hủy, nó giữ vai trò quan trọng trong cơ chế sinh bệnh của tụ cầu

– Độc tố ruột (Enterotoxin): Chỉ do một số chủng tụ cầu tiết ra, nó gây nên các bệnh đường tiêu hóa, nhiễm độc do thức ăn, viêm ruột cấp Độc tố này là những ngoại độc tố, bền với nhiệt độ và không bị phá hủy bởi dịch vị

1.4.4 Đặc tính gây bệnh

– Tác động của độc tố: Cơ chế tác động không giống các dạng enterotoxin khác Nó không tác động lên niêm mạc ruột theo cơ chế gắn với receptor mà tác động lên dây thần kinh X (Vagus), kích thích các trung tâm tuần hoàn, tiêu hóa,

hô hấp, điều tiết nhiệt do đó gây rối loạn toàn thân như nôn mửa, ỉa chảy, rối loạn

tuần hoàn, hô hấp, sốt… (Kelman et al., 2001)

– Vi khuẩn không phát triển trong đường tiêu hóa của người bệnh Trong các thực phẩm giàu protein, aw phù hợp, đã qua chế biến, vi khuẩn phát triển mạnh, tăng nhanh về số lượng và độc lực

– Dấu hiệu lâm sàng chính: nôn mửa, ỉa chảy, đau bụng

– Thời gian nung bệnh rất ngắn: 1 – 6h

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 26

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 27

CHƯƠNG II NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆU VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, địa điểm nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng

- Thực trạng vệ sinh thú y và vệ sinh an toàn thực phẩm

- Sự ô nhiễm vi sinh vật trong thịt bò, thịt lợn tiêu thụ trên địa bàn Thành phố Hưng Yên

2.1.2 Phạm vi nghiên cứu

Trong điều kiện cho phép, phạm vi đề tài chỉ đề cập đến các chỉ tiêu: tổng

số vi khuẩn hiếu khí, vi khuẩn E coli, vi khuẩn Salmonella, vi khuẩn Sta aureus

2.1.3 Địa điểm nghiên cứu

- Một số chợ trên địa bàn thành phố Hưng Yên

- Phòng Dịch tễ và Chẩn đoán xét nghiệm – Chi cục Thú y tỉnh Hưng Yên

- Bộ môn Vi sinh vật truyền nhiễm – Khoa Thú y – Học viện Nông nghiệp Việt Nam

2.1.4 Thời gian thực hiện đề tài

Từ tháng 10/2014 đến tháng 6/2015

2.2 Nội dung

- Khảo sát thực trạng quản lý và điều kiện vệ sinh thú y tại các quầy kinh doanh thịt gia súc (thịt bò, thịt lợn) ở một số chợ trên địa bàn thành phố Hưng Yên

- Xác định số loại và tổng số vi khuẩn hiếu khí có trong thịt lợn, thịt bò bày bán tại các chợ trên địa bàn thành phố Hưng Yên

- Phân lập, xác định số lượng và giám định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn E coli có trong thịt lợn, thịt bò bày bán tại các chợ trên địa bàn thành phố Hưng Yên

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 28

- Phân lập, xác định số lượng và giám định một số đặc tính sinh học của vi khuẩn Salmonella có trong thịt lợn, thịt bò bày bán tại các chợ trên địa bàn thành phố Hưng Yên

- Phân lập, xác định số lượng và giám định một số đặc tính sinh học của vi

khuẩn Sta aureus có trong thịt lợn, thịt bò bày bán tại các chợ trên địa bàn thành

phố Hưng Yên

- Đề xuất một số biện pháp nhằm hạn chế ô nhiễm vi khuẩn trên thịt động vật

2.3 Nguyên liệu

2.3.1 Mẫu nghiên cứu

Qua kết quả trên phiếu điều tra chúng tôi tiến hành lấy 228 mẫu thịt (bò, lợn) đang bày bán ở một số chợ trên địa bàn 12 xã, phường thuộc thành phố Hưng Yên

Kỹ thuật lấy mẫu theo Thông tư Số: 66/2009/TT-BNNPTNT ngày 13 tháng 10 năm 2009 “Ban hành quy chuẩn kỹ thuật quốc gia lĩnh vực thú y” trong

đó có quy định chung của quy chuẩn kỹ thuật lấy mẫu "Quy định chung của quy

chuẩn kỹ thuật quốc gia kỹ thuật lấy và bảo quản mẫu thịt từ các cơ sở giết mổ và kinh doanh th ịt để kiểm tra vi sinh vật”

Thời điểm lấy mẫu: Vào buổi sáng (7- 9h) và có biên bản ghi đầy đủ các thông tin trong biên bản lấy mẫu

2.3.2 Thiết bị, dụng cụ

- Túi đựng bằng chất dẻo vô trùng (túi linon)

- Etanol 70%/ bông thấm nước có tẩm Etanol 70% đựng trong chai

- Dao, kéo vô trùng

- Găng tay vô trùng

- Thùng xốp bảo quản mẫu với túi đá lạnh

- Tủ ấm, tủ sấy, tủ lạnh, nồi hấp cách thủy, cân, buồng cấy an toàn sinh học, máy dập mẫu stomatcher, kính hiển vi có vật kính dầu, ống fancol, bộ thuốc nhuộm Gram

- Đèn cồn, nước sinh lý, que cấy nhựa vô trùng dùng một lần, hộp lồng thủy tinh, khay men, cốc đong, ống nghiệm, dao mổ, kéo cong

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 29

2.3.3 Môi trường chính dùng để phân tích một số chỉ tiêu vi sinh vật trong thịt

Bảng 2.1 Môi trường chính dùng để phân tích các chỉ tiêu VSV

1 TSVSVHK Plate count agar (PCA)

3 Salmonella

Tetrathionat/novobioxin Muller kauffman (MKTTn), Rappaport Vassiliadis (RVS), thạch Deoxycholat lyzin xyloza (XLD), Hektoen enteric agar (HE), thạch máu, KHT O, H đa giá

4 Staphylococcus aureus Baird Parker (BP), thạch máu, Brain heart infusion

broth (BHI), huyết tương thỏ đông khô

2.4 Phương pháp nghiên cứu

- Lập phiếu điều tra, bảng biểu thu thập số liệu về thực trạng điều kiện vệ sinh thú y, tình hình quản lý của các cơ quan hữu quan đối với các cửa hàng, quầy kinh doanh thịt (bò, lợn) tươi sống tại các chợ trên địa bàn thành phố

- Để đánh giá thực trạng vệ sinh thú y tại các quầy, cửa hàng kinh doanh thịt gia súc gia cầm chúng tôi tiến hành điều tra 76 phiếu tại các hộ kinh doanh thịt gia súc đang bày bán ở một số chợ trên địa bàn 12 xã phường thuộc thành phố

Mẫu phiếu điều tra được thiết kế dựa trên TCVN 5452 – 91

2.4.1 Lấy mẫu và chuẩn bị mẫu

Việc lấy mẫu được tiến hành theo TCVN 4833-1:2002

Mẫu ban đầu: Đối với quầy hàng chúng tôi lấy ngẫu nhiên 03 sản phẩm

tại các vị trí khác nhau sao cho các vị trí được lấy mẫu được phân bổ đều và đại diện để lập thành mẫu ban đầu Mẫu lấy về cần được thử nghiệm ngay càng sớm càng tốt Nếu không đủ điều kiện để tiến hành thử nghiệm ngay thì bảo quản mẫu

ở điều kiện (-18oC)

Việc lấy mẫu thử nghiệm được thực hiện tại phòng xử lý mẫu vô trùng, mẫu được phân chia với tỷ lệ như sau: 1/4 dùng cho các chỉ tiêu cảm quan; 1/4

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 30

dùng cho các chỉ tiêu vi sinh vật; 1/4 dùng cho các chỉ tiêu lý hóa; và 1/4 để lưu mẫu Sau khi xử lý, mẫu được đưa đến các phòng thí nghiệm liên quan

Chuẩn bị mẫu để kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh

Pha loãng mẫu: Dùng các ống nghiệm, mỗi

ống nghiệm chứa 9ml dung dịch đệm peptone

để pha loãng mẫu thành các nồng độ tiếp theo

10-2, 10-3, 10-4, 10-5

2.4.2 Phương pháp kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật

2.4.2.1 Xác định tổng số vi sinh vật hiếu khí trong thịt theo TCVN 4884 : 2005 Cách tiến hành: Dùng phương pháp đổ đĩa

Với mỗi mẫu xét nghiệm phải nuôi cấy ít nhất ở 3 độ pha loãng liên tiếp, mỗi độ pha loãng được cấy trên 2 đĩa petri vô trùng

Dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml dung dịch mẫu ở các độ pha loãng tương ứng vào giữa các đĩa petri trống vô trùng

Rót vào mỗi đĩa khoảng 15 ml môi trường Plate Count Agar (PCA) đã đun tan chảy và được làm nguội đến nhiệt độ 44 - 47oC Xoay nhẹ đĩa theo chiều kim đồng hồ hoặc lắc sang trái và phải một cách nhẹ nhàng để cho mẫu tan đều vào môi trường

Đặt đĩa trên mặt phẳng ngang để thạch đông tự nhiên ở nhiệt độ phòng, lật

úp các đĩa và đặt vào tủ ấm 37oC nuôi ấm đến 72 h

Tính kết quả:

Tổng số vi sinh vật hiếu khí trong 1g mẫu được tính theo công thức:

Trong đó: X: TSVSVHK trong 1 gam thịt (CFU/g)

C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa ở 2 độ pha loãng liên tiếp

n1: Là số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được đếm

n2: Là số đĩa ở độ pha loãng thứ 2 được đếm

d : Hệ số pha loãng với độ pha loãng thứ nhất được đếm

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31

- Nếu các đĩa của 2 độ pha loãng liên tiếp có số khuẩn lạc từ 15-30, tính số khuẩn lạc của mỗi độ pha loãng và kết quả là trung bình số học của 2 giá trị thu được

- Nếu 2 đĩa nuôi cấy ứng với độ pha loãng 10-1 có số khuẩn lạc < 15 thì:

- Nếu 2 đĩa nuôi cấy ở độ pha loãng 10-1 không có khuẩn lạc nào thì:

Với: m là trung bình của số khuẩn lạc ở 2 đĩa

d là độ pha loãng của huyễn dịch ban đầu, d = 10-1

2.4.2.2 Xác định Escherichia coli trong thịt theo TCVN 7924-2 : 2008

Cách tiến hành:

Cấy ở 3 độ pha loãng 10-1; 10-2; 10-3, mỗi độ pha loãng nuôi cấy trên 2 đĩa môi trường Dùng pipet vô trùng chuyển 1 ml dung dịch mẫu ở các độ pha loãng tương ứng vào giữa các đĩa petri vô trùng Rót vào mỗi đĩa khoảng 15ml môi trường TBX đã đun tan chảy và được làm nguội đến nhiệt độ 44 - 47°C Xoay nhẹ đĩa theo chiều kim đồng hồ hoặc lắc sang hai bên, lật ngược các đĩa, nếu cần

ủ ấm các đĩa này ở 37°C/4h sau đó chuyển sang ủ ấm ở 44°C/18 - 24h

Tính kết quả:

Chọn các đĩa có chứa ít hơn 150 khuẩn lạc điển hình của E coli dương

tính glucuronidaza và ít hơn 300 khuẩn lạc tổng số trên mỗi đĩa thạch

Số lượng khuẩn lạc E coli trong 1 gam mẫu thử được tính theo công thức:

Trong đó:

N: Số khuẩn lạc E coli trong 1 gam thịt (CFU/g )

a: Là tổng số các khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa được giữ lại sau 2

độ pha loãng liên tiếp, có ít nhất 1 đĩa chứa tối thiểu 15 CFU màu xanh

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32

n1: Số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ nhất

n2: Số đĩa được giữ lại ở độ pha loãng thứ hai

V: Thể tích mẫu cấy đã dùng trên mỗi đĩa, tính bằng ml

d: Hệ số pha loãng tương ứng với độ pha loãng thứ nhất được giữ lại (d =

1 trong trường hợp các mẫu ở dạng lỏng khi mẫu thử được cấy trực tiếp)

- Nếu đĩa chứa ít hơn 10 khuẩn lạc, nhưng có ít nhất 4 khuẩn lạc, thì tính

kết quả theo trường hợp chung ở trên và báo cáo kết quả là số ước tính nhân với VSV trong 1ml hoặc 1g sản phẩm

- Nếu tổng số khuẩn lạc từ 3 đến 1, thì độ chụm của kết quả là quá thấp và

kết quả phải được ghi như sau: “Có mặt vi sinh vật nhưng nhỏ hơn (4 × d) trên 1g hoặc 1ml”

- Trong trường hợp ở nồng độ đầu tiên không có khuẩn lạc đặc trưng nào

mọc lên thì tổng số E coli được biểu thị kết quả như sau: “ít hơn 1/d vi sinh vật

trong 1ml” (sản phẩm dạng lỏng) hoặc “ ít hơn 1/d vi sinh vật trong gam” (sản phẩm dạng khác)

Với d là hệ số pha loãng mẫu của huyền phù ban đầu hoặc độ pha loãng thứ nhất đã cấy hoặc giữ lại

2.4.2.3 Định tính vi khuẩn Salmonella trong thịt theo TCVN 4829 : 2005

Cách tiến hành:

- Tăng sinh sơ bộ: Cân 25g mẫu trung bình đã cắt nhỏ vào túi PE vô trùng

chuyên dụng, bổ sung thêm 225ml dung dịch đệm peptone, đồng nhất bằng máy dập mẫu Stomacher ở tốc độ 260 vòng/phút trong 1 phút thu huyễn dịch có nồng

độ 10-1.Ủ huyễn dịch mẫu đã đồng nhất ở độ pha loãng 10-1 trong tủ ấm 37°C/18±2h

- Tăng sinh chọn lọc: Tiến hành trên 2 môi trường RVS và MKTTn

Chuyển 0,1ml dung dịch tiền tăng sinh vào ống nghiệm chứa 10ml môi trường RVS, ủ ở 41,5°C/24h

Chuyển 1ml dung dịch tiền tăng sinh vào ống chứa 10ml môi trường MKTTn, ủ 37°C/24h