GIỚI THIỆU TỔNG QUAN VỀ MÁY PHÂN TÍCH XÉT NGHIỆM SINH HÓA

Đặc điểm của phơng pháp phân tích xét nghiệm: Đặc điểm cơ bản của PTXN là tính chất của mẫu thử sinh học không bị ảnh hởng bởi các quá trình xảy ra trong cơ thể sau khi lấy mẫu, vì vậy c

chơng 1 giới thiệu tổng quan về máy phân tích xét

nghiệm sinh hoá

1.1.1 Vai trò và đặc điểm của phơng pháp xét nghiệm sinh hoá:

Xuất phát từ đặc điểm các phơng pháp tiếp cận đối với đối tợng sinh học

thì đối với phơng pháp khảo sát sinh lý việc tiến hành thí nghiệm liên quan trực tiếp tới cơ thể Đối với các khảo sát này không phụ thuộc vào kiểu đối t-ợng cụ thể, điểm đặc trng là việc đấu nối trực tiếp cơ thể vào hệ thống kỹ thuật, và vì vậy đối với chúng có ý nghĩa lớn là việc giám sát hành vi của toàn

bộ cơ thể vì nó có thể phản ứng với quá trình khảo sát một cách hoàn toàn không dự kiến trớc đợc và kết quả thu đợc là thu nhận một số các phân tích y

tế đợc hệ thống hoá cho phép phát hiện xu hớng phát triển bệnh tật, giám sát diễn biến của quá trình bệnh lý và hồi phục

Để đánh giá các tính chất của cơ thể, ngời ta còn biết tới một nguyên lý

tổ chức khảo sát chẩn đoán nữa: đó là khi trong vai trò ĐTKS sử dụng các mẫu thử sinh học-mẫu thử các chất và các mô lấy từ môi trờng bên trong cơ thể

Nhiệm vụ chủ yếu của phân tích xét nghiệm y tế là ở chỗ phải nhận đợc thông tin chẩn đoán xác thực về hoạt động của các hệ thống khác nhau trong cơ thể Các PTXN cung cấp thông tin chẩn đoán sớm nhất, đầy đủ và chính xác nhất về các quá trình hóa sinh tinh vi xảy ra ở các mức tế bào, phân tử và dới phân tử Chính vì thế việc lựa chọn đúng đắn khối lợng các xét nghiệm chẩn đoán và giải thích đợc kết quả có ảnh hởng rất nhiều đến hiệu quả và sự

MT BN

Hình 1.1: Sơ đồ ph ơng pháp chung của các khảo sát phân tích

ĐT SH

MT SH

kịp thời của việc chẩn đoán, và cả việc chọn cách điều trị lẫn giám sát hiệu lực của nó

Đối với các khảo sát y học: đó là các đặc điểm của các thực thể sinh học tham gia trong các quá trình sinh lý và sinh học xảy ra trong cơ thể Những

đặc trng này có thể là thành phần định tính hay định lợng của chất, dữ liệu về cấu trúc, các tơng quan hình học của các đối tợng, và đồng thời về động học thay đổi tính chất của các thành phần nào đó trong quá trình hoạt động của cơ thể Thông thờng, mục đích của phân tích là xác định sự có mặt của một thành phần cụ thể hoặc sự sai lệch có ý nghĩa chẩn đoán trong nội dung của nó Các khảo sát xét nghiệm y tế thờng liên quan tới việc phân tích một khối lợng nhỏ thực thể sinh học đợc lấy ra trớc từ cơ thể - các mẫu thử

1.1.2 Đặc điểm của phơng pháp phân tích xét nghiệm:

Đặc điểm cơ bản của PTXN là tính chất của mẫu thử sinh học không bị

ảnh hởng bởi các quá trình xảy ra trong cơ thể sau khi lấy mẫu, vì vậy các mẫu thử chỉ có ý nghĩa đến khi nào chúng còn mang “dấu ấn” của cơ thể đợc khảo sát Nh vậy, mẫu thử là “bức ảnh” tức thời của trạng thái cơ thể, tuy nhiên giá trị chẩn đoán của “bức ảnh” này sẽ giảm đi với thời gian Vì thế, nhiệm vụ chủ yếu của các phơng pháp phân tích là bảo đảm tính kịp thời của khảo sát, và nếu nh điều đó là không thể thì phải cất giữ mẫu thử cho đến giai

đoạn phân tích đặc tính của nó Do theo thời gian giá trị chẩn đoán của mẫu thử trong vai trò là vật mang thông tin bị giảm đi, nên việc tiến hành nhanh chóng và chất lợng toàn bộ công việc khảo sát là rất quan trọng

Đặc điểm thứ hai của PTXN là tất cả các kiểu biến đổi mẫu thử đều có thể áp dụng, cho đến cả việc tiêu hủy nó về mặt vật lý, cốt làm sao có thể nhận

đợc thông tin xác thực về trạng thái của cơ thể đợc nghiên cứu Điều này mở rộng đáng kể các cách thức xử lý mẫu thử bao gồm các thủ tục cải biến khác nhau đối với mẫu thử ban đầu

Mỗi nhóm phơng pháp phân tích bao gồm rất nhiều các phơng pháp cụ thể Vì vậy, việc nghiên cứu chi tiết chúng đòi hỏi phải tiếp tục phân biệt nhỏ chúng nữa Tuy nhiên, số lợng các chỉ tiêu có thể dùng đợc là rất lớn, và cho

đến nay vẫn cha có một cách tiếp cận chung nào cho việc phân biệt này

1.1.3 Đối tợng của phơng pháp xét nghiệm sinh hoá:

Xuất phát từ vai trò và đặc điểm của phơng pháp phân tích xét nghiệm sinh hoá thì đối tợng của phơng pháp phân tích là các vật liệu sinh học lấy từ môi trờng bên trong cơ thể của bệnh nhân: máu, nớc tiểu, bạch huyết (lim

pha), tủy sống, dịch vị, môi trờng mô sinh và các chất do cơ thể tạo ra trong quá trình hoạt động sống của nó

Các đối tợng của phơng pháp xét nghiệm sinh hoá đợc đa ra dới dạng gọi

là mẫu thử sinh học (MTSH) chứa các thực thể sinh học của đối tợng cần khảo sát: đó là các chất lỏng khác nhau, các sản phẩm bài tiết, các mô của cơ thể … Chúng có thể có các trạng thái cấu tạo khác nhau nh rắn, khí, nhng thông th-ờng là lỏng

Môi trờng chất lỏng sinh học chính là các hệ thống đa thành phần với cấu trúc tinh tế và rất nhạy cảm với các tác động lý hóa khác nhau Ngoài ra, đối t-ợng chất lỏng, thông thờng là đối tt-ợng tiện lợi nhất để tiến hành các khảo sát thí nghiệm và thực tế cho đến nay đối tợng sinh học là chất lỏng đợc áp dụng rộng rãi và phổ biến nhất cho đến nay

1.2 Cơ sở phơng pháp phân tích xét nghiệm:

Các máy phân tích xét nghiệm sinh hoá tự động sử dụng phơng pháp phân tích thành phần dung dịch dựa vào định luật hấp thụ ánh sáng (hay còn gọi là

ph-ơng pháp đo mầu quang điện), và phph-ơng pháp điện cực lựa chon ion:

1.2.1 Phơng pháp đo mầu quang điện:

Phơng pháp đo màu là một trong những phơng pháp phân tích thành phần dung dịch dựa trên việc so sánh cờng độ đo màu của nghiên cứu với cờng độ của dung dịch chuẩn (có nồng độ xác định)

Phơng pháp đo màu chủ yếu dùng để xác định lợng nhỏ của các chất có trong dung dịch ít tốn thời gian phân tích hơn so với các phơng pháp khác cho kết quả chính xác, đặc biệt cần phải tách riêng chất cần xác định ra khỏi thành phần dung dịch

Định luật đo màu quang điện:

Nếu rọi một chùm sáng (cờng độ I0) vào một Cuvét đựng dung dịch thì một phần của nó (Ir) bị phản xạ từ bề mặt của Cuvét, một phần khác (Ia) bị dung dịch hấp thụ

Phần còn lại (It) qua Cuvét:

I0 = Ia + Ir + It Thực tế, trong một loạt các phân tích ta chỉ sử dụng một loại Cuvét nên c-ờng độ dòng sáng phản xạ (Ir) là đại lợng không đổi và rất nhỏ, ta có thể Nh vậy phơng trình (1) có thể đơn giản nh sau:

I0 = Ia + It

Bằng cách đo lờng trực tiếp ta có thể xác định cờng độ dòng sáng rọi vào (I0) và dòng sáng truyền qua dung dịch (It) Còn đại lợng Ia ta không xác định

đợc trực tiếp mà đợc xác định thông qua Io và It

Định luật Bouguer- Lambert: Những lớp có chiều dày đồng nhất,

trong những điều kiện nh nhau, luôn hấp thụ một tỷ lệ nh nhau của dòng sáng rọi vào những lớp chất đó.

Về mặt toán học, định luật trên đợc mô tả nh sau:

I t =I 0 e -KoL

Trong đó:

I t là cờng độ dòng sáng sau khi đi qua dung dịch.

I 0 là cờng độ dòng sáng rọi vào dung dịch.

L là chiều dày của lớp dung dịch hấp thụ ánh sáng.

E là cơ sở mũ tự nhiên.

K 0 là hệ số Logarit hấp thụ ánh sáng.

Nếu đổi sang Logarit thập phân ta thu đợc phơng trình có dạng:

I 1 =I 0 10 -KL

Trong phơng trình này K là hệ số tắt

Hệ số K chỉ phụ thuộc vào chất tan và bớc sóng rọi vào dung dịch Do đó

định luật Bouguer- Lambert chỉ đúng cho tia sáng đơn sắc Nghĩa là ánh

sáng có bớc sóng xác định

Khi nghiên cứu sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch thì Beer đã thiết lập

rằng: Hệ số tắt K tỷ lệ với nồng độ của chất hấp thụ ánh sáng:

I

0

I

r

I

t

I

a

Hình1 2: Sự hấp thụ ánh sáng của dung dịch

K = C.

Với: C = nồng độ chất tan

= hệ số không phụ thuộc nồng độ

Định luật Beer cũng tơng tự nh định luật Bouguer - Lambert Nhng nếu

nh định luật Bouguer - Lambert khảo sát sự thay đổi sự hấp thụ ánh sáng với

dung dịch có nồng độ nhất định khi thay đổi chiều dày của lớp dung dịch hấp

thụ Thì định luật Beer lại khảo sát sự thay đổi độ hấp thụ ánh sáng của dung

dịch khi thay đổi nồng độ mà chiều dày của lớp dung dịch không thay đổi Kết hợp hai định luật trên ta đợc phơng trình của định luật cơ bản về

ph-ơng pháp đo màu gọi là định luật Bouguer - Lambert- Beer:

I t =I 0 10 -.C.L

Định luật Bouguer- Lambert- Beer: Độ hấp thụ cờng độ ánh sáng của

một lớp dung dịch phụ thuộc vào bản chất, nồng đọ và bề dày của lớp dung dịch có ánh sáng rọi qua Phơng trình của định luật là phơng trình:

I t =I 0 10 -.C.L

Hệ số gọi là hệ số tắt phân tử, đó là đại lợng không đổi, phụ thuộc vào bản chất của chất tan, vào bớc sóng của ánh sáng rọi và phụ thuộc vào nhiệt độ của dung dịch Nó tơng đơng với độ tắt của dung dịch

Đối với các chất có dạng đồ thị là tuyến tính, khi áp dụng phơng pháp đo màu, ta đo độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch và xác định đợc nồng độ của chất đó bằng cách nhấn độ hấp thụ E với một hệ số, hệ số này phụ thuộc vào bản chất của chất nghiên cứu Hệ số này đợc bằng cách lập tỷ số của độ hấp thụ trên nồng độ của dung dịch chuẩn

X = độ hấp thụ (E) / Nồng độ chuẩn (C)

Đối với chất cần nghiên cứu thì C = X.E

Có những chất không tuân theo định luật Bouguer-Lambert-Beer Độ tuyến tính có thể bị phá vỡ hoàn toàn hoặc ở trong phần khi áp dụng phơng pháp đo màu Với những chất nh vậy ta phải áp dụng phơng pháp đo với tổng khoảng nồng độ nào đó có quan hệ tuyến tính giữa độ tắt và nồng độ Khi đó kết quả phân tích sẽ đợc xác định nh với những chất tuân theo định luật Đối với những chất không có quan hệ tuyến tính trong bất kỳ nồng độ nào thì không thể áp dụng phơng pháp đo màu Dựa trên những lý thuyết đã trình bày

ta có thể thiết lập những nguyên tắc chung để phân tích thành phần dung dịch bằng phơng pháp đo màu nh sau:

 Màu của chất nghiên cứu cần phải đựoc chọn lọc và nếu cần thiết để











có kết quả chính xác ta phải tách các chất đó ra hoặc liên kết chất đó với các chất không màu

 Màu của chất nghiên cứu không đợc thay đổi trong suốt quá trình đo màu Bằng nghiên cứu riêng cần thiết phải thiết lập trớc khoảng thời gian trong đó màu mạnh nhất, bền nhất để ta tiến hành đo màu ngay trong khoảng thời gian đó

 Màu của chất nghiên cứu không đợc thay đổi rõ rệt theo độ axit của dung dịch và lợng thuốc thử thêm vào, do đó phải tiêu chuẩn hoá

điều kiện đo màu đối với mỗi chất

 Màu của chất nghiên cứu không đợc thay đổi theo nhiệt độ.Nếu có

sự thay đổi về nhiệt độ làm ảnh hởng tới màu của chất nghiên cứu thì phải tiến hành đo màu tại nhiệt độ nhất định

 Cờng độ của dung dịch không đợc quá thấp hoặc quá cao, đồng thời phảI đẳm bảo đúng dung tích quy định của mỗi Cuvet đựng dung dịch

Cơ sở của phơng pháp đo màu quang điện: Phơng pháp đo màu quang

điện là phơng pháp kết hợp giữa phơng pháp đo màu và ứng dụng của tế bào quang điện để chỉ thị kết quả đo khi tiến hành phân tích dung dịch

Cơ sở sở chính của phơng pháp đo màu quang điện là hiệu ứng quang

điện Hiệu ứng quang điện là hiệu ứng các electron đợc giải phóng khỏi bề mặt kim loại khi rọi một chùm sáng thích hợp vào bề mặt của bản kim loại đó (chùm sáng thích hợp là chùm sáng có năng lợng của phôtôn lớn hơn năng l-ọng liên kết electoron trong tấm kim loại đó)

Các loại tế bào quang điện: Hiệu ứng quang điện đợc sử dụng để chết tạo các lại tế bào quang điện nh: tế bào quang điện chân không, tế bào quang điện cơ khí, tế bào quang điện bán dẫn hay coàn gọi là pin quang điện Mô hình chung gồm có: Một bóng đèn có độ chân không cao bên trong có hai bản cực kim loại (bản cực dơng: A, và bản cực âm: K)

Hình 1.3: Sơ đồ sử dụng tế bào quang điện.

Tóm lại, với việc áp dụng định luật đo mầu và ứng dụng tế bào quang

điện trong quá trình đo ta hoàn toàn có thể xác định đợc các chỉ tiêu sinh hoá,

và trên thực tế ta có các phơng pháp phân tích các chỉ tiêu sinh hoá dựa trên việc áp dụng các lý thuyết cơ sở trên là:

a Phơng pháp phân tích điểm cuối:

Thiết bị thực hiện việc đo độ hấp thụ của dung dịch khi dung dịch của bệnh phẩm và thuóc thử đã phản ứng xong Sau đó, độ hấp thụ đo đợc sẽ đợc nhân trực tiếp với hệ số K và đa ra kết quả trực tiếp dới dạng đơn vị là nồng độ hấp thụ (mol/l; mmol/l…) Hệ số K có thể đợc nhập trực tiếp vào máy hoặc có thể đợc thiết bị tự tính toán khi chuẩn hoá máy Nếu phơng pháp chuẩn hoá máy đợc sử dụng thì hệ số K đợc tính toán nh sau:

K = Cstd / ABSStd Trong đó:

Cstd là nồng độ của dung dịch chuẩn

ABSStd là nồng độ hấp thụ quang của dung dịch chuẩn

-Photon có b ớc sóng phù hợp

A

V

G R

-K

Giá trị của hệ số K đợc sử dụng để tính toán nồng độ của mẫu theo công thức sau: Csample= ABSSample K

Trong đó:

Csample là nồng độ của ion trong mẫu

ABSSample là độ hấp thụ quang học của mẫu

b Phơng pháp phân tích tự động học:

Trong phơng pháp phân tích động học, tốc độ phản ứng đợc xác định bởi quá trình đo sự thay đổi độ hấp thụ của mẫu theo thời gian Thiết bị thực hiện

đọc lần kết quả đầu tiên sau một thời gian trễ đã đợc đặt trớc Thiết bị xác

định độ hấp thụ khác nhau giữa hai lần đo liên tiếp và tính toán độ hấp thụ trung bình (đơn vị tính là ABS/min) Khoảng thời gian giữa hai lần đo liên tiếp

có thể là một khoảng thời gian thay đổi đợc xác định bằng phơng pháp tối u hoá

Tốc độ hấp thụ trung bình sau khi đã đợc xác định sẽ đợc nhân với hệ số

K (đã biết) để cho kết quả theo công thức sau:

Hoạt độ Enzym (U/L) = ABS / min.K

đối với phơng pháp đo động học hệ số K thờng đợc nhà sản xuất hoá chất chỉ định trớc (Kfactor) hoặc cũng có thể đợc tính toán theo công thức:

Vtot là thể tích của mẫu xét nghiệm và thuốc thử sau khi trộn Vsample là thể tích của mẫu xét nghiệm

c Phơng pháp phân tích động học hai điểm (hay còn gọi là phơng pháp phân tích động học cố định thời gian):

ở phơng pháp này dung dịch mẫu và hoá chất đợc ủ và đọc hai lần Lần

đọc đầu tiên đợc thực hiện sau chu kỳ ủ thứ nhất Lần đọc thứ hai đợc thực hiện sau một khoảng thời gian ủ cố định tuỳ thuộc loại hoá chất sử dụng

Ph-ơng pháp này đợc sử dụng để xác định nồng độ của các chất có tốc độ phản ứng với thuốc thử không tuyến tính nh: Urê, Crêatinnin…

Công thức tính toán của phơng pháp nh sau:

ABS = ABS2- ABS1

Csample = ABS.Kfactor

TRong đó: ABSi là độ hấp thụ quang của dung dịch ở lần đọc thứ nhất và thứ hai (i = 1,2)

s e V

V K

sample

tot

100







d Phơng pháp đo màu:

Cơ sở của phơng pháp đo màu dựa trên sự chênh lệch độ hấp thụ quang của dung dịch đối với hai bớc sóng khác nhau ( - ):

Csample = ABS ()sample.Kfactor

Trong đó:

Csample: Nồng độ ion trong mẫu cần phân tích

ABSSample: Độ hấp thụ quang học của mẫu phân tích

Kfactor: Hệ số động học tơng ứng với các hoá chất

e Phơng pháp đo huyết thanh trắng (Serum Blank):

Phơng pháp đo huyết thanh trắng sử dụng hai phản ứng cho mỗi mẫu xét nghiệm Nó xác định độ hấp thụ quang của mẫu phản ứng với hoá chất (mẫu máu 2) và mẫu không phản ứng với hoá chất (mẫu máu 1).Công thức tính toán cho phơng pháp này là:

Cmẫumáu=(ABS (mẫu2- mẫu1)mẫumáu Cdungdịchchuẩn)/ABS (mẫu2-mẫu1)dungdịchchuẩn

Trong đó:

Cmẫumáu : Nồng độ mẫu máu cần phân tích

ABSmẫumáu: Độ hấp thụ quang học của mẫu phân tích

Cdungdịchchẩn: Nồng độ dung dịch chuẩn

1.2.2 Phơng pháp điện cực lựa chọn ion:

a Nguyên lý của điện cực lựa chọn Ion (ISE) dựa vào sự tơng tác của các ion chuyển động tự do trong mẫu với vật liệu cảm biến tích cực:

Màng chọn lọc ion phân tách mẫu có nồng độ điện phân cha biết ra khỏi dung dịch điện phân có nồng độ đã biết Màng này đợc chế tạo để chịu đợc các phản ứng với kiểu chất điện phân xác định chứa trong mẫu Màng này hoạt động nh một bộ trao đổi ion; phản ứng của nó đối với hoá trị của ion cho

đợc phản ánh trong sự thay đổi thế năng của màng tạo ra trong lớp ngăn giữa mẫu và màng

Nồng độ của dung dịch điện phân có giá trị đã biết xác định thế năng ở một mặt của màng Còn thế năng trên mặt kia của màng có giá trị cha biết Các phép đo gavanic đợc thiết lập với sự hỗ trợ của điện cực Calomel là cần thiết để xác định chênh lệch thế năng giữa mặt trong và mặt ngoài

1

2



 2

1 

 



Đầu cuối dòng

Điện cực tham chiếu Vôn kế Dung dịch nội

Điện cực chọn ion Màng chọn ion

Hình1.4: Sơ đồ cầu đo thế năng giữa dung dịch mẫu và dung dịch tham chiếu

Sử dụng dung dịch tham chiếu tạo nên kết nối điện giữa mẫu và điện cực Thế năng truyền dẫn hình thành ở điểm kết nối giữa mẫu và dung dịch tham chiếu Giá trị của thế năng truyền dẫn này đợc xác định trên cơ sở thành phần cấu tạo của dung dịch tham chiếu

Sử dụng cầu điện này có thể xác định thế năng trên mặt ngoài của màng Các quan hệ đợc mô tả bởi biểu thức Nerst:

Dấu (+) ứng với các

Cation, dấu (-) ứng với các

Anion

E là điện thế đo đợc

E’ là điện thế của hệ thống trong dung dịch chuẩn (tuỳ thuộc vào các yếu tố khác nhau, dung dịch trong và kiểu điện cực tham chiếu)

ai là hoạt tính của ion đợc đo

R là hằng số khí tổng quát (8,31J/Kmol)

T là nhiệt độ (K)

n là hoá trị của ion đợc đo

F là hằng số Faraday (96 496 A.s/g đơng lợng)

fi là hệ số hoạt tính

ci là nồng độ của ion đợc đo

Ngay sau khi mẫu đợc đo, một dung dịch chuẩn có nồng độ ion đã biết

đ-ợc đo để cung cấp giá trị tham chiếu Trên cơ sở giá trị mẫu đđ-ợc đo và giá trị tham chiếu, có thể xác định đợc nồng độ của mẫu

S là hệ số góc của điện cực (ở 250C về lý thuyết nó lên tới 59,16 mV

) ln(

.

ln

' '

i i

i c f nF

T R E E

a nF

T R E E









) log(

.

'

i

i c f S E