Đặc Điểm Dịch Tễ, Yếu Tố Gây Bệnh Của Vi Khuẩn Clostridium Perfringens Trong Bệnh Viêm Ruột Hoại Tử Ở Lợn Dưới 60 Ngày Tuổi Và Biện Pháp Phòng Trị

NGUYỄN VĂN NGUYÊN NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ, YẾU TỐ GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRONG BỆNH VIÊM RUỘT HOẠI TỬ Ở LỢN DƯỚI 60 NGÀY TUỔI TẠI THÁI NGUYÊN VÀ BIỆN

NGUYỄN VĂN NGUYÊN

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ,

YẾU TỐ GÂY BỆNH CỦA VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRONG BỆNH VIÊM RUỘT HOẠI TỬ Ở

LỢN DƯỚI 60 NGÀY TUỔI TẠI THÁI NGUYÊN

VÀ BIỆN PHÁP PHÒNG TRỊ

Chuyên ngành: Thú y

Mã số: 60 62 50

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP

Người hướng dẫn khoa học: TS NGUYỄN VĂN SỬU

THÁI NGUYÊN - 2010

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi trực tiếp thực hiện cùng với sự cộng tác giúp đỡ của Th.S Nguyễn Thị Kim Oanh - Trưởng phòng

Vi trùng - Trung tâm chẩn đoán thú y Trung Ương, TS Nguyễn Văn Sửu - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên Các số liệu, hình ảnh và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nào khác Tôi xin đảm bảo rằng các thông tin, trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Nguyễn Văn Nguyên

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Trung tâm chẩn đoán thú y Trung Ương, đã cho phép và tạo điều kiện giúp đỡ cho chúng tôi hoàn thành luận văn này

Xin bày tỏ lòng biết ơn các thầy, cô giáo, Th.S Nguyễn Thị Kim Oanh,

TS Nguyễn Văn Sửu đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin cảm ơn Khoa Sau đại học - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên; Phòng Vi trùng - Trung tâm chẩn đoán thú y Trung Ương, cùng toàn thể các bạn bè đồng nghiệp đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn

Để góp phần thực hiện thành công luận văn này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ động viên lớn của gia đình và đồng nghiệp Nhân dịp này, tôi xin bày

tỏ lòng biết ơn chân thành đối với mọi sự giúp đỡ quý báu đó

Xin trân trọng cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 9 năm 2010

Nguyễn Văn Nguyên

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC 3

1.1.1 Nghiên cứu trong nước 3

1.1.2 Nghiên cứu ngoài nước 5

1.2 MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VI KHUẨN Cl PERFRINGENS .7

1.2.1 Nghiên cứu về vi khuẩn Cl perfringens 7

1.2.2 Đặc điểm hình thái, tính chất nhuộm màu và sức đề kháng của vi khuẩn 9

1.2.3 Đặc tính nuôi cấy và sinh vật hoá học 10

1.2.4 Phân loại Cl perfringens và đặc tính gây bệnh 11

1.2.5 Các kháng nguyên và độc tố của Cl perfringens 14

1.3 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH DO CLOSTRDIUM PERFRINGENS GÂY RA 18

1.3.1 Bệnh viêm ruột xuất huyết của gia súc (hemorrhagic enteritis) 18

1.3.2 Bệnh viêm ruột và nhiễm độc tố ruột ở lợn 19

1.3.3 Bệnh viêm ruột hoại tử do Cl perfringens typ C gây ra ở lợn 19

1.3.4 Bệnh viêm ruột hoại tử do Cl perfringens typ A gây ra ở lợn 24

Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 28

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 28

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu 28

2.1.3 Thời gian nghiên cứu 28

2.2 NGUYÊN LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU 28

2.2.1 Mẫu nghiên cứu 28

2.2.2 Các loại môi trường, hoá chất 29

2.2.3 Động vật thí nghiệm 29

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 29

2.3.1 Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh viêm ruột hoại tử ở

lợn dưới 60 ngày tuổi tại tỉnh Thái Nguyên 29

2.3.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Cl perfringens ở lợn 30

2.3.3 Thử nghiệm phác đồ phòng và điều trị bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn dưới 60 ngày tuổi 30

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ 30

2.4.2 Phương pháp thực hiện 30

2.4.3 Nội dung điều tra, theo dõi 31

2.4.4 Các chỉ tiêu theo dõi trong dịch tễ 31

2.4.5 Phương pháp thu thập mẫu và phân lập vi khuẩn 31

2.4.6 Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn Cl perfringens trong 1 gam phân của lợn tiêu chảy nghi VRHT hoặc không tiêu chảy 35

2.4.7 Phương pháp giám định một số tính chất sinh vật, hoá học của các chủng Cl perfringens phân lập được 35

2.4.8 Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của các chủng vi khuẩn Cl perfringens phân lập được 38

2.4.9 Phương pháp xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn phân lập được 41

2.4.10 Thử nghiệm một số phác đồ điều trị VRHT cho lợn 42

2.4.11 Phương pháp xử lý số liệu 43

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 44

3.1 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ BỆNH VIÊM RUỘT HOẠI TỬ Ở LỢN DƯỚI 60 NGÀY TUỔI TẠI 3 HUYỆN THUỘC TỈNH THÁI NGUYÊN 44

3.1.1 Kết quả điều tra tình hình lợn tiêu chảy và chết nghi mắc bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn tại một số điểm nghiên cứu của tỉnh Thái Nguyên 44

3.1.2 Kết quả điều tra tình hình bệnh viêm ruột hoại tử tại tỉnh Thái Nguyên theo mùa vụ 47

3.1.3 Điều tra tình hình bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn tại tỉnh Thái Nguyên

theo giai đoạn phát triển 52

3.1.4 Điều tra tình hình bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn tại tỉnh Thái Nguyên theo phương thức chăn nuôi 57

3.1.5 Triệu chứng lâm sàng ở lợn nghi mắc VRHT 61

3.1.6 Bệnh tích ở lợn chết do VRHT 62

3.2 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VI KHUẨN CLOSTRIDIUM PERPRINGENS Ở LỢN 64

3.2.1 Kết quả xác định tỷ lệ mang trùng ở lợn 64

3.2.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Cl perfringens ở các bệnh phẩm của lợn chết nghi viêm ruột hoại tử 65

3.2.3 Kết quả giám định đặc tính sinh hoá của vi khuẩn Cl perfringens phân lập được 67

3.2.4 Xác định số lượng vi khuẩn Cl perfringens trong phân lợn bệnh và lợn bình thường 69

3.2.5 Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn Cl Perfringens bằng phản ứng PCR 72

3.2.6 Kết quả kiểm tra độc lực của vi khuẩn Cl perfringens phân lập được được bằng phương pháp tiêm truyền chuột bạch 74

3.2.7 Kết quả xác định khả năng mẫn cảm với một số loại kháng sinh của vi khuẩn Cl perfringens phân lập được 76

3.3 THỬ NGHIỆM PHÁC ĐỒ PHÒNG VÀ ĐIỀU TRỊ BỆNH VIÊM RUỘT HOẠI TỬ Ở LỢN DƯỚI 60 NGÀY TUỔI 79

3.3.1 Kết quả thử nghiệm vacxin phòng bệnh 79

3.3.2 Kết quả thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn dưới 60 ngày tuổi 81

3.4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 85

3.4.1 KẾT LUẬN 85

3.4.2 ĐỀ NGHỊ 86

TÀI LIỆU THAM KHẢO 87 HÌNH ẢNH MINH HỌA

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BHI : Brain Heart Infusion

Cl perfringens : Clostridium perfringens

FAO : Food and Agriculture Organization

NCCLS : The National Communitee for Clinical

Laboratory Standards (Hội đồng quốc gia Hoa Kỳ về các tiêu chuẩn lâm sàng phòng thí nghiệm)

OIE : World organization for animal health

TGC : Thioglycollate Medium U.S.P

VRHT : Viêm ruột hoại tử

Bảng 2.1 Trình tự các Nucletide của các mồi dùng để xác định một số loại

độc tố chính của vi khuẩn Cl perfringens 39

Bảng 2.2 Các chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR 39

Bảng 2.3 Tiêu chuẩn đánh giá mức độ mẫn cảm và kháng sinh theo NCCLS (1999) [65] 42

Bảng 3.1 Tỷ lệ lợn tiêu chảy và chết nghi VRHT tại một số huyện của tỉnh Thái Nguyên 45

Bảng 3.2 Kết quả lợn con nghi mắc bệnh viêm ruột hoại tử theo mùa vụ 48

Bảng 3.3 Kết quả lợn chết nghi mắc bệnh viêm ruột hoại tử theo mùa vụ tại Thái Nguyên 51

Bảng 3.4 Kết quả điều tra tình hình bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn tại tỉnh Thái Nguyên theo giai đoạn phát triển 53

Bảng 3.5 Kết quả điều tra tình hình lợn chết do viêm ruột hoại tử tại các điểm nghiên cứu theo giai đoạn phát triển 56

Bảng 3.6 Tình hình bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn tại tỉnh Thái Nguyên theo phương thức chăn nuôi 58

Bảng 3.7 Tình hình lợn chết bệnh viêm ruột hoại tử tại tỉnh Thái Nguyên theo phương thức chăn nuôi 60

Bảng 3.8 Triệu chứng lâm sàng của lợn mắc VRHT 61

Bảng 3.9 Bệnh tích của lợn mắc VRHT 63

Bảng 3.10 Kết quả xác định tỷ lệ mang vi khuẩn Cl perfringens ở lợn 64

Bảng 3.11 Kết quả phân lập vi khuẩn Cl perfringens ở các bệnh phẩm của lợn chết nghi viêm ruột hoại tử 66

Bảng 3.12 Kết quả giám định đặc tính sinh hoá của vi khuẩn Cl perfringens phân lập được 67

Bảng 3.13 Biến động số lượng vi khuẩn Cl perfringens trong phân lợn bệnh và lợn khỏe và lợn mắc tiêu chảy nghi VRHT 70

Bảng 3.14 Kết quả xác định serotype của các chủng vi khuẩn Cl perfringens

bằng phản ứng PCR 73

Bảng 3.15 Kết quả kiểm tra độc lực các chủng vi khuẩn phân lập được bằng

phương pháp tiêm truyền chuột bạch 75

Bảng 3 16 Kết quả xác định khả năng mẫn cảm với một số loại kháng sinh và

hóa dược 78 Bảng 3.17 Kết quả thử nghiệm vacxin phòng bệnh viêm ruột hoại tử 80 Bảng 3.18 Kết quả thử nghiệm phác đồ điều trị bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn 83

DANH MỤC CÁC BIỂU

Biểu đồ 3.1 Tỷ lệ lợn tiêu chảy và chết nghi VRHT tại một số huyện của tỉnh

Thái Nguyên 45 Biểu đồ 3.2 Tỷ lệ lợn viêm ruột hoại tử và chết theo mùa vụ 51

Biểu đồ 3.3 Tỷ lệ lợn viêm ruột hoại tử và chết tại các điểm nghiên cứu theo

giai đoạn phát triển 56

Biểu đồ 3.4 Tình hình lợn bệnh viêm ruột hoại tử và chết tại tỉnh Thái Nguyên

theo phương thức chăn nuôi 60

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Chăn nuôi lợn ở nước ta trong những năm gần đây đã và đang phát triển mạnh cả về số lượng và chất lượng, góp phần tích cực giải quyết nhu cầu thực phẩm tiêu dùng trong nước, một phần xuất khẩu và một phần giải quyết nhu cầu phân bón cho cây trồng Chăn nuôi lợn giải quyết việc làm cho nhiều người dân tạo nguồn thu nhập quan trọng của hàng triệu người

Theo Tổng cục thống kê tổng đàn lợn tại thời điểm tháng 10/2009 có 27.927 triệu con, sản lượng lợn xuất chuồng ước đạt 2.931 triệu tấn Sản lượng thịt chiếm 65% trong tổng sản lượng thịt các loại Chăn nuôi lợn đang trở thành một nghề mang lại hiệu quả kinh tế cao Tuy nhiên, dịch bệnh hàng năm cũng gây không ít khó khăn cho người chăn nuôi nhất là bệnh của lợn con Hậu quả của bệnh là gây ra những thiệt hại không nhỏ cho các cơ sở chăn nuôi

về cả số lượng và chất lượng con giống Thiệt hại đáng kể nhất thường gặp là

ở gia súc non trong giai đoạn bú sữa Bệnh có thể do một hoặc nhiều vi khuẩn gây nên, song một trong những bệnh gây chết nhiều gia súc non giai đoạn đầu sau khi sinh ra là bệnh viêm ruột hoại tử, bệnh chủ yếu do vi khuẩn

Clostridium perfringens gây ra Đây là một trong những bệnh truyền nhiễm nguy hiểm với gia súc non trong đó có lợn, đặc biệt là giai đoạn đầu sau khi sinh ra Bệnh gây viêm ruột, rối loạn đường tiêu hóa, khi mắc bệnh thường tiêu chảy, phân thối, lẫn chất keo nhầy, lợn con chết nhanh, chết nhiều

Vi khuẩn Clostridium perfringens gây viêm ruột hoại tử xuất huyết trầm

trọng, cấp tính ở lợn sơ sinh, tỉ lệ chết do bệnh này gây ra từ 50-100% gây thiệt hại lớn cho người chăn nuôi lợn Phan Thanh Phượng và cs (1996) [27]

Xuất phát từ thực tiễn nêu trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu, xác

định yếu tố gây bệnh do vi khuẩn Clostridium perfringens ở lợn con dưới 60

ngày tuổi và đưa ra phác đồ phòng, điều trị bệnh thích hợp tại Thái Nguyên sao cho có hiệu quả kinh tế cho người chăn nuôi lợn Nhằm hạn chế đến mức thấp nhất thiệt hại do dịch bệnh gây ra, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài

“Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ, yếu tố gây bệnh của vi khuẩn Clostridium perfringens trong bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn dưới 60 ngày tuổi tại Thái Nguyên và biện pháp phòng trị”

2 Mục tiêu nghiên cứu

- Xác định một số đặc điểm dịch tễ bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn giai đoạn dưới 60 ngày tuổi tại Thái Nguyên

- Nghiên cứu sinh vật học của vi khuẩn Clostridium perfringens gây

bệnh Viêm ruột hoại tử giai đoạn lợn dưới 60 ngày tuổi

- Xác định khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng phân lập được

- Biện pháp phòng và trị bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn giai đoạn dưới 60 ngày tuổi

3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Đề tài đã xác định được vai trò của vi khuẩn Cl perfringens gây bệnh

viêm ruột hoại tử ở lợn dưới 60 ngày tuổi tại 3 huyện nghiên cứu tại tỉnh Thái Nguyên và đưa ra phác đồ phòng trị có hiệu quả, là cơ sở cho cán bộ thú y, các trang trại và hộ chăn nuôi ứng dụng vào thực tiễn sản xuất nhằm giảm thiểu thiệt hại do bệnh gây ra

Khẳng định được hiệu quả của việc dùng vắc xin trong phòng bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn

Kết quả nghiên cứu của luận văn là cơ sở khoa học, nguồn tài liệu tham khảo cho các nghiên cứu sau

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

1.1.1 Nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn do Clostridium perfringens (Cl perfringens) gây ra được phát hiện thấy từ những năm 1980 gây thiệt hại

đáng kể về kinh tế cho chăn nuôi và sức khoẻ cộng đồng Tuy nhiên bệnh chưa được các nhà khoa học quan tâm đầy đủ và nghiên cứu sâu

Đầu những năm 1970 thông tin về bệnh được thông báo chính thức Năm 1980 bệnh viêm ruột hoại tử trẻ em được nghiên cứu về lâm sàng

và điều trị tại bệnh viện nhi đồng 1 Thành phố Hồ Chí Minh

Trần Thị Hạnh và Đặng Xuân Bình (2004) [11] khi nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh tiêu chảy ở lợn con cũng khẳng định một trong những nguyên

nhân gây bệnh quan trọng là Cl perfringens typ C Từ các kết quả thu được,

các tác giả đã nghiên cứu và chế tạo thử nghiệm thành công chế phẩm sinh

học: Cl perfringens - toxoid, để phòng và trị bệnh Các chế phẩm này đưa vào

sử dụng thử nghiệm không những cho kết quả tốt trong phòng và trị bệnh cho lợn và còn có tác dụng kích thích tăng trọng và giảm tiêu tốn thức ăn

Năm 1994, bệnh viêm ruột hoại tử đã gây chết rất nhiều hươu nai Nguyễn Ngọc Nhiên và cs (1996) [23] đã nghiên cứu và xác định được

nguyên nhân gây bệnh này là vi khuẩn Cl perfringens Kết quả cho thấy,

Cl perfringens không chỉ gây viêm ruột hoại tử cho lợn con, gây nhiễm độc ruột huyết cho ngựa con mà còn gây viêm ruột hoại tử cho hươu nai ở mọi lứa tuổi Tuy nhiên, vào thời điểm này các nhà khoa học vẫn chưa xác định

được bệnh do Cl perfringens thuộc typ nào gây ra

Theo các tác giả: Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng và cs (1996b) [7], Hồ Văn Nam và cs (1995) [20], cho dù bất cứ nguyên nhân nào dẫn đến

tiêu chảy thì hậu quả của nó cũng gây ra viêm nhiễm tổn thương thực thể đường tiêu hoá và cuối cùng là quá trình nhiễm trùng

Theo Phan Thanh Phượng và cs (1996) [27] vi khuẩn yếm khí Cl Perfringens

là một trong những tác nhân gây bệnh quan trọng trong hội chứng tiêu chảy của lợn ở lứa tuổi từ 1 đến 120 ngày tuổi Ở lợn con theo mẹ tỷ lệ mắc bệnh này có thể lên đến

100% và tỷ lệ chết lên đến 60% Lượng vi khuẩn Cl perfringens chứa trong 1 g phân

lợn ở lứa tuổi 1 đến 60 ngày tuổi từ 106 - 1010/0,2 CFU (Colonial forming unit)

Năm 1997, tại nhiều địa phương trong nước đã xuất hiện hiện tượng

bê, nghé, trâu, bò chết đột ngột so với số lượng lớn Ban đầu, bệnh này đã nhầm với tụ huyết trùng bởi cả hai bệnh này đều gây chết đột ngột Tuy nhiên, khi áp dụng các biện pháp phòng trị tụ huyết trùng đối với các gia súc

có triệu chứng của bệnh thì không thấy có hiệu quả Sau đó, các chẩn đoán trong phòng thí nghiệm đã xác định được nguyên nhân gây bệnh là vi khuẩn

Cl perfringens và E.coli, trong đó Cl perfringens đóng vai trò quan trọng

Bệnh phát ra do cơ thể suy yếu bởi các yếu tố như: bệnh ký sinh trùng đường máu, khẩu phần ăn mất cân đối… Các yếu tố này tác động đến sự phát triển

của vi khuẩn Cl perfringens, khả năng sản sinh độc tố ruột của vi khuẩn tăng

lên và gây bệnh (Lê Văn Tạo 2006 [29])

Hồ Văn Nam và cs (1997) [19] nhấn mạnh rằng vi khuẩn đường ruột có vai trò không thể thiếu được trọng hội chứng tiêu chảy Nguyễn Thị Nội và cs (1989) [22], sau khi điều tra tình hình nhiễm vi khuẩn đường ruột tại một số

cơ sở chăn nuôi lợn, kết luận: Nguyên nhân gây tiêu chảy chủ yếu ở một số cơ

sở chăn nuôi lợn là E.coli, Salmonella, Streptococus, bên cạnh đó còn thường xuyên phân lập được Klebsiella, Protues và Pseudomonas Đào Trọng Đạt,

Phan Thanh Phượng, Lê Ngọc Mỹ, Huỳnh Văn Kháng (1996b) [7] cho biết:

Đứng đầu trong số các mầm bệnh vi khuẩn đường ruột gây tiêu chảy là E.coli

Cũng theo tác giả, vi khuẩn yếm khí Cl perfringens gây bệnh khi có điều kiện

thuận lợi sẽ trở thành vai trò chính

Theo thông báo của Nguyễn Thị Nội và cs (1989) [22], Lê Minh Chí (1996) [3] thì trong một vài thập kỷ qua hội chứng tiêu chảy ở Việt Nam là một vấn đề thời sự, lợn ở rất nhiều địa phương bị bệnh và gây thiệt hại khá nghiêm trọng Theo các kết quả nghiên cứu của Hồ Văn Nam và cs (1997) [19], Hoàng Văn Tuấn, Lê Văn Tạo (1998) [35] cho thấy tỉ lệ mắc bệnh đường tiêu hoá ở lợn rất cao, nhất là viêm ruột ỉa chảy

Nhiễm độc máu do Cl perfringens xảy ra chủ yếu theo loài gia súc, lứa

tuổi và chế độ chăm sóc nuôi dưỡng Các trường hợp nhiễm độc trước hết là loài nhai lại sau đó là gia cầm, lợn và thỏ Thông thường thì gia súc sơ sinh và trưởng thành như cừu non, bê bị nhiễm độc và phụ thuộc vào yếu tố thức ăn như thức ăn nhiều đạm, quá thừa thức ăn và sự thay đổi thức ăn gây ra biến

đổi hệ vi khuẩn đường ruột và sản sinh độc tố của các chủng Cl perfringens

Độc tố được hấp thu qua niêm mạc đường tiêu hóa vào máu gây nhiễm độc cấp tính Đậu Ngọc Hào (2007)[9]

Trần Thị Hạnh (2000) [10] đã nghiên cứu vai trò của vi khuẩn E.coli và

Cl perfringens trong bệnh tiêu chảy ở lợn con và đã kết luận ngoài vi khuẩn

E.coli là nguyên nhân gây bệnh chính, một tác nhân gây bệnh cũng quan trọng

khác là Cl perfringens typ C Vi khuẩn này gây viêm ruột hoại tử, xuất hiện ở

lợn sơ sinh và gây ra tỷ lệ chết cao từ 50-100%

1.1.2 Nghiên cứu ngoài nước

Năm 1865 nhà vi trùng học Feser đã phát hiện ra vi khuẩn Cl perfringens đầu tiên trên mô bào của một số bò bị mắc bệnh Vi khuẩn Cl perfringens được

phân lập lần đầu tiên vào năm 1892 bởi Welch và Nuttall trong tổ chức có hơi của xác người chết Kể từ đó đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn này (Nguyễn Như Thanh và cs (1997) [30])

Năm 1931, bằng phương pháp trung hoà kháng độc tố với độc tố thu được từ môi trường nuôi cấy vi khuẩn, Wilsdon đã phân loại được 4 typ

Cl perfringens gây bệnh là A, B, C, D Năm 1943, cũng bằng phương pháp trên Bosworth đã phát hiện thêm typ E (Hatheway, (1990) [46])

Bệnh viêm ruột hoại tử do vi khuẩn Cl.perfringens ở lợn con được mô

tả lần đầu tiên ở nước Anh, Hunggari vào năm 1955, Đức 1970), ở Hà Lan năm 1971, ở Nhật năm 1983, ở Nga năm 1994 và ở Canada năm 1983

Trong quá trình nghiên cứu, chiết tách các loại độc tố, Hogh (1974) [48]

đã phát hiện thấy: ngoài độc tố β-toxin có hàm lượng cao nhất trong chất chứa

ở tuột, còn có một vài loại độc tố khác như: α-toxin (Lecitinase), κ-toxin (Collagenase), µ-toxin (Hyaluronidase) và δ-toxin Con vật chết trong các ca

bệnh viêm ruột hoại tử do Cl perfringens typ C chính là do vai trò tác động

của các độc tố

Ngoài ra, vi khuẩn Cl perfringens còn là một trong những nguyên nhân

gây ngộ độc thức ăn, tiêu chảy và viêm ruột hoại tử ở trẻ em và nhiều loại động vật, đặc biệt là ở gia súc non (Roeder và cs 1987 [55])

Năm 1989, nhiều công trình nghiên cứu ở Anh, Pháp, Mỹ đã công bố thành công trong việc giải trình tự gen mã hoá độc tố alpha (α) Năm (1996) Songer đã dùng phương pháp PCR và ELISA để xác định các loại độc tố của

vi khuẩn Cl perfringens (Songer J.G 1996 [57]) Đến năm 1997, người ta đã dùng phương pháp multiplex PCR để xác định các typ khác của vi khuẩn Cl

perfringens (Choi và cs 2003 [43])

Đến nay, phương pháp PCR nói chung và multiplex PCR nói riêng đã được sự dụng rộng rãi ở khắp nơi trên thế giới trong chuẩn đoán và định typ

Cl perfringens

Trong các typ vi khuẩn Cl perfringens gây bệnh, thì typ C có sự phân

bố rộng, và khả năng gây bệnh cho người cũng như động vật cao hơn cả so

với những typ khác Viêm ruột hoại tử ở những động vật non do vi khuẩn Cl

perfringens bởi typ C được tìm ra ở Anh và Hungari từ năm 1955, sau đó vi khuẩn này được nghiên cứu và tìm ra ở nhiều quốc gia khác trên thế giới như: Mỹ, Đan Mạch, Liên Xô, Hà Lan, Canada, Nhật Bản cũng như hầu khắp các quốc gia trên thế giới Taylor và cs (1986) [58]

Với khả năng hình thành giáp mô, nên ngoài kháng nguyên thân, vi

khuẩn Cl perfringens còn có kháng nguyên giáp mô Vi khuẩn còn có khả

năng sinh sản ra nhiều loại độc tố và enzym khác nhau, gây ra quá trình bệnh phong phú và thể lợi và phức tạp trong bệnh lý do độc tính gây ra (Roeder và

cs (1987) [55]) Theo Bergeland và cộng sự (1986) [42]; lợn con thường bị nhiễm bệnh từ 12 giờ đến 7 ngày tuổi, đặc biệt trong 3 ngày đầu

1.2 MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VI KHUẨN Cl PERFINGENS

1.2.1 Nghiên cứu về vi khuẩn Cl perfringens

Năm 1865 nhà vi trùng học Feser đã phát hiện ra vi khuẩn Cl perfringens

trên mô bào của một số bò bị mắc bệnh

Năm 1870 Muller phát hiện bệnh ngộ độc thực phẩm ở người do độc tố

của Cl Botulinum Bệnh gây nhiễm độc tố do độc tố của vi khuẩn sản sinh

trong quá trình sinh sống tại mô bào tổ chức của cơ thể động vật, gây hoại tử ở ngựa con và ngựa trưởng thành

Clostridium là trực khuẩn yếm khí, có nha bào phân bố rộng rãi trong thiên nhiên như ở đất, phân, nước bẩn, trong đường ruột và động vật Có một

số loài gây bệnh chỉ phân bố ở những vùng địa lý nhất định Giống vi khuẩn này có tới trên 83 loài, phần lớn không gây bệnh, chỉ có khoảng 14 loài gây bệnh cho người và gia súc nhỏ Niilo và Chalmers (1978) [52]; Hatheway C.L (1990) [46]

Năm 1994, Radostits O.M và cs [56] đã phân lập được Clostridium

septicum từ máu bò bị bệnh và đã xác định được vi khuẩn là tác nhân chính gây bệnh thủy thũng ác tính hay bệnh hoại thư sinh hơi của gia súc

Năm 1884, Carle đã mô tả bệnh uốn ván xảy ra điển hình ở thỏ Cùng năm đó, tác giả đã chứng minh được bệnh là do một loài vi khuẩn có nha bào

ở đầu Năm 1997, Kitasato [49] đã phân lập được trực khuẩn gây bệnh, tìm ra độc tố và đã gây bệnh thực nghiệm thành công Năm 1994, Radostis O.M [56]

đã nghiên cứu và tạo ra giải độc tố phòng bệnh bằng cách dùng focmalin làm

vô hoạt độc tố

Arleans và Thomas đã phát hiện ra vi khuẩn Clostridium chauvoei gây

bệnh ung khí than (Nguyễn Vĩnh Phước (1974) [26]); Timoney và cs (1994) [59]; Nguyễn Như Thanh và cs (1997) [30])

Năm 1897, Van Ecmengein đã phát hiện ra Clostridium botulinum ở thịt

dăm bông và trong ruột già người chết vì ngộ độc, sau đó Konstansov đã phân

lập được trực khuẩn này ở cá Clostridium histokyticum được Vainbec và

Xeganh phân lập năm 1916 Đây là trực khuẩn làm tan tổ chức, gây bệnh huyết niệu cho bò (Timoney và cs (1994) [59]) Vào năm 1959, lần đầu tiên

Peckham đã cho biết Clostridium colinum là vi khuẩn gram dương, yếm khí và

sinh nha bào gây viêm ruột non ở chim cút Các loài khác của giống

Clostridium cũng đều được phát hiện ở thế kỷ IX (Hatheway, 1990[46])

Dựa theo tác động của độc tố, người ta chia Clostridium gây bệnh thành

- Nhóm gây thối nát, hoại thư sinh hơi, viêm bắp thịt và phủ tạng gồm:

Clostridium chauvoei gây bệnh ung khí thán ở trâu, bò; Clostridium

heamolyticum, Clostridium septicum, Clostridium perfringens, Clostridium oedematiens, Clostridium sporogens gây hoại thư sinh hơi ở người và động vật Độc tốc của các loài này ít độc hơn độc tố thần kinh nhưng chúng có khả năng xâm nhập và lan rộng trong cơ thể vật chủ Nguyễn Quang Tuyên (2008) [36]

- Nhóm sản sinh độc tố ruột trong máu: Độc tố được sản sinh trong ruột

và hấp thu vào máu gây trúng độc toàn thân, Cl perfringens cũng thuộc nhóm

này và chúng được phân ra các typ A, B, C, D và E

- Nhóm gây bệnh đường ruột có khả năng sản sinh kháng sinh

Clostridium diffcile và Clostridium spiroform

Trong luận văn này, chúng tôi tập trung nghiên cứu tìm hiểu về Cl

Perfringens và bệnh do chúng gây ra tại Thái Nguyên

1.2.2 Đặc điểm hình thái, tính chất nhuộm màu và sức đề kháng của vi khuẩn

- Vi khuẩn Cl perfringens là vi khuẩn gram dương, yếm khí, không di

động, kích thước từ 0,8 - 1,5µm x 3 - 8 µm Vi khuẩn không có lông, không di động, hình thành giáp mô trong cơ thể động vật, hình thành nha bào trong môi trường trung tính hay kiềm tính Nha bào to hơn vi khuẩn, có hình ovan cân xứng hay lệch tâm Trong thực tế, ít khi quan sát được nha bào

- Trên môi trường thạch máu bò hay cừu 7%, sau 24 giờ nuôi cấy trong điều kiện yếm khí, vi khuẩn phát triển hình thành những khuẩn lạc rõ ràng, có đường kính 3-5mm, màu xám trong, gây dung huyết hoàn toàn

- Trong canh trùng non, Cl perfringens bắt màu Gram dương, nhưng

trong canh trùng già vi khuẩn có thể thoái hình, hình cong sợi dài và một số có thể bắt màu Gram âm

- Nha bào hầu hết của các chủng đều không tồn tại được ở nhiệt độ cao, đung sôi 5 phút có thể diệt được nha bào Tuy nhiên trong thực tế nha bào của

các chủng Cl perfringens typ C và typ A có sức đề kháng nhiệt rất lớn, đun

sôi 1000C trong vòng hơn 1 giờ mới bị vô hoạt

1.2.3 Đặc tính nuôi cấy và sinh vật hoá học

* Đặc tính nuôi cấy

Vi khuẩn Cl perfringens là vi khuẩn yếm khí hoàn toàn Vì vậy, trong

quá trình nuôi cấy, vấn đề quan trọng là phải tạo được môi trường yếm khí thích hợp thì vi khuẩn mới có khả năng phát triển được Tuy nhiên điều kiện

không đòi hỏi khắt khe như các vi khuẩn yếm khí khác Cl Perfringens phát

triển tốt ở môi trường yếm khí thông thường, nhiệt độ thích hợp là 37 - 47oC

- Vi khuẩn mọc tốt hơn ở những môi trường có thêm đường, máu hoặc một số chất như: axit amin, vitamin, huyết thanh và carbohydrat

- Trên môi trường thạch máu có 2% Glucose: Vi khuẩn tạo ra các khuẩn lạc xung quanh có vòng dung huyết đôi đặc trưng, vòng ngoài tan máu không hoàn toàn Hiện tượng dung huyết được hình thành do các độc tố Alpha (α) Beta (β) và Theta (υ) Hiện tượng dung huyết có xảy ra hay không

và mức độ của nó phụ thuộc vào độc tố của vi khuẩn được sinh ra và hồng cầu của loài động vật nào đưa vào môi trường Thường thì máu cừu và bò gây dung huyết mạnh

- Trong môi trường nước thịt gan yếm khí: Vi khuẩn phát triển nhanh chóng làm đục môi trường, chuyển sang màu vàng rơm, sinh nhiều hơi, khi

mở nắp có nhiều bọt khí Bề mặt môi trường đặc vi khuẩn hình thành khuẩn lạc có dạng tròn

- Khi nuôi cấy vào môi trường sữa quỳ (Litmus milk medium): Vi khuẩn phát triển tạo thành dạng cẩn mây điển hình do đường lactose trong môi trường bị lên men, tạo ra acid, làm đông vón casein và làm chuyển màu môi trường, từ màu xanh da trời thành màu hồng Sau đó thì các đám vẩn acid đó

bị vỡ, nứt ra do sự hình thành hơi

- Khi nuôi cấy trên môi trường thạch máu cừu hay máu bò 7% trong điều kiện yếm khí, sau 24h phát triển thành những khuẩn lạc rõ, hơi tròn và gây dung huyết hoàn toàn trên thạch máu bò

- Trên môi trường có huyết thanh người hay lòng đỏ trứng gà: Vi khuẩn phát triển, làm phân huỷ chất lecithin trong môi trường, tạo ra một vùng màu trắng đục ở quanh đường cấy vi khuẩn

- Typ B

Bệnh ở cừu xảy ra khá rõ ràng và rộng rãi ở châu Á, châu Âu, châu Phi Độc tố gây ra bởi typ B xảy ra lẻ tẻ ở bê và ngựa con với các triệu chứng ỉa chảy lẫn máu Typ B có khả năng sản sinh các loại độc tốt chủ yếu như: α, β,

ε, các loại độc tố thứ yếu là: γ, δ, υ, κ, µ và ν Cl perfringens typ B ngoài gây

bệnh lỵ ở cừu non, bệnh nhiễm máu độc tố ruột ở lừa, ngựa non, cừu mà còn

là nguyên nhân gây bệnh cho bê dưới 3 tuần tuổi, làm con vật chết nhanh với triệu chứng lơ đãng, nằm mệt mỏi, đau bụng, ỉa chảy, phân hôi tanh, lẫn máu, viêm ruột hoại tử, tỷ lệ chết có thể tới 100%

- Typ C

Cl perfringens typ C gây viêm ruột hoại tử ở trẻ em, trên gia súc thường gặp ở bê, nghé, dê, cừu, lợn con Typ C lần đầu tiên được tìm thấy trên lợn vào năm 1955 ở Anh và Hungari, sau đó ở Mỹ, Đan Mạch, Đức và Newzeland, Canada, Nhật Bản Bệnh có triệu chứng lâm sàng điển hình là tổ chức xuất huyết nặng, gia súc có thể bị chết khi chưa có triệu chứng ở tổ chức Gia súc mới sinh có tỷ lệ chết cao hơn gia súc trưởng thành Lợn bị tác động

bởi Cl perfringens typ C nhiều hơn các loài khác Lợn con rất mẫn cảm với

bệnh, chúng có thể bị bệnh rất sớm, ngay sau khi sinh được 1-2 ngày Typ này thường sản sinh ra một số loại độc tố chủ yếu như α, β và các độc tố thứ yếu như: λ, δ, ν, κ, γ

- Typ D

Bệnh do Cl perfringens typ D gây ra xuất hiện chủ yếu ở cừu, dê mọi

lứa tuổi, ít gặp ở trâu, bò và ngựa Con vật cũng có triệu chứng ỉa chảy, đôi khi có lẫn máu và chết đột ngột Loại này thường sản sinh độc tố chủ yếu là α,

ε và các độc tố thứ yếu như β, γ, µ, κ, δ, ν Độc tố ε (Epsilon) có khả năng tự gia tăng tính thẩm thấu trong đường ruột để hấp thu nhiều nhất vào hệ tuần hoàn và đến cả não Độc tố phá huỷ vi mạch ở tổ chức, gây thẩm suất dịch và

phù cấp tính, vì vậy nên ngoài tên gọi là độc tố đường ruột (Enterotoxin), toxin còn được gọi là độc tố thần kinh (Neurotoxin)

ε-Typ E:

Typ E xuất hiện không phổ biến trong nhóm Cl perfringens, gây nhiễm

máu độc tố ruột cho cừu, trâu, bò, dê, thỏ và một số loài gia súc khác và người Độc tố chủ yếu là α, ι, độc tố thứ yếu υ, κ, µ, ν

Kết quả nghiên cứu của Hogh.P (1974) [48] cho biết typ E là nguyên nhân gây chứng xuất huyết và hoại tử đường ruột của bê ở Úc Mặc dù typ E được phân lập ở hầu hết động vật nuôi, nhưng do hạn chế về điều kiện nghiên cứu nên khả năng gây bệnh của typ E đến nay vẫn chưa được làm sáng tỏ

Ngoài ra, còn có một số tác giả chia Cl perfringens thành 6 typ huyết thanh Ngoài 5 typ như trên còn có thên typ F Cl perfringens typ F gây viêm

ruột hoại tử ở trẻ em, ở dê và một số gia súc khác, công thức kháng nguyên không khác nhiều so với typ C, chỉ khác ở một số thành phần độc tố thứ yếu, còn các độc tố chủ yếu gây bệnh thì hoàn toàn giống nhau Vì thế, ngày nay typ F cũng được xem là typ C

Trong số 5 typ huyết thanh của Cl perfringens, typ C là một typ phân

bố rộng rãi và quan trọng nhất

1.2.4.2 Khả năng gây bệnh

Vi khuẩn Cl perfringens có trong hệ vi sinh vật đường ruột bình thường

của động vật và người Vì vậy thường có 2 yếu tố gây nên bệnh tiêu chảy ở gia súc: thứ nhất do vi khuẩn sẵn có trong đường ruột, thứ hai do thức ăn bị nhiễm

khuẩn Cl perfringens cùng với một số thay đổi về môi trường, khẩu phần thức

ăn, thức ăn chứa nhiều protein hoặc do lao tác quá mức… dẫn tới cơ thể bị giảm nhu động ruột, giữ lại vi khuẩn trong cơ thể và cuối cùng thì cơ thể hấp thu các độc tố gây bệnh Cacbon hyđrat không tiêu hoá được là môi trường

thuận lợi cho vi khuẩn Cl perfringens sinh trưởng và phát triển nhanh chóng

Bình thường, vi khuẩn này có nhiều ở ruột già nhưng khi sức đề kháng của cơ thể giảm, vi khuẩn lại xâm nhập lên ruột non và sản sinh ra một lượng lớn độc

tố, gây nhiễm độc huyết đường ruột Trong đường tiêu hoá, với sự bội nhiễm

về số lượng, vi khuẩn Cl perfringens tấn công vào lớp màng nhày rồi vào lớp

biểu mô ruột, dưới tác dụng của độc tố gây xuất huyết, hoại tử tổ chức nhung mao ruột, từ đó lan dần vào sâu tới các lớp niêm mạc ruột Trong nhiều trường hợp, vi khuẩn xâm nhập sâu vào thành ruột tạo thành những ổ viêm nhiễm, gây khí thũng dưới lớp niêm mạc hoặc lớp cơ hay đi sâu vào trong các tổ chức hay các hạch lympho lân cận Trong thực tế những phát hiện này có ý nghĩa rất quan trọng trong nghiên cứu sản xuất giải độc tố để phòng bệnh (Quinn và

cs (1994) [53] Cl perfringens typ C có thể phân lập được trong chất chứa

đường ruột của động vật khoẻ Theo kết quả kiểm tra vi khuẩn học, các mẫu phân lấy từ loài động vật trâu, bò, cừu, lợn và gia cầm có thể phát hiện được

Cl perfringens và cũng dễ dàng tìm thấy loài vi khuẩn này trong thức ăn, dụng cụ chăn nuôi, môi trường xung quanh chuồng trại gia súc trong đất và nguồn nước Ở Việt Nam, theo các nghiên cứu của Đào Trọng Đạt và cs (1998) [8] cũng đã chứng minh được điều đó

1.2.5 Các kháng nguyên và độc tố của Cl perfringens

1.2.5.1 Đặc tính của kháng nguyên

Người ta phân loại Cl perfringens dựa vào kháng nguyên hòa tan, nó

rất quan trọng vì liên quan tới sự gây bệnh khác nhau giữa các typ khác nhau cho người và động vật

Cl perfringens có một số kháng nguyên thân và kháng nguyên giáp mô Tuy nhiên các loại kháng nguyên này không có vai trò chủ yếu và quan trọng

trong việc nhận ra các chủng của Cl perfringens

Các chủng Cl perfringens sản sinh nhiều loại độc tố và enzyme khác

nhau, mỗi một chủng có những đặc điểm riêng trong việc sản sinh ra một vài

loài độc tố hay enzyme nào đó Việc phân chia các chủng Cl perfringens

thành các typ huyết thanh như ở trên chính là dựa trên cơ sở phát hiện các độc

tố do chúng sản sinh ra bằng phản ứng trung hoà độc tố đặc hiệu Mỗi một loại độc tố hay enzyme được nghiên cứu đầy đủ và chi tiết vì mỗi loại độc tố có vai trò quan trọng trong việc nhận biết các chủng

1.2.5.2 Những loại độc tố chủ yếu

* Độc tố α (Alpha - toxin)

Độc tố này được sản sinh bởi tất cả các typ Cl perfringens nhưng typ C

có khả năng sản sinh ra độc tố α nhiều nhất Độc tố α có bản chất là một phospholipase C và đóng vai trò quan trọng trong chứng hoại thư sinh hơi Nó

có khả năng thuỷ phân phosphatidylcholine và sphingomyelin, nhưng không thuỷ phân được các phospholipid khác Độc tố α là độc tố gây chết, gây hoại

tử và tan máu, đó là một enzym kiểu lecitinase trên thạch lòng đỏ trứng và vùng mờ đục trong dung huyết đôi ở trên thạch máu Cụ thể là chúng phá huỷ hồng cầu, gây hoại tử tổ chức phần mềm

* Độc tố β (Beta - toxin)

Độc tố β là độc tố gây chết chủ yếu được sinh sản bởi typ B và typ C Độc tố β gây nên hoại tử ruột Độc tố này mẫn cảm với Trypsin Với những gia súc non bú sữa, trong sữa đầu có anti-trypsin có tác dụng làm vô hoạt trypsin của dịch tuỵ, do đó độc tố không bị phá huỷ và gây bệnh Đây chính là nguyên nhân làm cho gia súc non đặc biệt mẫn cảm với độc tố này

Độc tố β có bản chất là 1 protein, là ngoại độc tố chủ yếu gây nhiễm độc ruột ở gia súc và người

Ngoài ra, độc tố β cũng được sinh ra bởi Cl perfringens typ E làm

tăng tính thấm thành ruột, tăng hấp phụ độc tố và đi vào mạch máu, phá huỷ thành mạch (kể cả mạch máu não) gây xuất huyết và phù thũng (Garmory

và cs, 2000 [45]) Trong những năm gần đây, một loại độc tố mới được phát

hiện có tên là độc tố β2 Độc tố này được phát hiện thấy trong các chủng

Cl perfringens typ C phân lập được từ lợn con mắc bệnh viêm ruột xuất huyết, hoặc từ typ A phân lập được từ những động vật khác (bê, nghé) có các triệu chứng viêm ruột xuất huyết và tiêu chảy

* Độc tố εεεε (Epsilon - toxin)

Độc tố ε là một tiền độc tố được hoạt hoá bởi enzym phân giải protein

và được sản sinh ra bởi các chủng typ B và D Độc tố này làm tăng khả năng lên men của ruột non, do vậy làm tăng việc hấp thu của chính độc tố này Độc

tố ε cũng đóng vai trò như một độc tố gây chết Trong trường hợp này, nó gây

ra sưng và xuất huyết thận, phù phổi, tràn dịch màng tim Chuỗi nucleotide của gene mã hoá độc tố ε chỉ ra rằng tiền độc tố này ở dạng trưởng thành có

297 amino acid với khối lượng phân tử là 33 kDa Độc tố ε ít gây bệnh ở gia súc non hơn ở gia súc trưởng thành

* Độc tố ιιιι (iota - toxin)

Đây là một loại độc tố kép gồm hai tiểu đơn vị là ι-a và ι-b Hai tiểu đơn vị này khác nhau về mặt hoá sinh và miễn dịch học Chuỗi gene mã hoá các tiểu đơn vị này đã được xác định và chuỗi amino acid dùng cho protein hoạt động chức năng nằm trong nhóm polipeptit có khối lượng phân tử từ 40-

81 kDa Chuỗi này phải được vào tế bào đích trước khi phát huy tác dụng, nhưng trong bản thân chuỗi này không thể tự thực hiện được điều đó; ι-b nhận diện vị trí nối trên tế bào vỏ não, nối vào vị trí đó và tác động qua lại để giúp

ι-a xâm nhập vào tế bào đích Độc tố ι của Cl perfringens được sản sinh từ

Cl perfringens typ E, được hoạt hoá bởi Trypsinase hay tự hoạt hoá khi có mặt của độc tố λ

* Độc tố ruột

Độc tố ruột được sản sinh bởi Cl perfringens là nguyên nhân gây bệnh

tiêu chảy do ngộ độc thực phẩm sau khi tiêu thụ một lượng thức ăn nhiễm vi

khuẩn Độc tố ruột thường được sản sinh ra bởi Cl perfringens các typ A, C,

D Hầu hết các chủng của typ A đều có khả năng sản sinh ra độc tố ruột

Độc tố ruột được sản sinh trong ruột trong quá trình tạo nha bào của vi khuẩn Độc tố ruột có khả năng phản ứng với bề mặt tế bào biểu mô ruột, gây phá huỷ mô và gây rối loạn dịch trong khoang ruột

Độc tố ruột của Cl perfringens khi được tách và tinh khiết là một chuỗi

peptit có trọng lượng phân tử 35kDa gồm 309 acid amin, độ đẳng điện

pH=4,3 Cl perfringens này có một nhóm sulphydryl tự do Hoạt lực của độc

tố ruột tăng lên gấp 3 khi kết hợp với Trypsin, tạo thành 1 protein gồm 284 acid amin và 2 chuỗi peptit ngắn gồm 10-15 acid amin

* Độc tố phụ

Ngoài các độc tố kể trên, còn 9 loại độc tố khác được sản sinh ra bởi ít

nhất một vài chủng của Cl perfringens Các loại độc tố này được gọi là các

độc tố phụ Có ít nhất một vài chủng sản sinh ra các loại độc tố θ, κ, µ, ν và neuramidase

+ Độc tố δ là độc tố gây dung huyết được sản sinh ra từ các chủng thuộc typ B và C, còn các chủng thuộc typ A, D và E không có khả năng này Độc tố

δ có đặc tính gây dung huyết mạnh đối với hồng cầu cừu, dê và lợn, nhưng hầu như bất hoạt đối với hồng cầu người, ngựa, thỏ, chuột và động vật có vú

+ Độc tố λ không được sản sinh ra từ các chủng thuộc typ A và C Đây

là 1 proteinase có khả năng tiêu hoá gelatin, haemoglobin và casein đến một chừng mực nhất định, nhưng cũng không tiêu hoá được collagen

+ Độc tố κ (collagenase; độc tố µ (hyaluronidase và độc tố λ (protease) đóng vai trò quan trọng trong việc gây bệnh do khả năng phân huỷ mô của vật chủ

+ Độc tố γ và η đã từng được xem là có vai trò về sự sai khác trong các phản ứng trung hoà với kháng huyết thanh, nhưng các yếu tố hoạt hoá đặc biệt

có liên quan tới các độc tố trên đã chỉ ra rằng toàn bộ các độc tố trên chưa từng được phân lập

Bảng 1.1 Một số loại độc tố chủ yếu của Cl perfringens sản sinh ra

Độc tố Typ

Alpha (α) Beta (β) Epsilon (ε) iota (ι)

tố θ được hoạt hoá bởi cysteine

1.3 NHỮNG NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH DO CLOSTRDIUM PERFRINGENS

GÂY RA

1.3.1 Bệnh viêm ruột xuất huyết của gia súc (hemorrhagic enteritis)

Theo Nguyễn Như Thanh và cs (1997)[30] bệnh viêm ruột xuất huyết

do Cl perfringens do typ A thường gặp ở bê, nghé và dê Một công bố khác của Bergeland (1986) [42] cho rằng: một số Cl perfringens typ A sản sinh

enterrotoxin có khả năng gây ra ngộ độc thực phẩm cho người khi dùng đồ ăn nguội chế biến từ thịt lợn, người ta chưa biết chính xác các mối liên quan giữa các nhóm vi khuẩn gây bệnh ngộ độc cho người và khả năng gây bệnh cho vật nuôi (Quinn.P.J et al, 1999 [54])

Bệnh viêm ruột xuất huyết xảy ra ở lợn con trong giai đoạn cai sữa do

Cl perfringens typ A gây ra (Radostits O.M và cộng sự, 1994 [56]) Bên cạnh

khả năng gây ngộ độc thực phẩm cho người Cl perfringens typ A còn gây

nhiễm trùng huyết và gây chết nhiều gia súc khác như động vật nhai lại, hươu, nai, thỏ

1.3.2 Bệnh viêm ruột và nhiễm độc tố ruột ở lợn

Clostridium gây bệnh đường tiêu hoá ở lợn có thể nhận biết được đưa vào triệu chứng lâm sàng và biến đổi bệnh lý Bệnh viêm ruột và nhiễm độc tố ruột huyết thường xảy ra ở lợn đang bú sữa như là một hội chứng, nhưng cũng

có thể gây bệnh cho lợn lớn với triệu chứng khó nhận biết hơn Vi khuẩn

Clostridium trong hệ vi sinh vật đường tiêu hoá có khả năng đáp ứng rất nhanh với bất kỳ thay đổi nào của môi trường sống, cư trú tại nơi có bệnh tích, gây

nên các triệu chứng lầm sàng và biến đổi bệnh lý Khi Clostridium gây bệnh

hình thành bệnh tích thì rất khó chẩn đoán nếu chỉ dựa vào triệu chứng lâm sàng và bệnh lý học vì chúng phụ thuộc vào bệnh ban đầu và sự có mặt của các vi sinh vật được nuôi cấy vi khuẩn Ở lợn con cai sữa lớn và lợn trưởng thành có một nhóm bệnh thường gây chết đột ngột, thường gắn liền với hiện

tượng viêm ruột Sự có mặt thường xuyên của Clostridium trong chất chứa

đường tiêu hoá của động vật này có thể liên quan tới nguyên nhân gây bệnh, nhưng hiện tượng chết đột ngột và sự thay đổi nhanh chóng sau khi chết đòi hỏi các nhà khoa học phải nghiên cứu

1.3.3 Bệnh viêm ruột hoại tử do Cl perfringens typ C gây ra ở lợn

Bệnh viêm ruột hoại tử (VRHT) ác tính ở lợn gây ra bởi Cl perfringens

typ C thường gặp nhất ở giai đoạn lợn con theo mẹ 1-14 ngày tuổi và đặc biệt xảy ra trầm trọng lúc sơ sinh dưới 1 tuần tuổi Bệnh có biểu hiện lâm sàng tiêu chảy xuất huyết nặng và có tỉ lệ tử vong cao trong trường hợp thể bệnh là cấp tính, ở thể á cấp tính mức độ hoại tử thường nhẹ hơn

Bệnh được mô tả lần đầu tiên vào năm 1955 ở Anh và Hungari, sau đó

Mỹ, Đan Mạch, Đức, Newzeland, Canada, Nhật Bản cũng có thông báo phát hiện Đến nay, bệnh đã được phát hiện hầu hết ở các vùng chăn nuôi lợn trên thế giới (Taylor D.J (1986) [58], Bergeland M.E (1986) [42]

* Mầm gây bệnh

Cl perfringens là vi khuẩn Gram dương, không di động, kích thước từ 1-1,5µm, tạo nha bào to hơn thân vi khuẩn, có hình trứng cân xứng hay lệch tâm Trong thực tế rất ít khi có thể quan sát được nha bào, (Taylor DJ (1986) [58], Bergeland M.E (1986) [42]

Trên môi trường thạch máu cừu hay bò 7% sau 24h nuôi cấy vi khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc rõ ràng, có đường kính 3-5mm màu xám

tròn, dung khuyết kiểu β (beta) Cl perfringens typ C sản sinh độc tố phần

lớn là α và β, nhưng chủ yếu độc tố β gây hoại tử xuất huyết Đây cũng chính

là nhân tố quan trọng nhất trong sinh bệnh học của bệnh này

Ngoài ra, trong quá trình nghiên cứu về bệnh VRHT do Cl perfringens

typ C gây ra trên lợn sơ sinh Bakhtin A.G (1956) [41], đã phát hiện trong một

hội chứng tương tự thấy Cl perfringens typ B cũng sản sinh ra β-toxin Sau

này Harbola P.C Khera S.S (1990) [47] cũng thông báo phát hiện thấy độc tố

này ở Cl perfringens typ D Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây của

Radostitss O.M (1994) [56], đã khẳng định: Theo như hầu hết các đặc điểm

mô tả lại thì đều thuộc vai trò gây bệnh của Cl perfringens typ C

* Đặc điểm dịch tễ

Bệnh VRHT do Cl perfringens typ C được biết đã có mặt rất nhiều nơi

trên thế giới, bệnh xảy ra chủ yếu ở trên lợn con giai đoạn theo mẹ Lứa tuổi mắc bệnh phổ biến nhất là 12h sau khi sinh đến 7 ngày tuổi, hay gặp nhất ở lúc 3 ngày tuổi Niilo và CS (1978) [52]: Bệnh cũng có thể xảy ra với lợn lúc 2-4 tuần tuổi và cả khi đã cai sữa Bergeland M.E (1986) [42] cho biết: Lợn

mắc bệnh thường bị chết, ở những ổ lợn mà nái mẹ không được phòng bệnh,

tỷ lệ khỏi rất thấp, lợn bệnh có thể chết đến 100% Đối với những chuồng nuôi không đảm bảo điều kiện vệ sinh thì chính phân và da của những lợn mẹ bị ô nhiễm bởi vi khuẩn yếm khí này là vật mang trùng, nguồn gieo rắc mầm bệnh cho lợn sơ sinh

* Sinh bệnh học

Phần lớn các trường hợp bệnh gây ra bởi Cl perfringens typ C trên lợn

con chỉ trong vòng vài phút hoặc sau vài giờ sau khi sinh (Arbuckle J.B.R (1972) [39] Vì một lý do nào đó mà vi khuẩn này trở nên bội nhiễm và tấn công vào đỉnh của các lông nhung tế bào biểu mô ruột, tại các vị trí đó trên khắp lớp màng nhày ruột, vi khuẩn tăng sinh và gây hoại tử, đồng thời còn gây xuất huyết trong trường hợp quá cấp tính Các vùng hoại tử lan dần và gây tổn thương vào chiều sâu đến lớp niêm mạc, dưới lớp niêm mạc và thậm chí đến tận lớp cơ Một số vi khuẩn có thể xâm nhập sâu vào trong khoang bụng Khí thũng này có thể tạo nên ở những hạch lympho vùng lân cận Có hiện tượng tắc nghẽn mạch ở vùng khí bị thũng Hầu hết vi khuẩn bám dính

ở lại trên các lông nhung bị hoại tử, sau đấy tróc ra và rơi vào lòng ruột cùng với tế bào và máu

Độc tố hoại tử, gây chết (độc tố β) là yếu tố quan trọng nhất trong sinh bệnh học của bệnh này Trong quá trình nghiên cứu, chiết xuất phân loại độc

tố, cùng với một số tác giả Hogh.P (1974) [48] thông báo: Ngoài độc tố β là độc tố có hàm lượng cao nhất trong chất chứa ruột, còn thu được một vài độc

tố khác như: α-toxin, µ-toxin, δ-toxin Con vật thường chết là do viêm ruột hoại từ xuất huyết, bởi chính vai trò các độc tố và cốt yếu là độc tố β

* Triệu chứng lâm sàng

Các dấu hiệu lâm sàng có những thay đổi lớn theo tình trạng miễn dịch

và ngày tuổi của lợn con khi bị nhiễm bệnh, giữa đàn lợn này với đàn lợn khác

và thậm chí ngay trong một ổ lợn Có thể có các bệnh như: Thể quá cấp, cấp tính, cận cấp tính và mãn tính Triệu chứng lâm sàng thường xuất hiện vào khoảng 2-3 ngày sau khi sinh và ở một trong các thể bệnh này:

- Thể quá cấp tính

Lợn con bị nhiễm thường vào khoảng 10h đầu tiên sau khi sinh và chết lúc 12-36 giờ sau đấy Lợn bệnh bị ỉa chảy ra máu, biểu hiện uể oải, kém hoạt động, không bú sữa, yếu ớt và có thể bị mẹ đè chết Trước khi chết thân nhiệt

hạ xuống 350C, da bụng có thể chuyển sang màu xám đen Có một vài trường hợp lợn con chết mà không thấy dấu hiệu ỉa chảy

- Thể bệnh mãn tính

Với thể bệnh này, lợn con có biểu hiện ỉa chảy kéo dài 1 tuần hay lâu hơn, phân có màu xám nhày, lợn con bị bệnh ngừng phát triển Bệnh có thể kéo dài đến 10 ngày hoặc lâu hơn, những con lợn này có thể chết sau vài tuần hoặc không thì cũng bị giết bỏ do gầy sút quá nhanh, yếu ớt không thể phát triển được

* Biến đổi bệnh lý do Cl perfringens typ C

Lợn con mắc bệnh có những biến đổi bệnh lý biểu hiện nặng nhẹ khác nhau, phụ thuộc vào các thể bệnh mà nó gặp phải Biểu hiện của những biến đổi bệnh lý thể hiện rõ thường thấy ở ruột tịt và ruột kết, ruột chay cũng bị tổn thương rất nặng và có thể lan ra đến ruột hồi, ruột tá thường không bị tổn thương Gặp thể quá cấp tính, lợn sơ sinh chết mà ít có dấu hiệu nhiễm bệnh, không bị mất nước Biến đổi bệnh lý đại thể quan sát được là da bụng trở nên thâm đen, con vật chết rất nhanh, đa số trường hợp lợn con khi đó chưa rụng rốn Trong ruột thường có mầu đỏ sẫm, xoang ruột chứa đầy chất lỏng màu máu Những phần ruột tiếp theo, trong đó có ruột kết và đôi khi ở trong xoang bụng cũng chứa chất lỏng màu máu Hầu hết các dấu hiệu biểu hiện đặc trưng

đó là viêm ruột xuất huyết hoại tử Đôi khi trên thành đoạn ruột non và có thể

cả ở thành bụng thường thấy có khí thũng cắt vào

Các biến đổi vi thể cho thấy lông nhung trong đoạn ruột bị hoại tử, có thể quan sát thấy ở trên các điểm hoại tử này có các vi sinh vật bao bọc Lớp biểu bì có thể hoặc không bị hoại tử và có thể xuất huyết xuyên qua màng niêm mạc, dưới lớp màng niêm mạc

Trường hợp cấp tính, quan sát đại thể cho thấy lợn con bị bệnh có thể có dấu hiệu mất nước, biểu hiện của chứng hoại tử thường nặng hơn so với trường hợp bệnh ở thể quá cấp tính, nhưng chúng xuất huyết ít hơn Một số trường hợp cấp tính đều thấy có khí thũng ở ruột, cũng có thể có khí thũng lan đến vùng lân cận và làm viêm xoang cấp tính có Fibrin Thành ruột dày lên, xoang ruột có thể chứa máu xuất huyết và thường có các màng hoại tử, màng niêm mạc có màu vàng hoặc xám

Biến đổi bệnh lý vi thể quan sát được bao gồm: Sự biến mất của hầu hết các lông nhung (do hoại tử) nhưng phần lớn chúng bị bong ra để lại một mảng hoại tử nằm dưới lớp niêm mạc, ở đây thấy có các tế bào bị viêm thoái hoá và

có cả vi khuẩn Những vi mạch dưới màng niêm mạc đều bị hoại tử và có thể chứa chất gây tắc nghẽn mạch Khí thũng có thể hình thành dưới niêm mạc, tạo sự căng thẳng cho lớp cơ và khí thũng có thể xâm nhập vào xoang bụng

Thể cận cấp tính, biến đổi bệnh lý cho thấy sự kết dính giữa các vùng bị nhiễm khuẩn của ruột non thành ruột dày lên và bị khí thũng nặng, dễ vỡ Màng bị hoại tử được thay thế bằng niêm mạc làm cho bề ngoài ruột có màu vàng xám giống như một dải băng

Thể mãn tính, lợn bị nhiễm bệnh này có những bệnh lý tương tự thể cận cấp tính, nhưng không thể quan sát được rõ ràng từ bề mặt thành mạc của ruột non Kiểm tra kỹ có thể phát hiện thấy những vùng hoại tử, dài 1-2 cm Khi quan sát vi thể có thể thấy vùng hoại tử được thay thế bằng niêm mạc, ở trên

đó có khá nhiều loại vi khuẩn khác nhau

1.3.4 Bệnh viêm ruột hoại tử do Cl perfringens typ A gây ra ở lợn

Theo Taylor D.J (1986) [58], Bergenlad M.E (1986) [42]: Cl perfringens

typ A được coi là một phần của phổ hệ vi sinh vật bình thường ở lợn Do yếu tố Stress nội sinh hay ngoại sinh nào đó làm cho sinh thái của phổ hệ mất cân bằng,

từ đó tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển và gây bệnh đường ruột Từ những kết

quả thu thập được đã chứng tỏ sự liên quan của Cl perfringens đến bệnh VRHT,

trong cả trường hợp ỉa chảy ở lợn con và lợn thời kỳ đầu cai sữa

* Mầm gây bệnh-toxin

Cl perfringens typ A cũng giống như Cl perfringens typ C, nhưng

khuẩn lạc của typ A trên môi trường thạch máu tạo thành 2 vòng dung huyết đặc trưng, vòng dung huyết ngoài tạo ra do α-toxin, còn vòng trong do γ-toxin

Một số Cl perfringens typ A sản sinh ra độc tố ruột khi tạo nha bào (dạng nha bào), có một số khác (Cl perfringens typ A dạng dinh dưỡng) sinh

ra độc tố ruột và thường tạo ra nhiều độc tố α Vì thế đã làm xuất hiện hai hội

chứng có liên quan đến Cl perfringens typ A Cả hai nhóm tạo nha bào sản

sinh độc tố ruột và nhóm tạo độc tố ruột sản sinh α-toxin khi ở dạng dinh dưỡng đã được xác minh ở trên lợn (Taylor D.J (1986) [58], Bergeland M.E (1986) [42])

* Đặc điểm dịch tễ

Vi khuẩn thường tồn tại ở chất chứa trong đường ruột và đất Nha bào

có thể sống sót trong đá lạnh 00C và ở nước sôi 1000C trong 10 phút, nhưng các tế bào dinh dưỡng lại dễ bị tác động bởi nhiệt Trong thực tế đặc điểm dịch

tễ của bệnh do Cl perfringens typ A gây ra ở lợn đến giờ vẫn chưa được

nghiên cứu nhiều, vì thế còn nhiều điểm chưa được làm sáng rõ

Bệnh xảy ra ở các trang trại chăn nuôi và trong một số ổ lợn là sự kết hợp

của các nhóm Cl perfringens typ A với các đặc tính sinh vật giống nhau Tuy

nhiên cho đến nay người ta vẫn chưa xác định một cách chắc chắn chúng thuộc

nhóm vi khuẩn Cl perfringens typ A nào (Dạng nha bào hay dinh dưỡng)

Theo Taylor D.J (1986) [58], Bergeland M.E (1986) [42] cho biết: Một

số nhóm Cl perfringens typ A có gen sản sinh độc tố ruột (Entertoxin) có khả

năng gây ra ngộ độc thực phẩm cho người, thường hay xảy ra với đồ ăn nguội

là thịt lợn và cho đến bây giờ người ta vẫn chưa biết một cách chính xác mối liên quan giữa các nhóm vi khuẩn gây ngộ độc cho người này với khả năng gây bệnh cho vật nuôi

* Sinh bệnh học

Bệnh nhiễm khuẩn Cl perfringens typ A thường xảy ra ở lợn con sau

khi đẻ khoảng vài giờ, vi khuẩn có thể được tìm thấy ở ngay phân su Trong chất chứa ruột (đoạn ruột chay, ruột hồi) có thể phát hiện được 108 - 109 CFU/g tương đương với số lượng vi khuẩn có trong ruột già và trong phân

Vi khuẩn dạng dinh dưỡng (Vegerative forms) sản sinh độc tố α và có thể một số độc tố khác gây hoại tử ở tế bào biểu mô ruột của lợn trong gây bệnh thực nghiệm

Dạng hình thành nha bào sản sinh độc tố ruột, gây hoại tử lông nhung khá nặng và hút nước vào trong lòng ruột, độc tố cố định vào tế bào biểu mô của ruột kết, làm mất khả năng tái hấp thu nước Kháng thể của cả hai loại độc

tố ruột này có trong sữa đầu, bệnh thường quan sát được khi lợn con đã cai sữa lúc 5-7 tuần tuổi (Taylor D.J (1986) [58], Bergeland M.E (1986) [42])

* Triệu chứng lâm sàng

Lợn con mắc bệnh Cl perfringens typ A dạng dinh dưỡng, biểu hiện

phân nhão như kem trong vòng 48 giờ sau khi sinh, lợn bệnh không bị sốt, da

bụng biến màu trông giống các ca nhiễm Cl perfringens typ A Tiêu chảy

thường kéo dài tới 5 ngày, phân trong chuồng trông lầy nhầy và có thể có màu mận hồng, lợn bệnh thường ít chết, sau khi khỏi còi cọc chậm phát triển

Trường hợp bệnh gây ra bởi Cl perfringens typ A dạng nha bào, lợn

bệnh tháo chảy ra nước, kéo dài 24-48h Đối với lợn cai sữa 5-7 tuần tuổi, thường thấy ỉa chảy hoặc phân nhão khi nhiễm bệnh và kéo dài 4-7 ngày Dạng ỉa chảy này lợn thường ít chết nhưng sau đó rất chậm phục hồi Lợn mắc

bệnh thường do ăn phải thức ăn bị ô nhiễm nha bào Clostridia

* Biến đổi bệnh lý do Cl perfringens typ A

Biến đổi bệnh lý đại thể quan sát được đó là: Lợn bị bệnh thường biểu hiện mất nước, thành ruột non dày, trong đó chất chứa tựa như bột nhão, rất hiếm trường hợp thấy có máu, niêm mạc viêm nhẹ và có dính chút ít chất hoại

tử Trong ruột già cũng đầy chất chứa nhão, niêm mạc thường là bình thường hoặc thỉnh thoảng thấy có mảnh vụn hoại tử Bệnh xảy ra trên lợn sau cai sữa rất ít thấy biến đổi bệnh lý trên niêm mạc ruột, nhưng có thể thấy bọt và các chất chứa nhầy trong ruột

Ruột non ở những lợn chết thường xung huyết, chất chứa có nhiều dịch

và nước, nhưng không có máu Trên bề mặt niêm mạc không tràng và hồi tràng quan sát thấy các đám hoại tử Những quan sát sau khi mổ khám không

thể chứng minh được là trường hợp bệnh do viêm ruột Cl perfringens typ A Tuy nhiên, điều này giúp phân biệt bệnh do Cl perfringens typ B và C, vì

những con bị bệnh không có hiện tượng ruột non có màu đỏ đậm Ngoài hiện tượng xung huyết bên ngoài ruột và xác chết mầu thẫm, các biến đổi khác không rõ Trong thể mãn tính, cũng có thể quan sát thấy một số biến đổi tương

tự Cl perfringens Cl perfringens typ A có thể phân lập từ môi trường nuôi

cấy ruột non của những động vật bị bệnh viêm ruột do một số nguyên nhân

khác như bệnh viêm dạ dày ruột - ruột (TGE), rotavirus, cầu trùng và nhiễm

Crystosporidia Bệnh tích quan sát được cũng như phần triệu chứng đã mô tả,

tuy nhiên Cl perfringens typ A có thể gây teo lông nhung và có chứa chất

nhày niêm mạc

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Lợn con dưới 60 ngày tuổi tại một số huyện của tỉnh Thái Nguyên

- Vi khuẩn Cl perfringens gây bệnh ở lợn tại Thái Nguyên

2.1.2 Địa điểm nghiên cứu

- Các trang trại, hộ gia đình nuôi lợn tại các huyện Phú Bình, Đồng Hỷ

và huyện Định Hóa thuộc tỉnh Thái Nguyên

- Phòng vi trùng, Trung tâm chẩn đoán thú y Trung Ương

2.1.3 Thời gian nghiên cứu

- Từ tháng 8/2009 đến tháng 8/2010

2.2 NGUYÊN LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU

2.2.1 Mẫu nghiên cứu

- Mẫu là phân lợn tiêu chảy nghi mắc bệnh viêm ruột hoại tử: Được lấy trực tiếp từ trực tràng lợn, hoặc vừa được thải ra, khoảng 2 - 3 gam cho vào ống nghiệm vô trùng có nút vặn để tránh nhiễm trùng kế phát Mẫu phân được bảo quản lạnh và đưa ngay về phòng thí nghiệm để tiến hành các xét nghiệm tiếp theo trong vòng 24h

- Mẫu bệnh phẩm: Là phủ tạng gồm: Gan, lách, ruột của lợn từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi mắc bệnh tiêu chảy vừa chết hoặc sắp chết

- Các dụng cụ lấy mẫu được chuẩn bị trước, đảm bảo vô trùng và tuân theo quy trình và phương pháp lấy mẫu trong nghiên cứu vi sinh vật thú y

- Các mẫu thu thập được ghi rõ số liệu

2.2.2 Các loại môi trường, hoá chất

- Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu, chúng tôi đã sử dụng các môi trường thông thường và một số loại thuốc thử do phòng vi trùng Trung tâm chẩn đoán thú y Trung Ương cung cấp

- Các môi trường đặc biệt để nuôi cấy phân lập, giám định vi khuẩn yếm khí có nguồn gốc trong nước hoặc ngoài nước do Trung tâm chẩn đoán thú y Trung Ương cung cấp

- Các môi trường sử dụng trong đề tài do hãng Oxoid của Anh, Diagnosis của Pháp

- Các loại giấy tẩm kháng sinh của hãng Oxoid của Anh sản xuất

- Các máy móc, dụng cụ và vật liệu cần thiết khác của Phòng vi trùng, Trung tâm chẩn đoán thú y Trung Ương

2.2.3 Động vật thí nghiệm

- Chuột bạch khoẻ mạnh, có trọng lượng trung bình từ 18-20g/con

2.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.3.1 Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn dưới 60 ngày tuổi tại tỉnh Thái Nguyên

2.3.1.1 Tình hình bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn tại một số điểm nghiêm cứu tại tỉnh Thái Nguyên

2.3.1.2 Kết quả điều tra tình hình bệnh VRHT tại tỉnh Thái Nguyên theo mùa vụ 2.3.1.3 Điều tra tình hình bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn tại tỉnh Thái Nguyên theo giai đoạn phát triển

2.3.1.4 Điều tra tình hình bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn tại tỉnh Thái Nguyên theo phương thức chăn nuôi

2.3.1.5 Triệu chứng lâm sàng ở lợn nghi mắc VRHT

2.3.1.6 Bệnh tích ở lợn chết do VRHT

2.3.2 Kết quả phân lập vi khuẩn Cl perfringens ở lợn

2.3.2.1 Xác định tỷ lệ mang trùng ở lợn

2.3.2.2 Phân lập vi khuẩn Cl perfringens ở các bệnh phẩm của lợn chết nghi

mắc bệnh viêm ruột hoại tử

2.3.2.3.Giám định đặc tính sinh hoá của vi khuẩn Cl perfringens phân lập được 2.3.2.4 Xác định số lượng vi khuẩn Cl perfringens trong phân lợn bệnh và

lợn bình thường

2.3.2.5 Xác định serotype vi khuẩn Cl perfringens bằng phản ứng PCR 2.3.2.6 Kiểm tra độc lực của vi khuẩn Cl perfringens phân lập được bằng

cách tiêm truyền động vật thí nghiệm

2.3.2.7 Xác định khả năng mẫn cảm với một số loại kháng sinh của vi khuẩn

Cl perfringens phân lập được

2.3.3 Thử nghiệm phác đồ phòng và điều trị bệnh viêm ruột hoại tử ở lợn dưới 60 ngày tuổi

2.3.3.1 Kết quả thử nghiệm vacxin phòng bệnh

2.3.3.2 Kết quả thử nghiệm một số phác đồ điều trị lợn mắc bệnh viêm ruột hoại tử cho lợn dưới 60 ngày tuổi

2.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.4.1 Phương pháp nghiên cứu dịch tễ

Sử dụng phương pháp nghiên cứu dịch tễ học mô tả (Descriptive study), dịch

tễ học phân tích (Analytic Study) và dịch tễ học thực nghiệm (Nguyễn Như Thanh (2001 [31])

2.4.2 Phương pháp thực hiện

- Trực tiếp quan sát để phát hiện lợn tiêu chảy nghi VRHT Những lợn phân lỏng được coi là bị tiêu chảy (loại trừ những lợn bị bệnh truyền nhiễm có triệu chứng tiêu chảy)

- Phỏng vấn chủ hộ chăn nuôi về những thông tin cần thiết