Phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật (biofilm) và bước đầu định hướng ứng dụng xử lý ô nhiễm nước thải

1.2. Khả năng tồn tại của màng sinh vật Màng sinh vật phát triển mạnh ở những nơi có nƣớc, chẳng hạn nhƣ trong nhà bếp, kính áp tròng và thậm chí trong cơ thể sinh vật. Khi hệ thống mạng lƣới sinh vật phát triển đầy đủ, có thể quan sát thấy bằng mắt thƣờng. 1.2.1. Trong môi trƣờng tự nhiên Trong các rừng mƣa nhiệt đới điều kiện độ ẩm cao là điều kiện thuận lợi cho sự phát triển phong phú của màng sinh vật nhƣ rêu và những cặn bám dƣới đáy ao Khóa luận tốt nghiệp Đoàn Diệu Linh 4 K53A Sinh học hồ, hay những mảng rêu địa y bám trên thân cây, hay những váng nổi trên bề mặt ao, hồ… (Hình 2A) Màng sinh vật còn có thể đƣợc tìm thấy ở sa mạc. Một trong những hình thức phổ biến của dạng màng sinh vật sa mạc đƣợc gọi là vec-ni sa mạc (varnish desert), một thuật ngữ mô tả hiện tƣợng những hòn đá vách núi có màng sinh vật phát triển xuất hiện những vết màu. Màng sinh vật cũng có thể đƣợc tìm thấy phát triển trong môi trƣờng cực trị nhƣ sông băng ở Nam Cực, hay các mạch suối nƣớc nóng… Đối với thực vật, một số loài thực vật cộng sinh với vi khuẩn có trong màng sinh vật bám ở rễ cây. Rễ cây tiết ra một lƣợng đáng kể các loại đƣờng, axit amin, vitamin… nhƣ là chất dinh dƣỡng cho các màng sinh vật. Ngƣợc lại, màng sinh vật tạo điều kiện thuận lợi cho khả năng hấp thụ chất dinh dƣỡng của thực vật [39]. 1.2.2. Trong các vật liệu, hệ thống Trong khi màng sinh vật đối với tự nhiên mang nhiều yếu tố tích cực thì đối với công nghiệp, màng sinh vật lại là nguyên nhân của nhiều vấn đề tiêu cực nhƣ sự ô nhiễm và tắc nghẽn màng sinh vật (biofouling) xảy ra gần nhƣ ở tất cả những khâu xử lý trong công nghiệp có liên quan đến việc sử dụng nƣớc nhƣ hoạt động làm mát, sản xuất bột giấy… Màng sinh vật là nguyên nhân gây ra hiện tƣợng tắc ống dẫn ăn mòn ống dẫn và làm ô nhiễm nguồn nƣớc. Trong các vật dụng hàng ngày cũng có sự xuất hiện của màng sinh vật. Những mảng bám trên vòi hoa sen, bồn rửa mặt, sự tắc nghẽn đƣờng ống nƣớc là những ví dụ cho sự có mặt của màng sinh vật (Hình 2B) [39]. 1.2.3. Trong y tế và cơ thể sinh vật Trên thực tế cơ thể con ngƣời và các sinh vật nói chung là nơi tồn tại của hệ thống rất đa dạng các loài vi sinh vật. Tuy nhiên đôi khi sự mất cân bằng về hệ vi sinh vật trong cơ thể là nguyên nhân gây ra các vấn đề về nhiễm trùng. Trong đó màng sinh vật là một trong số những nguyên nhân gây ra một số bệnh nhiễm trùng mãn tính viêm tai hay thƣờng gặp nhất là trên những mảng bám răng. Thậm chí bề mặt của những dụng cụ y tế đặt trong cơ thể nhƣ van tim niệu quản nhân tạo cũng có thể là nơi phát triển của biofilm (hình 2C) [38]. Khóa luận tốt nghiệp Đoàn Diệu Linh 5 K53A Sinh học A B C Hình 2. Một số vị trí tồn tại của màng sinh vật A: Màng sinh vật phát triển trên mặt hồ B: Màng sinh vật phát triển trong hệ thống ống dẫn C: Màng sinh vật phát triển trong một số bộ phận cơ thể ngƣời 1.3. Thành phần của màng sinh vật Mạng lƣới màng sinh vật nói chung bao gồm 97% nƣớc, 2-5% là các tế bào vi khuẩn, 3-6% các hợp chất ngoại bào và các ion [36]. 1.3.1. Thành phần các hợp chất ngoại bào (EPS) Việc hình thành các hợp chất ngoại bào là điều kiện tiên quyết cho sự hình thành màng sinh vật. Mạng lƣới ngoại bào (EPS) có độ dày từ 0 2 đến 1µm. Ở một vài loài vi khuẩn độ dày của lớp EPS mỏng hơn không vƣợt quá 10 đến 30nm. Ngoài những đặc tính cấu trúc, bảo vệ và thẩm thấu EPS còn là nơi dự trữ chất dinh dƣỡng cho tế bào phát triển trong điều kiện thiếu chất dinh dƣỡng [21] . Sự phân bố của EPS trong màng sinh vật thay đổi theo không gian và thời gian. Hàm lƣợng EPS tăng theo độ dày và độ già của màng sinh vật. Màng sinh vật mỏng có lƣợng EPS thấp và giàu protein. Thành phần EPS phong phú hơn khi vào sâu trong cấu trúc màng sinh vật. Hầu nhƣ lƣợng EPS đƣợc sản sinh trong màng sinh vật cũng có nhiều điểm khác so với các vi sinh vật phù du [19]. Thành phần EPS thay đổi theo thành phần vi sinh vật và điều kiện môi trƣờng hình thành nên màng sinh vật. EPS thông thƣờng bao gồm 40-95% polysaccharide, 1-60% protein, 1-10% axit nucleic và 1-40% lipid [12]. Khóa luận tốt nghiệp Đoàn Diệu Linh 6 K53A Sinh học Bảng 1. Vai trò của các thành phần trong EPS [13] Chức năng của hợp chất ngoại bào Thành phần của EPS Chức năng trong biofilm Cấu trúc Polysaccharide trung tính Cấu tạo nên biofilm Amyloid Kênh dẫn Polysaccharide tích điện hoặc kị nƣớc Kênh dẫn ion, kênh dẫn nƣớc Hoạt hóa Các enzym ngoại bào Phân hủy các hợp chất hữu cơ Hoạt hóa bề mặt Amphiphlic Tƣơng tác bề mặt Màng bao Xuất bào, kênh dẫn nƣớc Thông tin di truyền Lectin Đặc trƣng nhận dạng Axit nucleic Thông tin di truyền, cấu trúc Hoạt hóa quá trình oxi hóa khử Hợp chất hữu cơ chịu nhiệt của vi khuẩn Thu nhận electron Chất dinh dƣỡng Các loại polymer Nguồn cung cấp cacbon, nitơ, photpho 1.3.1.1. Vai trò của protein ngoại bào Nhìn chung, thành phần protein trong EPS là tƣơng đối lớn, song vai trò của chúng trong màng sinh vật chƣa đƣợc biết đến một cách rõ ràng. Đối với một số loại vi khuẩn protein đóng vai trò là pili roi curli và sợi amyloid đƣợc cho là yếu tố quan trọng cho sự hình thành màng sinh vật. Ngoài ra, những enzym ngoại bào, thông thƣờng là protease và glycosidase trong màng biofilm, đóng vai trò trao đổi chất [33]. 1.3.1.2. Vai trò của polysaccharide ngoại bào Polysaccharide là thành phần quan trọng để tạo nên cấu trúc hoàn chỉnh biofilm. Các polysaccharide có thể rất đa dạng về các đặc tính sinh lý, sinh hóa thông qua dạng liên kết glycoside giữa các phân tử (β-1 4 β-1 3 hay α-1 6) hay đơn vị monomer cấu tạo nên. Polysaccharide có thể là các đồng phân tử cấu tạo bởi một đơn phân monosacharide duy nhất nhƣ cellulose dextran hay dị phân tử cấu tạo bởi 2 đến 4 dạng đơn phân khác nhau nhƣ alginate emulsan gellan. Các Khóa luận tốt nghiệp Đoàn Diệu Linh 7 K53A Sinh học monosaccharide phổ biến trong biofilm là D-glucose, D-galactose, D-mannose, Lfucose nhóm axit uronic nhƣ axit D-glucuronic, axit D-galacturonic. Thành phần các đƣờng đơn có ảnh hƣởng đến đặc tính của polysaccharit và qua đó ảnh hƣởng đến tính chất của biofilm [7]. 1.3.2. Thành phần tế bào Cấu trúc màng sinh vật bao gồm thành phần tế bào liên kết với nhau một cách có trật tự đảm bảo cho sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào. Mạng lƣới chất ngoại bào quy định sự sắp xếp tế bào và tạo nên những kênh dẫn truyền nƣớc bên trong màng sinh vật. Chính nhờ cấu trúc này mà các chất dịch, nƣớc có thể lƣu thông qua màng sinh vật tạo điều kiện cho các chất dinh dƣỡng đƣợc khuếch tán, phân phối đến khắp các tế bào trong màng đồng thời loại đi những chất thải không cần thiết [23]. Màng sinh vật có thể đƣợc hình thành bởi tập hợp các tế bào của một hoặc nhiều loài vi sinh vật khác. Trong biofilm các tế bào tập hợp thành các đơn vị cấu trúc là các vi khuẩn lạc. Thành phần này đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành biofilm đặc biệt là ở giai đoạn đầu bởi nó qui định đặc tính hình thành biofilm cho từng loài vi sinh vật đảm nhiệm chức năng tiết các hợp chất ngoại bào cũng nhƣ có chứa các yếu tố phụ trợ tế bào nhƣ lông roi lông nhung hỗ trợ cho việc bám dính của các tế bào khác lên bề mặt giá thể. Giữa các tế bào trong hệ thống mạng lƣới màng sinh vật có các kênh dẫn, cho phép di truyền ngang các tính trạng mới trong quần thể sinh vật [6]. 1.4. Quá trình hình thành màng sinh vật Dựa trên các phƣơng pháp phân tích di truyền học, proteomics và sinh học phân tử, cùng với những phân tích về mặt cấu trúc, hóa học màng sinh vật, các nhà khoa học đã đƣa ra một mô hình cấu trúc màng sinh vật cơ bản [8]. Trong mô hình này, vi khuẩn hình thành nên các vi khuẩn lạc và đƣợc bao quanh bởi một mạng lƣới chất ngoại bào giúp các thành phần tế bào liên kết với nhau một cách có trật tự đảm bảo sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào đồng thời tạo nên những kênh dẫn truyền dịch ngoại bào bên trong màng sinh vật. Nhờ đó dịch tế bào có thể đi qua màng sinh vật tạo điều kiện cho việc khuếch tán, phân phối chất dinh dƣỡng đến khắp các tế bào trong màng cũng nhƣ loại bỏ các chất thải [34]. Sự tạo thành màng sinh vật cũng giống nhƣ một quá trình phát triển của vi sinh vật và cần phải trải qua một số bƣớc bao gồm: sự gắn kết của các tế bào vi Khóa luận tốt nghiệp Đoàn Diệu Linh 8 K53A Sinh học sinh vật trôi nổi tự do lên một bề mặt, sự tăng trƣởng và liên kết các tế bào thành vi khuẩn lạc, sự tạo thành màng sinh vật trƣởng thành (hoàn chỉnh), và cuối cùng là sự tách rời của các tế bào vi sinh vật thành dạng dịch lỏng tế bào (Hình 3). Hình 3. Các giai đoạn chính hình thành màng biofilm [11] 1.Giai đoạn gắn kết lên bề mặt, 2. Hình thành lớp tế bào trên bề mặt, 3. Hình thành mạng lƣới ngoại bào, 4. Hình thành biofilm hoàn chỉnh, 5. Quá trình tách rời Giai đoạn 1: Gắn kết thuận nghịch Các bề mặt trong môi trƣờng thủy sinh thƣờng đạt đƣợc điều kiện cho sự hấp thụ của các chất vô cơ và hữu cơ. Dƣới một số điều kiện nhất định và tùy thuộc đặc tính lý hóa, các vi khuẩn có thể di chuyển hƣớng đến bề mặt bởi chuyển động Brown hay hóa ứng động và hình thành mối tƣơng tác tạm thời với bề mặt thông qua các lực tƣơng tác yếu nhƣ lực Van der Waals, lực hút tình điện, liên kết hydro. Nhờ khả năng di chuyển độc lập bằng các cử động co rút tế bào hay sử dụng các tiêm mao, và khả năng tiết các chất ngoại bào giúp các tế bào riêng rẽ đƣợc bao bọc trong một mạng lƣới và bắt đầu sự hình thành màng sinh vật [30]. Tuy nhiên, các tế bào này chƣa hẳn đã đi vào quá trình hình thành màng sinh vật và có thể rời bề mặt để tiếp tục đời sống tự do riêng lẻ. Giai đoạn 2: Gắn kết không thuận nghịch Khóa luận tốt nghiệp Đoàn Diệu Linh 9 K53A Sinh học Sau khi gắn kết thuận nghịch ban đầu lên một bề mặt, vi sinh vật không những phải giữ liên kết với bề mặt giá thể mà còn phải tăng trƣởng để hình thành một màng sinh vật hoàn chỉnh. Vì vậy giai đoạn tiếp theo là sự sản xuất các chất ngoại bào nhằm làm tăng tính bám dính ổn định thông qua các cầu nối hữu cơ giữa tế bào và giá thể. Việc chuyển từ giai đoạn bám dính thuận nghịch sang giai đoạn bám dính không thuận nghịch đƣợc thực hiện nhờ lông roi, tiêm mao vào các sợi bám dính. Trong khi sự vận động thông qua trung gian lông roi đƣợc đánh giá là quan trọng trong bƣớc đầu thiết lập sự bám dính của vi sinh vật lên bề mặt thì vận động co rút đƣợc chỉ ra là cần thiết cho sự trƣởng thành của màng sinh vật trong điều kiện tĩnh. Cụ thể nhu động co rút giúp cho sự hình thành nên các vi khuẩn lạc trong màng sinh vật bằng cách tạo điều kiện thuận lợi cho tƣơng tác giữa các vi khuẩn với bề mặt để hình thành nên các nhóm tế bào qua đó giúp tăng cƣờng mức độ bám dính với bề mặt [30]. Giai đoạn 3: Hình thành mạng lƣới ngoại bào Các hợp chất polymer ngoại bào tiếp tục đƣợc tạo ra bởi các tế bào để liên kết các tế bào với nhau một cách có tổ chức đồng thời tạo thành cầu nối giữa các vi khuẩn lạc. Chúng cũng có vai trò trong việc thu hút các tế bào sống trôi nổi (có thể là từ nhiều loài khác nhau) trong môi trƣờng. Kết quả là mật độ tế bào trong một màng sinh vật cũng nhƣ lƣợng các polymer ngoại bào tạo ra tăng lên. Một mạng lƣới màng sinh vật dần đƣợc hình thành [34]. Giai đoạn 4: Hình thành một biofilm hoàn chỉnh Khi tế bào vi sinh vật bám dính không thuận nghịch lên bề mặt thì quá trình trƣởng thành của màng sinh vật bắt đầu. Trong suốt quá trình này, sự phân chia của các tế bào vi sinh vật bám dính không thuận nghịch là nguyên nhân giúp các tế bào phân chia để lan rộng và phát triển dần lên từ các điểm gắn kết để hình thành các vi khuẩn lạc hay các cụm tế bào. Từ một phạm vi ban đầu biofilm có thể mở rộng về không gian cũng nhƣ độ phức tạp tùy thuộc vào điều kiện môi trƣờng. Một biofilm hoàn chỉnh có cấu trúc giống nhƣ tháp hình nấm đƣợc bao quanh bởi các kênh vận chuyển nƣớc có tính thẩm thấu cao tạo điều kiện cho việc vận chuyển chất dinh dƣỡng và oxy vào bên trong biofillm cũng đƣợc quan sát. Các biofilm phát triển khá chậm thƣờng cần vài ngày để đạt đƣợc cấu trúc hoàn chỉnh. Một biofilm trƣởng thành đƣợc coi nhƣ một tổ chức tiên tiến luôn có sự thích nghi liên tục với môi Khóa luận tốt nghiệp Đoàn Diệu Linh 10 K53A Sinh học trƣờng bao quanh điều này cũng có nghĩa là khi điều kiện môi trƣờng bất lợi vi khuẩn có thể tách rời khỏi biofilm để tìm một môi trƣờng mới phù hợp hơn [18]. Giai đoạn 5: Tách rời Khả năng phát triển của màng sinh vật giới hạn trong điều kiện dinh dƣỡng của môi trƣờng nuôi cấy và biểu hiện của các phân tử cảm ứng mật độ tế bào. Các phân tử này đƣợc giải phóng ra nhằm đáp ứng với những hạn chế về dinh dƣỡng, sự tích tụ các sản phẩm độc hại và một số nhân tố khác, bao gồm các yếu tố pH, nguồn cung cấp cacbon, oxy. Trong một số trƣờng hợp, khi màng sinh vật đạt đến khối lƣợng và một mức cân bằng động tối đa thì các tế bào trong đó sẽ tự tách rời và cùng với các tế bào của một màng khác hình thành nên các vi khuẩn lạc [29].

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Nguyễn Quang Huy, người thầy đã trực tiếp hướng dẫn em rất tận tình trong quá trình thực hiện đề tài, giúp em vượt qua khó khăn và hoàn thành tốt khóa luận này

Em cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô giáo trong Khoa Sinh học, trường Đại Học Khoa học Tự nhiên đã nhiệt tình giảng dạy, hướng dẫn và cung cấp cho em những kiến thức bổ ích trong suốt bốn năm học vừa qua và giúp

đỡ em rất nhiều trong việc nắm bắt kiến thức cũng như động viên em rất lớn về mặt tinh thần

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến TS Phạm Bảo Yên cùng các anh chị, các bạn, các em thuộc phòng Enzyme học và phân tích hoạt tính sinh học - Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Protein và Enzyme và phòng thí nghiệm bộ môn Sinh

lý thực vật và Hóa sinh đã luôn chia sẻ, giúp đỡ và tạo điều kiện rất lớn để em có thể thực hiện được đề tài khóa luận này

Khóa luận được thực hiện có sự hỗ trợ kinh phí của đề tài cấp Đại học Quốc gia Hà Nội mã số QG11-16 và đề tài Nghiên cứu phát triển công nghệ màng sinh học trong xử lý nước thải giàu nitơ, photpho của Bộ Công thương Nhân dịp này em xin cảm ơn sự hỗ trợ của các đơn vị tài trợ

Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã luôn ở bên, động viên, giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập và thực hiện khóa luận, giúp em trưởng thành hơn khi sắp bước đi trên những con đường mới

Hà Nội, ngày 28 tháng 5 năm 2012

Sinh viên

Đoàn Diệu Linh

BẢNG MỘT SỐ KÍ HIỆU VIẾT TẮT

EPS Hợp chất ngoại bào (Extracellular Polymeric Substances)

OD Mật độ quang học (Optical Density)

PNPG 4-nitrophenyl-βD-Galactopyranoside

w/v Khối lƣợng (g)/thể tích (ml)

MỤC LỤC

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ BIOFILM 2

1.1 Giới thiệu về Biofilm 2

1.2 Khả năng tồn tại của màng sinh vật 3

1.2.1 Trong môi trường tự nhiên 3

1.2.2 Trong các vật liệu, hệ thống 4

1.2.3 Trong y tế và cơ thể sinh vật 4

1.3 Thành phần của màng sinh vật 5

1.3.1 Thành phần các hợp chất ngoại bào (EPS) 5

1.3.2 Thành phần tế bào 7

1.4 Quá trình hình thành màng sinh vật 7

1.5 Vai trò của màng sinh vật đối với vi sinh vật 10

1.5.1 Bảo vệ tế bào trước những điều kiện bất lợi của môi trường 10

1.5.2 Mối quan hệ hợp tác giữa các loài 10

1.6 Ứng dụng của màng sinh vật 11

1.6.1 Ứng dụng trong phòng trừ bệnh hại ở cây trồng 11

1.6.2 Ứng dụng trong xử lý nước thải 11

1.7 Vấn đề xử lý nước thải 12

1.7.1 Quá trình nitrate hóa 13

1.7.2 Quá trình phản nitrate hóa 13

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 15

2.1 Chủng vi sinh vật nghiên cứu 15

2.2 Hóa chất, thiết bị 15

2.2.1 Môi trường nuôi cấy 15

2.2.2 Thuốc thử 16

2.2.3 Máy móc, thiết bị 17

2.3 Phương pháp nghiên cứu 18

2.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn 18

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu đánh giá khả năng tạo màng sinh vật của các chủng vi sinh vật 18

2.3.3 Tối ưu hóa các điều kiện của môi trường 19

2.3.4 Khả năng đồng hóa các hợp chất hữu cơ 19

2.3.5 Phương pháp nhuộm Gram nhận dạng chủng nghiên cứu 20

2.3.6 Quan sát cấu trúc màng sinh vật bằng kỹ thuật ảnh chụp trên kính hiển vi điện tử quét 21

2.3.7 Phương pháp đo phân tích hàm lượng nitrate N-NO3 - -.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.-.- 21

2.3.8 Phương pháp đo phân tích hàm lượng nitrite N-NO2- 22

2.3.9 Phương pháp đo phân tích hàm lượng nitrite N-NH4+ 22

2.3.10 Phương pháp thống kê sinh học 23

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24

3.1 Kết quả phân lập các chủng vi sinh vật có khả năng tạo biofilm 24

3.2 Đánh giá khả năng hình thành biofilm 25

3.2.1 Chủng vi sinh vật phân lập trên môi trường Winogradsky 1 25

3.2.2 Chủng vi sinh vật phân lập trên môi trường Winogradsky 2 27

3.3 Ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng hình thành màng sinh vật của một số chủng vi khuẩn phân lập 28

3.3.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ 28

3.3.2 Ảnh hưởng của độ pH 28

3.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl 29

3.4 Cấu trúc màng sinh vật 30

3.4.1 Hình thái vi khuẩn phân lập 30

3.4.2 Hình thái màng sinh vật 31

3.4.3 Cấu trúc hiển vi của màng biofilm nổi 32

3.5 Khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ 33

3.6 Hoạt tính chuyển hóa nitơ 34

3.6.1 Khả năng chuyển hóa phân giải amoni 34

3.6.2 Khả năng chuyển hóa nitrite thành nitrate 35

KẾT LUẬN 37

KIẾN NGHỊ 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

MỞ ĐẦU

Hiện nay vấn đề ô nhiễm môi trường đặc biệt là ô nhiễm nước thải đang ngày càng gia tăng gây ảnh hưởng đến sức khỏe của con người và môi trường sinh thái Nước thải có hàm lượng nitơ cao quá mức cho phép khi được thải ra sông, hồ,

sẽ gây ra hiện tượng phú dưỡng làm nước có màu và mùi khó chịu đặc biệt là lượng ôxy hòa tan trong nước giảm mạnh gây ảnh hưởng đến hệ sinh thái thủy sinh

Những nghiên cứu về vi sinh vật học ngày nay đóng một vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực từ công nghiệp, nông nghiệp, y học và đặc biệt là trong vấn đề

xử lý ô nhiễm môi trường Việc áp dụng các phương pháp sinh học để xử lý nước thải hiện nay đang được quan tâm đặc biệt là phương pháp sử dụng vi sinh vật, chủ yếu là vi khuẩn để phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ Trong phần lớn những nghiên cứu trong phòng thí nghiệm, các vi sinh vật thường được xem xét đánh giá dưới góc độ là những tế bào đơn lẻ Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng hầu hết các tế bào vi sinh vật thường liên kết với nhau tạo thành một cộng đồng và bám dính trên các bề mặt giá thể thông qua mạng lưới các hợp chất ngoại bào, hình thành nên cấu trúc gọi là màng sinh vật (biofilm)

Biofilm là một dang cấu trúc sống tồn tại khá phổ biến trong tự nhiên Chúng được hình thành khi các tế bào tiết ra các polymer ngoại bào tạo điều kiện thuận lợi cho việc bám dính, hình thành mạng lưới Cấu trúc biofilm giúp cho vi sinh vật tồn tại và chống chịu được trong những điều kiện bất lợi của môi trường đồng thời thông qua mối quan hệ hợp tác giữa các loài khác nhau trong hệ thống màng sinh vật, các vi sinh vật có thể tận dụng được nguồn dinh dưỡng

Nghiên cứu về màng sinh vật giúp chúng ta có cái nhìn mới về mối tương tác của vi sinh vật trong điều kiện tự nhiên Những phát hiện nghiên cứu mới giúp chúng ta kiểm soát được sự phát triển của vi sinh vật, từ đó ứng dụng vào nhiều ngành công nghiệp khác nhau trong đó có xử lý ô nhiễm môi trường Xuất phát từ

thực tiễn trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh

vật có khả năng tạo màng sinh vật (biofilm) và bước đầu định hướng ứng dụng

xử lý ô nhiễm nước thải”

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ BIOFILM 1.1 Giới thiệu về Biofilm

Vi sinh vật là những cấu trúc vô cùng nhỏ bé mà ta không thể quan sát thấy bằng mắt thường Chúng phân bố ở khắp mọi nơi trong đất trong nước, trong không khí Sự phân bố của chúng tùy thuộc vào các yếu tố đặc trưng của môi trường Chúng tham gia vào việc chuyển hóa vật chất như các chu trình chuyển hóa các hợp chất cacbon nitơ và các chất khoáng khác Mối quan hệ giữa các nhóm vi sinh vật với nhau cũng rất phức tạp cũng có các quan hệ ký sinh, cộng sinh, hỗ sinh, kháng sinh Trong quá trình sống, gặp những môi trường khác nhau, các chủng

vi sinh vật này có những biến đổi thích nghi để phù hợp với điều kiện sống [3]

Vi sinh vật tồn tại dưới hai hình thức chủ yếu là dạng tế bào sinh vật phù du trôi nổi tự do và dạng liên kết với nhau trên bề mặt giá thể tạo thành cấu trúc màng

sinh vật (biofilm) Nghiên cứu vi sinh vật học trong lịch sử có truyền thống tập

trung vào các kết quả nghiên cứu thực nghiệm về vi sinh vật trôi nổi tự do trong môi trường chất lỏng Tuy nhiên, các nghiên cứu ngày nay cho thấy rằng phần lớn các tế bào vi sinh vật tồn tại trong một cộng đồng không gian riêng biệt được gọi là biofilm Trên thực tế có đến 99% vi khuẩn sống trong màng biofilm, và chỉ có 1% sống trong trạng thái phù du, tự do [10, 32]

Hình 1 Màng biofilm của Bacillus subtilis dưới kính hiển vi điện tử quét [25]

Trong lịch sử nghiên cứu vi sinh vật, Leeuwenhoek là người đầu tiên quan sát các chủng vi khuẩn qua kính hiển vi vào năm 1684 [24] Với việc tự chế ra rất nhiều kính hiển vi, Leeuwenhoek đã phát hiện ra những dạng sinh vật sống mà ông gọi chúng là “những động vật vô cùng nhỏ bé” Ông là người đã phát hiện ra hiện tượng bám dính và phát triển phổ biến của vi khuẩn trong các mảng bám răng một

dạng của màng biofilm [1] Đến những năm 1940, những nghiên cứu đầu tiên về sự phát triển của vi sinh vật thành các lớp được thực hiện, khi Zobell mô tả những đặc điểm cơ bản về sự gắn kết quần thể vi sinh vật Ban đầu, màng sinh vật được cho là một hệ thống đồng nhất các tế bào bám dính trong lớp chất nhờn Tuy nhiên, những nghiên cứu sau này cho thấy màng sinh vật thường là tập hợp nhiều các loài vi khuẩn tạo thành quần thể phức tạp riêng biệt có khả năng phát triển các cấu trúc phức tạp [35] Trong suốt những năm 1960 đến 1970 đã có rất nhiều nghiên cứu về

sự phát triển màng sinh vật, tuy nhiên thuật ngữ màng sinh vật (biofilm) chỉ mới được công nhận từ năm 1984 [7]

Có rất nhiều định nghĩa khác nhau về màng sinh vật đã được đề xuất trong những năm qua Theo bách khoa toàn thư Wikipedia màng sinh vật được định nghĩa là: “một cấu trúc tập hợp của vi sinh vật được bao quanh bởi mạng lưới ngoại bào do chính nó tạo ra và được gắn kết trên bề mặt trên bề mặt hữu sinh hoặc vô sinh” [40] Nhìn chung, màng sinh vật là một quần thể sinh vật có cấu trúc phức tạp liên kết với nhau bởi một hệ thống mạng lưới ngoại bào Mạng lưới này có chứa các polysaccharide ngoại bào, protein và ADN có nguồn gốc từ vi sinh vật Giữa các cấu trúc của chúng có các kênh dẫn chất lỏng cho phép các tế bào tương tác với nhau và hợp tác trao đổi chất Màng sinh vật có thể được hình thành do một loài vi sinh vật song đa số màng sinh vật là sự cộng sinh của nhiều loài vi sinh vật khác nhau [9]

Sự hình thành màng sinh vật được coi là một trong số những cơ chế tồn tại của vi sinh vật, tại đó vi khuẩn tận dụng được các nguồn dinh dưỡng và nhận được

sự bảo vệ trong các điều kiện bất lợi như khô hạn, bức xạ cực tím hoặc những chất độc hại Mặt khác có thể coi hệ thống màng sinh vật là một mạng lưới nhiều gen, tại

đó các vật liệu di truyền có thể dễ dàng được trao đổi qua lại giữa các tế bào vi sinh vật [32]

1.2 Khả năng tồn tại của màng sinh vật

Màng sinh vật phát triển mạnh ở những nơi có nước, chẳng hạn như trong nhà bếp, kính áp tròng và thậm chí trong cơ thể sinh vật Khi hệ thống mạng lưới sinh vật phát triển đầy đủ, có thể quan sát thấy bằng mắt thường

1.2.1 Trong môi trường tự nhiên

Trong các rừng mưa nhiệt đới điều kiện độ ẩm cao là điều kiện thuận lợi cho

sự phát triển phong phú của màng sinh vật như rêu và những cặn bám dưới đáy ao

hồ, hay những mảng rêu địa y bám trên thân cây, hay những váng nổi trên bề mặt

ao, hồ… (Hình 2A)

Màng sinh vật còn có thể được tìm thấy ở sa mạc Một trong những hình thức phổ biến của dạng màng sinh vật sa mạc được gọi là vec-ni sa mạc (varnish desert), một thuật ngữ mô tả hiện tượng những hòn đá vách núi có màng sinh vật phát triển xuất hiện những vết màu

Màng sinh vật cũng có thể được tìm thấy phát triển trong môi trường cực trị như sông băng ở Nam Cực, hay các mạch suối nước nóng…

Đối với thực vật, một số loài thực vật cộng sinh với vi khuẩn có trong màng sinh vật bám ở rễ cây Rễ cây tiết ra một lượng đáng kể các loại đường, axit amin, vitamin… như là chất dinh dưỡng cho các màng sinh vật Ngược lại, màng sinh vật tạo điều kiện thuận lợi cho khả năng hấp thụ chất dinh dưỡng của thực vật [39]

Trong các vật dụng hàng ngày cũng có sự xuất hiện của màng sinh vật Những mảng bám trên vòi hoa sen, bồn rửa mặt, sự tắc nghẽn đường ống nước là những ví dụ cho sự có mặt của màng sinh vật (Hình 2B) [39]

1.2.3 Trong y tế và cơ thể sinh vật

Trên thực tế cơ thể con người và các sinh vật nói chung là nơi tồn tại của hệ thống rất đa dạng các loài vi sinh vật Tuy nhiên đôi khi sự mất cân bằng về hệ vi sinh vật trong cơ thể là nguyên nhân gây ra các vấn đề về nhiễm trùng Trong đó màng sinh vật là một trong số những nguyên nhân gây ra một số bệnh nhiễm trùng mãn tính viêm tai hay thường gặp nhất là trên những mảng bám răng Thậm chí bề mặt của những dụng cụ y tế đặt trong cơ thể như van tim niệu quản nhân tạo cũng

có thể là nơi phát triển của biofilm (hình 2C) [38]

A B C

Hình 2 Một số vị trí tồn tại của màng sinh vật

A: Màng sinh vật phát triển trên mặt hồ B: Màng sinh vật phát triển trong hệ thống ống dẫn C: Màng sinh vật phát triển trong một số bộ phận cơ thể người

1.3 Thành phần của màng sinh vật

Mạng lưới màng sinh vật nói chung bao gồm 97% nước, 2-5% là các tế bào

vi khuẩn, 3-6% các hợp chất ngoại bào và các ion [36]

1.3.1 Thành phần các hợp chất ngoại bào (EPS)

Việc hình thành các hợp chất ngoại bào là điều kiện tiên quyết cho sự hình thành màng sinh vật Mạng lưới ngoại bào (EPS) có độ dày từ 0 2 đến 1µm Ở một vài loài vi khuẩn độ dày của lớp EPS mỏng hơn không vượt quá 10 đến 30nm Ngoài những đặc tính cấu trúc, bảo vệ và thẩm thấu EPS còn là nơi dự trữ chất dinh dưỡng cho tế bào phát triển trong điều kiện thiếu chất dinh dưỡng [21]

Sự phân bố của EPS trong màng sinh vật thay đổi theo không gian và thời gian Hàm lượng EPS tăng theo độ dày và độ già của màng sinh vật Màng sinh vật mỏng có lượng EPS thấp và giàu protein Thành phần EPS phong phú hơn khi vào sâu trong cấu trúc màng sinh vật Hầu như lượng EPS được sản sinh trong màng sinh vật cũng có nhiều điểm khác so với các vi sinh vật phù du [19] Thành phần EPS thay đổi theo thành phần vi sinh vật và điều kiện môi trường hình thành nên màng sinh vật EPS thông thường bao gồm 40-95% polysaccharide, 1-60% protein, 1-10% axit nucleic và 1-40% lipid [12]

Bảng 1 Vai trò của các thành phần trong EPS [13]

Kênh dẫn Polysaccharide tích điện

hoặc kị nước Kênh dẫn ion, kênh dẫn nước Hoạt hóa Các enzym ngoại bào Phân hủy các hợp chất hữu cơ

Hoạt hóa bề mặt

Màng bao Xuất bào, kênh dẫn nước

Thông tin di truyền

1.3.1.1 Vai trò của protein ngoại bào

Nhìn chung, thành phần protein trong EPS là tương đối lớn, song vai trò của chúng trong màng sinh vật chưa được biết đến một cách rõ ràng Đối với một số loại vi khuẩn protein đóng vai trò là pili roi curli và sợi amyloid được cho là yếu

tố quan trọng cho sự hình thành màng sinh vật Ngoài ra, những enzym ngoại bào, thông thường là protease và glycosidase trong màng biofilm, đóng vai trò trao đổi chất [33]

1.3.1.2 Vai trò của polysaccharide ngoại bào

Polysaccharide là thành phần quan trọng để tạo nên cấu trúc hoàn chỉnh biofilm Các polysaccharide có thể rất đa dạng về các đặc tính sinh lý, sinh hóa thông qua dạng liên kết glycoside giữa các phân tử (β-1 4 β-1 3 hay α-1 6) hay đơn

vị monomer cấu tạo nên Polysaccharide có thể là các đồng phân tử cấu tạo bởi một đơn phân monosacharide duy nhất như cellulose dextran hay dị phân tử cấu tạo bởi

2 đến 4 dạng đơn phân khác nhau như alginate emulsan gellan Các

monosaccharide phổ biến trong biofilm là D-glucose, D-galactose, D-mannose, fucose nhóm axit uronic như axit D-glucuronic, axit D-galacturonic Thành phần các đường đơn có ảnh hưởng đến đặc tính của polysaccharit và qua đó ảnh hưởng đến tính chất của biofilm [7]

L-1.3.2 Thành phần tế bào

Cấu trúc màng sinh vật bao gồm thành phần tế bào liên kết với nhau một cách có trật tự đảm bảo cho sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào Mạng lưới chất ngoại bào quy định sự sắp xếp tế bào và tạo nên những kênh dẫn truyền nước bên trong màng sinh vật Chính nhờ cấu trúc này mà các chất dịch, nước có thể lưu thông qua màng sinh vật tạo điều kiện cho các chất dinh dưỡng được khuếch tán, phân phối đến khắp các tế bào trong màng đồng thời loại đi những chất thải không cần thiết [23]

Màng sinh vật có thể được hình thành bởi tập hợp các tế bào của một hoặc nhiều loài vi sinh vật khác Trong biofilm các tế bào tập hợp thành các đơn vị cấu trúc là các vi khuẩn lạc Thành phần này đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành biofilm đặc biệt là ở giai đoạn đầu bởi nó qui định đặc tính hình thành biofilm cho từng loài vi sinh vật đảm nhiệm chức năng tiết các hợp chất ngoại bào cũng như có chứa các yếu tố phụ trợ tế bào như lông roi lông nhung hỗ trợ cho việc bám dính của các tế bào khác lên bề mặt giá thể Giữa các tế bào trong hệ thống mạng lưới màng sinh vật có các kênh dẫn, cho phép di truyền ngang các tính trạng mới trong quần thể sinh vật [6]

1.4 Quá trình hình thành màng sinh vật

Dựa trên các phương pháp phân tích di truyền học, proteomics và sinh học phân tử, cùng với những phân tích về mặt cấu trúc, hóa học màng sinh vật, các nhà khoa học đã đưa ra một mô hình cấu trúc màng sinh vật cơ bản [8] Trong mô hình này, vi khuẩn hình thành nên các vi khuẩn lạc và được bao quanh bởi một mạng lưới chất ngoại bào giúp các thành phần tế bào liên kết với nhau một cách có trật tự đảm bảo sự trao đổi thông tin liên tục diễn ra giữa các tế bào đồng thời tạo nên những kênh dẫn truyền dịch ngoại bào bên trong màng sinh vật Nhờ đó dịch tế bào

có thể đi qua màng sinh vật tạo điều kiện cho việc khuếch tán, phân phối chất dinh dưỡng đến khắp các tế bào trong màng cũng như loại bỏ các chất thải [34]

Sự tạo thành màng sinh vật cũng giống như một quá trình phát triển của vi sinh vật và cần phải trải qua một số bước bao gồm: sự gắn kết của các tế bào vi

sinh vật trôi nổi tự do lên một bề mặt, sự tăng trưởng và liên kết các tế bào thành vi khuẩn lạc, sự tạo thành màng sinh vật trưởng thành (hoàn chỉnh), và cuối cùng là sự tách rời của các tế bào vi sinh vật thành dạng dịch lỏng tế bào (Hình 3)

Hình 3 Các giai đoạn chính hình thành màng biofilm [11]

1.Giai đoạn gắn kết lên bề mặt, 2 Hình thành lớp tế bào trên bề mặt, 3 Hình thành mạng lưới ngoại bào, 4 Hình thành biofilm hoàn chỉnh, 5 Quá trình tách rời

Giai đoạn 1: Gắn kết thuận nghịch

Các bề mặt trong môi trường thủy sinh thường đạt được điều kiện cho sự hấp thụ của các chất vô cơ và hữu cơ Dưới một số điều kiện nhất định và tùy thuộc đặc tính lý hóa, các vi khuẩn có thể di chuyển hướng đến bề mặt bởi chuyển động Brown hay hóa ứng động và hình thành mối tương tác tạm thời với bề mặt thông qua các lực tương tác yếu như lực Van der Waals, lực hút tình điện, liên kết hydro Nhờ khả năng di chuyển độc lập bằng các cử động co rút tế bào hay sử dụng các tiêm mao, và khả năng tiết các chất ngoại bào giúp các tế bào riêng rẽ được bao bọc trong một mạng lưới và bắt đầu sự hình thành màng sinh vật [30]

Tuy nhiên, các tế bào này chưa hẳn đã đi vào quá trình hình thành màng sinh vật và có thể rời bề mặt để tiếp tục đời sống tự do riêng lẻ

Giai đoạn 2: Gắn kết không thuận nghịch

Sau khi gắn kết thuận nghịch ban đầu lên một bề mặt, vi sinh vật không những phải giữ liên kết với bề mặt giá thể mà còn phải tăng trưởng để hình thành một màng sinh vật hoàn chỉnh Vì vậy giai đoạn tiếp theo là sự sản xuất các chất ngoại bào nhằm làm tăng tính bám dính ổn định thông qua các cầu nối hữu cơ giữa

tế bào và giá thể Việc chuyển từ giai đoạn bám dính thuận nghịch sang giai đoạn bám dính không thuận nghịch được thực hiện nhờ lông roi, tiêm mao vào các sợi bám dính Trong khi sự vận động thông qua trung gian lông roi được đánh giá là quan trọng trong bước đầu thiết lập sự bám dính của vi sinh vật lên bề mặt thì vận động co rút được chỉ ra là cần thiết cho sự trưởng thành của màng sinh vật trong điều kiện tĩnh

Cụ thể nhu động co rút giúp cho sự hình thành nên các vi khuẩn lạc trong màng sinh vật bằng cách tạo điều kiện thuận lợi cho tương tác giữa các vi khuẩn với

bề mặt để hình thành nên các nhóm tế bào qua đó giúp tăng cường mức độ bám dính với bề mặt [30]

Giai đoạn 3: Hình thành mạng lưới ngoại bào

Các hợp chất polymer ngoại bào tiếp tục được tạo ra bởi các tế bào để liên kết các tế bào với nhau một cách có tổ chức đồng thời tạo thành cầu nối giữa các vi khuẩn lạc Chúng cũng có vai trò trong việc thu hút các tế bào sống trôi nổi (có thể

là từ nhiều loài khác nhau) trong môi trường Kết quả là mật độ tế bào trong một màng sinh vật cũng như lượng các polymer ngoại bào tạo ra tăng lên Một mạng lưới màng sinh vật dần được hình thành [34]

Giai đoạn 4: Hình thành một biofilm hoàn chỉnh

Khi tế bào vi sinh vật bám dính không thuận nghịch lên bề mặt thì quá trình trưởng thành của màng sinh vật bắt đầu Trong suốt quá trình này, sự phân chia của các tế bào vi sinh vật bám dính không thuận nghịch là nguyên nhân giúp các tế bào phân chia để lan rộng và phát triển dần lên từ các điểm gắn kết để hình thành các vi khuẩn lạc hay các cụm tế bào Từ một phạm vi ban đầu biofilm có thể mở rộng về không gian cũng như độ phức tạp tùy thuộc vào điều kiện môi trường Một biofilm hoàn chỉnh có cấu trúc giống như tháp hình nấm được bao quanh bởi các kênh vận chuyển nước có tính thẩm thấu cao tạo điều kiện cho việc vận chuyển chất dinh dưỡng và oxy vào bên trong biofillm cũng được quan sát Các biofilm phát triển khá chậm thường cần vài ngày để đạt được cấu trúc hoàn chỉnh Một biofilm trưởng thành được coi như một tổ chức tiên tiến luôn có sự thích nghi liên tục với môi

trường bao quanh điều này cũng có nghĩa là khi điều kiện môi trường bất lợi vi khuẩn có thể tách rời khỏi biofilm để tìm một môi trường mới phù hợp hơn [18]

Giai đoạn 5: Tách rời

Khả năng phát triển của màng sinh vật giới hạn trong điều kiện dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy và biểu hiện của các phân tử cảm ứng mật độ tế bào Các phân tử này được giải phóng ra nhằm đáp ứng với những hạn chế về dinh dưỡng,

sự tích tụ các sản phẩm độc hại và một số nhân tố khác, bao gồm các yếu tố pH, nguồn cung cấp cacbon, oxy Trong một số trường hợp, khi màng sinh vật đạt đến khối lượng và một mức cân bằng động tối đa thì các tế bào trong đó sẽ tự tách rời và cùng với các tế bào của một màng khác hình thành nên các vi khuẩn lạc [29]

1.5 Vai trò của màng sinh vật đối với vi sinh vật

1.5.1 Bảo vệ tế bào trước những điều kiện bất lợi của môi trường

Mạng lưới ngoại bào của màng sinh vật là nơi khu trú cho các vi khuẩn tồn tại Mạng lưới ngoại bào đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc và chức năng của các màng sinh vật Chất nền ngoại bào này cũng có khả năng ngăn chặn sự xâm nhập của các tác nhân kháng khuẩn vào trong màng nhờ hoạt tính trao đổi anion đồng thời làm hạn chế sự khuếch tán của một số hợp chất từ môi trường xung quanh vào bên trong màng sinh vật

Mạng lưới chất ngoại bào cũng được ghi nhận là có khả năng giúp tế bào chống lại tác động của một số kim loại nặng, các cation và chất độc; đồng thời bảo

vệ tế bào tránh khỏi nhiều yếu tố stress từ môi trường như sự thay đổi độ pH, bức xạ tia cực tím, áp suất thẩm thấu và sự khô hạn Thành phần chính của màng sinh vật chiếm tới 97% là nước Khả năng giữ nước cao của mạng lưới ngoại bào thông qua các liên kết hydro trong cấu trúc màng giúp bảo vệ màng chống lại sự khô hạn trong môi trường tự nhiên [20]

1.5.2 Mối quan hệ hợp tác giữa các loài

Màng sinh vật được hình thành nhờ sự hợp tác cùng chung sống của nhiều loài vi sinh vật tạo nên một quần xã vi sinh vật phức tạp Khả năng tồn tại với những điều kiện dinh dưỡng khác nhau giúp các loài vi sinh vật tận dụng được tối

đa nguồn dinh dưỡng trong môi trường cũng như hỗ trợ nhau theo hướng cùng có lợi trong chu trình chuyển hóa vật chất Các loài vi sinh vật cũng có thể phối hợp các cơ chế trao đổi chất để cùng phân giải một hợp chất hữu cơ thúc đẩy quá trình tuần hoàn các nguyên tố trong tự nhiên

Môi trường nội bào trong cấu trúc màng sinh vật cung cấp phương tiện trao đổi dinh dưỡng và chuyển hóa chất hiệu quả thông qua các pha dung dịch lớn tăng cường khả năng hấp thụ dinh dưỡng cũng như loại bỏ những sản phẩm trao đổi chất

có nguy cơ độc hại Màng sinh vật cung cấp một môi trường lý tưởng cho sự thiết lập mối quan hệ hợp dưỡng giữa các loài vi sinh vật [14]

Các vi khuẩn tồn tại trong màng sinh vật, liên kết với nhau qua mạng lưới chất ngoại bào, sẽ có hiện tượng trao đổi gen từ tế bào này sang tế bào khác, giúp cộng đồng vi sinh vật trong mạng lưới tiếp nhận được vật liệu di truyền mới đẩy mạnh sự tiến hóa và đa dạng di truyền trong cộng đồng các vi sinh vật [20]

1.6 Ứng dụng của màng sinh vật

1.6.1 Ứng dụng trong phòng trừ bệnh hại ở cây trồng

Trong một vài năm gần đây hướng nghiên cứu sử dụng các chủng vi khuẩn

có khả năng hình thành màng sinh vật làm tác nhân phòng trừ bệnh hại cây trồng cũng đã được lưu tâm Bais và cộng sự cũng đã ghi nhận quá trình ức chế

P.syringae bởi chủng Bacillus subtilis 6051 có liên quan đến việc hình thành chất

hoạt động bề mặt surfactin tại vùng rễ cây [16] Theo một công trình khác của

Haggag công bố năm 2007 đã phân lập được 2 chủng Paenibacillus polymyxa có khả năng đối kháng với Aspergillus niger gây bệnh thối rễ ở đậu trên mô hình cây

trồng và chứng minh cơ chế đối kháng này có liên quan đến sự hình thành biofilm trên bề mặt rễ cây bằng phương pháp chụp ảnh hiển vi điện tử quét [37]

1.6.2 Ứng dụng trong xử lý nước thải

Trong cấu trúc màng sinh vật, các vi sinh vật liên kết với nhau chặt chẽ, tạo

ra một cấu trúc bền vững, hoạt động có hiệu quả hơn trong việc xử lý nước thải Trong mạng lưới màng sinh vật thường sản phẩm của chủng này lại là cơ chất cho một chủng khác cũng giúp cho quá trình phân hủy các chất diễn ra hiệu quả hơn

So sánh với việc sử dụng các chủng vi sinh vật trôi nổi để xử lý nước thải thì công nghệ xử lý sinh học nước thải bằng màng sinh vật mang lại nhiều lợi ích đáng

kể Một là, mật độ các chủng vi sinh vật trong màng sinh vật cao hơn nhiều, tạo điều kiện xử lý tối đa nguồn nước thải Hai là, ngoài việc loại bỏ các chất không mong muốn trong nước thải thì quá trình tiếp theo là loại bỏ các vi sinh vật này khỏi môi trường Đối với các tế bào trôi nổi, việc khử trùng nguồn nước sẽ tốn một chi phí lớn, do vậy việc áp dụng màng sinh vật trên các giá thể cố định thể hiện ưu thế

lớn Với những ưu điểm này, các nhà khoa học đã đề xuất công nghệ xử lý nước thải ứng dụng màng sinh vật được xem là giải pháp thân thiện môi trường [22]

1.7 Vấn đề xử lý nước thải

Ngày nay, vấn đề ô nhiễm nước thải là một vấn đề lớn trong bối cảnh toàn cầu như là một hệ quả của tiến trình công nghiệp hóa đô thị hóa, kết hợp với sự tăng trưởng dân số và sự thay đổi về lối sống Việc xử lý nước thải môi trường trong tình hình thực tiễn hiện nay là một vấn đề mang tính thời sự cấp thiết Bởi lẽ

xử lý nước thải không chỉ nhằm mục đích cải thiện điều kiện vệ sinh môi trường sống của con người mà còn nhằm duy trì cân bằng sinh thái, tạo điều kiện phát triển bền vững lâu dài cho loài người

Đặc trưng của nước thải sinh hoạt là hàm lượng chất hữu cơ lớn, chứa nhiều

vi sinh vật trong đó có các vi sinh vật gây bệnh Khi xây dựng các công trình xử lý nước thải phải đạt được các yêu cầu về chất lượng nguồn nước xả ra Một trong những chỉ tiêu cần đạt được là hàm lượng nitơ trong nước thải Hàm lượng nitơ trong nước thải cao làm ảnh hưởng đến sức khỏe con người đến môi trường và các quá trình xử lý khác trong trạm xử lý nước thải

Có nhiều nguồn nitơ (từ tự nhiên và từ hoạt động của con người) có thể dẫn dến ô nhiễm Tuy nhiên, một trong số những nguồn ô nhiễm nitơ tiềm năng liên quan đến cách hoạt động nông nghiệp, hoặc xử lý các rác thải sinh hoạt của con người Chẳng hạn như ở các hầm tự hoại cung cấp phân bón cho nông nghiệp, ở những khu vực tập trung và xử lý rác thải [15] Bên cạnh đó việc xử lý ô nhiễm Nitơ còn có ý nghĩa trong nền nông nghiệp sinh thái nuôi trồng quảng canh Với hệ thống nuôi tôm công nghiệp, các trang trại nuôi tôm áp dụng hình thức nuôi với mật

độ dày đặc cả tôm giống lẫn lượng thức ăn Vì nuôi trong những bể cô lập nên thức

ăn thừa tồn đọng trong bể dễ dàng bị phân hủy ra các hợp chất thứ cấp và cuối cùng

về amonia

Trong nước thải, các hợp chất của nitơ tồn tại dưới 3 dạng: các hợp chất hữu

cơ amoni và các hợp chất dạng oxy hóa (nitrite và nitrate) Trong quá trình xử lý nước thải bằng phương pháp sinh học, nitơ amon sẽ được chuyển hóa thành nitrite

và nitrate qua quá trình nitrate hóa Khi môi trường thiếu oxy, các loại vi khuẩn khử nitrate sẽ tách oxy của nitrate và nitrite để oxy hóa chất hữu cơ Nitơ phân tử (N2) tạo thành trong quá trình này sẽ thoát ra khỏi nước

1.7.1 Quá trình nitrate hóa

Nitrate hóa là một quá trình tự dưỡng Năng lượng cho sự phát triển của vi khuẩn được lấy từ các hợp chất oxy hóa của nitơ Nitrate hóa là sự kết hợp của quá trình oxy hóa amoni và quá trình oxy hóa nitrite thành nitrate Các vi khuẩn chuyển

hóa amoni như Nitrosomonas, Nitrosococcus chuyển hóa amoni thành nitrite theo phương trình (1) Các vi khuẩn oxy hóa nitrite như Nitrobacter, Nitrococcus sau đó

chuyển hóa nitrite thành nitrate theo phản ứng (2) [17]

15 CO2 + 13 NH4+  10 NO2- + 3 C5H7NO2 + 23 H+ + 4 H2O (1)

5 CO2 + NH4+ + 10 NO2- + 2 H2O  10 NO3- + C5H7NO2 + H+ (2) Các vi khuẩn Nitrosomonas và Nitrobacter sử dụng năng lượng lấy từ các phản ứng trên để tự duy trì hoạt động sống và tổng hợp sinh khối Cùng với quá trình thu năng lượng, C5H7NO2 tạo thành dùng để tổng hợp nên sinh khối mới cho

có thể xảy ra khi lượng oxy hòa tan trong nước rất ít hoặc đã hết

1.7.2 Quá trình phản nitrate hóa

Khi thiếu oxy và tồn tại nitrate hóa sẽ xảy ra quá trình ngược lại: Tách oxy khỏi nitrate và nitrite để sử dụng lại trong các quá trình oxy hóa các chất hữu cơ khác Quá trình này được thực hiện nhờ các vi khuẩn phản nitrate hóa (vi khuẩn yếm khí tùy tiện) Trong điều kiện không có oxy tự do mà môi trường vẫn còn chất hữu cơ cacbon một số loại vi khuẩn khử nitrate hoặc nitrite để lấy oxy cho quá trình oxy hóa các chất hữu cơ Quá trình khử nitrate được biểu diễn theo phương trình phản ứng sau:

4 NO3- + 5Chữu cơ + 4 H+  5 CO2 + 2 N2 + 2 H2O Trong những năm gần đây những nghiên cứu ứng dụng mạng lưới màng sinh vật trong xử lý nước thải đang thu hút sự quan tâm trên thế giới Đặc biệt việc phân lập các chủng vi sinh vật vừa có khả năng phân hủy các hợp chất nitơ gây ô nhiễm đồng thời vừa có khả năng tạo màng sinh vật là một hướng nghiên cứu hứa hẹn đem lại nhiều tiềm năng cho việc xử lý nước thải Xuất phát từ thực tiễn đó

trong quy mô đề tài khóa luận, chúng tôi phân lập các chủng vi sinh vật từ các mẫu nước thải có khả năng hình thành màng sinh vật nhằm bước đầu nghiên cứu ứng dụng trong vấn đề xử lý nước thải giàu nitơ

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Chủng vi sinh vật nghiên cứu

Với mục tiêu phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học của các chủng vi sinh vật có khả năng tạo thành màng sinh vật và ứng dụng trong xử lý nước thải, chúng tôi đã tiến hành lựa chọn và lấy mẫu nước thải tại nhiều khu vực khác nhau Mẫu được lấy và phân tích trong ngày Các địa điểm thu mẫu cụ thể như sau:

Nước thải từ khu tập trung rác thải làng Vạn Phúc, Hà Đông, Hà Nội

Nước thải từ hầm Biogas làng Phú Bến, Thụy Hương, Chương Mỹ, Hà Nội Nước thải từ khu vực đầm nuôi tôm ấp Xẻo Rừng, xã Ninh Thành Lợi, huyện Hồng Dân, tỉnh Bạc Liêu

Hình 4 Một số địa điểm, khu vực lấy mẫu trong đề tài

A Nước thải khu tập trung rác thải làng Vạn Phúc

B Nước thải đầm nuôi tôm Bạc Liêu

2.2 Hóa chất, thiết bị

2.2.1 Môi trường nuôi cấy

Môi trường LB (Luria – Bertani broth hay Luria broth) (g/l)

Môi trường LB là môi trường thường được sử dụng cho việc nuôi cấy các chủng vi khuẩn hiếu khí Môi trường có đầy đủ các chất dinh dưỡng, nguồn cacbon, nitơ cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển

Môi trường phân lập Nitrosomonas: môi trường Winogradski 1(g/l)

2.2.2 Thuốc thử

Thuốc thử Brucice sulfanil:

Dung dịch Naphtylendiamide dihydrochloride được chuẩn bị:

Hòa tan 0,1g Naphtylendiamide dihydrochloride (C10H7NHCH2NH2.2HCl) trong 100ml nước cất khử ion

Các dung dịch thuốc thử đều được bảo quản ở điều kiện nhiệt độ thấp và tránh ánh sáng

2.2.3 Máy móc, thiết bị

Nồi khử trùng (ALP - Nhật Bản)

Máy lắc ổn nhiệt (Satorius - Đức)

Tủ cấy vi sinh vật (Aura vertical - Ý)

Cân điện tử 2 số lẻ (Kern - Đức)

Cân phân tích (Presica - Thụy Sỹ)

Máy đo pH (Horiba - Nhật Bản)

Máy đo mật độ quang học (Bionate - Anh)

Tủ ấm (Memmert - Đức)

Tủ sấy (Memmert - Đức)

Máy khuấy từ gia nhiệt (IKA RET - Đức)

Kính hiển vi điện tử quét JSM - 5421LV (Nhật)

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp phân lập vi khuẩn

Vi khuẩn được phân lập từ các mẫu nước thải bằng phương pháp pha loãng mẫu trong nước cất hoặc nước muối sinh lý đã khử trùng

Mẫu sau khi pha loãng được cấy gạt dịch ở các nồng độ từ 10-1 đến 10-4 trên các đĩa petri chứa môi trường thạch phân lập Nitrosomonas và Nitrobacter Các đĩa sau khi cấy trải được nuôi cấy trong tủ ấm với nhiệt độ 37oC trong thời gian từ 24 đến 48 giờ Các khuẩn lạc xuất hiện và được quan sát sau thời gian ít nhất là 24 giờ Sau khi phát triển, các khuẩn lạc sẽ được tách riêng rẽ và được nuôi cấy trong môi trường LB bổ sung thạch

2.3.2 Phương pháp nghiên cứu đánh giá khả năng tạo màng sinh vật của các chủng vi sinh vật

Các chủng vi sinh vật được nuôi tĩnh trong điều kiện dinh dưỡng thích hợp, mạng lưới màng sinh vật có thể được hình thành trên bề mặt các giá thể Màng biofilm được tạo thành có thể được phát hiện bằng cách nhuộm tím tinh thể 1%(w/v) [31] Dung dịch tím kết tinh 1% có khả năng bắt màu với các tế bào sống

Sự thay đổi về cường độ màu thể hiện mức độ và số lượng các tế bào vi sinh vật

Thí nghiệm được tiến hành theo phương pháp của Morikawa và cộng sự [26] Các chủng vi khuẩn sau khi phân lập được lắc kích hoạt với 15ml LB trong bình tam giác ở 37oC trong 24 giờ Hút một lượng thể tích dịch nuôi cấy bổ sung vào 700 μl LB lỏng trong các ống eppendorf đã khử trùng sao cho mật độ tế bào xác định bằng máy đo mật độ quang học OD620 đạt khoảng 0,3-0,4 và ủ trong điều kiện tĩnh ở 37oC

Sau khoảng thời gian từ 24 đến 48 giờ, các dịch nuôi cấy được loại bỏ khỏi các ống eppendorf Đánh giá mật độ tế bào sống trôi nổi trong môi trường bằng phương pháp đo mật độ quang học ở bước sóng 620nm (OD620) dịch nuôi cấy vi khuẩn

Quan sát khả năng tạo màng sinh vật: Mỗi ống eppendorf được rửa sạch 2 lần bằng nước cất khử trùng Sau đó mỗi ống eppendorf được bổ sung 1ml dung dịch tím Gentian và giữ trong 25 phút ở nhiệt độ phòng Loại bỏ dung dịch nhuộm, rửa sạch 2 lần bằng nước cất và sau đó quan sát sự bắt màu của các tế bào bám trên thành ống với tím kết tinh