Bài giảng công nghệ di truyền chương 2 polymerase chain reaction

Thiết kế primer • Primer dimer: primer bắt cặp với nhau... sử dụng trong cloning gene tương đồng • Primer dimer: primer bắt cặp với nhau... Long-rang PCR – Cần kéo dài thời gian cho lon

Polymerase Chain Reaction

Tp Hồ Chí Minh

24-9-2014

• Gắn thêm adenine (A) ở đầu 3’ của sản phẩm

– Có ích khi tạo dòng bằng TA kit

Enzyme bền nhiệt có hoạt tính sửa sai

• Tli : Thermococcus litoralis

– Bền ở 95 oC Giữ hoạt tính sau 1h ở 95 oC

• Pfu: Pyrococcus furiosus

Thiết kế primer

• Chiều dài

– Ngắn: dễ bắt cặp  không chuyên biệt

– Dài : Khó bắt cặp  chuyên biệt

– 20 – 30 nu

• Bắt cặp sai (mismatches)

– Đầu 3’ của primer phải bắt cặp hoàn toàn với nu

trên khuôn mẫu, thường sử dụng C/G (why ?)

– Đầu 5’ của primer không cần bắt cặp hoàn toàn

với khuôn mẫu  chèn trình tự nhận biết của RE

Thiết kế primer

• Primer dimer: primer bắt cặp với nhau

( sử dụng trong cloning gene tương đồng)

• Primer dimer: primer bắt cặp với nhau

Ứng dụng

1 Giải trình tự DNA

2 Chẩn đoán

- Xác định tính trạng di truyền

- Phát hiện sinh vật gây bệnh

- Phát hiện chất gây nhiễm thực phẩm

3 Pháp y

4 Đa dạng di truyền quần thể

5 Khảo cổ học và tiến hóa

Cần quan tâm

• Kích thước sản phẩm

– Hỗn hợp enzyme (+ 1 proof-reading) sẽ tăng kích thước sản phẩm khoảng 10 kb (Long-rang PCR)

– Cần kéo dài thời gian cho long-rang PCR

– Tuổi mẫu (chất lượng mẫu) tỉ lệ nghịch với kích thước

khuếch đại của sản phẩm

• Khuếch đại sản phẩm sai trình tự

– Primer bắt cặp khuếch đại đoạn không mong muốn (không đặc hiệu, nồng độ muối, nhiệt độ,…)

– Sử dụng primer đặc hiệu, tăng nhiệt độ bắt cặp, tăng Mg ion

Các loại PCR cải biến – tăng độ nhạy

• Hot-start PCR

– Giảm sự bắt cặp không đặc hiệu của primer 

giảm khuếch đại sản phẩm không mong muốn – Cho enzyme polymerase vào dung dịch khi đạt

nhiệt độ bắt cặp tối thích

– Bọc enzyme hoặc muối Mg bằng sáp

– Sử dụng antibody bất hoạt enzyme giai đoạn đầu

Các loại PCR cải biến – tăng độ nhạy

• Touch-down PCR

– Giảm sự bắt cặp không đặc hiệu của primer 

giảm khuếch đại sản phẩm không mong muốn

– Nhiệt độ bắt cặp ban đầu cao tránh bắt cặp không đặc hiệu xảy ra, sau đó sẽ giảm đến nhiệt độ bắt cặp tối thích

Các loại PCR cải biến – tăng độ nhạy

• Nested-PCR

Tăng độ chuyên

biệt

copies

Hard-Hard-copies

copies

Hard-Inverse PCR

Reverse transcriptase PCR (RT-PCR)

RT-PCR

– Hoặc sử dụng các đoạn đầu dò đặc hiệu mang

chất phát huỳnh quang (ex: Taq man probe)

Quantitative PCR (qPCR)

Hệ thống SYBER Green

Quantitative PCR (qPCR)

Hệ thống Taqman probe

PCR mỏ neo (anchored PCR)