Bài giảng công nghệ di truyền chương 3 simple cloning

Vai trò của các gene • bla: mã hóa beta-lactamase, enzyme thủy phân vòng beta-lacta của ampiciline... Vai trò của các gene • lacZ’: mã hóa beta-galactosidase, enzyme thủy phân các đườn

Simple cloning

Tp Hồ Chí Minh

24-9-2014

Vector pUC

• Ori: vùng tự tái bản

• ampR or bla

(beta-lactamase) : gen kháng ampiciline

• lacZ’:

beta-galactosidase gene

• MCS: multi cloning site

• lacI: lac repressor gene

Vai trò của các gene

• bla: mã hóa beta-lactamase, enzyme thủy

phân vòng beta-lacta của ampiciline

Vai trò của các gene

• lacZ’: mã hóa beta-galactosidase, enzyme thủy

phân các đường đôi bao gồm X-gal tạo màu

xanh

Cấu trúc của…

(c) IPTG: isopropyl --D-thiogalactoside

Cắt vector và DNA

Nối bằng ligase được…

… hay…

… và cuối cùng là…

… DNA tái tổ hợp (recombinant)

Chuyển tất cả cấu trúc vào E.coli

• Hóa biến nạp (competence cell + thermal

shock)

• Điện biến nạp (electroporation)

Operon lacZ và IPTG

Chọn dòng mang DNA tái tổ hợp

Blue + White Systems

+ ampiciline + IPTG

+ XGal

Yêu cầu cần có của Vector

1 Điểm khởi đầu nhân đôi (an origin of replication)

2 Chỉ thị chọn lọc (selectable marker)

3 Những trình tự nhận biết duy nhất của các RE

(suitable single restriction sites)

4 Kích thước phù hợp (suitable size)

5 Chỉ thị nhận biết đoạn DNA chèn

6 Nhiều bản sao trong tế bào vật chủ

7 Tàn tật , không có khả năng chuyển sang tế bào vi

khuẩn khác (loại bỏ những trình tự tham gia trong quá trình tiếp hợp)

Vector nhân tạo đầu tiên, pBR322

Polycloning vector

• Chứa vùng polylinkers hay multicloning sites

• Chứa đoạn DNA ngoại lai từ 3 -10 kb

Nhóm pUC

Nhóm pGEM

Nhóm pBluescript

Biến nạp (transformation)

• Lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào:

– Số lượng DNA tái tổ hợp

– Kiểu DNA tái tổ hợp

– Vật chủ

• Hóa biến nạp (calcium chloride)

• Điện biến nạp (electroporation)

Tính chất của tế bào chủ

1 Hiệu quả biến nạp

- Khả năng tiếp nhận DNA, (chưa hiểu rõ)

- Hiện diện hệ thống phân hủy DNA nội sinh

 sử dụng các dòng E coli đột biến làm giảm khả năng phân hủy DNA ngoại sinh

2 Sự bền vững của plasmid trong tế bào vật chủ

- Hệ thống tái tổ hợp của tế bào vật chủ

 Sử dụng các dòng đột biến hạn chế sự tái tổ hợp

DH5  , tế bào chủ cho pUC vector

1) Tránh vector tự nối lại bằng

1) Hoặc vector chứa gene gây chết

tế bào vật chủ khi tự nối

Ex: gene ccdB (control of cell death)

2) Nhân dòng cưỡng bức

- Tạo vector có DNA chèn theo chiều mong

muốn  thuận lợi cho việc biểu hiện protein

 Sử dụng hệ thống vector chứa multicloning

site (MCS) hoặc polylinker

Vector chứa RS của topoisomerase

5) Hệ thống recombinase

Linkers – Các đoạn nối

Adaptors – Các đoạn chuyển đổi

Cassette

M13, vòng đời

Bộ gene M13 và vector M13

Multicloning sites trong lacZ’ gene

Vector có nguồn gốc từ M13

• pBlueScripIIKS2+

phage lamda

Bacteriophage lamda

Nếu loại bỏ vẫn

không ảnh hưởng đến sinh sản và làm tan tế bào chủ của phage

Bacteriophage lamda

Chèn thêm

đoạn DNA ngoại

lai vào

Bacteriophage lamda

Chèn thêm

đoạn DNA ngoại

lai vào

Vector cải tiến từ phage 

Cosmid = plasmid + đầu cos

• Dùng tạo dòng các đoạn DNA kích thước lớn

• Thành phần

– Marker kháng kháng sinh

– Trình tự ori

– Đoạn DNA mang đầu cos của phage lamda

• Kích thước nhỏ, chứa đoạn DNA eukaryote khoảng 45 kb

Tạo dòng bằng cosmid

Bacterial Artificial Chromosomes

(BAC) vectors

• Yếu tố F (Fertility factor): plasmid, di chuyển

sang tế bào mới không hiện diện yếu tố F nhờ tiên mao giới tính (sex pilus)

• Có khả năng chèn vào chromosome tế bào chủ

• Mang DNA ngoại lai lớn (300 kb)

• Chuyển vào E coli bằng xung điện

• Số bản sao thấp 1-2

• Ổn định trong E coli

Bacterial Artificial Chromosomes

Yeast Artificial Chromosomes (YAC)

vectors

• Dựa trên cấu trúc NST của nấm men

• Có thể nhận DNA 2000 kb