Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo thông đỏ (taxus wallichiana zucc)

Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo thông đỏ (taxus wallichiana zucc)

CHƯƠNG 1

GIỚI THIỆU

1.1 Đặt vấn đề

Bệnh ung thư hiện đang là căn bệnh gây tử vong với tỉ lệ cao nhất Theo thống

kê của các cơ sở, tổ chức y tế Trung ương các nước hàng năm, trên thế giới có hơnmột triệu trường hợp mắc bệnh ung thư được phát hiện thêm Trong đó, trường hợpdẫn đến tử vong là hơn 65% Ở Việt Nam, trong những năm gần đây, số người mangbệnh ung thư không ngừng tăng cao với một hệ số rất lớn Đồng thời, tỉ lệ tử vongluôn rất cao, hơn 75% Theo báo cáo của Viện Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ, một trongnhững nguyên nhân chính là do tình trạng thiếu thuốc đặc trị mà chỉ có thể điều trịbằng phương pháp bổ trợ

Ngoài việc nghiên cứu để tổng hợp các dược phẩm chống ung thư thì những nămgần đây trên thế giới đã chuyển sang sử dụng các loại dược thảo để chữa bệnh cho conngười Mà người Việt Nam lại có truyền thống sử dụng những bài thuốc dân gian đểchữa trị, hầu hết chúng đều bắt nguồn từ các cây thuốc Những cây thuốc đã mang lại

ý nghĩa về mặt y học và kinh tế Các cây thuốc chiếm 30% giá trị thuốc trên thị trườngthế giới Ở Việt Nam, hơn 90% nguyên liệu phải nhập khẩu, chủ yếu là sản xuất cácdạng thuốc thông thường, để trị các bệnh thông thường

Ngoài ra, việc ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật để sản xuất các hợpchất thứ cấp đã tạo ra một bước tiến xa trong khoa học thực vật Trong đó, taxol một

alkaloid diterpenoid được thu nhận từ các bộ phận của cây thuộc nhóm Taxus (cây

thông đỏ ở Việt Nam), được sử dụng làm thuốc trị bệnh ung thư Taxol đã được sửdụng trong thành phần của hầu hết các lọai thuốc đặc trị cho phần lớn các loại bệnhung thư như ung thư phổi, ung thư dạ dày, ung thư ruột kết, ung thư cổ, đầu … hayngay cả các khối u hắc tố ác tính khác

Taxol có nhiều trong vỏ cây Taxus wallichiana Zucc (Thông Đỏ Himalaya) hiện đang bị đe dọa tuyệt chủng do nạn chặt phá rừng Taxus wallichiana là loại cây thuộc

nhóm tăng trưởng rất chậm, việc thu hoạch vỏ cây để chiết xuất Taxol sẽ làm cây chết,gây thiệt hại cho nguồn tài nguyên rừng và ảnh hưởng đến môi trường sinh thái quốc

gia Việc nuôi cấy tế bào Taxus wallichiana để thu nhận hợp chất Taxol là một việc

làm hết sức cần thiết giúp khai thác được nguồn dược liệu quý hiếm này mà khônglàm ảnh hưởng đến nguồn giống tự nhiên cũng như môi trường sinh thái của ViệtNam, đáp ứng nhu cầu tiêu thụ trên thị trường, làm giảm giá thành sản xuất các sảnphẩm có hoạt tính sinh học nguồn gốc từ thực vật Với những lý do đó chúng tôi điđến thực hiện đề tài “Nghiên cứu ảnh hưởng của thành phần khoáng và các yếu tố

khác nhằm nâng cao hàm lượng taxol trong nuôi cấy tế bào mô sẹo Thông Đỏ (Taxus

wallichiana Zucc) ”.

1.2 Mục tiêu và yêu cầu thí nghiệm

1.2.1 Mục tiêu

Nghiên cứu tỉ lệ của thành phần khoáng và chất cảm ứng nhằm nâng cao hàm

lượng taxol tích lũy trong nuôi cấy mô sẹo cây Thông Đỏ (Taxus wallichiana).

1.2.3 Giới hạn đề tài

Do giới hạn của một luận văn tốt nghiệp nên tôi chỉ tiến hành thí nghiệm xungquanh các vấn đề có liên quan đến kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo cây Thông Đỏ

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu chung về thực vật nhóm Taxus

2.1.1 Nguồn gốc - lịch sử

Các loài thực vật thuộc nhóm Taxus (Thông Đỏ) được con người biết đến và

sử dụng đã hàng ngàn năm nay Từ lâu, người ta đã biết cây Thông Đỏ là loại cây cóđộc tính rất cao và rất nguy hiểm Ngày nay, các nhà khoa học đã xác định các độc tố

đó chủ yếu là do các hợp chất Taxine

Thực vật thuộc nhóm Taxus gồm hơn 10 loài khác nhau phân bố ở nhiều vùng

từ châu Mỹ, châu Âu, đến châu Á, như: Taxus wallichiana (Thông Đỏ Himalaya),

Taxus brevifoia (Thông Đỏ Thái Bình Dương), Taxus baccata (Thông Đỏ Châu Âu), Taxus cuspidata (Thông Đỏ Nhật Bản), Taxus chinesis (Thông Đỏ Trung Quốc), …,

cùng một số loài Taxus lai tạo giữa các loài Thông Đỏ trên

Hình 2.1 Rừng Taxus baccata ở Châu Âu

Tại Việt Nam cây Taxus wallichiana Zucc sống chủ yếu ở Lâm Đồng, Khánh

Hòa thuộc lọai đại mộc, chiều cao có thể đến 30 mét, vỏ có màu nâu đỏ nhạt, hơi dày,

thịt màu đỏ sẫm, giác có màu vàng trắng, lõi nâu đậm Thân cây nhẵn, cành xèo rộng,

lá mọc cách xếp thành hai dãy, mặt trên lá có màu lục, mặt dưới hơi vàng, lá dàikhoảng 2,5 – 4 cm, rộng 2 – 4 cm, thót dần và nhọn phía đầu lá, lá mọc tạo thành mộtgóc 60 – 90o so với trục của cành mang lá, có gân nổi rõ ở mặt trên, mặt dưới màuxanh vàng có hai dải khí khổng màu xanh nhạt hoặc xanh vàng trông rõ, cuống lángắn khoảng 0,2 cm

Thông Đỏ là cây đơn tính biệt chu Hoa Thông Đỏ gồm 8 – 10 nhị, mỗi nhị có

4 – 8 túi phấn mọc ở các nách lá vùng đỉnh cành và thường tạo thành cụm màu vàngnhạt, hình trứng cuống ngắn Nón cái mọc riêng lẽ ở nhánh, phân bố dọc theo suốtđoạn cành Nón đực và nón cái chỉ phân bố ở cành mới Quả Thông Đỏ có hình ô vanhay hình trứng, có muống nhỏ, gốc quả được bọc bởi các vảy xếp thành lớp tạo đế,quả non có màu nâu sẫm, quả chín có màu nâu nhạt hay màu đỏ

Cây Thông Đỏ sinh trưởng rất chậm, ưa sáng và ưa ẩm nhưng lại cần bóng râm

để nảy mầm và phát triển những năm đầu Mùa hoa từ tháng 8 - 12 và kết trái vàotháng 6 - 7 năm sau Hoa đực ở nách lá hình cầu màu vàng lục có cuống ngắn, nónđực gồm 3 - 14 nhị đực Nón cái một noãn, ít khi có hai không cuống, một noãn thẳngthuộc loại đơn tính khác gốc ở cuối cành Hạt hình trứng, khô cứng, dài 0,6 - 0,7 cm,ngoài có một lớp vỏ giả nạc mềm màu đỏ Hạt phát tán không xa, nảy mầm và pháttriển nơi có độ ẩm cao, có cường độ ánh sáng trung bình Tỷ lệ nảy mầm trong tựnhiên rất thấp so với số lượng hạt cây mang hàng năm, hạt chỉ nảy mầm sau hai năm,sau khi rụng

Gỗ Thông Đỏ chắc, không cong vênh, không nứt nẻ, chịu ẩm, chịu nước có thểdùng làm gỗ xây dựng và đồ gỗ gia dụng Vì thế Thông Đỏ đã bị khai thác bừa bãi,quá mức nếu không có biện pháp bảo vệ nghiêm ngặt, chúng có thể bị diệt vong trongtương lai không xa

2.1.2 Phân loại khoa học

Phân giới TracheobiontaNhóm SpermatophytaPhân nhóm Coniferophyta

Hình 2.2 Đặc điểm hình thái cây Thông Đỏ

Thực vật thuộc nhóm Taxus có hơn 10 loài khác nhau phân bố ở nhiều vùng ônđới ẩm, vùng cận nhiệt đới, vùng nhiệt đới núi cao bắc bán cầu từ châu Mỹ, châu Âuđến châu Á gồm:

- Taxus brevifoia (Thông Đỏ Thái Bình Dương)

- Taxus baccata (Thông Đỏ châu Âu)

- Taxus cuspidate (Thông Đỏ Nhật Bản)

- Taxus chinesis (Thông Đỏ Trung Quốc)

- Taxus globosa (Thông Đỏ Mexico)

- Taxus marei (Thông Đỏ Đài Loan)

- Taxus wallichiana (Thông Đỏ Himalaya)

- Taxus sumatrana (Thông Đỏ Sumatra)

- Taxus floridana (Thông Đỏ Florida)

- Taxus Canadensis (Thông Đỏ Canada)

Trong đó có 3 loài ở khu vực Trung và Đông Á 3 – 4 loài ở phía bắc Châu

Mỹ và 2 loài ở Việt Nam là T Chinensis (Thông đỏ lá ngắn) và T Wallichiana Zucc

(Thông đỏ lá dài) Thông Đỏ lá ngắn phân bố ở Trung Quốc, Ấn Độ, Malaysia, ViệtNam Ở Việt Nam, cây phân bố rãi rác ở 1 số vùng núi thuộc các tỉnh Lào Cai (HoàngLiên Sơn), Hà Tây (Ba Vì), Nghệ An (Quỳ Châu) độ cao: 900 – 1600 m (Vũ Văn Vụ

và ctv, 1996, Sách đỏ VN) Thông Đỏ lá dài phân bố ở Nepal (vùng núi Himalaya),phía bắc Mianma, Đông – Nam Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Philippin, Việt Nam

Ở Việt Nam, loài này cũng chỉ thấy ở một số vùng núi cao thuộc các tỉnh Lào Cai(Hoàng Liên Sơn), Khánh Hòa, Lâm Đồng (Đà Lạt, Đơn Dương), Hà Giang (Thái An– Quản Bạ), độ cao phân bố từ 1400 đến 1600 m (Nguyễn Tiệp, 1996 và 2001)

Hình 2.3 Các loại Taxus trên thế giới

2.1.3 Thành phần hóa học

Trong các bộ phận của cây thuộc nhóm Taxus có rất nhiều hợp chất khác nhau.

Cấu tử chính và đặc trưng chung của cây này là Diterpenoid Các hợp chất này thườnggọi chung là Taxoid, trong đó Taxol và đồng phân Taxoltere là hai hợp chất quantrọng được tạo ra do sự chuyển hóa hợp chất 10-deacetybacctin III (là một hợp chất

trung gian quan trọng có trong lá của các loài thực vật nhóm Taxus)

2.2 Sơ lược về cây Thông Đỏ

Cây thông đỏ (Taxus wallichiana Zucc) thuộc họ Thanh Tùng (Taxaceae), gồm

các chi:

Taxaceae:

Austrotaxus - thanh tùng New CaledoniaPseudotaxus - thông trắng (bạch đậu sam)Taxus - thanh tùng (thông đỏ, hồng đậu sam)Cephalotaxaceae:

Amentotaxus - dẻ tùng, sam bôngCphalotaxus - đỉnh tùng (phỉ 3 mũi)Torreya - phỉ

Bảng 2.1 Điểm khác biệt giữa chi Taxaceae và chi Cephalotaxaceae

Áo hạt Bao phủ môt phần hạt Bao phủ toàn bộ hạt

2.2.1 Giá trị kinh tế và trong ngành y dược

Thông Đỏ là loài cây quý có giá trị kinh tế cao Gỗ thông đỏ chắc, không congvênh, không nứt nẻ, chịu ẩm, chịu ướt, có thể dùng làm gỗ xây dựng và các đồ giadụng

Lá Thông Đỏ là loại thuốc dân gian được dùng từ lâu đời để trị hen suyễn,viêm phế quản, chứng tiêu hóa không bình thường… (Võ Văn Chi, 2004) Đặc biệt là

vào năm 1994, một số nhà khoa học trên thế giới công bố từ cây thông đỏ có thể tìm

thấy các hoạt chất để chữa trị bệnh ung thư Cụ thể, Taxol chiết xuất từ vỏ các loài: T.

brevifolia, T cuspidata, T yunnanensis, T baccata và T wallichiana,… đều có chất

lượng và hiệu suất cao, được dùng để chữa trị ung thư buồng trứng, ung thư vú, ungthư đầu, cổ và có triển vọng xử lý hắc tố (melanomas) , khoảng 1 kg Taxol/9000 kg

vỏ của T brevifolia, còn các loài khác cho hiệu suất nhỏ hơn Đặc biệt hàm lượng rất

biến động theo điều kiện sinh thái môi trường

Hiện tại trong hoá trị ung thư, hai loại thuốc trị bệnh ung thư tuyến tiền liệt vàung thư vú có hai dược phẩm sử dụng nhiều nhất và hiệu quả nhất là Taxol vàTaxotere Thuốc Taxol được bào chế từ chất Paclitaxel và thuốc Taxotere được bàochế từ chất Docetaxel Hai dược chất trên đều có chung nguồn gốc và dược liệu, chiết

xuất từ cây thông đỏ (Taxus wallichiana) Thông thường 1 kg lá thông đỏ chiết xuất

được 20 mg Taxol và giá 1 mg Taxol trên thị trường thế giới hiện nay là 4,87 USD

Ví dụ: Để có một liều thuốc trị bệnh ung thư, người ta cần khoảng 1kg taxol và

để có 1kg taxol, cần không dưới 7.000kg vỏ Thông Đỏ Nghĩa là để có một liều thuốctrị bệnh ung thư được bào chế, chúng ta phải "hy sinh" khoảng sáu cây Thông Đỏtrưởng thành Như vậy, toàn bộ rừng Thông Đỏ của Việt Nam nếu được dùng làmnguyên liệu cũng chỉ đủ để điều chế trên 10 liều thuốc chữa trị ung thư

Song Thông Đỏ cũng là loài cây độc nổi tiếng, gia súc khi ăn phải loài cây này

sẽ bị ngộ độc Thông Đỏ được xếp vào nhóm thực vật hiếm ở Việt Nam (Trần VănTiến, 1999)

Ở Việt Nam, năm 1995 Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia

khảo sát vùng Pà Cò, Mai Châu, Hoà Bình đã gặp 5 cây Thông Đỏ T chinensis (còn

gọi là Thông Đá, Cây Tra) bên trái núi đá vôi Riêng ở Lâm Đồng các nhà nghiên cứu

lâm sinh đã phát hiện 1 loài Thông Đỏ Himalaya (T.Wallichiana Zucc) có rải rác

nhiều nơi trên độ cao khoảng 1.500 m, một vài địa điểm có Thông Đỏ như: khu vựcgiáp ranh Xuân Thọ, Xuân Trường cách Đà Lạt 17 km phát hiện 2 cây Thông Đỏ 1lớn và 1 nhỏ, cây lớn có 3 thân đường kính gốc đạt 115 cm, ba thân có đường kínhtương ứng là 57 cm, 41 cm và 15 cm, chiều cao cây khoảng 30 m Cây nhỏ có đườngkính 33 cm, cao 15 m Cả 2 cây đều mọc bên khe núi Cành của các cây trên đã đượcthu thập và giâm hom tại trung tâm lâm sinh Lâm Đồng và đã có nhiều cây hom, cáccây hom này đã được đưa về trồng tại trạm Mang Linh cho phù hợp với nhu cầu sinhthái của loài.

2.2.3 Đặc điểm hình thái

Cây Thông Đỏ thuộc họ thanh tùng (Taxaceae) Ở Việt nam, Taxus

wallichiana phân bố ở các tỉnh Lào Cai, Yên Bái, Sơn La, Nghệ An, Hà Tĩnh, Phú

Yên, Khánh Hòa, Lâm Đồng

Cây Thông Đỏ thuộc loài đại mộc, cây mọc cao đến 30m Vỏ ngoài có màunâu đỏ nhạt, hơi dày, bong vảy, thịt màu đỏ sẫm, giác có màu vàng trắng, lõi màu nâuđậm Thân cây nhẵn, cành xòe rộng, cành non màu lục, gốc cành mang chồi do nhữngvảy màu lục xếp lợp

Lá mọc cách xếp thành hai dãy mặt trên lá có màu lục, mặt dưới hơi vàng Ládài khoảng 2,5 – 4 cm, rộng 2 – 4 cm, thót dần và nhọn phía đầu lá, lá mọc tạo thànhmột góc 60 – 90o so với trục của cành mang lá Thông Đỏ hầu như không có cuống lá

và là cây đơn tính biệt chu

Hoa đơn tính khác gốc Hoa đực Thông Đỏ gồm 8 – 10 nhị, mỗi nhị có 4 – 8túi phấn mọc ở các nách lá vùng đĩnh cành và thường tạo thành cụm màu vàng nhạt,hình trứng cuống ngắn Hoa cái mọc riêng lẽ ở nhánh, phân bố dọc theo suốt đoạncành Hoa đực và hoa cái chỉ phân bố ở cành mới

Quả Thông Đỏ có hình ô van hay hình trứng, có muống nhỏ, gốc quả đượcbọc bởi các vảy xếp thành lớp tạo đế, quả non có màu nâu sẫm, quả chín có màu nâunhạt hay màu đỏ nhạt, mềm, nhiều nước, ngọt

2.2.4 Đặc điểm sinh trưởng

Thông Đỏ là loại cây có biên độ sinh thái hẹp, ưa bóng, thường phân bố ởnhững vùng núi cao có độ dốc trên 300 m hay các vùng cận nhiệt đới ẩm trên đỉnh núi

đá vôi ở độ cao 1000 – 2000 m Điều kiện thổ nhưỡng, địa hình cũng đặc biệt đất cóthảm mục dày, xốp có lớp mặt màu đen, ở tầng sâu có màu nâu trắng, đất có kết cấutơi, có thành phần cơ giới nhẹ trên bề mặt đất, có các khối đá Granit xen kẽ, rải rác tạonên địa hình lồi lõm chia cắt mạnh (Nguyễn Thượng Hiền, 1998).

Thông Đỏ được xem là nhóm cây khỏa tử chịu bóng hoặc hơi ưa sáng, thườngmọc dưới tán một số cây gỗ thuộc các họ Lauraceae, Magnoliaceae, Fagaceae,Illiaceae, Thông Đỏ thích hợp vùng khí hậu có hai mùa rõ rệt trong năm, mùa mưakéo dài từ tháng 4 đến tháng 10, lượng mưa trung bình từ 1600 - 1800 mm, nhiệt độbình quân 200C, độ ẩm 80 - 90%

Thông Đỏ thường ra lá non vào mùa xuân và hè, hoa đực xuất hiện sớm hơnhoa cái từ cuối mùa đông, đến giữa mùa xuân năm sau cả hoa đực và hoa cái mới nở.Thông Đỏ sinh trưởng rất chậm, tái sinh tự nhiên từ hạt rất khó Tuy vậy, nếu trênđỉnh núi có vài cây to, vẫn có thể tìm thấy cây con mọc từ hạt

2.3 Sơ lược về hợp chất taxol

Taxol có dạng tinh thể nhỏ, rất mịn, màu trắng , không tan trong nước chỉ tantrong một số dung môi hữu cơ như cồn ethylic, methanol, chlorofrom, , nhiệt độnóng chảy khoảng 216 – 2170C

2.3.2 Cơ chế hoạt động của Taxol

Taxol và Taxotere chỉ hoạt động duy nhất trên hoạt động phân chia của tế bàoung thư Taxol chỉ tác động trên vi ống của tế bào ung thư nhưng không tác động lênDNA tế bào như các lọai thuốc trị ung thư khác

Trong tế bào, vi ống có nhiệm vụ kiểm soát vị trí của nhiễm sắc thể trong suốtquá trình phân chia tế bào và luôn ở trạng thái cân bằng động (một đầu vi ống luônkhông ngừng trùng hợp (polimer hóa), một đầu luôn khử trùng hợp (khử polimerhóa), tốc độ polimer hóa và khử polimer hóa gần như luôn bằng nhau, chỉ thay đổi khi

có sự biến đổi của trạng thái tế bào)

Khi có sự hiện diện Taxol trong tế bào, Taxol sẽ bám vào vách trong vi ống,kích thích sự polimer hóa đồng thời ngăn cản sự khử polimer hóa đầu còn lại, làm mấttính cân bằng của vi ống, phá vỡ chức năng thông thường của vi ống, ảnh hưởng trựctiếp đến sự phân chia tế bào và gây chết tế bào

2.3.3 Sơ lược về quá trình sản xuất Taxol

Taxol có nhiều trong các bộ phận của cây Thông Đỏ, đặc biệt là vỏ cây, lá vàphần lỏi thân cây Tuy nhiên, việc tách chiết Taxol từ các bộ phận của cây này rất khókhăn, hiệu suất rất thấp và vô cùng tốn kém Đồng thời, vỏ cây Thông Đỏ rất mỏng vàphát triển rất chậm, việc khai thác vỏ cây sẽ làm chết cây Hiện nay, có bốn phươngpháp sản xuất và thu nhận Taxol mà không cần phải khai thác vỏ cây cây Thông Đỏ:

+ Tổng hợp hóa học: tổng hợp nhân tạo nhưng giá thành quá cao, khó có thểđưa ra thị trường

+ Bán tổng hợp từ tiền chất tự nhiên: tổng hợp từ tiền chất Taxol 10 –deacetylbaccatin III có trong lá cây Taxus

+ Sản xuất từ nấm hay vi khuẩn: sản xuất Taxol từ vi sinh vật có nhiều hứa hẹnnhưng chưa có kết quả khả quan

+ Nuôi cấy tế bào Taxus: phương pháp này được xem là ổn định và hiệu quảnhất hiện nay

Phần lớn các nghiên cứu về phương pháp nuôi cấy tế bào cây Thông Đỏ để thu

nhận Taxol cùng các hợp chất liên quan đều được thực hiện trên các loài Taxus

wallichiana (Thông Đỏ Himalaya), Taxus brevifoia (Thông Đỏ Thái Bình Dương),

Taxus baccata (Thông Đỏ Châu Âu), Taxus cuspidata (Thông Đỏ Nhật Bản), Taxus chinesis (Thông Đỏ Trung Quốc)…

Quá trình nuôi cấy tế bào cây Thông Đỏ thường sẽ lần lượt diễn ra qua các giaiđọan như : sự tạo mô sẹo, sự tạo huyền phù tế bào, sự sinh phôi sôma Mô sẹo đượctạo ra từ mẫu cấy được đặt trên môi trường thích hợp Huyền phù tế bào sẽ được tạo rabằng cách nuôi cấy tế bào mô sẹo trong môi trường lỏng, phôi Sự sinh phôi sôma cóthể xảy ra trực tiếp trên môi trường thích hợp hoặc gián tiếp từ mô sẹo hay huyền phù

tế bào

Việc nuôi cấy tế bào trong môi trường nhân tạo vẫn có thể buộc tế bào sản sinhcác hợp chất thứ cấp tương tự như trong cơ thể thực vật Điều này được thực hiện dễdàng do mỗi tế bào thực vật đều là đơn vị cơ sở cấu trúc và chức năng độc lập, có khảnăng thực hiện mọi sự chuyển hóa, tăng trưởng, phát triển cũng như sinh sản của cơthể thực vật nói riêng và mọi sinh vật sống nói chung

Việc thu nhận hợp chất thứ cấp đều có thể từ mô sẹo, từ huyền phù tế bào, từcác cơ quan nuôi cấy hay từ lông rễ, tuy nhiên, huyền phù tế bào là hệ thống nuôi cấythường được sử dụng nhất và đã được áp dụng thành công với rất nhiều lọai thực vậtkhác nhau hay với nhiều lọai hợp chất thứ cấp cũng như alkaloid khác nhau

2.3.4 Ưu điểm của quá trình nuôi cấy Taxol

Hệ thống tế bào cung cấp sản phẩm đồng nhất, liên tục, không bị hạn chế,không phụ thuộc mùa màng, sâu – dịch bệnh, thiên tai …

Các hệ thống tế bào có thể được nuôi cấy trong các bình phản ứng sinh học lớn(bioreactor) và có thể được cảm ứng để sản xuất một lượng lớn Taxol bằng cách thayđổi điều kiện môi trường hay điều kiện nuôi cấy

Hệ thống tế bào sẽ dễ dàng thích nghi với những thay đổi điều kiện môi trườnghơn so với cây ngoài tự nhiên

Các hệ thống tế bào có thể chỉ sản xuất một phổ các chất rất hạn chế so với khi

ly trích các chất từ các bộ phận khác, giúp ích cho việc tinh sạch sản phẩm về sauđược đơn giản hơn

Bên cạnh việc cung cấp Taxol, các hệ thống tế bào nuôi cấy cũng có thể cungcấp nhiều tiền chất của Taxane, nhằm mục đích sử dụng để bán tổng hợp Taxol haybán tổng hợp các dẫn xuất khác của Taxol

2.4 Nuôi cấy mô sẹo

2.4.1 Khái niệm

Đây là bước đầu tiên trong nhiều phòng nuôi cấy mô Việc nhân số lượng lớn môsẹo từ mẫu cấy đầu tiên là cần thiết Mẫu cấy đầu tiên có thể lấy từ cây con vô trùngtrong ống nghiệm hay từ thân, rễ, lá của cây bên ngoài đã vô trùng Sau khi mô sẹođược hình thành, có thể sử dụng làm nguồn nguyên liệu cho nhiều thí nghiệm khácnhư nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy soma sản xuất các chất thứ cấp

Mô sẹo là một khối tế bào phát sinh vô tổ chức, có hình dạng không xác định.Được hình thành từ mặt cắt của thân hay rễ, bao gồm tế bào nhu mô hay thành phần tếbào rây Đặc tính mô sẹo phát triển không theo quy luật, có thể biệt hóa thành rễ, chồi

và phôi hoàn chỉnh

Cảm ứng tạo mô sẹo chia làm 3 thời kỳ: thời kỳ cảm ứng các tế bào chuyển hóacủa mẫu cấy chuyển ngược trạng thái phát triển, biến đổi hình thái và chức năng theohướng tế bào phân sinh Thời kỳ phân chia tế bào: các tế bào phân hóa của mô sẹo cótần suất phân chia tương đối nhanh Thời kỳ phân hóa tế bào: tốc độ phân chia và sinhtrưởng giảm đi cho tới khi dừng hẳn, trong mô sẹo xuất hiện cấu trúc mô dẫn

Tác nhân chủ yếu cảm ứng mô sẹo là chất điều hòa sinh trưởng Tùy vào từngloại thành phần, liều lượng và nồng độ các loại kích thích tố mà cảm ứng mô sẹo khácnhau Thường mô sẹo được hình thành trên môi trường giàu auxin, có thể kết hợp vớicytokinin tùy từng loại cây Hàm lượng hormon nội sinh và chiều di chuyển của cáchormon này trong mẫu cấy có ảnh hưởng đến phát sinh mô sẹo Vì vậy nguồn mẫucấy, việc lấy mẫu, cách đặt mô sẹo trên môi trường nuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến sự phátsinh mô sẹo dẫn đến những phản ứng khác nhau của mẫu cấy

Mô sẹo thường có màu vàng, trắng, xanh hay màu sắc tố anthocyanin Sự biệthóa của tế bào hình thành những chất liệu cấu tạo mô, các tế bào rây, vùng mô phânsinh trung tâm của sự tạo nên chồi và rễ Nhiều nhà khoa học cho rằng, mô sẹo đượctạo ra từ những mô hay cơ quan có chứa diệp lục có khả năng quan tự dưỡng Mô sẹo

có chứa diệp lục phụ thuộc vào lượng đường bổ sung trong môi trường và cường độánh sáng Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng quang tự dưỡng của tế bào chứadiệp lục (tế bào có màu xanh) như: cường độ ánh sáng, ánh sáng màu xanh cần thiếtcho sự biệt hóa diệp lục hình thành các enzyme, đường thấp, auxin thấp, CO2 cao,

tăng hàm lượng phosphate và những tế bào quang tự dưỡng có khả năng cố định CO2bằng chu trình Calvin mặc dù có sự xuất hiện của các acid hữu cơ 4 carbon.

Một vấn đề quan tâm trong nuôi cấy mô sẹo là sự biến tính tế bào Sự biến tínhnày xảy ra do: độ già của mẫu, sự thay đổi tế bào chất của nhân, tế bào đa bội thể có

số lượng DNA cao, thời gian duy trì nuôi cấy mô sẹo, điều kiện nuôi cấy, thành phầnmôi trường nhất là chất điều hòa sinh trưởng

Để tạo mô sẹo trong môi trường nuôi cấy có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng,đôi khi dịch chiết Phụ thuộc vào từng loại mô nuôi cấy mà chất điều hòa sinh trưởngthêm vào có khác nhau Chất điều hòa sinh trưởng thường tổ hợp thành 4 nhóm:auxin, cytokinin, auxin kết hợp với cytokinin, dịch chiết (Trần Văn Minh, 2006)

2.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình phát sinh mô sẹo

Hầu hết các mô và cơ quan thực vật đều có khả năng tạo mô sẹo Khả năng nàyphụ thuộc và trạng thái sinh lí, hóa sinh và kiểu gen Sự tăng sinh mô sẹo là do sự cânbằng giữa trạng thái sinh lí mẫu nuôi cấy và tác động của các chất điều hòa sinhtrưởng

Cơ quan được nuôi cấy: các mô và cơ quan khác nhau của thực vật có thể được

sử dụng làm vật liệu nuôi cấy tạo mô sẹo như lá, thân, rễ, củ, chồi hoa, túi phấn, phôihợp tử chưa trưởng thành và trưởng thành Tuy nhiên với mỗi loại mô hay cơ quanthường phải sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng và nồng độ sử dụng phù hợp với

độ nhạy cảm của tế bào trong mô hay cơ quan đó

Sinh lí mẫu nuôi cấy: mẫu cơ quan nuôi cấy trưởng thành thường khó nuôi cấyphát sinh cơ quan hay mô sẹo Ngược lại với những mẫu nuôi cấy còn non, auxin kíchthích tạo mô sẹo dễ dàng trên những vết cắt

Vai trò của ánh sáng: tùy loài thực vật hay mẫu nuôi cấy quá trình hình thành

mô sẹo cần ánh sáng hay trong tối Ngoài ra ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởngthực vật như auxin có vai trò quan trọng trong sự tạo mô sẹo

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật: auxin có vai trò quan trọng trong sự tạo môsẹo Trong môi trường nuôi cấy, auxin thường gây ra: sự tạo bướu ở các mô và cơquan, kích thích sự phân chia tế bào (tạo mô sẹo), kích thích sự tạo rễ bất định, gây ra

sự phát sinh phôi từ tế bào soma trong dịch huyền phù tế bào Khi nồng độ auxin thấpthì sự tạo rễ chiếm ưu thế, khi nồng độ auxin cao sẽ không có sự tạo rễ bất định nhưng

lại xảy ra sự tạo mô sẹo Auxin được sử dụng để tạo mô sẹo với loại và nồng độ thayđổi tùy thuộc vào vật liệu nuôi cấy Đa số các mẫu cấy thực vật thuộc nhóm song tửdiệp không có khả năng tạo mô sẹo trong môi trường chỉ có auxin mà cần phải có sự

phối hợp giữa auxin và cytokinin Sự tạo mô sẹo từ lá solanum melongena xảy ra trên

môi trường có nhiều loại auxin khác nhau như NAA; 2,4-D; 2,4,5-T ở các nồng độ

thay đổi từ 0,1 - 10 mg/l, còn ở tử diệp cây mầm Azadirachta indica cần IAA ở nồng

độ 0,5 mg/l và BA 1,0 mg/l để có thể tạo mô sẹo (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị ThủyTiên, 2006)

2.4.3 Nuôi cấy mô tế bào và sản xuất hoạt chất thứ cấp

Các chất trao đổi thứ cấp hay còn gọi là các chất thứ cấp có thể xếp trong banhóm chính: alkaloid, tinh dầu và glycoside Các alkaloid có dạng tinh thể là các hợpchất chứa nitrogen, có thể được tách chiết bằng cách dùng dung dịch acid Alkaloid cóhoạt tính sinh trên tất cả động vật và được sử dụng trong công nghiệp dược Họ alkaloidbao gồm: codein, nicotine, caffeine và morphine Các tinh dầu chứa hỗn hợp terpenoid

và được sử dụng như là chất mùi, chất thơm và dung môi Glycoside bao gồm cácphenolic, tanin và flavonoid, saponin và các cyanogenic glycoside, một số trong chúngđược sử dụng làm chất nhuộm, các chất mùi thực phẩm và dược phẩm

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật có thể cải thiện các hợp chất có giá trị trong ydược, gia vị, hương liệu và màu nhuộm mà không thể sản xuất chúng từ các tế bào visinh vật hoặc tổng hợp bằng con đường hóa học Những năm gần đây, sự phát triểncủa các hợp chất thứ cấp quan trọng trong thương mại là kết quả được mong đợi nhấttrong lĩnh vực nghiên cứu này Ưu thế về mặt nguyên lí của kỹ thuật nuôi cấy tế bàothực vật là có thể cung cấp liên tục các nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỉ lệ lớnlượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy (Mulbagal và Tsay, 2004)

Một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất các hợp chấtthứ cấp từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái Nhiều hợp chất thứ cấp được sảnxuất trong suốt quá trình phân hóa tế bào, vì thế chúng được tìm thấy trong các mô cókhả năng phân hóa cao như rễ, lá và hoa Do sự phân hóa hình thái và sự trưởng thànhkhông xuất hiện trong nuôi cấy tế bào nên các chất thứ cấp có khuynh hướng ngưngtạo thành trong quá trình nuôi cấy Tuy nhiên, các tế bào không phân hóa trong nuôicấy huyền phù thường tạo thành một khối vài trăm tế bào, các tế bào ở giữa khối có sự

tiếp xúc với môi trường khác với các tế bào ở bên ngoài nên sự phân hóa sẽ xuất hiệntới một mức độ nào đó trong khối để tạo các chất thứ cấp.

Nuôi cấy mô sẹo (trên môi trường thạch) có ưu điểm là thao tác đơn giản, dễ vậnchuyển nhưng nhược điểm là thể tích nuôi cấy bé nên khó phát triển ở quy mô côngnghiệp, mẫu nuôi cấy chỉ tiếp xúc được một mặt với nguồn dinh dưỡng, những sảnphẩm do mẫu nuôi cấy tạo ra trong quá trình trao đổi chất sẽ tích tụ xung quanh dẫnđến làm chậm sự sinh trưởng của tế bào

2.4.4 Các giai đoạn phát triển của mô sẹo

Mô sẹo cấy chuyền càng nhiều lần khả năng tái sinh càng giảm Sự tăng trưởngcủa mô sẹo thường theo đường cong sigma và gồm 5 pha: Thời kì đầu tế bào chuẩn bịphân chia (lag phase), thời kì tăng trưởng nhanh tế bào phân chia cực đại (exponentialphase), thời kì tăng trưởng tuyến tính tế bào phân chia chậm dần và tăng kích thước(linear stage), thời kì tăng trưởng chậm (decelerating growth), thời kì cân bằng sốlượng tế bào là hằng số (stationary phase) (Dương Công Kiên, 2003)

Auxin có vai trò khá quan trọng trong sự tăng sinh của mô sẹo Mô sẹo sau khihình thành nếu được tiếp tục duy trì trong môi trường có auxin thì sẽ tăng sinh nhanh,nhưng nếu chuyển sang môi trường có đầy đủ các thành phần dinh dưỡng nhưngkhông có auxin thì sự tăng sinh của mô sẹo sẽ rất chậm Tốc độ tăng trưởng của môsẹo phụ thuộc vào thành phân cũng như nồng độ của auxin (Nguyễn Đức Lượng và LêThị Thủy Tiên, 2006)

2.4.5 Hình thái mô sẹo

Sau khi trưởng thành mô sẹo được cấy chuyền Môi trường cấy chuyền cũnggiống như môi trường tạo mô sẹo nhưng chất điều hòa sinh trưởng được giảm nồng

độ Kích thước tách mô sẹo nhỏ vừa phải để tế bào phát triển mạnh nhất, thường cụm

mô sẹo có kích thước 5 - 10 mm và có trọng lượng 20 - 100 mg, thời gian giữa 2 lầncấy chuyền là 20 - 30 ngày phụ thuộc vào từng loại mô sẹo Trong quá trình phát triển

mô sẹo thường xuất hiện 2 loại tế bào:

- Loại tế bào xốp, có không bào to, nhân nhỏ, tế bào chất loãng

- Loại tế bào cứng, có không bào nhỏ, nhân to, tế bào chất đậm đặc

Dạng mô sẹo cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh của các cơ quan của khối mô.Khả năng chồi sớm mất đi ở mô sẹo xốp nhưng vẫn duy trì ở mô sẹo cứng Nguyên nhân

có thể do tế bào mô sẹo mất đi khả năng tổng hợp một số chất thiết yếu cho sự tái sinhcủa nó khi số lần cấy chuyền tăng lên (Gautht, 1962) Vì vậy nuôi cấy mô sẹo nhằm mụcđích tái sinh chồi cần cố gắng tìm điều kiện môi trường thích hợp cho sự hình thành khối

mô sẹo cứng, chắc Các mô sẹo xốp cần được loại bỏ dần vì mô sẹo này phát triển rấtnhanh thường lấn át mô sẹo cứng có khả năng tái sinh phôi

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật hiện diện trong môi trường nuôi cấy cũng

có tác động khá lớn đến sự phát sinh hình thái của mô sẹo Nếu giữ nguyên nồng độ

và loại auxin trong môi trường nuôi cấy nhưng thay đổi thành phần và nồng độcytokinin thì hình thái của mô sẹo sẽ thay đổi Trong đa số các trường hợp, sự hiệndiện của BA trong môi trường nuôi cấy kích thích sự tạo mô sẹo dạng nốt, chắc, màunâu và có khả năng sinh phôi Mô sẹo trên môi trường có kinetin có dạng bở vàthường không có khả năng sinh phôi Nồng độ auxin tăng cao kích thích sự tạo mô sẹodạng bở nhưng khi giảm nồng độ auxin thì mô sẹo có dạng nốt và chắc (Nguyễn ĐứcLượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2006)

2.5.6 Màu sắc của mô sẹo

Mô sẹo của nhiều loài thực vật khác nhau về cấu tạo (tổ chức), độ xốp và màusắc Nó có thể có màu vàng úa hay trắng, có màu diệp lục hay màu sắc tố anthocyanin.Sắc tố đôi khi đồng dạng hay bị phân bố có những vùng không có cấu trúc sắc tố Cấutrúc sắc tố thường giống như cấu trúc ở mô của mô sẹo và có lẻ mất dần đi qua cấychuyền nhiều lần Mô sẹo có cấu trúc sắc tố xanh sinh trưởng ngoài sáng tốt hơn trongtối Cấu trúc sắc tố còn chịu ảnh hưởng ở các mức độ khác nhau của hàm lượngđường, sự có mặt của tinh bột hòa tan, thiếu hụt nitrogen, nhiệt độ, ánh sáng và auxinngoại sinh

Theo Mol và ctv (1996), anthocyanin là tác nhân tạo nên màu xanh, tím, đỏ và

cam ở thực vật bật cao Trong tự nhiên, việc tổng hợp anthocyanin bị tác động bởi cácyếu tố như bức xạ ánh sáng, nhiệt độ, chất kích kháng và mức độ dinh dưỡng, hàmlượng đường sucose (Nagira và Ozeki, 2004; Hennayake và ctv, 2006), nồng độ NH4+

(Konczak và ctv, 2001; Piovan và Filippini, 2007) Trong đó, ánh sáng là một yếu tốt

khá quan trong Cụ thể mô sẹo khi được nuôi cấy ngoài sáng có khả năng tổng hợpanthocyanin cao hơn trong tối Kết quả sự tổng hợp anthocyanin của mô thực vật khiđược chiếu sáng được quyết định bởi của các gen liên quan đến sinh tổng hợp

anthocyanin (Mol và ctv, 1996) Mô sẹo phát triển trong điều kiện được chiếu sáng sẽ

có hoạt động trao đổi chất tốt hơn so với mô sẹo nuôi trong tối và một lượng lớnprotein được sản xuất, đây là một dấu hiệu của sự tăng biểu hiện gen Bên cạnh đó,một số nghiên cứu về tác động của ánh sáng đến một số gen tổng hợp anthocyanin chỉ

ra rằng sự biểu hiện của gen tổng hợp anthocyanin được kiểm soát chủ yếu bởi các cơquan thụ cảm UV-B và cơ quan này được điều chỉnh bởi ánh sáng Cơ chế sự truyềntín hiệu liên quan đến vai trò trung gian của ánh sáng như trong nghiên cứu nuôi cấy

mô sẹo Oxalis reclinata ánh sáng là một tác nhân kích thích tổng hợp anthocyanin hay

trong công trình nghiên cứu của Crouch và ctv (1993), người đầu tiên báo cáo về sự

tích lũy màu đỏ, màu của anthocyanin trong nuôi cấy mô sẹo Oxalis reclinata.

2.4.7 Phát sinh cơ quan trong nuôi cấy mô sẹo

Sự phát sinh cơ quan có thể hình thành trong khối mô sẹo được kiểm soát phátsinh cơ quan tiềm sinh qua vận dụng môi trường dinh dưỡng và chất điều hòa sinhtrưởng Sự tái sinh diễn ra trên môi trường đơn giản hơn là nhu cầu nuôi cấy mô.Thông thường môi trường dinh dưỡng chứa các thành phần vô cơ, hữu cơ, chất điềuhòa sinh trưởng… Mỗi loại mô có nhu cầu riêng và đôi khi mô cần các chất hỗ trợ khisinh trưởng kém Hiện tượng này phụ thuộc vào một số tác nhân như nguồn gốc môsẹo nuôi cấy, kiểu gen và tuổi sinh lý, hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng và các tácnhân vật lý

Sự phát sinh cơ quan phụ thuộc vào kích thước mẫu nuôi cấy Mẫu nuôi cấynhỏ khả năng tái sinh thấp, mẫu nuôi cấy lớn có chứa nhu mô tủy, mô mạch và tượngtầng có khả năng phát sinh chồi mà không phụ thuộc vào nồng độ auxin và cytokinin.Tuổi sinh lý mẫu nuôi cấy cũng là nhân tố ảnh hưởng đến quá trình hình thành cơ

quan Ở Echevaria, lá già phát sinh chồi, lá non phát sinh rễ và lá có độ tuổi trung

bình phát sinh chồi và rễ Chất lượng và cường độ ánh sáng tác động theo quy luật ảnhhưởng đến hiện tượng phát sinh cơ quan Vùng ánh sáng xanh thúc đẩy hình thànhchồi, ánh sáng đỏ thích hợp hình thành rễ Trong tính chất tự nhiên quá trình biệt hóatrong mô có thể bị kiểm soát bởi nhiều bước sóng ánh sáng khác nhau Ánh sáng giatăng hình thành rễ ở vài mô tách rời và ức chế các mô khác

 Sự hình thành chồi từ mô sẹo

Sự hình thành chồi từ mô sẹo được kích thích bởi: các chất sinh trưởng đưa vàomôi trường, chất được sản sinh ra trong nuôi cấy mô sẹo, các chất có chứa sẵn trongcác mẫu nuôi cấy Khả năng hình thành chồi từ mô sẹo phụ thuộc vào số lần cấytruyền mà các chất có trong mẫu không có khả năng tổng hợp trong thời gian dài và sựhình thành tế bào xốp Sự hình thành chồi được điều khiển bằng: tỷ lệ cytokinin/auxin

từ 10 - 100, carbohydrate như sucrose và các chất hữu cơ như casein hydrolysate, điềukiện nuôi cấy, dịch chiết Tạo rễ cần auxin, đường, khoáng, nhiệt độ, ánh sáng, adeninsulfate có tác dụng cản trở auxin GA3 cản trở sinh tổng hợp và tích lũy hạt tinh bột,cần thiết trong hình thành chồi Sự hình thành chồi nhiều khi lại xảy ra trên môitrường không sinh trưởng, hay có cytokinin + IBA có hiệu quả hơn so với chỉ dùngauxin

Ở hầu hết mô sẹo, sự hình thành chồi thường bị giảm do tuổi sinh lý già và cấychuyền nhiều lần nhưng khả năng ra rễ có thể tồn tại nhiều năm như ở cây mía Phátsinh chồi đỉnh có thể phát sinh rễ và ngược lại hay chồi phát sinh có thể sinh trưởng

không cần rễ như ở loài Pergularia Mô sẹo có thể duy trì khả năng không biệt hóa

qua sinh trưởng tăng sinh không cần hormone và trao đổi chất Đây là quá trình sinhtrưởng mạnh mẽ và mô sẹo thường khó tái sinh (Trần Văn Minh, 2003)

2.4.8 Ứng dụng của nuôi cấy mô sẹo

- Nhân giống in vitro các loài thực vật mà phương pháp nhân giống đỉnh sinh

trưởng ít hiệu quả hay khó thực hiện

- Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan

- Làm nguồn nguyên liệu để nuôi cấy tế bào đơn cho chọn lọc dòng tế bào

- Thu nhận các sản phẩm hoạt chất thứ cấp có hoạt tính sinh học cao

- Làm nguyên liệu nuôi cấy huyền phù tế bào

2.4.9 Những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sản xuất các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào

Các thông số hóa học và vật lí như thành phần môi trường khoáng và nồng độ

pH môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, nhiệt độ nuôi cấy, sự thông khí, sự lắc hoặckhuấy và ánh sáng ảnh hưởng đến hàm lượng các hợp chất thứ cấp đã được nghiêncứu nhiều (Goleniowski và Trippi, 1999; Wang và ctv, 1999) Một vài sản phẩm tíchlũy trong tế bào ở mức cao hơn so với ở trong cây trồng tự nhiên khi được nuôi cấy ở

điều kiện tối ưu Các thông số vật lí và yếu tố dinh dưỡng có thể gần như là yếu tố cơbản cho việc tối ưu hóa hiệu suất nuôi cấy

 Các chất điều hòa sinh trưởng: chất điều hòa sinh trưởng cần thiết cho nuôi cấy

tế bào, ảnh hưởng đến quá trình biệt hóa tế bào hình thành cơ quan như chồi,thân, lá, rễ Ảnh hưởng đến sự tổng hợp các chất thứ cấp của nhóm auxin (IAA,NAA, 2,4-D) và nhóm cytokinin (kinetin và BA)

 Nguồn đạm: chủ yếu là đạm hòa tan, đạm dạng nitrat hay hỗn hợp đạm nitrat

và amonium Đôi khi sử dụng casein hydrolysate hay nguồn đạm tự nhiên

 Nguồn cacbon: sucrose là nguồn cacbon và năng lượng chủ yếu được sử dụngtrong nuôi cấy mô Trong nhiều trường hợp hàm lượng cacbon cũng ảnh hưởngđến sự phát triển của tế bào và sản lượng của các chất trao đổi thứ cấp Tùy vàotừng loại cây trồng mà sử dụng đường mannose, galactose hay glucose Loạiđường và nồng độ đường được sử dụng cũng ảnh hưởng đến nồng độ các chấtthứ cấp được thu nhận

 Nhiệt độ, pH, ánh sáng và oxygen: là tất cả những thông số cần được kiểm tra

trong nghiên cứu sản xuất hợp chất thứ cấp Nhiệt độ từ 17 - 25°C thường đượcdùng trong nuôi cấy tạo mô sẹo và phát triển tế bào nuôi cấy Nhưng mỗi loạicây sẽ thích hợp với một nhiệt độ cụ thể pH của môi trường 5,6 - 5,8 trước khihấp khử trùng

 Ánh sáng: các chất thứ cấp được tạo ra trong quá trình nuôi cấy ở điều kiện tốihay có ánh sáng phụ thuộc vào từng loài thực vật và trong quá trình dinh dưỡng

ở nuôi cấy in vitro là quá trình quang tự dưỡng Mỗi loại thực vật có những

điều kiện tối ưu khác nhau để sinh trưởng và sản xuất các chất hữu dụng, vì thế

tùy từng trường hợp mà thay đổi các yếu tố cho phù hợp

 Các chất khác: trong những nghiên cứu gần đây cho thấy sử dụng các cơ chấttrong quá trình nuôi cấy là cần thiết để tăng hiệu suất thu nhận các chất thứ cấp.Điều này cho phép thực hiện các phản ứng sinh tổng hợp ra các chất thứ cấpmới mà bản thân tế bào thực vật không có

2.4.10 Các phương pháp nâng cao tổng hợp hoạt chât trong nuôi cấy tế bào

- Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy

- Phương pháp cố định tế bào

- Chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất cao

- Cung cấp tiền chất (precursor feeding)

- Chất kích kháng bảo vệ thực vật (chất cảm ứng)

2.4.10.1 Tối ưu hoá điều kiện nuôi cấy

Khả năng tổng hợp các hợp chất thứ cấp của tế bào có thể chịu ảnh hưởng bởinhiều yếu tố vật lý (như nhiệt độ, độ thoáng khí, ánh sáng, pH…) và hoá học (nhưchất điều hoà sinh trưởng thực vật), thành phần các chất trong môi trường nuôi cấy…Tuỳ từng loại tế bào mà sự đáp ứng với các yếu tố kể trên sẽ khác nhau Khi xác địnhđược điều kiện nuôi cấy tối ưu thì sự sản xuất và tích luỹ các hợp chất thứ cấp trong tế

bào in vitro sẽ cao hơn so với cây trồng ngoài thiên nhiên (Verpoorte và ctv, 1994)

2.4.10.2 Chọn lọc dòng tế bào có khả năng sản xuất cao

Hệ thống tế bào nuôi cấy là một quần thể tế bào có nhiều kiểu gen khác nhau

Do đó, các đặc tính sinh lý của tế bào sẽ khác nhau Phương pháp chọn lọc dòng tếbào là một kỹ thuật hữu hiệu để tăng sản lượng các hợp chất thứ cấp

2.4.10.3 Bổ sung tiền chất

Sự bổ sung các tiền chất hữu cơ xuất phát từ quan niệm cho rằng những hợpchất này có thể là chất trung gian hoặc là chất khởi đầu của một con đường sinh tổnghợp các sản phẩm thứ cấp nào đó Sự bổ sung các tiền chất của quá trình sinh tổnghợp các hợp chất thứ cấp mong muốn vào môi trường nuôi cấy giúp nâng cao hiệu quảsản xuất của tế bào trong một số trường hợp xác định Phương pháp này sẽ có giá trịkhi giá thành của các tiền chất không quá đắt

2.4.10.4 Cố định tế bào

Trong lĩnh vực nuôi cấy tế bào thực vật để thu nhận các sản phẩm thứ cấp, việc

cố định tế bào giúp kéo dài thời gian sử dụng, đặc biệt là trong các hệ thống phản ứngsinh học Mặt khác, những tế bào cố định ít bị tác động bởi điều kiện môi trường hơn

so với tế bào tự do Tế bào cố định thường là những tế bào có khả năng tiết các sảnphẩm thứ cấp ra môi trường ngoài Tế bào ở trạng thái cố định đôi khi tạo ra được cáchợp chất thứ cấp có sản lượng cao hơn tế bào ở trạng thái lơ lững tự do Các chất được

sử dụng để cố định tế bào là agarose, carageenan, alginate, agar, các sợi propylen…

Sự cố định tế bào giúp tăng sản xuất các hợp chất thứ cấp nhưng cũng không loại trừkhả năng chính những chất cố định lại là tác nhân kích thích sự sản xuất các hợp chất

thứ cấp

2.4.10.5 Nhân tố cảm ứng (elicitor)

Tiến trình cảm ứng biểu hiện gene của các enzyme xúc tác tổng hợp các chấtbiến dưỡng thứ cấp trong nuôi cấy tế bào thực vật được biết đến nhờ là sự cảm ứng(Ketchum và ctv, 1999) Sự cảm ứng trong sản suất hợp chất thứ cấp của tế bào thựcvật xảy ra do sự tiếp xúc giữa tế bào thực vật với các biotic và abiotic elicitor Thuậtngữ “elicitor” được sử dụng đầu tiên cho các tác nhân kích thích bất kỳ dạng phản ứngphòng vệ nào của cây với các bệnh lý xuất hiện trên đồng ruộng Thực vật có thể sảnxuất ra các chất kháng sinh biến dưỡng thứ cấp nhờ các phytoalexin trong các phảnứng chống lại sự tấn công của vi khuẩn Do đó, các vi sinh vật (đặc biệt là nấm và cácthành phần của chúng) đã được sử dụng rộng rãi để cảm ứng sản xuất hợp chất thứ cấptrong tế bào thực vật (Dicosmo và ctv, 1985)

2.4.11 Đường cong sinh trưởng

Sự tăng trưởng của mô sẹo thường theo đường cong sigma Có 5 pha được địnhrõ: thời kì đầu tế bào chuẩn bị phân chia; thời kì tăng trưởng nhanh tế bào phân chiacực đại (exponential phase); thời kì tăng trưởng tuyến tính tế bào phân chia chậm dần

và tăng kích thước (linear stage); thời kì tăng trưởng chậm (decelerating growth) Cuốicùng là thời kì cân bằng số lượng tế bào là hằng số Trong mỗi pha, các tế bào đápứng khác nhau cần kiểm soát sự tổng hợp của các chất thứ cấp, xác định pha tăngtrưởng để thu được sản phẩm với năng xuất cao

2.5 Một số nghiên cứu về nuôi cấy mô sẹo

Theo Quách Thị Liên và Nguyễn Đức Thành (2003), đã nghiên cứu “Những

kết quả bước đầu trong việc tái sinh cây trinh nữ hoàng cung (Crinum latifolium L.)

từ mô sẹo” Môi trường thích hợp để tạo mô sẹo cây trinh nữ hoàng cung là môitrường MS có bổ sung sucroza 20 g/l + agar 7,5 g/l + nước dừa 20% + kinetin 1 ml/l +inostol 200 ml/l +NAA 1 mg/l + Casein 400 mg/l

Đối với cây Đơn Nem, sử dụng môi trường (MS +3 mg/l 2,4-D) và môi trường(MS + 3 mg/l NAA) là tốt nhất cho quá trình hình thành mô sẹo, cho tỷ lệ mô sẹo cao

và thời gian hình thành mô sẹo sớm (theo Quách Thị Liên và ctv, 2004)

Dựa vào các kết quả nghiên cứu của các tác giả Bùi Văn Lệ và ctv (2006), mô

sẹo xanh được cảm ứng từ lá cây dừa cạn (Catharanthus roseus) invitro được nuôi