Khảo sát quy trình thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học từ việc nuôi cấy tế bào hai loài drosera

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang vii 2.3.4 Khảo sát tác động của việc bổ sung tiền chất lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất của cây con .... Ảnh hưởng của việc bổ sung tiền chất lên s

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang i

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Những kết quả trong

nghiên cứu này hoàn toàn chưa được công bố bởi bất kỳ tác giả nào khác

NCS Quách Ngô Diễm Phương

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang ii

Công trình này là kết quả hơn 3 năm học tập và nghiên cứu của tôi tại Bộ môn

Công nghệ Sinh học Thực vật và Chuyển hoá Sinh học thuộc Khoa Sinh, trường

Đại học Khoa học Tự nhiên với rất nhiều sự dạy bảo, quan tâm và giúp đỡ

Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến

PGS TS Bùi Văn Lệ, người đã đề ra hướng nghiên cứu thu nhận hợp chất thứ cấp

trên đối tượng cây bắt ruồi ở Việt Nam bằng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật và

tận tình chỉ dạy cũng như đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi được thực hiện, hoàn

thành luận án này

Đồng thời, tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến GS TS Nguyễn

Kim Phi Phụng – Khoa Hóa, trường ĐH Khoa học Tự nhiên Cô là người đã

đặt nền móng đầu tiên cho khối kiến thức Hóa học mà tôi có được để ứng dụng trong

luận án này Mặc dù không là người hướng dẫn, nhưng Cô luôn ở bên cạnh, đốc thúc,

hỗ trợ tinh thần cho tôi trong lúc thực hiện luận án

Thời gian làm thực tập sinh ở nước ngoài đã giúp tôi trưởng thành hơn trong

chuyên môn, trong tác phong học tập và nghiên cứu Xin chân thành cám ơn Bộ Giáo

dục Đào tạo và Chương trình trao đổi hợp tác Danida (ENREKA). Bên cạnh

đó, cho phép tôi được đặc biệt bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến PGS TS Ole

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang iii

Vang, người đã hướng dẫn, dạy bảo tôi, luôn tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên

cứu trong suốt quãng thời gian tôi ở Đan Mạch Cho tôi được nói lời cám ơn đến tất

cả Thầy Cô, bạn bè ở Lab Molecular Mechanisms of Dietary Components; Khoa

Science, Systems and Models; Trường ĐH Roskilde, Đan Mạch đã hướng dẫn

những thao tác đầu tiên khi tôi vàoLab cũng như đã tạo nên những tình cảm ấm áp,

thân thiện Tôi cũng xin gửi lời cám ơn đến các bạn du học sinh Việt Nam ở

Roskilde; đặc biệt là chị Thảo Trân, Tuyết Phương, Thu An, Như Ngọc, Thành

Tâmđã chia sẽ cuộc sống và giúp đỡ tôi như gia đình ở nơi xa xứ

Cho tôi được gửi lời cám ơn đến Thầy Cơ GS Trần Thanh Vân và học bổng

Odon Vallet

Cám ơn các Thầy Cơ Bộ mơn Sinh hĩa đã quan tâm tìm hiểu và xét duyệt ngay

khi ý tưởng của luận án được hình thành

Trân trọng cám ơn các Thầy Cơ tham gia Hội đồng, Thầy Cơ tham gia phản

biện kín đã dành thời gian xem xét, đánh giá cũng như góp ý để luận án được chỉnh

chu, hoàn thiện hơn

Cám ơn toàn thể Thầy Cơ đồng nghiệp của tôi tại Khoa Sinh, Trường ĐH

Khoa học Tự nhiên, TP HCM đã dạy dỗ từ những ngày tôi mới chập chững bước

vào giảng đường đại học cho đến ngày hôm nay cũng như đã cổ vũ tinh thần và hỗ trợ

khi cần thiết để tôi hoàn thành luận án Đặc biệt xin được cám ơn Cơ Phượng, anh

Huy, KPNamđã góp ý và sữa chữa bài vở giúp tôi

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang iv

Cám ơn toàn thể các em đang học tập và làm việc tại phòng Công nghệ Sinh học

Thực vật B23 Cho tôi được đặc biệt cám ơn: Lan Anh, Cẩm Tú, Vòng

BínhLong, Lưu Ly, Xuân Sơn, Hữu Hoàng, Minh Tuấn, Thanh Minh, Aí

Hiền đã hỗ trợ bất cứ lúc nào tôi cần

Gửi lời cám ơn đến: Bích Chiêu, Bích Tuyền, Hoàng Thị Thu, Phương Thy,

Thanh Minh, Bích Thùy, Phi Yến, những “người bạn học trò” của Cô đã dốc hết

tâm huyết để cùng Cô nghiên cứu luận án này

Gửi lời cám ơn đến các bạn cùng khóa Cao học Sinh hóa K13 đã thường xuyên

quan tâm và động viên tôi cho đến giờ phút này Đặc biệt, cho tôi nói lời cám ơn đến

Thiên Hoàng, chị Như, anh Nhứt

Cuối cùng, tôi xin phép được dâng tặng thành quả của công trình này cho gia đình

tôi, chỗ dựa vững chắc nhất của tôi trong những năm qua Cám ơn Ba Mẹ đã tạo mọi

điều kiện tốt nhất về vật chất và tinh thần để tôi có thể học tập, nghiên cứu khoa học

và đạt được kết quả này Cám ơn anh chị hai và vợ chồng út đã luôn ở bên cạnh, giúp

đỡ, cổ vũ Gia đình thực sự đã giúp tôi có thể toàn tâm toàn ý với luận án này

Chân thành cám ơn

Quách Ngô Diễm Phương

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang v

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

Lời cảm ơn ii

MỤC LỤC v

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU x

DANH MỤC BẢNG xiii

DANH MỤC HÌNH xvi

MỞ ĐẦU 1

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đặc điểm giống thực vật Drosera 3

1.1.1 Đặc điểm phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm phân bố 5

1.1.3 Đặc điểm hình thái 6

1.1.4 Đặc tính sinh học 11

1.1.5 Hiện trạng của Drosera trên thế giới [112] 13

1.1.6 Thành phần hĩa học 14

1.1.7 Giá trị và tầm quan trọng 17

1.1.8 Tình hình nghiên cứu 20

1.2 Tăng năng suất thu nhận hợp chất trong nuơi cấy tế bào thực vật 22

1.2.1 Nuơi cấy tế bào thực vật (plant cell cultures) 22

1.2.2 Tối ưu khả năng tích lũy hợp chất của tế bào thực vật 24

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang vi

1.2.3 Can thiệp vào con đường sinh tổng hợp hoạt chất 29

2 VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 35

2.1 Nuôi cấy in vitro hai loài Drosera để tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu 35

2.1.1 Vật liệu 35

2.1.2 Phương pháp 35

2.2 Sàng lọc và thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn nguyên liệu in vitro của Drosera 38

2.2.1 Các phương pháp khảo sát hoạt tính sinh học được sử dụng để sàng lọc phân đoạn cao chứa hoạt chất 38

2.2.2 Các bước tiến hành sàng lọc để cô lập hoạt chất từ nguồn nguyên liệu in vitro của hai loài Drosera 41

2.2.3 Kiểm tra hoạt tính sinh học của hợp chất cô lập được 42

2.2.4 Xác định cấu trúc và hàm lượng hợp chất 49

2.2.5 Lựa chọn hợp chất có tiềm năng làm hợp chất đích cho mục tiêu nghiên cứu tăng năng suất thu nhận trên đối tượng này 51

2.3 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh 51

Vật liệu 51

Phương pháp 52

2.3.1 Khảo sát vòng đời in vitro để xác định các giai đoạn tăng trưởng ở Drosera 52

2.3.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất của cây con 52

2.3.3 Khảo sát tác động của NAA lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất của cây con 53

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang vii

2.3.4 Khảo sát tác động của việc bổ sung tiền chất lên sự tăng trưởng và tích lũy

hoạt chất của cây con 54

2.3.5 Khảo sát tác động của việc sử dụng chất cảm ứng (elicitor) lên sự tăng trưởng và sự tích lũy hoạt chất 54

2.3.6 Khảo sát tác động cảm ứng của việc gây stress nitrogen lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất 55

2.3.7 Kiểm chứng hiệu quả làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh của các kỹ thuật đã khảo sát 55

2.4 Khảo sát ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào 56

Vật liệu 56

Phương pháp 56

2.4.1 Tạo dịch huyền phù tế bào 56

2.4.2 Ứng dụng một số kỹ thuật tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào 59

2.5 Xử lý thống kê 62

3 KẾT QUẢ -THẢO LUẬN 63

3.1 Nuôi cấy in vitro hai loài Drosera để tạo nguồn nguyên liệu khởi đầu 63

3.1.1 Khử trùng nguyên liệu nuôi cấy 63

3.1.2 Nhân giống bằng chồi bên 63

3.1.3 Nhân giống bằng tạo chồi bất định từ lớp mỏng tế bào 66

3.1.4 Thử nghiệm quy trình nuôi cấy hai bước (Improved 2-step Liquid Culture System) trong việc cải thiện khả năng nhân chồi và phát triển thành cây con hoàn chỉnh [24] 69

3.1.5 Tạo rễ và phát triển cây con hoàn chỉnh 72

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang viii

3.2 Sàng lọc và thu nhận một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn

nguyên liệu in vitro của Drosera 72

3.2.1 Xử lý mẫu và điều chế các loại cao chiết 72

3.2.2 Sàng lọc và cô lập hợp chất có hoạt tính kháng oxy hóa 74

3.2.3 Sàng lọc và cô lập hợp chất có khả năng ức chế tăng sinh tế bào in vitro 84

3.2.4 Lựa chọn hợp chất có tiềm năng làm hợp chất đích cho mục tiêu nghiên cứu tăng năng suất thu nhận trên đối tượng này 100

3.3 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh 101

3.3.1 Khảo sát vòng đời in vitro để xác định các giai đoạn tăng trưởng của D burmanii 102

3.3.2 Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin trong cây con tái sinh 104

3.3.3 Khảo sát tác động của NAA lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất 109

3.3.4 Khảo sát tác động của việc bổ sung tiền chất (phenylalanine và tyrosine) lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin 111

3.3.5 Khảo sát tác động của việc sử dụng chất cảm ứng (elicitor) lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất 113

3.3.6 Khảo sát tác động cảm ứng của việc gây stress nitrogen lên sự tăng trưởng và tích lũy hoạt chất 120

3.3.7 Kiểm chứng hiệu quả làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy cây con tái sinh của các kỹ thuật đã khảo sát 122

3.4 Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống nuôi cấy dịch huyền phù tế bào 123

3.4.1 Tạo dịch huyền phù tế bào 123

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang ix

3.4.2 Ứng dụng một số kỹ thuật tăng năng suất thu nhận hoạt chất lên hệ thống

nuôi cấy dịch huyền phù tế bào 134

4 KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 14 

4.1 Kết luận 14 

4.2 Đề nghị 1

DANH MỤC CÔNG TRÌNH LIÊN QUAN 15 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 15

PHỤ LỤC a

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang x

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU

CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D : 2,4-dichlorophenoxy acetic acid

4E-BP1 : the Eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) Binding Protein 1

AFM : Atomic Force Microscopy

AI : hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất (%)

AOS : Active oxide species

BHA : butylate hydroxy aldehyde

BSA : Bovine Serum Albumine

COSY : COrelation SpectroscopY

DEPT : Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DLD-1 : dòng tế bào ung thư ruột kết ở người

DMSO : Dimethyl sulphoxide

DTT : 1, 4-DiThioTreitol

DW : Dry weight (trọng lượng khô)

FBS : Fetal Bovine Serum

FTC : Ferric thyociante

FW : Fresh weight (trọng lượng tươi)

HMBC : Heteronuclear Multiple Quantum Correlation

HMQC : Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HPLC : High Performane Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng cao áp)

I : tỷ lệ ức chế sự tăng sinh tế bào (%)

IAA : indoleacetic acid

IBA : 3-indolebutyric acid

IC50 : Inhibitory Concentration of 50% growth

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xi

LB : Luria – Bertani

MS : Murashige & Skoog, 1962

mTOR : mammalian Target Of rapamycin

mTORC1/2 : mammalian TOR Complex 1/ 2

NAA : Naphthalene Acetic Acid

NMR : Nuclear Magnetic Resonance

OD : Optical Density

PAL : Phenylamine ammonia lysase

PBS : Phosphate Buffer Saline

PDK : Protein Dependent Kinase

PDK1/ 2 : Phosphoinositide-Dependent Kinase 1/ 2

PI : Protease Inhibitor

PI3K : PhosphoInositide 3-Kinase

PIP2 : PhosphatidylInositol (4,5)-BiPhosphate

PIP3 : PhosphatidylInositol (3,4,5)- TriPhosphate

PKB : Protein Kinase B

PKC : Protein Kinase C

PTEN : Phosphatase and TENsin homolog

PVDF : PolyVinylidene DiFluoride

PVP : Poly Vinyl Pyrrolidone

Raptor : Regulatory Associated Protein of mTOR

Rheb : Ras Homolog Enriched in Brain

Rictor : rapamycin-Insensitive Companion of mTOR

ROS : Reactive Oxygen Spices

S6K1 : p70-S6 Kinase 1

SAR : Systemic Acquired Resistance

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xii

SRB : SulfoRhodamine B

TAL : Tyrosine ammonia lyase

TBA : ThioBarbituric Acid

TBS : Tris Buffered Saline

TCA : Trichloroacetic acid

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xiii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các loài Drosera thiên nhiên chứa plumbagin và 7-methyljuglone 15

Bảng 1.2 Các loài Drosera in vitro chứa plumbagin và 7-methyljuglone 15

Bảng 1.3 Các naphthoquinone vi lượng được tách chiết từ Drosera 15

Bảng 1.4 Dược tính và các hoạt tính ứng dụng khác của dịch chiết Drosera 18

Bảng 1.5 Hoạt tính chống thụ thai công bố gần đây nhất của D burmanii 19

Bảng 1.6 Những nghiên cứu về nhân giống in vitro giống Drosera 20

Bảng 1.7 Những nghiên cứu ứng dụng công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật trong thu nhận hoạt chất từ các loài thực vật cùng họ với Drosera 21

Bảng 2.1 Thử nghiệm quy trình nuôi cấy 2 bước với 2 kiểu nuôi cấy rắn và lỏng 37 Bảng 2.2 Các nghiệm thức được bố trí việc bổ sung hay không bổ sung 2,4-D 61

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của BA (mg/l) lên sự nhân chồi bên 64

Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BA (mg/l) lên sự tạo chồi bất định từ phát hoa 67

Bảng 3.3 Thử nghiệm quy trình nuôi cấy 2 bước với 2 kiểu nuôi cấy rắn, lỏng 70

Bảng 3.4 Phần trăm nước của hai loại nguyên liệu tươi Drosera in vitro 72

Bảng 3.5 Thu suất các loại cao từ bột cây Drosera 73

Bảng 3.6 Năng lực khử thể hiện qua giá trị OD ở bước sóng 700nm của các loại cao theo phương pháp Yen và Duh (1993) 74

Bảng 3.7 Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao chloroform của D indica 76

Bảng 3.8 Năng lực khử thể hiện qua giá trị OD ở bước sóng 700nm của các phân đoạn theo phương pháp Yen và Duh (1993) 77

Bảng 3.9 Hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất theo phương pháp FTC 80

Bảng 3.10 Hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất theo phương pháp TBA 81

Bảng 3.11 Tỷ lệ % hoạt tính kháng oxy hóa AI (%) của các hoạt chất khảo sát 82

Bảng 3.12 Tỷ lệ (%) ức chế sự tăng sinh dòng tế bào ung thư ruột kết DLD-1 sau khi cảm ứng 48 giờ của các cao chiết (100µg/ml) 84

Bảng 3.13 Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao chloroform của D burmanii 86

Bảng 3.14 Tỷ lệ (%) ức chế sự tăng sinh dòng tế bào ung thư ruột kết DLD-1 sau khi cảm ứng 48 giờ của các phân đoạn (100µg/ml) 86

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xiv

Bảng 3.15 Kết quả sắc ký cột phân đoạn 3 của bảng 3.14 87

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của hợp chất ở các nồng độ khác nhau lên sự tăng sinh của

tế bào DLD-1 sau 24, 48 giờ cảm ứng 89

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của hợp chất ở các nồng độ khác nhau lên kích thước của tế

bào DLD-1 sau 24, 48 giờ cảm ứng 91

Bảng 3.18 Nồng độ protein tổng của sinh khối tế bào khi bị cảm ứng bởi hợp chất

B và rapamycin theo thời gian 94

Bảng 3.19 Ảnh huởng của hợp chất B và rapamycin lên sự biểu hiện của protein

mTOR, pmTOR, S6K theo thời gian 96

Bảng 3.20 Phổ 1 H-NMR, 13 C-NMR và HMBC của hợp chất B 99

Bảng 3.21 Kết quả định lượng quercetin và plumbagin trong Drosera bằng HPLC

101

Bảng 3.22 Các giai đoạn tăng trưởng của D burmanii 102

Bảng 3.23 Ảnh hưởng của hàm lượng khoáng đa lượng lên sự tăng trưởng và sự

tích lũy plumbagin của cây 104

Bảng 3.24 Ảnh hưởng của ánh sáng lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin

trong cây con 105

Bảng 3.25 Ảnh hưởng của pH môi trường lên sự tăng trưởng và sự tích lũy

plumbagin của cây 107

Bảng 3.26 Ảnh hưởng mật độ cá thể nuôi cấy ban đầu lên sự tăng trưởng và sự

tích lũy plumbagin của cây con 108

Bảng 3.27 Ảnh hưởng NAA lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của cây

con 109

Bảng 3.28 Ảnh hưởng của việc bổ sung tiền chất lên sự tăng trưởng và sự tích lũy

plumbagin của cây con 111

Bảng 3.29 Ảnh hưởng của acid salicylic lên sự tăng trưởng và sự tích lũy

plumbagin của cây con 113

Bảng 3.30 Ảnh hưởng của acid salicylic lên sự tích lũy plumbagin ở hai bộ phận rễ

và lá D burmanii 116

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xv

Bảng 3.31 Ảnh hưởng của cao nấm men lên sự tăng trưởng và sự tích lũy

plumbagin của cây con 117

Bảng 3.32 Ảnh hưởng của cao nấm men lên sự tích lũy plumbagin ở lá và rễ của D burmanii 119

Bảng 3.33 Ảnh hưởng của việc gây stress nitrogen lên sự tăng trưởng và tích lũy plumbagin của D burmanii 120

Bảng 3.34 Kết quả định lượng plumbagin trong cây con D burmanii in vitro đã được ứng dụng các kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận plumbagin bằng HPLC 123

Bảng 3.35 Ảnh hưởng của nền khoáng, nồng độ đường lên khả năng sống của

lớp mỏng tế bào 123

Bảng 3.36 Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo từ lá và rễ D burmanii 125

Bảng 3.37 Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo từ lá dưới ảnh hưởng của 2,4-D, KN, NAA 127

Bảng 3.38 Tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo từ rễ dưới ảnh hưởng của 2,4-D, KN, NAA 128

Bảng 3.39 Hàm lượng plumbagin tích lũy trong các loại mô khác nhau 134

Bảng 3.40 Ảnh hưởng của mật độ tế bào nuôi cấy ban đầu đến thời gian tăng trưởng của dịch huyền phù tế bào rễ Drosera 135

Bảng 3.41 Ảnh hưởng ánh sáng và tốc độ lắc lên sự tăng trưởng và tích lũy plumbagin 137

Bảng 3.42 Ảnh hưởng của 2,4-D lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của dịch huyền phù tế bào 139

Bảng 3.43 Ảnh hưởng của phenylalanine và tyrosine lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của dịch huyền phù tế bào D burmanii 142

Bảng 3.44.Ảnh hưởng của acid salicylic lên lên sự tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của dịch huyền phù tế bào 145

Bảng 3.45 Kết quả định lượng plumbagin trong dịch huyền phù tế bào D burmanii đã được ứng dụng kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận plumbagin bằng HPLC 146

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xvi

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cây phát sinh loài trong các phân giống thuộc giống Drosera dựa trên

trình tự DNA chloroplast rbcL và DNA nhân 18S ribosome 4

Hình 1.2 Sự phân bố Drosera trên thế giới (vùng có màu xanh lá) 5

Hình 1.3 Các dạng cấu trúc thân của Drosera 6

Hình 1.4 Các hình dạng khác nhau của lá và lông tuyến Drosera 7

Hình 1.5 Màu sắc đa dạng của hoa Drosera 9

Hình 1.6 Mặt cắt ngang của hoa Drosera 9

Hình 1.7 Các dạng nang chứa hạt của Drosera 10

Hình 1.8 Hình thái hạt Drosera 10

Hình 1.9 Phương tiện và cơ chế bắt côn trùng của D indica L 12

Hình 1.10 Cấu trúc hóa học của các naphthoquinone và naphthoquinone-glucoside tách chiết từ các loài Drosera 16

Hình 1.11 Một số flavonoid và flavonoid glucoside có trong Drosera 16

Hình 1.12 Một số hình thái lạ mắt của Drosera 19

Hình 2.1 Sơ đồ phương pháp nhân giống bằng chồi bên 36

Hình 2.2 Sơ đồ phương pháp nhân giống bằng chồi bất định 37

Hình 2.3 Con đường truyền tín hiệu mTOR và những cơ chất có liên quan 46

Hình 2.4 Phương pháp Western Blot 46

Hình 2.5 Buồng đếm tế bào và quy tắc đếm trong 1 ô lớn có thể tích 0,1mm 3 59

Hình 3.1 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi bên của Drosera 64

Hình 3.2 Ảnh hưởng của BA lên sự nhân chồi bên từ đốt thân D indica L sau 5 tuần 65

Hình 3.3 Ảnh hưởng của BA lên sự nhân chồi bên từ đốt thân D burmanii sau 5 tuần 65

Hình 3.4 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của BA lên sự tạo chồi bên của Drosera 67

Hình 3.5 Sự tái sinh chồi bất định từ ngọn phát hoa D indica sau 5 ngày 68

Hình 3.6 Sự tái sinh chồi bất định từ ngọn phát hoa D burmanii 68

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xvii

Hình 3.7 Biểu đồ biểu diễn ảnh hưởng của việc ứng dụng quy trình nuôi cấy lỏng 2

bước lên khả năng tạo chồi của Drosera (trái: D indica, phải: D burmanii)

70

Hình 3.8 Cây con Drosera hoàn chỉnh với đầy đủ các bộ phận, kể cả rễ trên môi

trường MS lỏng (trái: D indica, phải: D burmanii) 72

Hình 3.9 Biểu đồ biễu diễn năng lực khử của các loại cao chiết theo phương pháp

của Den và Duh (1993) 74

Hình 3.10 Năng lực khử của các loại cao chiết theo phương pháp của Den và Duh

74

Hình 3.11 Biểu đồ biểu diễn năng lực khử của các phân đoạn trong thử nghiệm

Yen & Duh 77

Hình 3.12 Năng lực khử của các phân đoạn trong thử nghiệm Yen & Duh 77

Hình 3.13 Tinh thể hình kim của hợp chất A 78

Hình 3.14 Đường cong biến thiên độ hấp thu quang phổ ở 500nm để theo dõi động

học của phản ứng 80

Hình 3.15 Đường cong biến thiên độ hấp thu quang phổ ở 532nm để theo dõi động

học của phản ứng 81

Hình 3.16 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ hoạt tính kháng oxy hóa của hợp chất cô lập so

với vitE và BHA ở cả hai phương pháp FTC và TBA 82

Hình 3.17 Biều đồ thể hiện tỷ lệ % ức chế tăng sinh tế bào DLD-1 của các loại cao

chiết 85

Hình 3.18 Biểu đồ biểu diễn tỷ lệ (%) ức chế tăng sinh dòng tế bào DLD-1sau khi

cảm ứng 48 giờ của các phân đoạn 86

Hình 3.19 Cô lập và thu nhận hoạt chất B 88

Hình 3.20 Đường cong tăng sinh tế bào DLD-1 theo thời gian dưới ảnh hưởng của

hợp chất B ở các nồng độ khác nhau 89

Hình 3.21 Biểu đồ thể hiện tỷ lệ ức chế tăng sinh tế bào của hợp chất ở các nồng

độ khác nhau (trái: sau 24 giờ cảm ứng, phải: sau 48 giờ cảm ứng) 89

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xviii

Hình 3.22 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hoạt chất lên kích thước của tế bào

DLD-1 92

Hình 3.23 Tế bào DLD-1 dưới ảnh hưởng của hợp chất B sau 48 giờ cảm ứng

được quan sát dưới kính hiển vi đối pha, độ phóng đại 10x 93

Hình 3.24 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của hợp chất B (4µM) và rapamycin

(0,5µM) lên hàm lượng protein tổng của lysate tế bào DLD-1 95

Hình 3.25 Biều đồ thể hiện ảnh huởng của hợp chất B và rapamycin lên sự biểu

hiện của protein mTOR, pmTOR, S6K theo thời gian 97

Hình 3.26 Tín hiệu phát quang của kháng thể bắt cặp với các protein mTOR,

pmTOR, và S6K 98

Hình 3.27 Biểu đồ thể hiện các giai đoạn tăng trưởng của D burmanii 102

Hình 3.28 Các giai đoạn tăng trưởng của D burmanii nuôi cấy in vitro 102

Hình 3.29 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng khoáng đa lượng lên sự tăng trưởng và sự

tích lũy plumbagin của cây 104

Hình 3.30 Ảnh hưởng hàm lượng khoáng đa lượng lên sự tăng trưởng và sự tích

lũy plumbagin của cây Trong đó, ở MS1/8 và MS0 các chồi con không có

dấu hiệu tăng sinh và chết 104

Hình 3.31 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của ánh sáng lên sự tăng trưởng và sự tích

lũy plumbagin của cây 105

Hình 3.32 Ảnh hưởng của ánh sáng đến sự tăng trưởng của D buramnii in vitro

106

Hình 3.33 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của pH môi trường lên sự tăng trưởng và sự

tích lũy plumbagin của cây 107

Hình 3.34 Ảnh hưởng của pH môi trường đến sự tăng trưởng của D buramnii in

vitro Từ trái sang phải: pH5,2; pH5,8; pH6,4 107

Hình 3.35 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của mật độ cá thể nuôi cấy ban đầu lên sự

tăng trưởng và sự tích lũy plumbagin của cây con 108

Hình 3.36 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của NAA lên sự tăng trưởng và sự tích lũy

plumbagin của cây con 109

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xix

Hình 3.37 Ảnh hưởng của NAA lên sự phát triển của rễ và sự tăng trưởng của cây

in vitro 110

Hình 3.38 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của việc bổ sung tiền chất lên sự tích lũy

plumbagin của cây con 112

Hình 3.39 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của salicylic acid lên khả năng tăng trưởng

và sự tich lũy plumbagin 114

Hình 3.40 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian cảm ứng và nồng độ cảm ứng

của salicylic acid đến sự tích lũy plumbagin trong cây con D burmanii 114

Hình 3.41 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của cao nấm men lên sự tăng trưởng và sự

tích lũy plumbagin của D.burmanii 117

Hình 3.42 Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của thời gian cảm ứng và nồng độ cảm ứng

của cao nấm men lên sự tích lũy plumbagin trong cây con D burmanii 118

Hình 3.43 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của việc gây stress nitrogen lên khối lượng

cây tươi 120

Hình 3.44 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của việc gây stress nitrogen lên hàm lượng

plumbagin 120

Hình 3.45 Biều đồ thể hiện ảnh hưởng của nền khoáng và nồng độ đường lên khả

năng sống của lớp mỏng tế bào 124

Hình 3.46 Hình thái mô sẹo được tạo thành từ lá D.burmanii 126

Hình 3.47 Hình thái mô sẹo được tạo thành từ rễ D.burmanii 126

Hình 3.48 Biểu đồ thể hiện tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo dưới ảnh hưởng của 2,4-D, NAA,

KN 128

Hình 3.49 Hình thái mô sẹo dưới tác động kết hợp của 3 loại hormone 129

Hình 3.50 Dịch huyền phù tế bào được tạo thành từ mô sẹo 131

Hình 3.51 Dịch huyền phù tế bào được tạo thành trực tiếp từ lớp mỏng tế bào 132

Hình 3.52 Tế bào D burmanii bắt màu hồng khi nhuộm TTC 133

Hình 3.53 Đường cong tăng trưởng của các dịch huyền phù tế bào D burmanii có

mật độ tế bào ban đầu khác nhau 135

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang xx

Hình 3.54 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của ánh sáng và tốc độ lắc lên sự tăng

trưởng và sự tích lũy plumbagin 137

Hình 3.55 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của 2,4-D lên sự tăng trưởng và tích lũy

plumbagin 140

Hình 3.56 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của phenylalanine và tyrosine lên sự tăng

trưởng và tích lũy plumbagin của dịch huyền phù tế bào D burmanii 143

Hình 3.57 Con đường tổng hợp plumbagin từ tiền chất tyrosine thông qua các đơn

vị acetate 144

Hình 3.58 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của acid salicylic lên sự tăng trưởng và sự

tích lũy plumbagin của dịch huyền phù tế bào 145

Hình 3.59 Sinh tổng hợp plumbagin ở Drosera và một số yếu tố tác động lên quá

trình sinh tổng hợp 147

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 1

MỞ ĐẦU

Từ ngàn xưa, con người đã biết sử dụng cây cỏ thiên nhiên để chữa bệnh, tuy nhiên,

nguồn dược liệu khai thác từ thiên nhiên cho đến nay vẫn không đủ để đáp ứng nhu

cầu sử dụng Cùng với sự phát triển không ngừng của khoa học hiện đại, các nhà

khoa học đã phải tìm nhiều biện pháp để tổng hợp các dược phẩm có cơ cấu tương

tự các hợp chất mà người xưa đã khai thác từ thiên nhiên Song, các dược phẩm

tổng hợp thường gây ra không ít những tác dụng phụ như giảm khả năng trị liệu,

gây độc tố…Do đó, việc nghiên cứu cây cỏ thiên nhiên nhằm tìm ra các hợp chất có

giá trị trị liệu để cung cấp thêm nguồn khai thác dược liệu là việc làm hết sức cần

thiết Hơn nữa, nghiên cứu áp dụng các kỹ thuật công nghệ sinh học dựa trên các

phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro nhằm đảm bảo được một cách chủ động số

lượng cần thiết các hợp chất có giá trị trị liệu là điều mà các nhà khoa học luôn đề

cao hàng đầu và đang tích cực hướng đến

Drosera, một loài thực vật bắt mồi mang nhiều đặc điểm khác lạ so với các loài

thực vật khác: có khả năng cảm ứng; có khả năng tiết ra nhiều loại hợp chất thơm,

ngọt ngào để thu hút côn trùng; có nhiều loại enzyme thủy phân để tiêu hóa côn

trùng làm nguồn dinh dưỡng…Đặc biệt, chúng có một giá trị dược tính rất to lớn

trong điều trị các căn bệnh hiểm nghèo như: lao, ung thư, HIV, tim mạch, ho gà,

hen suyễn…kể cả những căn bệnh do đột biến Thế nhưng, theo kết quả từ bộ sưu

tập thực vật của Juniper và cộng sự [58], Drosera trong thiên nhiên hiện nay tương

đối hiếm Loài cây này đang được đánh giá là loài có nguy cơ tuyệt chủng cao trên

thế giới, nhiều quốc gia đã phải ban hành luật để bảo vệ chúng [20], [21]

Ở Việt Nam, theo Phạm Hoàng Hộ [5], có tất cả 3 loài Drosera Tuy nhiên, cho đến

nay, người dân chỉ thường thấy 2 loài trong số đó là: D indica L và D burmanni

Vahl Theo Đỗ Tất Lợi [6], chưa loài nào được nghiên cứu về thành phần hóa học,

dược tính, song dân gian không ít người sử dụng chúng để chữa bệnh: ho gà, kiết lị,

lao hạch, cam tích, viêm loét, chai chân, nám…

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 2

Trước những ghi nhận đó, nhằm hướng đến mục tiêu tìm kiếm nguồn nguyên liệu

chủ động cung cấp hoạt chất có giá trị trị liệu cho ngành dược, luận án:

KHẢO SÁT QUY TRÌNH THU NHẬN CÁC HỢP CHẤT CÓ HOẠT TÍNH SINH HỌC

TỪ VIỆC NUÔI CẤY TẾ BÀO HAI LOÀI DROSERA

Đã được hình thành với 3 nội dung chính:

¾ Thiết lập quy trình vi nhân giống 2 loài Drosera thu hái ở Việt Nam

¾ Sàng lọc, thu nhận và xác định một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ nguồn

nguyên liệu nuôi cấy in vitro của hai loài Drosera

¾ Khảo sát việc ứng dụng một số kỹ thuật làm tăng năng suất thu nhận hoạt chất

có tiềm năng trên hệ thống nuôi cấy tế bào in vitro Drosera:

Lựa chọn điều kiện nuôi cấy thích hợp

Bổ sung tiền chất

Sử dụng những nhân tố cảm ứng con đường sinh tổng hợp (elicitor, stress)

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 3

1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Đặc điểm giống thực vật Drosera

1.1.1 Đặc điểm phân loại

Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan, Drosera thuộc: [9]

Giới: Plantae (Thực vật) Ngành: Magnoliophyta (Ngọc Lan) Lớp: Magnoliopsida (Ngọc Lan)Phân lớp: Rosidae (Hoa Hồng) Bộ: Caryophyllales Họ: Droseraceae

Giống: Drosera

Tên tiếng Anh: Sundew, Sondou, Doublom

Drosera là giống thực vật chiếm số lượng loài nhiều nhất trong nhóm thực vật ăn

thịt, với hơn 188 loài [77] Năm 1994, Seine và Barthlott đã chia các loài thuộc

giống Drosera vào 11 nhóm (section) thuộc 3 phân giống (subgenus) (hình 1.1)

− Phân giống Drosera: là phân giống lớn nhất, các loài thuộc phân giống này

được chia thành 7 section gồm Drosera, Ptycnostigma, Thelocalyx,

Phycopsis, Bryastrum, Lasiocephala, Coelophylla

− Phân giống Ergaleium: các loài thuộc phân giống này được chia thành 3

section gồm Stoloniferae, Erythrorhizae, Ergaleium

− Phân giống Regiae: chỉ gồm 1 loài duy nhất là D regiae thuộc section

Regiae

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 4

Hình 1.1 Cây phát sinh loài trong các phân giống thuộc giống Drosera dựa trên trình

tự DNA chloroplast rbcL và DNA nhân 18S ribosome [122]

n bố

n bố rộng rnhiều ở Úc

i (28 loài),Châu Á (chZealand )

hủ yếu ở Đ) có khoảng

ùng có màu

giới (hình thì có hơnước khác Á) phát h[31]

y 3 loài Dr

nhiên, cho

ica, D bur

nhiều ở cácTĩnh), khu

g đó, đa sốđược phát

ỹ (17 loài),

g 3-4 loài,

Việt Nam làngười dân

ư những vị

n Bắc, Bắchiên nhiên

h thái Bắc

5

ố

t , ,

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 6

1.1.3 Đặc điểm hình thái

1.1.3.1 Thân

Hầu hết các loài Drosera đều là thân thảo, mềm, mảnh, hình dạng nhỏ Tuy nhiên,

hình thái của chúng rất đa dạng tùy vào kết cấu của thân:

− Thân trên mặt đất, phân nhánh hay không phân nhánh, thân có thể ngắn hay dài

(chiều cao có thể từ 1cm đến 2-3m tùy loài), thẳng hay ở dạng xoắn (hình 1.3a)

− Thân tiêu biến, chỉ có lá kết cụm từ một điểm tạo thành dạng hoa hồng úp xuống

hay ngược lên trên mặt đất (hình 1.3b)

− Thân rễ hay thân củ ở dưới đất, lá và cuống lá tủa ra từ thân tạo thành các phiến

mỏng xòe rộng ra từ một điểm (hình 1.3c)

Hình 1.3 Các dạng cấu trúc thân của Drosera

tiết này đư

ược tạo bởi

i 2 lớp tế blớp biểu bbắt dính v

ủ khắp bề

i một cuốnbào tuyến

ì tạo thành

và tiêu hóa

khác nhau

đến 60cm4), chủ yế

Lá mọc cụhân trên khừng loài Đmặt phiến

ng dài, nhỏtiết Chất k

h những gicon mồi

u của lá và l

m (D binat

ếu ở 2 dạ

m về một hông Lá kĐặc trưng

n lá của ch, có cấu trúkeo dính điọt keo (dạ

lông tuyến

ta) Lá có n

ạng: hình điểm nhưkèm có thể

của lá Dro

húng Lông

úc đa bào vđược tiết raạng dịch nh

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 8

1.1.3.3 Rễ

Hệ thống rễ của hầu hết các loài Drosera tương đối đơn giản: rễ chùm nhưng chỉ có

một vài nhánh Ở một số loài, rễ của chúng được gọi là rễ giả vì chủ yếu chỉ giữ

chức năng như 1 cơ quan hút nước, cung cấp nước cho cây và giúp cho cây bám

được vào đất, hoàn toàn không có vai trò trong hấp thu dinh dưỡng cho cây

Drosera ở Nam Phi sử dụng rễ của chúng chỉ để trữ nước và chất dinh dưỡng do

cây chuyển hóa Một số loài có hệ thống rễ thô và rắn chắc có thể sống sót qua mùa

đông lạnh cho dù thân cây của chúng đã chết Một số loài khác như D adelae và D

hamiltonii sử dụng rễ của chúng cho mục tiêu nhân giống vô tính thông qua sự nẩy

chồi bất định dọc trên rễ Còn Drosera ở Úc có thể tạo thành những dạng thân hành

dưới đất giúp cây sống sót qua mùa hè khô hạn Rễ của loài Drosera có sắc tố

thường phát triển dài hơn nhiều so với chiều cao thân cây, một cây cao 1cm có thể

có rễ dài đến 15cm bám sâu dưới lòng đất D lasiantha và D scorpioides cũng có

khả năng hình thành rễ bất định D intermedia và D rotundifolia từng được công

bố có thể hình thành dạng cộng sinh với nấm Arbuscular mycorrhizas (AMs), giúp

cây dễ dàng hấp thu dinh dưỡng từ đất [77]

1.1.3.4 Hoa (hình 1.6)

Lưỡng tính, nhỏ, có dạng tỏa tia, mỗi phát hoa có 3-20 hoa [127] Cũng như hoa của

các loài thực vật ăn thịt khác, hoa Drosera thường được giữ ở vị trí cao hơn nhiều

so với lá của chúng nhờ cuống hoa hay thân Sự sắp đặt tự nhiên này ban đầu được

cho là sự thích nghi của cây để tránh bắt nhầm những tác nhân gây thụ phấn tiềm

năng Nhưng gần đây, nhiều nghiên cứu đã cho thấy rằng Drosera cuốn hút côn

trùng làm tác nhân thụ phấn và bẫy con mồi làm thức ăn với hai kiểu khác nhau

[82] Do đó, có thể nói rằng sự sắp đặt tự nhiên của vị trí hoa Drosera (cuống hoa

dài) nhằm giúp nâng hoa lên một vị trí mà ở đó có thể nhận diện được tác nhân thụ

phấn cho chúng một cách an toàn Hoa nở chỉ khi chúng đáp ứng với sự nhạy cảm

ánh sáng trực tiếp và toàn bộ hoa tự cũng có tính hướng quang, thường di chuyển

đến vị trí có ánh sáng mặt trời [27]

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 9

Hình 1.5 Màu sắc đa dạng của hoa

Drosera [130]

Hình 1.6 Mặt cắt ngang của hoa Drosera

(D peltata, D spathulata) [124], [126]

Cánh hoa: 5 cánh rời, hình nêm hay hình trứng, kích thước 5-10 x 3-4mm Nói

chung, hoa thường có màu trắng, hồng hay hoa cà, có vân Các loài Drosera ở Úc

có dãy màu hoa rộng hơn, bao gồm cam (D callistos), đỏ (D adelae), vàng (D

zigzagia), tím (D microphylla) (hình 1.5) Hầu hết đều có cánh nhỏ (< 1.5cm),

ngoại trừ 1 số loài đặc biệt như D regia và D cistiflora có cánh rộng (>4cm) [27]

Đài hoa: 5 cánh, màu xanh ngả vàng, mọc từ đế, hình ngọn giáo ở đỉnh rồi thuôn

hẹp dần, kích thước 3-5 x 1-2mm, mép liền, có tuyến tiết [127]

Bộ phận sinh dục đực: 5 chỉ nhị hình sợi, dài 3-5mm [127] Hạt phấn thường kết

lại với nhau thành từng đơn vị bộ bốn nhờ sự kết dính giữa các vách, đây là một cấu

trúc duy nhất có ở thực vật hạt kín Bộ bốn hạt phấn này hoạt động như một đơn vị

riêng biệt và một lượng nhiều hơn số hạt phấn này được xem như để tăng cường

khả năng tự thụ phấn, vì mỗi hoa trong cụm hoa Drosera nở ra chỉ trong vài giờ vào

buổi sáng Hầu hết hoa tự thụ phấn nhờ côn trùng Nếu sự thụ phấn không diễn ra,

hạt phấn và nhụy sẽ tự thụ phấn khi hoa khép cánh [99]

Bộ phận sinh dục cái: bầu nhụy dạng ống, trứng hay dạng cầu méo, có 3 thai tòa, 3

vòi nhụy dính nhau ở đế, thường uốn cong, hướng vào trong, đầu nhụy đơn giản

[127] Bầu noãn thượng và chia ngăn, đính noãn ở vách Noãn được xác định nhờ

sự kéo dài của phôi tâm và những tế bào biểu bì mở rộng [99]

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 10

1.1.3.5 Quả nang và hạt

Quả nang: đường kính 2-6mm (hình 1.7), chứa nhiều hạt [127]

Hạt: hình ellip, hẹp như một đường thẳng hay hình cánh quạt Drosera có vỏ hạt ít

phức tạp hơn so với Drosophyllum hay Dionaea Hạt có vẩy hình mắc lưới, cấu tạo

gồm 3 phần: 1 lớp vỏ hạt có nhiều lignin, 1 lớp nội nhũ có nhiều tinh bột, và 1 phôi

nhỏ [99], [128] (hình 1.8) Hạt thu được sau một tuần từ khi hoa nở

Hình 1.7 Các dạng nang chứa hạt của Drosera [125]

Hình 1.8 Hình thái hạt Drosera [56]

Hình thái hạt D indica (mắc lưới 6 canh thẳng) và

D burmanii (mắc lưới 4 cạnh không thẳng)

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 11

1.1.4 Đặc tính sinh học

1.1.4.1 Điều kiện sống

Khí hậu: Drosera thích nghi với các vùng khí hậu khác nhau Chủ yếu là những nơi

ẩm ướt như những vùng đất thấp lầy, bờ ao, bờ sông hay những vùng đất cao,

thoáng đãng nhưng có độ ẩm cao; thậm chí có thể chịu được úng ngập nhưng không

thể chịu được khô hạn do hệ thống rễ của chúng cạn, khó ăn sâu vào trong đất tìm

mạch nước ngầm [99], [123]

Đất đai: sống được ở hầu hết các điều kiện đất đầm lầy, sỏi, cát, đất acid Đất trồng

Drosera là một hỗn hợp gồm 3/4 đất mùn + 1/4 cát, cát sạch, cát trộn bột than gỗ

pH: cây chịu được môi trường acid (pH3) đến môi trường trung tính (pH7), nhờ đó

cây có thể sống được trên những vùng đất than bùn, có tốc độ phân giải của các hợp

chất hữu cơ thấp [99]

Độ ẩm: 50 - 80%, độ ẩm thấp hơn sẽ làm mất giọt keo dính đầu lông tiết

Nhiệt độ: chịu được nhiệt độ cao (>300C) vào mùa hè, và thấp (∼50C) vào mùa

đông [99]

Ánh sáng: cây thích hợp với ánh sáng trực tiếp, tối thiểu từ 6 - 8 giờ chiếu sáng một

ngày Khi cây sống ở nơi có cường độ ánh sáng cao thì toàn bộ cây sẽ chuyển sang

màu đỏ Nếu cây không nhận đủ ánh sáng thì tua cuốn sẽ có màu xanh

Nhu cầu dinh dưỡng: trong những điều kiện tự nhiên, Drosera mọc hầu hết trên

các cơ chất acid, thường thiếu nitrogen và phosphor Mặt khác, nồng độ muối cao sẽ

ngăn cản sự tăng trưởng của cây, ảnh hưởng này biểu hiện rõ hơn sự thiếu hụt côn

trùng trong môi trường [105] Côn trùng là một nguồn bổ sung nitrogen có giá trị

Cây sẽ tăng trưởng tối đa khi được cung cấp côn trùng; trong khi đó nếu bổ sung

nitrogen vô cơ, cây sẽ tăng trưởng chậm hơn và sự trổ hoa thường sẽ bị ức chế

Nhiều nghiên cứu cho thấy nitrogen là một nguồn dinh dưỡng rất quan trọng cho

Drosera [60]

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 12

1.1.4.2 Cơ chế bắt côn trùng

Phương  tiện bẫy mồi: cái bẫy mồi của những loài cây này bao gồm rất nhiều

những lông tơ mang tuyến tiết trên bề mặt lá và thân cây (hình 1.9A), những tuyến

tiết này tiết ra nhiều giọt giống như keo (dew-drop) (hình 1.9B) thu hút côn trùng

Giọt keo này không bị khô và mất đi dưới ánh nắng mặt trời, chính vì lý do này mà

loài cây này được đặt tên “sundew” [32] Tế bào tiết của những tuyến tiết sản sinh

ra nhiều enzyme thủy phân protein, chẳng hạn như protease, acid phosphatase Khi

tuyến tiết được kích hoạt, các enzyme này sẽ được hoạt hóa và được tiết ra ngoại

bào cùng với một dịch nhầy Dịch nhầy được tiết ra bởi tuyến lông (không có những

tuyến riêng biệt để tiết enzyme và chất nhầy), chính chất nhầy này sẽ giữ vai trò bẫy

mồi cũng như tiêu hóa chúng [99]

Hình 1.9 Phương tiện và cơ chế bắt côn trùng của D indica L

A: Lông tơ trên bề mặt lá và thân cây [129], B: Giọt keo dew-drop [129], C:

Con mồi bị thu hút và đến gần lá cây [120], D: Giọt keo bắt dính con mồi

[120], E: Lông tiết cúi gập, giữ chặt con mồi [120]

E

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 13

Cơ chế bẫy mồi: con mồi bị thu hút, đến gần lá cây, lập tức sẽ bị những giọt keo bắt

dính ở đó (hình 1.9C, D) Chất keo dính này không độc, không gây chết con mồi,

chúng chỉ có vai trò bắt dính con mồi và tạo áp lực kéo các lông tiết cuộn gập

xuống Lông tiết phần do áp lực của các giọt keo, phần do nhạy cảm với protein sẽ

cúi gập, giữ chặt con mồi (hình 1.9E) Tuyến tiết khi đó ngừng tiết dịch keo dính và

tiết nhiều enzyme thủy phân tiêu hóa con mồi Sản phẩm tiêu hóa mau chóng được

lá hấp thụ, cung cấp chất dinh dưỡng từ con mồi cho cây [32]

Hình thức sinh sản: chủ yếu là loài cây một năm [127], với 2 hình thức sinh sản:

− Hữu tính (bằng hạt) [59]: cây có thể tự thụ phấn hay thụ phấn nhờ gió và côn

trùng Hạt được phóng thích khi trái chín rục Bên trong hạt thường có không khí

nên chúng có thể trôi nổi trong nước nhiều ngày, giúp giống Drosera được phát tán

đến nhiều nơi theo dòng nước

− Vô tính (bằng mầm) [99]: một số loài sundew ở Úc (như D dichrosepala và D

pygmaea) lại phát sinh mầm Mầm đại diện cho những cơ quan đặc biệt trong sinh

sản vô tính, có chức năng và thậm chí có cấu trúc tương tự như hạt Mầm tượng

trưng cho những đầu chồi mầm bị rụng mà chính những đầu chồi mầm này sẽ hoạt

động sinh sản giống như hạt, chỉ khác là không có quá trình thụ tinh xảy ra Kiểu

sinh sản vô tính này trước đây đã được mô tả ngắn gọn bởi Slack (1980) [104] và

Lowrie (1989) [72], họ cho rằng mầm bao gồm mô sinh dưỡng và những cấu trúc lá

và rễ phát sinh phôi Nhiều dữ liệu cho thấy ở Drosera kiểu sinh sản vô tính có hiệu

quả hơn hữu tính: mất ít thời gian hơn (70-90 ngày), trong khi hạt phải mất 120-150

ngày, nẩy chồi có hiệu quả (80-100%) chỉ trong vòng 7-14 ngày [99]

1.1.5 Hiện trạng của Drosera trên thế giới [112]

Mỹ: tất cả đều đã được liệt trong danh sách thực vật có nguy cơ tuyệt chủng ở các

tiểu bang [USDA, 2006] May mắn là một số ít quần thể Drosera vẫn được duy trì

bảo vệ tốt trong những khu sinh thái thiên nhiên được bảo tồn như Vườn Quốc gia,

Khu bảo tồn sinh vật hoang dã

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 14

Châu Âu: nhiều loài Drosera đã được bảo vệ bằng luật pháp (Đức, Áo, Thụy Điển,

Cộng hòa Séc, Phần Lan, Hungary, Pháp, Bulgaria)

Ở Nam Phi và Úc: hai trong số ba trung tâm phát triển về sự đa dạng và sinh thái tự

nhiên của giống cây này đã và đang phải chịu một áp lực lớn từ những hoạt động

sống của con người Hạn hán từng xảy ra ở nước Úc hơn 10 năm qua và cũng đã

nâng cao đáng kể mối đe dọa tuyệt chủng cho một số loài Drosera ở đó

Madagascar: một số loài Drosera là loài đặc hữu của nước này, nhưng hiện đang

trên đà có nguy cơ tuyệt chủng do không được bảo vệ và liên tục bị thu hái phục vụ

cho sản xuất dược liệu Hằng năm, 100-200 triệu cây được thu hái làm dược liệu

1.1.6 Thành phần hóa học

1.1.6.1 Naphthoquinone

Drosera thiên nhiên (bảng 1.1) cũng như in vitro (bảng 1.2) có thể sản sinh 2 loại

naphthoquinone chính là: plumbagin và 7-methyljuglone [64] Sự hiện diện và hàm

lượng của chúng đã được sử dụng như những đặc trưng (marker) hóa học để phân

loại thực vật ở các loài Drosera [26] Crouch và cộng sự (1990) [25] đã công bố

hàm lượng plumbagin trong D natalensis và D capensis thiên nhiên chiếm khoảng

0,0025%, và 0,0048%FW Mặt khác, Repcák và Galambosi (1994) [95] cũng đã

chứng minh trong D rotundifolia và D anglica ở Phần Lan sự hiện diện của

7-methyljuglone, hàm lượng hợp chất này trong cây thay đổi tùy thuộc vào sự phát

triển và sinh lý của lá Họ khảo sát thấy hàm lượng 7-methyljuglone cao nhất trong

lá non (2,7%DW ở D rotundifolia và 2,1%DW ở D anglica) và hàm lượng này

giảm trong lá trưởng thành (0,8-1,2%DW ở D rotundifolia và 0,6-1,6%DW ở D

anglica) Hơn nữa, ở những lá có nhiều sắc tố đỏ, hàm lượng các naphthoquinone

này thấp (0,04-0,1%DW ở cả hai loài) Ngoài ra, Drosera còn tổng hợp được một

số naphthoquinone vi lượng khác như droserone, hydroxydroserone và nhiều

naphthoquinone glucoside (bảng 1.3) mà không tìm được ở các loài khác [99]

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 15

Bảng 1.1 Các loài Drosera thiên nhiên chứa plumbagin và 7-methyljuglone [99]

Bảng 1.3 Các naphthoquinone vi lượng được tách chiết từ Drosera [99]

a: Sản phẩm chuyển hóa sinh học thu được từ dịch chiết với dung môi hữu cơ

b: Sản phẩm chuyển hóa sinh học thu được từ dịch chiết với dung môi methanol

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 16

Hình 1.11 Một số flavonoid và flavonoid glucoside có trong Drosera

Hình 1.10 Cấu trúc hóa học của các naphthoquinone và naphthoquinone-glucoside

tách chiết từ các loài Drosera [22]

1.1.6.2 Flavonoid

Drosera còn chứa phổ rộng các flavonoid, flavonoidglucoside như quercetin,

isoquercitin, kaempferol, astragalin, hyperin, gossypin,…(hình 1.12) [99] D

rotundifolia và D anglica thiên nhiên ở Phần Lan được đem phân tích hàm lượng

flavonoid aglycone bằng HPLC, trong đó thành phần quercetin chiếm 3,6-6,4%DW

ở cả 2 loài, trong khi thành phần kaempferol chỉ chiếm 0,07-0,45%DW Cả 2

flavonoid đều có ở lá, thân, và hoa nhưng chủ yếu ở hoa [82], [105] Cấu trúc hóa

học của một số flavonoid và flavonoid glucoside đã được công bố tách chiết từ

Drosera được trình bày trong hình 1.11

O OH

OH

O

OH HO

O O

OH OH

O OH OH OH OH

Hyperin

O

OH HO

O OH

OH OH O

HO

CH2OH O OH

Gossypin Myricetin

O

OH HO

O OH

OH OH OH

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 17

1.1.7 Giá trị và tầm quan trọng

1.1.7.1 Trong lãnh vực sinh thái, môi trường

D burmanii Vahl thường mọc ở vùng đất chua, bạc màu nên trở thành loài chỉ thị

cho vùng có đặc tính này [99]

1.1.7.2 Trong nghiên cứu khoa học

Họ Droseraceae là một đối tượng điển hình cho các nghiên cứu về tiến hóa ở thực

vật Bên cạnh đó, giống Drosera bao gồm rất nhiều loài thích nghi với từng điều

kiện môi trường khác nhau nên thích hợp cho những nghiên cứu về sự thích nghi

cấu trúc và chức năng (dinh dưỡng từ côn trùng, sản sinh mầm) Ngoài ra, hạt phấn

của Drosera được tổ chức cố định thành bộ bốn, là trạng thái chuyển tiếp từ giao

phấn sang tự thụ phấn trong quá trình tiến hóa của hệ thống thụ phấn thực vật [99]

1.1.7.3 Trong y dược

Dịch chiết từ Drosera được chứng minh là có nhiều dược tính và những hoạt tính có

giá trị ứng dụng khác (bảng 1.4) Cho đến nay, Drosera vẫn còn đang là đối tượng

thu hút các nhà khoa học về giá trị trị liệu của chúng Tháng 5/2009, V.Madhavan

và các cộng sự [73] vừa chứng minh được cả dịch chiết alcohol và dịch chiết nước

của D burmanii đều có khả năng chống thụ thai trên chuột (bảng 1.5) Tháng

10/2009, Hema B và cộng sự [49] đã khẳng định có thể sử dụng D burmanii để

điều chế thuốc điều trị chứng co giật, động kinh với giá thành rẻ mà hạn chế tác

dụng phụ hơn so với thuốc tổng hợp

Ở những nước Châu Âu: Drosera được bán trên thị trường với dạng dược thảo

khô “Herba Droserae”, song cây trong tự nhiên không đủ cung cấp nhu cầu, họ

thường phải nhập khẩu các loài cây này từ các nước khác [30], chủ yếu từ Ấn Độ

hay một số nước Châu Á tạo nên nguồn thu nhập có giá trị cho các nước này

Ở Ấn Độ: các loài như D indica, D burmanii, D peltata được sử dụng như những

thành phần chính trong một số vị thuốc pha chế mà dân địa phương thường gọi là

“Golden ash” [55]

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 18

Ở Trung Quốc: D burmanii (tên thông thường là Cẩm Địa La) được người dân

Vân Nam dùng để chữa bệnh viêm ruột, lị, sưng, đau họng, ho do phổi nóng, khạc

ra máu, đổ máu mũi và trẻ em bị cam tích Ở Quảng Tây, toàn cây D burmanii

dùng để trị đòn ngã, tổn thương và bệnh mề đay [6]

Ở Campuchia: D burmanii được dùng để chế một loại thuốc trị bệnh nấm [1]

Riêng ở Việt Nam: theo Phạm Hoàng Hộ [5], chưa loài nào trong 3 loài Drosera có

ở Việt Nam được nghiên cứu về thành phần hóa học cũng như dược tính, song trong

dân gian đã không ít người dùng chúng để chữa bệnh:

− Năm 1958-1959, bệnh viện Vinh từng dùng D burmanii dưới nhiều dạng khác

nhau (rượu thuốc, xirô, thuốc hãm, thuốc cao) chữa bệnh ho gà [6]

− D burmanii được công nhận có giá trị trong việc chữa những căn bệnh như: kiết

lị, lao hạch, cam tích (suy dinh dưỡng nhưng bụng chướng to ở trẻ em) [1], [5]

− Ở Thanh Hóa, người dân thường ngâm D indica (Cỏ Mồ côi, cỏ Trói gà) trong

rượu để chữa chai chân, chúng làm mềm và làm bong các vết chai sần [6]

Bảng 1.4 Dược tính và các hoạt tính ứng dụng khác của dịch chiết Drosera [99]

Chống lão hóa và xơ cứng động mạch Grieve (1959)

Ức chế độc tố Harborne (1982)

Chống hen suyễn Frenzer (1980)

Chống ung thư Kreher và ctv (1990); Fujii và ctv (1992)

Ngừa thai, phá thai Bhargava (1984); Bhagava và ctv (1985)

Chống nhiễm nấm Békésiová (1997)

Ngừa hủi, phong Bokemo (1984)

Chống vi khuẩn Lloyd và ctv (1994); Fujii và ctv (1992)

Chống đột biến Farr và ctv (1985); Durga và ctv (1992)

Ngừa giun lãi Fetterer và ctv (1991)

Chống co thắt Juniper và ctv (1989)

Chống virut Walt (1972)

Tim mạch Itoigawa và ctv (1991)

Dùng làm mỹ phẩm Slack (1980)

Miễn nhiễm Kreher và ctv (1990)

Diệt côn trùng Gujar và ctv (1988); Joshi và ctv (1989)

Chống vi trùng lao Gundidza và ctv (1990)

Chống ho gà Weiss (1991); Ragazzi và ctv (1993)

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 19

Hình 1.12 Một số hình thái lạ mắt của Drosera [131]

Bảng 1.5 Hoạt tính chống thụ thai công bố gần đây nhất của D burmanii [73]

Xử lý Liều lượng (mg/kg) % ức chế thụ thai

Dịch chiết nước 450 83,66

1.1.7.4 Trong công nghiệp

Ở một số nơi trên thế giới, dịch chiết Drosera được dùng làm đông tụ sữa do giàu

hàm lượng acid hữu cơ và enzyme [99] Ngoài ra sắc tố của một số loài Drosera

còn được dùng để nhuộm vải [32]

Thân hành của những loài Drosera ở Úc được xem như một món ăn cao lương mỹ

vị có nhiều giá trị bổ dưỡng [120]

1.1.7.5 Trong đời sống tinh thần

Sự đa dạng về giống loài, sự lạ mắt về hình thái khiến Drosera đem lại giá trị kinh

tế khá cao trong thị trường hoa cảnh thế giới (hình 1.11)

Luận án Tiến sĩ Sinh học Trang 20

1.1.8 Tình hình nghiên cứu

1.1.8.1 Trong nước

Ở Việt Nam, thị trường cây cảnh về loài cây bắt mồi mới chỉ thấy ở một vài năm

gần đây Giá trị sử dụng cũng như giá trị dược tính của chúng còn cục bộ ở một số

địa phương, chưa được phổ biến rộng rãi Do vậy, nhu cầu nhân giống in vitro hay

thu nhận dược chất từ loài cây này ở Việt Nam chưa được biết đến, tình hình nghiên

cứu về chúng chưa được đào sâu và còn khá mới mẻ

1.1.8.2 Ngoài nước

Bảng 1.6 Những nghiên cứu về nhân giống in vitro giống Drosera

Loài Mẫu cấy Môi trường Kết quả Tài liệu

tham khảo

D rotundifolia

MS (Murashige and Skoog 1962); RM (Reinert and Mohr 1967)