Luận văn Thạc sĩ Nghiên cứu nhân giống cây gấc (momordica cochinchinensis) bằng phương pháp nuôi cấy mô

 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khảnăng tái sinh chồi gấc; Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khảnăng nhân nhanh của chồi gấ

đại học thái nguyên TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ CễNG NGHỆ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học PGS TS Ngụ Xuõn Bỡnh

Thỏi Nguyờn

Trang phụ bỡa

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt

Danh mục các bảng

Danh mục các đồ thị

MỞ ĐẦU……… 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU……….… 4

1 TỔNG QUAN VỀ CÂY GẤC……… … 4

1.1 Giới thiệu chung về cõy Gấc……… 4

1.2 Nguồn gốc, phõn loại và đặc điểm thực vật học của cõy gấc……… 5

1.2.1 Phõn bố và gieo trồng……… 5

1.2.2 Đặc điểm thực vật học ……… 6

1.2.3 Đặc điểm sinh trưởng, phỏt triển……… 8

1.2.4 Cụng dụng của cõy Gấc………9

2 TèNH HèNH NGHIấN CỨU TRấN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM CÂY GẤC………10

2.1 Tỡnh hỡnh nghiờn cứu về mặt dược lý của cõy Gấc……… … 10

2.2 Tỡnh hỡnh nghiờn cứu về nhõn giống cõy Gấc bằng phương phỏp nuụi cấy mụ……… 13

3 KHÁI QUÁT VỀ NUễI CẤY Mễ TẾ BÀO THỰC VẬT………… 13

3.1 Khỏi niệm nuụi cấy mụ tế bào thực vật………… ……… 13

3.2 Sơ lược lịch sử nuụi cấy mụ tế bào thực vật………… ……… 14

3.3 Cơ sở khoa học của phương phỏp nuụi cấy mụ tế bào thực vật……… 16

3.4 Điều kiện và mụi trường nuụi cấy mụ tế bào thực vật……… 17

3.5 Cỏc cụng đoạn của nuụi cõy mụ tế bào……… 25

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIấN CỨU…… 28

1 Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiờn cứu……… …………28

1.1 Đối tượng nghiờn cứu……… ………28

1.2 Thời gian nghiờn cứu……… …… … …… 28

2 Nội dung và phương phỏp nghiờn cứu……… ……… 28

2.1 Nội dung nghiên cứu……… … … … 28

2.2 Phương pháp nghiên cứu……… ……… 28

2.3 Xử lý số liệu……… 35

2.4 Điều kiện thí nghiệm……… ………… 36

2.4.1 Thí nghiệm in vitro……… … 36

2.4.2 Thí nghiệm thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên…36 CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN………… 37

3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của hóa chất và thời gian khử trùng đến tỉ lệ sống của mẫu Gấc……… ……… 37

3.1.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của H2O2 đến tỷ lệ sống của mẫu Gấc 37

3.1.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của HgCl2 đến tỷ lệ sống của mẫu Gấc ……… 38

3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi cây Gấc……….… 41

3.2.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến khả năng tái sinh chồi cây Gấc…… ………….……… ……….… 41

3.2.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi cây Gấc……….………… 42

3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi cây Gấc… ………… …… 43

3.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của Kinetin đến hiệu quả nhân chồi… 44

3.3.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhân chồi……… 45

3.3.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và Kinetin đến hiệu quả nhân chồi……….… ……… 47

3.3.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và nước dừa đến hiệu quả nhân chồi……….…… 48

3.3.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả nhân chồi……….……… 49

3.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các chất kích thích sinh

trưởng đến khả năng ra rễ chồi Gấc……….………… 51

3.4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả ra rễ… 51 3.4.2 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến hiệu quả ra rễ 53 3.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây con trong vườn ươm……….……… 54

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……….… 56

1 KẾT LUẬN……….………… 56

2 KIẾN NGHỊ……… 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MUC CAC BANG TRONG LUÂN VĂN

Bảng 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 và thời gian khử trùng

đến tỷ lệ sống của mẫu gấc (Sau 15 ngày nuôi cấy)) 37Bảng 3.2

Ảnh hưởng của nồng độ HgCl2 và thời gian khử trùngđến tỷ lệ sống của mẫu gấc (Sau 15 ngày nuôi cấy) 38

Bảng 3.3 So sánh kết quả nghiên cứu khử trùng 2 loại hoá chất(Oxy già và HgCl

Bảng 3.4 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh chồi gấc 41Bảng 3.5 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến khả năngtái sinh chồi gấc 42Bảng 3.6 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ kinetin đến hiệu quả nhân chồi. 44Bảng 3.7 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của BAP đến hiệu quảnhân chồi. 45Bảng 3.8 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng sự phối hợp giữa BAPvà kinetin đến hiệu quả nhân chồi gấc. 46Bảng 3.9 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữaBAP và nước dừa đến hiệu quả nhân chồi gấc. 48Bảng 3.10 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của sự kết hợp giữaBAP và IBA đến hiệu quả nhân chồi gấc. 50Bảng 3.11 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả ra rễ. 51Bảng 3.12 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của NAA đến hiệu quảra rễ 52Bảng 3.13 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệsống của cây con trong vườn ươm. 54

DANH MUC CAC HÌNH TRONG LUÂN VĂN

Hình 3.1 Ảnh hưởng của chất khử trùng H2O2 đến tỷ lệ sống

Hình 3.2 Ảnh hưởng của chất khử trùng HgClcủa mẫu gấc 2 đến tỷ lệ sống 39

Hình 3.3 Ảnh hưởng của kinetin đến khả năng tái sinh chồi

Hình 3.4 Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi cây gấc 42Hình 3.5 Ảnh hưởng của kinetin đến hiệu quả nhân chồi cây gấc 44Hình 3.6 Ảnh hưởng của BAP đến hiệu quả nhân chồi cây gấc 46Hình 3.7 Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và Kinetin đến hiệu quả nhân chồi cây gấc 47Hình 3.8 Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và nước dừa

Hình 3.9 Ảnh hưởng của sự kết hợp giữa BAP và IBA đến hiệu quả nhân chồi cây gấc 50Hình 3.10 Ảnh hưởng của IBA đến hiệu quả ra rễ cây gấc 52Hình 3.11 Ảnh hưởng của NAA đến hiệu quả ra rễ cây gấc 53Hình 3.12 Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây controng vườn ươm 55

NHƯNG CHƯ VIÊT TĂT

MỞ ĐẦU

Gấc có tên khoa học là Momordica cochinchinensis thuộc bộ Vioales,

họ bầu bí (Cucurbitaceae) [8] Trong gấc có chứa lycopen và β-carcaroten với

hàm lượng cao gấp nhiều lần các thực phẩm đang được sử dụng phổ biến trênthế giới Quả gấc và hạt gấc chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học có giátrị, đặc biệt hạt gấc được dùng trong nhiều bài thuốc dân tộc để chữa bệnh [5,

6, 8] Ngoài ra, các nghiên cứu gần đây còn cho thấy dầu gấc có khả năngsửa chữa sai lệch DNA do bị chiếu tia tử ngoại [9], có tác dụng chống phóng

xạ đó là những cơ sở để sử dụng dầu gấc trong việc điều trị bệnh ung thư [5]

Về mặt dinh dưỡng, tác giả Vương Thuý Lệ đã chứng minh rằng, gấc

có hàm lượng β-carcarotene cao nhất trong các loại trái cây với hàm lượng 35,5mg/100g thịt trái [20] Hàm lượng lycopene trong gấc cao gấp 76 lần

khoai tây [18] Vương Thuý Lệ và cs (2002) đã khảo sát thực nghiệm tác

dụng của β-carcarotene trong gấc đến trẻ em (ở miền Bắc Việt Nam) cho thấy, lượng hồng cầu, β-carcarotene, vitamin A trong máu của nhóm ăn xôi gấc tăng lên rõ rệt so với hai nhóm ăn dầu gấc và β-carcarotene tổng hợp [19] Aoki và cs (2002) nghiên cứu những chất màu có trong gấc Gấc chứa β-carcarotene,

lycopene, zeaxanthin, β-carcryptoxanthin Trong đó hàm lượng lycopene đạt

380µg/g thịt trái [14] Ishida và cs (2004) nghiên cứu thành phần acid béo và

carotenoid trong gấc cho thấy, thịt gấc chứa 22% acid béo gồm có 32% oleic

acid, 29% palmitic acid và 28% linoleic acid [18]

Về mặt dược học, đã có nhiều nghiên cứu về khả năng khắc phục hậu

quả chất độc màu da cam và phòng chữa ung thư gan của β-carcarotene có trong

gấc Thơi gian gân đây , quả gấc đã bắt đầu được tiếp thị ở khu vực châu Á

với nhiêu dang san phâm như n ước ép , d ầ u gấ c Tư năm 2002, ở Việt Nam san phâm dâ u Gâc (VINAGA) đươc ban nhiêu trên thi trương trong va ngoài nước Nhu câu ngay c àng tăng của sản phẩm quả g ấc làm nguyên liệu

chê biên ơ mưc công nghiêp đa hinh thanh cac vung san xuât nguyên liêu tainhiêu tinh khu vực phía Bắc và phía Nam của Việt Nam

Ở Việt Nam cây gấc được trồng rải rác khắp nơi, tập trung nhiều nhất

là các vùng phía Bắc Gấc có thể trồng bằng hạt hay giâm cành nhưng cho hệ

số nhân giống không cao [8] Mặt khác, gấc là lo ại cây đơn tí n h k h ác g ố c , cây moc tư hat se phân hoa thanh cây đưc va cây cai ri êng biêt Viêc trông cây gấc bằng phương pháp gieo hạt truyền thống làm giảm hiệu quả sản xuất ,tôn kem vê công sưc va chi ph í do không thê phân biêt đươc đăc điêm giơi tính của cây ở giai đoạn đầu trước khi cây ra hoa Vì vậy, để phát triển vùng nguyên liêu san xuât gấc, cân thiêt phai tiên hanh cac ky thuât nhân giông vô tính từ cây cái có năng suất và chất lượng ổn định Phương pháp này đã và đang chứng tỏ là một phương pháp có ý nghĩa quan trọng cho công tác giống cây trồng, mang lại hiệu quả kinh tế cao

Xuất phát từ tính cấp thiết của đề tài, chúng tôi tiến hành: “Nghiên cứu nhân giống cây gấc (Momordica cochinchinensis) bằng phương pháp nuôi cấy mô”

Mục đích nghiên cứu và nội dung nghiên cứu

2 Nội dung nghiên cứu

 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng và hoá chất khử trùng đến tỉ lệ sống của mẫu gấc;

 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khảnăng tái sinh chồi gấc;

 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khảnăng nhân nhanh của chồi gấc;

 Nghiên cứu ảnh hưởng của một số chất điều tiết sinh trưởng đến khảnăng ra rễ của chồi gấc;

 Xác định giá thể phù hợp cho sinh trưởng phát triển của cây in vitrongoài vườn ươm

Ý nghĩa của đề tài:

-car Ý nghĩa khoa học

 Kết quả nghiên cứu đưa ra một số kỹ thuật vi nhân giống cây gấc bằngphương pháp in vitro Từ đó, đánh giá được tác động của một số chấtđiều tiết sinh trưởng trong nhân giống cây gấc

 Bổ sung nguồn tài liệu tham khảo phục vụ nghiên cứu, giảng dạy vàsản xuất giống gấc thương phẩm có năng suất cao

-car Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu góp phần hoàn thiện kỹ thuật nhân giống cây gấcnhằm cung cấp giống gấc với số lượng lớn, chất lượng đảm bảo, đồng thờigiữ được đặc tính di truyền của cây chọn lọc

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 TỔNG QUAN VỀ CÂY GẤC

1.1 Giới thiệu chung về cây gấc

Gấc là loài cây thân thảo, dây leo thuộc chi mướp đắng, hoa sắc vàng,quả hình bầu dục, đáy nhọn, ngoài có nhiều gai, sắc xanh, khi chín chuyểnsang màu đỏ cam Thịt gấc màu đỏ cam, hạt gấc màu nâu thẫm, hình dẹp, cókhía [2] Ở miền Nam gấc có quanh năm, miền Bắc gấc thường chín vào mùađông Các nghiên cứu khoa học cho thấy trong quả gấc chứa nhiều vitamin,

đặc biệt là rất giàu β-carcarotene, lycopene là các vi chất thiên nhiên rất cần thiết cho cơ thể con người Lycopene và β-carcarotene được chứng minh là chất

chống oxy hóa, có khả năng trung hòa các gốc tự do, chống lại sự già nua của

tế bào cơ thể, giúp trẻ hóa làn da, sửa chữa những tổn thương trong cấu trúc

cơ thể, giúp ngăn ngừa bệnh ung thư và các bệnh gan, mật Lycopene là

carotenoid duy nhất có khả năng ngăn ngừa được chứng nhồi máu cơ tim,bảo vệ gen khỏi bị tổn thương và có khả năng hạn chế những biến chứng củabệnh tiểu đường [9]

Các nhà nghiên cứu cũng thừa nhận gấc là loại quả sạch, an toàn và cóhiệu quả chống oxy hóa cao hơn cà chua và cà rốt nhiều lần, tăng khả năngmiễn dịch và sức đề kháng cho cơ thể, loại bỏ phần nào tác hại của môitrường như tia xạ, thuốc trừ sâu giúp cơ thể khỏe mạnh, da dẻ mịn màng

Phần ăn được của gấc chứa lượng β-carcarotene (chiếm gần 1/2 tổng carotenoid

có trong dầu gấc) cao gấp hai lần so với dầu gan cá thu và khoảng 10 lần so

với cà rốt [11] Đó là nguồn β-carcarotene thiên nhiên thuần túy nên có tác dụng

chống lão hóa mạnh nhất, đồng thời bổ sung nguồn vitamin A hợp lý và an

toàn Khi vào cơ thể, β-carcarotene dưới tác dụng của men carotenase có trong

gan và thành ruột sẽ chuyển hóa thành vitamin A, vì vậy khi sử dụng gấc sẽkhông có hiện tượng thừa vitamin A Thành phần carotenoid có trong gấcphụ thuộc rất nhiều vào giống, đất trồng với hàm lượng dao động 3.768-7.516µg/g Trong quả gấc thì màng hạt là bộ phận có hàm lượng acid béocao, bao gồm các acid béo không no là các thành phần được gọi là nhữngchất béo có lợi vì có tác dụng tốt trên hệ tim mạch thông qua việc giảm huyết

áp, cải thiện cấu trúc mạch vành và giúp giảm nguy cơ mắc các bệnh lýtim mạch [11]

1.2 Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm thực vật học của cây gấc

1.2.1 Phân bố và gieo trồng

Cây gấc được trồng rải rác ở khắp nước ta, ngoài ra còn thấy ở Lào,Campuchia, các nước phía Nam và Đông Nam Á như Ấn Độ, Thái Lan, namTrung Quốc, Nhật Bản [8]

Cây gấc là một loại dây leo, mỗi năm lụi một lần, nhưng lại đâm chồi

từ gốc cũ lên vào mùa xuân năm sau, hoặc thường được gieo trồng vào tháng

2, 3 Đây là loại cây ưa khí hậu ấm áp, độ ẩm không khí cao 60 - 70% và độ

ẩm đất 70 - 80%, nhưng kém chịu rét, chịu được hạn nhưng không chịu đượcúng ngập nước Nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng và phát triển trongkhoảng 250C - 350C Cây gấc không kén đất, đất sỏi đá, đất pha đều trồngđược, tốt nhất là đất thịt nhẹ, đất phù sa bồi có đủ ẩm và thoát nước tốt, pHthích hợp trong khoảng 5,6 đến 7 Đặc biệt, cây gấc rất thích hợp với đất giàulân do đó trên đất nghèo lân cần phải bón phân lân sẽ giúp cho gấc có nhiềuquả Lá mọc so le, chia thuỳ khía sâu tới 1/2 phiến lá Hoa đực, hoa cái riêngbiệt, cánh hoa màu vàng nhạt Mùa hoa tháng 4, tháng 5 Quả hình bầu dụcdài độ 15 - 20cm, đáy nhọn, ngoài có nhiều gai, khi chín màu vàng đỏ đẹptươi Mùa quả tháng 6 đến tháng 2 năm sau Gấc nếp thì quả có gai thưa hơngấc tẻ Trong quả có nhiều hạt xếp thành những hàng dọc, quanh hạt có màng

màu đỏ máu, tươi Bóc lớp màng đỏ sẽ thấy hạt hình gần giống con ba banhỏ, ngoài có lớp vỏ cứng, mép có răng cưa Trồng một năm có thể thu hoạchhàng chục năm Ngay năm đầu đã có quả nhưng ít, càng về sau càng nhiềuquả [8].

lá 12 đến 20 cm, phía đáy hình trái tim, mặt trên phiến lá sờ ram ráp Nơi tiếpgiáp cuốn và phiến lá có hai tuyến to gần bằng hạt ngô nổi như hai mắt cua

Hoa nở vào tháng 4 đến tháng 5 Hoa đực cái riêng biệt, hoa đực có lábắc to bao lại như hình tổ sâu, khi nở hoa loe ra hình phễu, màu trắng vàngmặt trong tràng hoa có lông, 5 nhị Hoa cái có lá bắc nhỏ, bầu hình thoi rõ từkhi nụ còn non, có gai nhỏ, cánh hoa ở đầu bầu, phát triển thành quả từ tháng6

Quả to hình bầu dục dài từ 15 - 20cm, đuôi nhọn có nhiều gai mềm đỏđẹp Quả non màu xanh, quả chín màu đỏ tươi Bổ đôi theo chiều ngang thấy

có 6 hàng hạt xếp đều nhau, mỗi hàng có từ 6 đến 10 hạt Quanh hạt có nhiềumàng màu đỏ tươi Người ta còn dựa vào độ sai của quả (nhiều hay ít), kíchthước của quả (to hay nhỏ), gai quả (dày hay thưa), màu sắc của ruột quả (đỏhay vàng gạch), dầu (ít hay nhiều), số lượng hạt (nhiều hay ít) để phân loại:gấc tẻ, gấc nếp, gấc đá, gấc chôm chôm hay gấc lai

Có hai loại được trồng chủ yếu là:

Gấc nếp: Trái to, nhiều hạt, gai to, ít gai, khi chín chuyển sang màu

đỏ cam rất đẹp Bổ trái ra bên trong cuồi (cơm) vàng tươi, màng đỏ bao bọchạt có màu đỏ tươi rất đậm và dày thớ

Gấc tẻ: Trái nhỏ hoặc trung bình vỏ dày tương đối có ít hạt, gai nhọn,trái chín bổ ra bên trong cơm có màu vàng nhạt và màng đỏ bao bọc hạtthường có màu đỏ nhạt hoặc màu hồng không được đỏ tươi như gấc nếp, nênchọn giống gấc nếp để có trái to nhiều thịt bao quanh và chất lượng cũng tốthơn

Hạt gấc có màng đỏ bao quanh lớp vỏ cứng đen, quanh mép có răngcưa tù và rộng, hạt dày 25 - 35mm, rộng 19 - 31mm trông gần giống con ba

ba nhỏ bằng gỗ do đó gấc còn có tên gọi là mộc miết tử (mộc là gỗ, miết làcon ba ba) trong hạt có nhân chứa dầu

Quả bắt đầu thu hoạch vào tháng 9, rộ vào tháng 11 đến tháng 12 và tớicuối tháng 1 vẫn còn gấc xanh trên cây Mỗi cây cho trung bình 30 đến 60quả mỗi năm, kích thước và khối lượng mỗi quả cũng có thể thay đổi tùythuộc vào từng giống, trọng lượng mỗi quả có thể từ 0,5 đến 3,0kg Quả gấc

bổ đôi có các thành phần sau:

Lớp vỏ cứng có gai bọc phía ngoài có màu xanh, khi chín có màu vàngđỏ

- Lớp thịt màu vàng dày, mềm.

- Lớp trong cùng là hạt và màng đỏ bao ngoài hạt gấc xếp thành 6hàng, mỗi hàng có từ 6 - 10 hạt [17]

1.2.3 Đặc điểm sinh trưởng, phát triển

- Ánh sáng: Cây gấc là cây ưa ánh sáng ngắn ngày, ưa khí hậu ấm áp

và độ ẩm không khí cao, chịu hạn và chịu rét kém Cây sinh trưởng tốt trongđiều kiện cường độ chiếu sáng mạnh nhưng quả phát triển tốt trong điều kiệnchiếu sáng giảm Giai đoạn quả đang lớn nếu gặp ánh sáng chiếu trực tiếpquả rất dễ bị rám, thối hoặc sớm rụng Chính vì vậy trồng gấc tốt nhất nênlàm giàn để nâng cao chất lượng cũng như phẩm chất quả

Nhiệt độ: Nhiệt độ trung bình cho gấc phát triển là từ 25 - 270C, hạtgấc có thể nảy mầm ở nhiệt độ 13 - 150C, nhưng tốt nhất ở 250C

Đất đai: Gấc không chịu được úng ngập, đọng nước, vì vậy khi trồngtốt nhất nên làm vồng, ụ hay trồng ở nơi có khả năng tiêu thoát nước tốt Câygấc cần nước nhiều nhất ở giai đoạn ra hoa và phát triển trái Thiếu nướctrong giai đoạn này sẽ làm hoa rụng, trái phát triển kém, năng suất thấp Giaiđoạn từ khi mới trồng đến trước khi ra hoa yêu cầu độ ẩm đất đạt 65 - 70%,

độ pH 5,6 - 7,0

Cao độ: Gấc có thể phân bố ở độ cao từ 0 - 1500m so với mặt nướcbiển Để gấc cho nhiều quả nhất thiết phải làm giàn, càng có điều kiện vươn

xa ánh sáng mặt trời thì gấc càng cho nhiều quả

Kĩ thuật trồng và thu hoạch: Gấc là loại cây dễ trồng có thể trồng bằnghạt hay giâm cành vào các tháng 2 - 3 Tuy nhiên, trồng bằng hạt tỷ lệ câyđực cao hơn cây cái, do đó nên trồng bằng dây Khi trồng nên kết hợp cả hailoại để có tỷ lệ hoa đực, hoa cái phù hợp nâng cao tỷ lệ thụ phấn sẽ sai quả.Trồng 1 năm thu hoạch nhiều năm, mùa thu hoạch quả tháng 8 - 9 đến

tháng 1 - 3 năm sau Sau đó, cây lụi đi sang xuân lại nẩy chồi mọc cây mới [17].

1.2.4 Công dụng của cây gấc

Quả chín hái về đem bổ, vét hạt với cả màng đỏ Nếu để nấu xôi thìdùng tươi trộn với gạo (có thể thêm ít rượu) Nếu để chế dầu gấc thì phải sấyhay phơi khô tới khi không còn dính tay, bóc lấy màng đỏ tươi rồi lại phơihay sấy khô ở nhiệt độ thấp (600C - 70oC) Tán nhỏ màng rồi áp dụng mộttrong hai phương pháp sau [8]:

1 Chiết bằng dung môi: Lấy kiệt bằng ete dầu hoả Sau đó, thu hồi ete

bằng đun cách thủy trong khí Nitơ hay khí carbonic Cặn còn lại là dầu gấc

Để lâu dầu này sẽ để lắng một lớp tinh thể caroten thô ở dưới, bên trên là lớpdầu no caroten Tỷ lệ dầu trong màng đỏ là 8% Trung bình 100kg quả gấccho độ 1,9 lít dầu gấc

2 Ép dầu : màng đỏ đã sấy khô, tán nhỏ, đem đồ lên rồi ép lấy dầu Để

lâu cũng sẽ phân làm 2 lớp như trên Dùng cồn 950 loại acid tự do trong dầutheo 2 phương pháp trên thì được dầu chế trung tính

Thành phần hoá học:

Dầu gấc: Dầu sánh, trong, màu đỏ tím đậm, mùi thơm vị ngọt, vị béo,

không khé cổ Tỉ lệ caroten trên 0,15% Nếu có cặn phải là cặn caroten tinh thể Dược điển Việt Nam (1997) quy định dầu phải chứa ít nhất 0,1% β-car

caroten, 1ml dầu gấc có 30mg caroten tương ứng với 50.000 đơn vị quốc tế

vitamin A

Hạt gấc: Khô, già, vỏ ngoài cứng đen, chắc, nặng, mép có răng cưa tù

và rộng, trong có nhân trắng ngà, có dầu, không bị thối đen Nguyên hạt,không vỡ nát, không thối nhân, không lẫn tạp chất là tốt Trong nhân hạt gấccó: 6% nước, 2,9% chất vô cơ, 55,3% chất béo, 16,6% chất protid, 2,9%đường toàn bộ, 1,8% tanin, 2,8% cellulose và 11,7% chất không xác định

được Ngoài ra, còn có các men phosphatase, invectase và peroxydase.

Công dụng:

1 Màng gấc: Nhân dân ta dùng đồ xôi, ăn cả xôi và màng gấc.

2 Dầu gấc: Dầu gấc có tác dụng như những thuốc có vitamin A, dùng bôi lên

các vết thương, vết loét, vết bỏng làm cho da chóng lành Uống dầu gấc,người bệnh chóng lên cân, tăng sức chống đỡ bệnh tật của cơ thể, do chất

caroten dưới tác dụng của men carotenase có nhiều trong gan sẽ tách β-car caroten thành hai phần tử vitamin A Dùng cho trẻ em chậm lớn, trong bệnh

khô mắt, quáng gà

3 Hạt gấc: Trong lịch sử các nhà đông y đã sử dụng hạt gấc để trị bệnh, uống

hoặc ngâm trong cồn hoặc thuốc để xoa bóp Hạt gấc vị đắng, hơi ngọt, tính

ấm, có độc, dùng chữa các chứng bệnh mụn nhọt độc, tràng nhạt, eczema,viêm da thần kinh, trĩ, phụ nữ sưng vú Có thể chế thuốc viên hay tán bộtuống Liều uống từ 0,8 - 1,2g Nhưng thường dùng đắp ngoài da đồ mụnnhọt Nhân dân ta còn dùng để đắp chữa chai bàn chân

4 Rễ gấc: Sao vàng, tán mỏng, dùng uống chữa tê thấp sưng chân gọi là

2.1 Tình hình nghiên cứu về mặt dƣợc lý của cây gấc

Thực tế nghiên cứu khoa học cho thấy, công dụng của gấc với sứckhỏe con người còn hơn thế rất nhiều Trong trái gấc, dầu gấc là phươngthuốc kỳ diệu Dầu gấc sánh, trong, màu đỏ tím đậm, mùi thơm vị ngọt, béo

Dầu gấc có chức năng phòng chống thiếu vitamin, tăng khả năng miễn

dịch, tăng sức đề kháng của cơ thể, chống oxy hoá, chống lão hóa tế bào,phòng chữa bệnh tật, loại bỏ các tác động có hại của môi trường như hóa chấtđộc, tia xạ giúp cơ thể phát triển khoẻ mạnh, nhất là đối với phụ nữ và trẻ

em [11]

Các nhà khoa học Mỹ sau gần chục năm nghiên cứu cây gấc và sảnphẩm từ gấc đã thừa nhận: Gấc là một loại quả sạch nhất, an toàn nhất và cóhiệu quả chống ôxy hóa cao hơn cà chua và cà rốt rất nhiều lần

Các hãng dược phẩm lớn của Mỹ gọi trái gấc là fruit from heaven (loạiquả đến từ thiên đường) Một số nghiên cứu của Mỹ được công bố gần đây

cho thấy các hợp chất của β-carCaroten, Lycopen, Alphatocopherol,…có trong

dầu gấc có tác dụng làm vô hiệu hóa 75% các chất gây ung thư nói chung,nhất là ung thư vú ở phụ nữ [15]

Gấc là loại thực phẩm đã được sử dụng lâu đời ở nước ta, nhưng việcnghiên cứu cây này thì mới chỉ được nghiên cứu trong những năm gần đây.Tại Việt Nam, Đại học Bách Khoa Hà Nội và Viện Dinh Dưỡng Việt Namcũng từng có đề tài nghiên cứu về bột gấc Nghiên cứu, cho thấy khi dùng bộtgấc cho gà ăn thì thấy toàn bộ số gà được ăn bột gấc không bị chết dịch vàcho chất lượng lòng đỏ trứng rất tốt Lô gà không được ăn bột gấc để đốichứng thì bị mắc bệnh rất nhiều… Điều đó chứng tỏ gà được ăn thức ăn cóbột gấc sẽ có sức đề kháng cao, không bị nhiễm dịch bệnh và chất lượng thịt

và trứng cao hơn

Ở Việt Nam, Từ những năm 1941, Bùi Đình Sang và cs đã dùng dầugấc để chế tạo son môi cho các “bà đầm” người Pháp, sau đó cả phụ nữTràng An dùng thì thấy môi đỏ thắm, rất “nhuận”, ướt và má hồng tươi …[8]

Dầu gấc còn có thể được chế tạo làm kem dưỡng da rất tuyệt vời Vìvậy, các hãng mỹ phẩm có thể dùng dầu gấc để sản xuất son môi, kemdưỡng

da…vừa có tác dụng làm đẹp, vừa có tác dụng nâng cao sức khỏe cho phụ nữ.

Từ năm 1941, Bộ môn dược liệu Đại học Dược Hà Nội đã bước đầuxác định màng đỏ bao quanh hạt gấc có chứa beta-caroten và một tỷ lệ dầuthảo mộc cao Một số nhà khoa học Đại học y Hà Nội và Đại học Dược HàNội thời đó đã chứng minh dầu màng đỏ bao quanh hạt gấc có tác dụng giốngnhư vitamin A và có tác dụng tăng trọng cho súc vật và người[8]

Năm 1951, Nguyễn Văn Đàn và cs đã mang dược liệu này sang nghiên

cứu ở Đức và xác định ngoài β-carcaroten thì phần này của quả gấc còn chứa

lycopen là một chất chống lão hóa mạnh nhất hiện nay Ngành dược Việt

Nam đã sản xuất một số chế phẩm có chứa dầu màng gấc làm thuốc bổ, điềutrị suy dinh dưỡng cho trẻ em và một số bệnh về mắt, đặc biệt, trong khoảngthời gian 20 - 30 năm gần đây, các bác sĩ đã sử dụng dầu màng gấc để phòng

và điều trị một số bệnh ung thư ở Việt Nam [8]

Như vậy, việc phát triển trồng rộng rãi cây gấc để cung cấp các sản

phẩm có chứa β-carcaroten, vitamin E và vitamin F phục vụ nhu cầu phòng

bệnh và chữa bệnh cho nhân dân ta là một hướng cần được khuyến khích vàđầu tư Các thuốc này không những sẽ góp phần hạn chế nhập khẩu các thuốcchống suy dinh dưỡng, phòng chống lão hóa mà còn có khả năng xuất khẩusang các nước khác, vì cây gấc là một loại thực vật độc đáo ở nước ta

Năm 2001, Nguyễn Công Suất và cs là người đầu tiên chiết xuất dầugấc trên dây chuyền công nghệ hiện đại để biến gấc thành “cây hàng hóa”.Ông là người khởi xướng việc sản xuất viên nang dầu gấc với thương hiệuVINAGA, được thị trường Mỹ và trong nước tin dùng Viên nang dầu gấcVINAGA đã có mặt trên thị trường quốc tế và các hiệu thuốc trên toàn quốc,

được thị trường đón nhận và tin dùng bởi hàm lượng β-carCaroten của gấc cao

gấp 68 lần cà chua, có tác dụng phòng chống thiếu vitamin, tăng khả năngmiễn dịch, tăng sức đề kháng của cơ thể, chống oxy hóa, chống lão hóa tế

bào, loại bỏ các tác hại của môi trường: hóa chất độc hại, tia xạ, thuốc trừsâu,…giúp cơ thể khỏe mạnh, da dẻ hồng hào, mịn màng VINAGA rất cầnthiết cho mọi gia đình, nhất là phụ nữ và trẻ em Thương hiệu gấc Việt Namdành cho các bà nội trợ dùng nấu xôi, chế biến các món ăn, dùng thay phẩmmàu trong chế biến thức ăn, cho vào cháo, sữa cho trẻ nhỏ…để phòng chốngsuy dinh dưỡng, thiếu vi chất, tăng sức đề kháng cho trẻ em [8].

2.2 Tình hình nghiên cứu về nhân giống cây gấc bằng phương pháp nuôi cấy mô

Hiện nay, trên thế giới và Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về nuôicây mô tế bào thực vật cây gấc Năm 1996, tác giả Phan Tuấn Nghĩa và cộng

sự đã hoàn thiện quy trình nhân nhanh cây gấc từ nguyên liệu ban đầu là hạtgấc bằng phương pháp nuôi cấy mô cho phép sản xuất hàng loạt cây gấctrong khoảng thời gian 10 đến 12 tuần [7] Năm 2009, tác giả Lê Văn Hoà và

cs đã thử nghiệm vi nhân giống cây gấc bằng nuôi cấy mô tế bào và đưa rađược một số môi trường nhân nhanh cơ bản và giá thể thử nghiệm ra vườnươm, kết quả như sau: (1) Môi trường thích hợp cho sự nhân chồi gấc in vitro

là môi trường cơ bản MS có bổ sung 100ml/l nước dừa, 7,5g/l agar, 25g/lđường, 0,2mg/l BA và 0,2mg/l IBA cho hiệu quả cao nhất; (2) Sử dụng môitrường cơ bản MS có bổ sung 100ml/l nước dừa, 7,5g/l agar, 25g/l đường,0,2mg/l NAA và 2g/l than hoạt tính thích hợp cho sự tạo rễ chồi gấc in vitro;(3) Sử dụng môi trường chất nền là tro trấu có phủ màng nylon thích hợp chobước đầu thuần dưỡng cây gấc ex vitro [3]

3 KHÁI QUÁT VỀ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT

3.1 Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cảcác loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật trên môi

trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng [1] Nhân giống vô tính

in vitro được tiến hành trên nguyên tắc cắt nuôi đoạn thân có mang chồi ởnách lá, đoạn rễ hay mảnh củ

3.2 Sơ lƣợc lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật

Nuôi cấy mô tế bào thực vật đã trải qua một lịch sử phát triển lâu dài

và được đánh dấu bằng những sự kiện chính sau:

- Năm 1902, Harberlandt lần đầu tiên đưa ra các lý thuyết và Schneider

và Butschli (người mô tả chính xác quá trình phân chia tế bào) vào thựcnghiệm nuôi cấy mô cây 1 lá mầm nhưng không thành công [10]

- Năm 1929 – 1933, Bchumuker, Scheitter, Pfcifer và Lance thànhcông trong việc nuôi cấy một đoạn đầu mút rễ hoàn chỉnh [10]

- Năm 1934, Kogl lần đầu tiên xác định được vai trò của IAA, mộthooc môn thực vật đầu tiên thuộc nhóm Auxin có khả năng kích thích sự pháttriển tăng trưởng và phân chia tế bào thực vật

- Năm 1939, Gautheret, Nobecourt và White đã đồng thời nuôi cấy môsẹo thành công trong thời gian dài từ mô tượng tầng Nobetcourt nuôi cấy củ

Cà rốt và nhận được sự phân bào tạo ra khối tế bào phân chia

- Năm 1941, Overbeek và cộng sự đã sử dụng nước dừa trong nuôi cấyphôi non ở cây cà rốt Patura

- Năm 1955, Miller và cộng sự phát minh ra cấu trúc và sinh tổng hợpKinetin là 1 cytokinin đóng vai trò quan trọng trong phân bào và phân hóachồi ở mô nuôi cấy

- Năm 1957, Skoog và Miller tạo ra được chồi từ mảnh mô thân câythuốc lá đồng thời khám phá vai trò của tỷ lệ nồng độ các chấtAuxin/Cytokinin, nồng độ auxin/nồng độ cytokinin < 1 có xu hướng tạo rachồi Ngược lại khi nồng độ auxin/nồng độ cytokinin > 1 mô có xu hướng tạo

rễ Tỷ lệ nồng độ auxin và cytokinin thích hợp sẽ kích thích phân hóa cả chồi

và rễ, tạo cây hoàn chỉnh

- Năm 1958, Keinert và Sterward tạo được phôi và cây hoàn chỉnh từ

tế bào tượng tầng tách từ cây cà rốt được nuôi cấy một dạng huyền phù

- Năm 1960, Morel đã thực hiện bước ngoặt cách mạng trong sử dụng

kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng trong nhân nhanh các loại địa lancymbidim

- Năm 1960, Cooking lần đầu tiên sử dụng enzym phân giải thành tếbào và đã tạo ra số lượng lớn tế bào trần ở những cây trồng khác nhau

- Năm 1966, Guha và cộng sự thành công trong nuôi cấy thể đơn bội ở

cà độc dược từ bao phấn

- Năm 1967- 1968, Nichkoi Nakato và cộng sự tạo được cây đơn bội từbao phấn thuốc lá

- Năm 1971, Takeb tái sinh thành công cây thuốc lá từ tế bào trần

- Năm 1972, Carlson và cộng sự lần đầu tiên thực hiện lai tế bào somagiữa các loài, tạo được cây từ dung hợp tế bào trần của 2 loài thuốc láNicotiana glauca và N langsdorfi

- Năm 1977, Chers lai thành công tế bào soma cây cà chua và câykhoai tây

Từ năm 1977 đến nay, công nghệ tế bào thực vật đã có những bướctiến vượt bậc với việc áp dụng các công nghệ cao trong chọn tạo giống câytrồng như: đột biến tế bào soma, cứu phôi lai xa, dung hợp tế bào trần, tạodòng kháng thể, nuôi cấy bao phấn, hạt phấn trên nhiều đối tượng cây trồng.Chúng ta đang bước vào giai đoạn thứ tư của nuôi cấy mô tế bào, đây là giaiđoạn nuôi cấy mô tế bào được ứng dụng mạnh mẽ vào thực tiễn chọn giống,nhân giống, sản xuất các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học và nghiên cứu lý

luận di truyền ở thực vật bậc cao [1].

3.3 Cơ sở khoa học của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật.

* Tính toàn năng (Totipotence ) của tế bào

Năm 1902, Nhà Sinh lý thực vật học người Đức Haberlandt, đã tiếnhành nuôi cấy các tế bào thực vật để chứng minh tế bào là toàn năng

Haberlandt cho rằng mỗi tế bào của bất kỳ sinh vật nào cũng đều cókhả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh Ông nhận thấy,mỗi tế bào của cơ thể đa bào đều phát sinh từ hợp bào thông qua quá trìnhphân bào nguyên nhiễm Điều đó có nghĩa là mỗi tế bào của một sinh vật sẽchứa toàn bộ thông tin di truyền cần thiết của một cơ thể hoàn chỉnh Khi gặpđiều kiện thuận lợi nhất định, những tế bào đó có thể sẽ phát triển thành một

cơ thể hoàn chỉnh

Năm 1953, Miller và Skoog (Notingham Unio) đã thành công khi thựcnghiệm tái sinh cây con từ tế bào lá, chứng minh được tính toàn năng của tếbào Thành công trên đã tạo ra công nghệ sinh học ứng dụng trong nhân giống

vô tính, tạo giống cây trồng và dòng chống chịu [10]

Tính toàn năng của tế bào mà Haberlandt nêu ra chính là cơ sở lý luậncủa phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật Cho đến nay, con người đãhoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh

từ một tế bào riêng rẽ

* Sự phân hoá và phản phân hoá tế bào

Sự phân hoá tế bào là sự chuyển các tế bào phôi sinh thành các tế bàocủa mô chuyển hoá, đảm nhận các chức năng khác nhau trong cơ thể Ví dụ:

Mô dậu làm nhiệm vụ quang hợp, mô bì làm nhiệm vụ bảo vệ, nhu mô làmnhiệm vụ dự trữ, mô dẫn làm nhiệm vụ vận chuyển nước và chất dinh dưỡng

Quá trình phân hoá tế bào được biểu diễn ở sơ đồ sau:

Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào chuyên hoá

Mặc dù các tế bào đã chuyển hoá thành các mô chức năng nhưngchúng vẫn không mất đi khả năng phân chia của mình Trong điều kiện thíchhợp, các tế bào lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ.Quá trình đó được gọi là phản phân hoá tế bào (ngược lại với quá trình phânhoá tế bào) Sơ đồ hoá như sau:

Phân hoá tế bào

Tế bào phôi sinh Tế bào giãn Tế bào chuyên hoá

Phản phân hoá tế bào

Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là một quá trình hoạt hoá,phân hoá gen Tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển cá thể, cómột số gen được hoạt hoá (mà trước đây bị ức chế) để cho biểu hiện trạngthái mới, một số gen khác lại bị đình chỉ hoạt động Điều này xảy ra theo mộtchương trình đã được mã hoá trong cấu trúc phân tử ADN của mỗi tế bào.Mặt khác, khi tế bào nằm trong khối mô của cơ thể thường bị ức chế bởi các

tế bào xung quanh Khi tách riêng tế bào tạo điều kiện thuận lợi cho các genđược hoạt hoá Quá trình phân hoá được xảy ra theo một chương trình định sẵn[10]

3.4 Điều kiện và môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường nuôi cấy là yếu tố quyết định cho sự phân hoá tế bào và cơquan nuôi cấy

a) Điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật

* Điều kiện vô trùng

Nuôi cấy in vitro là nuôi cấy trong điều kiện vô trùng Nếu không đảmbảo tốt điều kiện vô trùng nuôi cấy thì môi trường sẽ bị nhiễm, mô nuôi cấy

sẽ bị chết Điều kiện vô trùng có ý nghĩa quyết đến sự thành bại của nuôi cấy

Phương tiện khử trùng: Nồi hấp vô trùng, tủ sấy, buồng cấy và tủ cấy

vô trùng, phòng nuôi cây

* Điều kiện ánh sáng và nhiệt độ

Ánh sáng và nhiệt độ là hai yếu tố chính có ảnh hưởng cơ bản đến quátrình sinh trưởng của mô nuôi cấy

Ánh sáng:

Sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy chịu ảnh hưởng từ các yếu tốnhư: thời gian chiếu sáng, cường độ ánh sáng và chất lượng ánh sáng Thờigian chiếu sáng tác động đến quá trình phát triển của mô nuôi cấy Thời gianchiếu sáng thích hợp với đa số các loài cây là 12 – 18h/ngày Cường độ ánhsáng tác động đến sự phát sinh hình thái của mô nuôi cấy

Theo Ammirato (1986): Cường độ ánh sáng cao kích thích sự sinhtrưởng của mô sẹo, ngược lại, cường độ ánh sáng thấp kích thích sự tạo chồi.Nhìn chung, cường độ ánh sáng thích hợp cho mô nuôi cấy là 1000 - 7000lux(Morein, 1974), ngoài ra chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng tới sự phát

sinh hình thái của mô thực vật in vitro: Ánh sáng đỏ làm tăng chiều cao củathân chồi hơn so với ánh sáng trắng Nếu mô nuôi cấy trong ánh sáng xanhthì sẽ ức chế vươn cao nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới sự sinh trưởng của môsẹo Hiện nay, trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô để cung cấp nguồnánh sáng có cường độ 2000 - 2500lux, người ta sử dụng các dàn đèn huỳnhquang đặt cách bình nuôi cấy từ 35- 40cm [4].

Nhiệt độ:

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật, nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnhhưởng tới sự phân chia tế bào và các quá trình sinh hóa trong cây Tùy thuộcvào xuất xứ của mẫu nuôi cấy mà điều chỉnh nhiệt độ cho phù hợp Nhìnchung nhiệt độ thích hợp nhất cho sự sinh trưởng tốt ở nhiều loài cây là 250C[4]

b) Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật

Môi trường dinh dưỡng có đầy đủ các chất dinh dưỡng, các chất cầnthiết cho sự phân chia, phân hoá tế bào cũng như sự sinh trưởng bình thườngcủa cây

Thành phần hóa học của môi trường đóng vai trò quyết định đến sựthành công hay thất bại của nuôi cấy tế bào và mô thực vật Mỗi một loại vậtliệu khác nhau có những đòi hỏi khác nhau về thành phần môi trường, khi bắtđầu nghiên cứu một số loài mới hoặc giống mới cần phải chọn lựa cho đốitượng nghiên cứu một loại môi trường cơ bản phù hợp

Từ những năm 1933, Tukey đã nghiên cứu tạo ra môi trường nuôi cấythực vật, cho đến nay đã có rất nhiều loại môi trường khác nhau được sửdụng cho mục đích này, trong đó có một số môi trường cơ bản được sử dụngrất phổ biến như MS, LS, WP Ví dụ, môi trường MS (Murashige&Skoog,1962) là môi trường được sử dụng rộng rãi nhất trong nuôi cấy mô của tế bàothực vật, môi trường MS thích hợp cho cả thực vật 1 lá mầm, 2 lá mầm Hay

môi trường Gramborg (1965) còn gọi là B5 dùng thử nghiệm trên đậu tương, được sử dụng trong tách và nuôi tế bào trần.

Tuy có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật nhưngđều gồm một số thành phần cơ bản sau [1]:

+ Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

+ Nguồn cacbon

+ Các vitamin và aminoacid

+ Chất bổ sung, chất làm thay đổi trạng thái môi trường

+ Các chất điều hòa sinh trưởng

* Các muối khoáng đa lượng và vi lượng

Đối với cây trồng, các chất khoáng đa và vi lượng đóng vai trò rất quantrọng Ví dụ, magiê là một phần của phân tử diệp lục, canxi cấu tạo màng tếbào, nitơ là thành phần quan trọng của vitamin, amino axit và protein Ngoài

ra, các nguyên tố vi lượng như Fe, Zn, Mo, Mn là thành phần của một sốenzim cần thiết cho hoạt động sống của tế bào

Muối khoáng là thành phần không thể thiếu trong các môi trường nuôicấy tế bào thực vật, làm vật liệu cho sự tổng hợp các chất hữu cơ, enzym

Các ion của các muối hòa tan giúp ổn định áp suất thẩm thấu của môitrường trong tế bào, duy trì điện thế hóa của thực vật Ví dụ: K, Ca rất quantrọng trong điều hòa tính thấm lọc của tế bào

* Nguồn cacbon

Khi nuôi cấy in vitro, các tế bào thực vật thường không có khả năngquang hợp, do đó đòi hỏi phải cung cấp nguồn cacbon cho các hoạt độngdinh dưỡng của tế bào

Nguồn cacbon được ưa chuộng nhất hiện nay trong nuôi cấy là đường

saccarose, một số trường hợp sử dụng glucose và fructose thay thế chosaccarose nhưng chúng thường nghèo hydrat cacbon so với nhu cầu của thựcvật.

Ngoài ra, khi khử trùng môi trường cần chú ý không nên kéo dài thời gian để tránh xảy ra hiện tượng caramen hóa làm cho môi trường chuyển sang màu vàng dẫn đến ức chế sự sinh trưởng và phát triển của tế bào

* Các vitamin và axit amin

Ảnh hưởng của các vitamin đến sự phát triển của tế bào nuôi cấy in vitro ở các loài khác nhau là khác nhau

Hầu hết tế bào nuôi cấy đều có khả năng tổng hợp tất cả các loạivitamin cơ bản nhưng với số lượng dưới mức yêu cầu Để mô có thể sinhtrưởng, tốt nhất phải bổ sung thêm vào môi trường một hay nhiều loạivitamin và amino axít Trong các loại vitamin, B1 được xem là vitamin quantrọng nhất cho sự phát triển của thực vật Axit nicotinic (B3) và pyridoxune(B6) cũng có thể được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng cườngsức sống cho mô

Các chất bổ sung

Nước dừa: Công bố đầu tiên về sử dụng nước dừa trong nuôi cấy mô thuộc

về Van Overbeek và cộng sự (Van Overbeek cs, 1941) [21] Sau đó, tác dụngtích cực của nước dừa trong môi trường nuôi cấy mô, tế bào thực vật đã đượcnhiều tác giả ghi nhận Nước dừa đã được xác định là rất giàu các hợp chấthữu cơ, chất khoáng và chất kích thích sinh trưởng (George, 1993) [16].Nước dừa đã được sử dụng để kích thích phân hóa và nhân nhanh chồi ởnhiều loại cây Nước dừa thường được lấy từ quả dừa để sử dụng tươi hoặcsau bảo quản Thông thường nước dừa thường được xử lý để loại trừ cácprotein, sau đó được lọc qua màng lọc để khử trùng trước khi bảo quản lạnh.Tồn dư của protein trong nước dừa không gây ảnh hưởng đến sinh trưởng của

mô hoặc tế bào nuôi cấy, nhưng sẽ dẫn đến kết tủa dung dịch khi bảo quảnlạnh Chất cặn có thể được lọc hoặc để lắng dưới bình rồi gạn bỏ phần cặn.Nước dừa thường sử dụng với nồng độ 5 - 20% thể tích môi trường, kíchthích phân hóa và nhân nhanh chồi.

Dịch chiết nấm men: Có tác dụng kích thích sự sinh trưởng và phát

triển của mô và tế bào Dịch chiết nấm men là chế phẩm thường dùng trongnuôi cấy vi sinh vật, mô tế bào động vật với nồng độ thích hợp

Ngoài ra, có thể sử dụng dịch thủy phân casein hydrolyase (0,1 - 1%) hoặc bột chuối với hàm lượng 40g bột khô trong 100g/l (xanh) nhằm tăng cường sự phát triển của mô sẹo hay cơ quan nuôi cấy

Agar: Trong môi trường nuôi cấy đặc, người ta thường sử dụng agar để

làm rắn hoá môi trường Nồng độ agar sử dụng thường là 0,6 - 1%, đây làloại tinh bột đặc chế từ rong biển để tránh hiện tượng mô chìm trong môitrường hoặc bị chết vì thiếu O2 nếu nuôi trong môi trường lỏng và tĩnh

pH môi trường: Với mỗi loại cây trồng yêu cầu một loại môi trường

khác nhau nhưng pH của môi trường thường từ 5,6 - 6,0 [1]

Nếu pH của môi trường thấp hơn 5 thì thạch sẽ khó đông và cao hơn 6

sẽ làm môi trường bị cứng

* Các chất điều tiết sinh trưởng

Các chất kích thích sinh trưởng gồm 2 nhóm chính auxin và cytokinin,ngoài ra còn có gibberlin và etylen cũng là nhóm chất tham gia điều tiết sựsinh trưởng phát triển và phân hóa cơ quan [10]

axit (NAA) và 2,4 - diclophenoxy axit (2,4 D) Các chất này cũng đóng vaitrò quan trọng trong sự phân chia của mô và trong quá trình hình thành rễ.NAA được Went và Thimann (1937) phát hiện Chất này có tác dụng tăng hôhấp của tế bào và mô nuôi cấy, tăng hoạt tính enzim và ảnh hưởng mạnh đếntrao đổi chất của nitơ, tăng khả năng tiếp nhận và sử dụng đường trong môitrường NAA là auxin nhân tạo, có hoạt tính mạnh hơn auxin tự nhiên IAA.NAA có vai trò quan trọng đối với phân chia tế bào và tạo rễ Kết quả nghiêncứu của Butenko (1964) cho thấy NAA tác động ở mức độ phân tử trong tếbào theo ba cơ chế: Cơ chế thứ nhất: NAA gắn với phân tử enzim và kíchthích enzim hoạt động Sarkissian đã phát hiện tác dụng của auxin thích thíchhoạt tính của ATPase; cơ chế thứ hai: Auxin tác động vào gen và các enzimphân giải axit nucleic; cơ chế thứ ba: Auxin tác động thông qua sự thay đổitính thẩm thấu của màng Dùng phương pháp đánh dấu phân tử có thể thấyNAA dính kết vào màng tế bào làm cho màng hoạt động như một bơm proton

và bơm ra ngoài ion H+ làm màng tế bào mềm và kéo dài ra, do đó tế bào lớnlên và dẫn tới sinh trưởng Trong tế bào NAA có tác dụng lên sự tổng hợpaxit nucleic [10]

Trong cây, auxin được tổng hợp ở các mô non đặc biệt là lá đang pháttriển và vùng đỉnh chồi Từ những vùng này auxin được chuyển xuống cácphần phía dưới của cây

-car Cytokinin:

Cytokinin là chất điều hoà sinh trưởng có tác dụng làm tăng sự phânchia tế bào Các cytokinin thường gặp là kinetin, 6–benzyl aminopurin(BAP) Kinetin được Skoog phát hiện ngẫu nhiên trong chiết xuất axitnucleic Kinetin thực chất là một dẫn xuất của bazơ nitơ adenine BAP làcytokinin tổng hợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn kinetin Kinetin vàBAP cùng có tác dụng kích thích phân chia tế bào kéo dài thời gian hoạt

động của tế bào phân sinh và làm hạt chế sự hoá già của tế bào Ngoài ra cácchất này có tác dụng lên quá trình trao đổi chất, quá trình tổng hợp ADN,tổng hợp protein và làm tăng cường hoạt tính của một số enzim Cơ chế tácdụng của auxin ở mức độ phân tử trong tế bào thể hiện bằng tác dụng tương

hỗ của cytokinin với các nucleoprotein làm yếu mối liên kết của histon vớiADN, tạo điều kiện cho sự tổng hợp ADN

Những nghiên cứu của Miller và Skoog (1963) đã cho thấy không phảicác chất kích thích sinh trưởng ngoại sinh tác dụng độc lập với hoocmon sinhtrưởng nội sinh Phân chia tế bào, phân hoá và biệt hoá được điều kiển bằng

sự tác động tương hỗ giữa các hoocmon ngoại sinh và nội sinh Tác độngphối hợp của auxin và cytokinin có tác động quyết định đến sự phát triển vàphát sinh hình thái của tế bào và mô Những nghiên cứu của Skoog cho thấy

tỷ lệ auxin/cytokinin cao thì thích hợp cho sự hình thành rễ và thấp thì thíchhợp cho quá trình phát sinh chồi Nếu tỷ lệ này ở mức độ cân bằng thì thuậnlợi cho phát triển mô sẹo (callus) Das (1958) và Nitsch (1968) khẳng địnhrằng chỉ khi tác dụng đồng thời của auxin và cytokinin thì mới kích thíchmạnh mẽ sự tổng hợp DNA, dẫn đến quá trình cảm ứng cho sự phân chia tếbào Theo Dmitrieva (1972) giai đoạn đầu của quá trình phân bào được cảmứng bởi auxin còn giai đoạn tiếp theo thì cần tác động tổng hợp của cả haichất kích thích Skoog và Miller (1957) đã khẳng định vai trò của cytokinintrong quá trình phân chia tế bào cụ thể là cytokinin điều kiển quá trìnhchuyển pha trong mitos và giữ cho quá trình này diễn ra một cách bìnhthường [10]

Cytokinin được tổng hợp bởi rễ và hạt đang phát triển

-car Gibberellin:

Gibberellin được phát hiện đầu tiên bởi nhà nghiên cứu người nhật

Kurosawa (1920) khi nghiên cứu bệnh ở mạ lúa do nấm Gibberella Fujikuroigây ra Năm 1939 đã tách chiết được Gibberellin từ nấm G Fujikuroi vàđược gọi là Gibberellin A Gibberellin có tác dụng kéo dài tế bào, nhất làthân và lá vì vậy khi xử lý với các cây đột biến lùn và các cây này có thể khôiphục lại bình thường Các nghiên cứu tiếp theo khám phá ra trong cơ thể thựcvật cũng có các chất giống như Gibberellin cả về cấu tạo và tác dụng Nhữngchất này đặt tên theo thứ tự là A1, A2, A3 và A4 Do Gibberellin tồn tại trongthực vật, nó tham gia vào các quá trình sinh trưởng và phát triển trong sựtương tác với các chất điều hoà sinh trưởng khác.

Trong cây Gibberellin được tổng hợp ở lá đang phát triển, quả và rễ sau

đó được vận chuyển đi khắp nơi trong cây và có nhiều trong xylem

-car Ethylen:

Ethylen là chất điều hoà sinh trưởng dạng khí Ethyllen có rất nhiều tácdụng đối với hoạt động sinh lý và trao đổi chất ở thực vật Đã từ lâu vai tròcủa ethyllen đối với việc làm tăng hô hấp trong thời gian quả chín đã đượcứng dụng nhiều Trong những năm gần đây một số nghiên cứu cho thấy tácdụng của ethyllen lên sự kéo dài thân và rễ, kích thích tế bào phát triển về bềngang, kích thích nảy mầm, tạo lông rễ, tạo hoa ở dứa và lan, ức chế vậnchuyển ngang và xuống của auxin [10]

3.5 Các công đoạn của nuôi cây mô tế bào

Theo tác giả Lê Trần Bình và cs [1]: Trong nuôi cấy mô, tế bào gồm 5giai đoạn sau:

-car Giai đoạn 1: Giai đoạn chuẩn bị

Đây là giai đoạn quan trọng quyết định toàn bộ quy trình nhân giốnginvitro Mục đích của giai đoạn này là tạo được vật liệu vô trùng để đưa vàonuôi cấy

Mẫu đưa từ bên ngoài vào đảm bảo các yêu cầu sau: tỷ lệ nhiễm thấp;

tỷ lệ sống cao; tốc độ sinh trưởng nhanh

Kết quả của giai đoạn này phụ thuộc vào cách lấy mẫu, nồng độ vàthời gian xử lý diệt khuẩn Vật liệu thường được chọn và đưa vào nuôi cấy là:Đỉnh sinh trưởng, chồi nách, hoa tự, hoa, đoạn thân, mảnh, lá, rễ

- Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy

Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng sự pháttriển của mô nuôi cấy Quá trình này điều khiển chủ yếu bằng các chất điềuhòa sinh trưởng (tỷ lệ auxin/cytokinin) đưa vào môi trường nuôi cấy Tuynhiên, bên cạnh đó cũng phải quan tâm đến tuổi của mẫu đem vào nuôi cấy.Thường các mô non, chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơn những mô

đã chuyển hoá

- Giai đoạn 3: Giai đoạn nhân nhanh chồi

Mục đích của giai đoạn này là tạo hệ số cao nhất Chính vì thế giaiđoạn này được coi là giai đoạn then chốt của quá trình nuôi cấy Để tăng hệ

số người ta thường đưa vào môi trường nuôi cấy các chất điều hòa sinhtrưởng (auxin, cytokinin…), các chất bổ sung khác như nước dừa, dịch chiếtnấm mem… kết hợp với các yếu tố ánh sáng, nhiệt độ thích hợp Tuỳ thuộcvào đối tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng cách kích thích sựhình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của cácchồi nách hoặc thông qua việc tạo thành cây từ phôi vô tính

- Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Khi đạt được kích thước nhất định các chồi được chuyển sang môitrường ra rễ Thường sau 2 - 3 tuần, các chồi riêng lẻ này sẽ ra rễ và trở thànhcây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này người ta bổ sung vào môi trường nuôi cấycác chất điều hoà sinh trưởng thuộc nhóm auxin, là nhóm hoocmon thực vật

quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy Trong nhóm này các chấtIAA, IBA, NAA, 2.4-D được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất để tạo rễ cho chồi.

- Giai đoạn 5: Giai đoạn đưa cây ra đất

Đây là giai đoạn cuối cùng của quá trình và nó quyết định khả năngứng dụng của quá trình nhân giống invitro trong thực tiễn sản xuất Đây làgiai đoạn chuyển cây từ môi trường dị dưỡng sang môi trường tự dưỡng hoàntoàn Do đó phải đảm bảo các điều kiện ngoại cảnh thích hợp để cây có thểđạt tỷ lệ sống cao trong vườn ươm cũng như trong ruộng sản xuất