Nghiên cứu phân biệt loài phụ salmonella gây bệnh với các loài phụ khác trong thực phẩm bằng kỹ thuật sinh học phân tử

Một cá thể mang bệnh mãn tính có khả năng truyềnnhiễm cho một số lớn các cá thể khác, qua đó gia tăng mức độ lan truyền và tạo áplực chọn lọc để tiến hóa thành các chủng có tính gây bệnh

NGUYỄN TIẾN DŨNG

NGHIÊN CỨU PHÂN BIỆT LOÀI PHỤ

SALMONELLA GÂY BỆNH VỚI CÁC LOÀI PHỤ

KHÁC TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT

SINH HỌC PHÂN TỬ

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGUYỄN TIẾN DŨNG

NGHIÊN CỨU PHÂN BIỆT LOÀI PHỤ SALMONELLA

GÂY BỆNH VỚI CÁC LOÀI PHỤ KHÁC TRONG

THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT

SINH HỌC PHÂN TỬ

CHUYÊN NGÀNH VI SINH

MÃ SỐ: 1.05.12 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

PGS.TS TRẦN LINH THƯỚC

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - 2010

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 6

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 6

1.1 Vị trí phân loại và cách gọi tên Salmonella 7

1.2 Đặc điểm sinh học và tính chất nuôi cấy 10

1.3 Đặc điểm kháng nguyên 11

1.4 Bệnh do Salmonella 12

1.5 Đặc điểm di truyền liên quan đến tính gây bệnh của Salmonella 13

1.5.1 Đặc điểm bộ gen 13

1.5.2 Các cụm gây bệnh 14

1.5.3 Các gen gây độc 15

1.6 Đặc điểm tiến hóa về tính gây bệnh 18

1.6.1 Các bước tiến hóa về tính gây bệnh của giống Salmonella 18

1.6.2 Tiến hoá theo hướng tăng tính gây bệnh 19

1.6.3 Loài phụ S entreica I tiến hóa theo hướng thích nghi với vật chủ là người và động vật máu nóng 20

1.6.4 Tiến hóa của protein có vai trò bám dính có liên quan đến phổ vật chủ 21 1.7 Sự tương tác giữa Salmonella và vật chủ 22

1.7.1 Cấu tạo của hệ tiêu hóa của người và động vật máu nóng liên quan đến quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn 22

1.7.2 Sự tương tác giữa Salmonella và vật chủ 24

1.7.3 Cơ chế phòng vệ của vật chủ đối với sự xâm nhập của mầm bệnh 25

1.8 Triệu chứng bệnh do Salmonella 28

1.9 Ý nghĩa của việc phân biệt loài phụ S enterica I với Salmonella spp. trong thực phẩm và thủy sản 29

CHƯƠNG 2 33

VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 33

2.1 Thiết bị chính 34

2.2.1.Hóa chất 34

2.2.2 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật 36

2.3 Vật liệu thí nghiệm 36

2.3.1 Chủng giống vi sinh vật 36

2.3.2 Chuột sử dụng trong các nghiên cứu 37

2.4 Phương pháp 37

2.4.1 Phương pháp bảo quản chủng vi sinh vật 37

2.4.2 Định lượng mật độ tế bào bằng phương pháp nuôi cấy 38

2.4.3 Phương pháp nuôi cấy để phân lập hoặc phát hiện Salmonella spp trong thực phẩm 39

2.4.4 Phương pháp nuôi cấy xác định S enterica I 42

2.4.5 Phương pháp PCR để phát hiện Salmonella spp., S enterica I và để khảo sát sự hiện diện của các gen 44

2.4.6 Thí nghiệm khảo sát lựa chọn gen mục tiêu cho qui trình phát hiện Salmonella spp và S enterica I 47

2.4.7 Khảo sát xây dựng quy trình multiplex PCR phát hiện phân S enterica I và Salmonella spp trong thực phẩm dựa vào hai gen invA và iagAB 47

2.4.8 Khảo sát tỷ lệ nhiễm Salmonella spp và S enterica I trong thực phẩm bằng phản ứng multiplex PCR 2 cặp mồi nhân bản đồng thời gen mục tiêu invA và iagAB 48

2.4.9 Phương pháp RT-PCR trong thí nghiệm khảo sát sự biểu hiện của các gen gây bệnh 48

2.4.10 Phương pháp nghiên cứu khả năng xâm nhiễm và gây bệnh ở chuột 50

2.4.11 Nghiên cứu sự phiên mã in vivo của gen ssrA ở Salmonella sử dụng mô hình chuột bị gây nhiễm 53

2.4.12 Phương pháp nghiên cứu xây dựng quy trình chuẩn phát hiện Salmonella spp .53

2.4.13 Xác nhận hiệu lực phương pháp PCR trong phân tích Salmonella spp trong thực phẩm 55

CHƯƠNG 3 59

KẾT QUẢ - THẢO LUẬN 59

pháp nuôi cấy, sinh hóa, miễn dịch 60

3.2 Nghiên cứu phương pháp phát hiện Salmonella spp và loài phụ gây bệnh S enterica I trong thực phẩm bằng phản ứng PCR 61

3.2.1 Khảo sát khả năng nhân bản sao các gen mục tiêu invA, fimA, iagAB, spvC ở Salmonella bằng các cặp mồi tương ứng 61 3.2.2 Phát hiện Salmonella spp bằng phản ứng PCR dựa trên gen mục tiêu invA 62 3.2.3 Phát hiện loài phụ gây bệnh S enterica I bằng phản ứng PCR dựa vào gen mục tiêu iagAB 64 3.2.4 Phát hiện phân biệt Salmonella spp và S enterica I bằng phản ứng multiplex PCR dùng 2 cặp mồi 66 3.2.5 Khảo sát tỷ lệ nhiễm Salmonella spp và S enterica I trong thực phẩm bằng phản ứng multiplex PCR 2 cặp mồi nhân bản đồng thời gen mục tiêu invA và iagAB 68

3.3 Nghiên cứu so sánh sự hiện diện và biểu hiện của các gen gây bệnh ở

Salmonella spp và loài phụ S enterica I 70

3.3.1 So sánh sự hiện diện các gen gây bệnh ở Salmonella spp và loài phụ S enterica I từ mẫu có nguồn gốc thực phẩm và mẫu có nguồn gốc bệnh phẩm 70 3.3.2 So sánh mức độ phiên mã của các gen gây bệnh ở Salmonella spp và loài phụ S enterica I trong điều kiện in vitro 73 3.3.3 Khảo sát sự phiên mã in vivo của gen ssrA ở Salmonella sử dụng mô hình chuột bị gây nhiễm 76

3.4 Nghiên cứu so sánh đặc tính gây bệnh của loài phụ S enterica I với các

loài phụ khác 78

3.4.1 Khảo sát so sánh tính gây bệnh in vivo của loài phụ S enterica I với các loài phụ khác 78 3.4.2 Sự khác biệt về tính kháng các nhân tố phòng vệ của vật chủ 83 3.4.3 Mối quan hệ giữa các gen gây bệnh và độc lực của Salmonella 89

3.5 Xây dựng quy trình PCR phát hiện Salmonella spp và S enterica I để

ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm 92

dựa vào gen invA 92

3.5.2 Đề xuất quy trình phân tích Salmonella spp bằng phương pháp PCR dựa trên gen mục tiêu invA 96

3.5.3 Đánh giá hiệu lực của quy trình PCR để phát hiện Salmonella spp trong thực phẩm dựa trên gen mục tiêu invA 98

3.5.4 Đề xuất quy trình PCR để phát hiện Salmonella spp dựa vào gen mục tiêu invA thành tiêu chuẩn ngành trong lĩnh vực thủy sản 101

3.6 Xây dựng quy trình multiplex PCR phát hiện phân biệt Salmonella spp với S enterica I trong thực phẩm 101

3.6.1 Tối ưu hóa quy trình multiplex PCR 2 cặp mồi để phát hiện phân biệt Salmonella spp với S enterica I trong thực phẩm dựa vào gen invA và iagAB 101

3.6.2 Đề xuất quy trình multiplex PCR 2 cặp mồi để phát hiện phân biệt Salmonella spp với S enterica I trong thực phẩm dựa vào gen invA và iagAB 104

CHƯƠNG 4 106

KẾT LUẬN - ĐỀ NGHỊ 106

4.1 Kết luận 107

4.2 Đề nghị 108 DANH MỤC CÁC BÀI BÁO ĐÃ CÔNG BỐ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

Bảng 1.1 Sự phòng vệ của vật chủ chống lại sự xâm nhiễm của mầm bệnh 26

Bảng 1.2 Các yêu cầu về Salmonella trong các qui định an toàn vệ sinh thực phẩm của một số nước 30

Bảng 2.1 Trình tự các mồi được sử dụng trong nghiên cứu 35

Bảng 2.2 Danh mục chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm 37

Bảng 2.3 Các phương pháp phân lập và định danh vi sinh vật đã sử dụng 37

Bảng 2.4 Các đặc trưng sinh hóa của Salmonella 41

Bảng 2.5 Các đặc trưng sinh hoá của S enterica I 43

Bảng 2.6 Nhiệt bộ bắt cặp của các cặp mồi được sử dụng trong phản ứng multiplex PCR 46

Bảng 3.1 Tổng hợp kết quả phân lập, định danh các chủng Salmonella từ thực phẩm dùng làm nguyên liệu cho nghiên cứu 60

Bảng 3.2 Kết quả kiểm tra tính chuyên biệt các gen fimA; invA mục tiêu trên các chủng Salmonella đã được xác nhận nguồn gốc 63

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát sự hiện diện của các gen invA và fimA trên các chủng Salmonella có nguồn gốc tự nhiên và được nuôi cấy thuần chủng 63

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát sự hiện diện của gen iagAB trên các chủng vi sinh vật .65

Bảng 3.5 Kết quả multiplex PCR kết hợp 2 cặp mồi nhân bản sao đồng thời 2 gen invA và iagAB 66

Bảng 3.6 Tần suất hiện diện của Salmonella spp và S enterica I trong các nhóm thực phẩm tại TP HCM 69

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát sự hiện diện các gen gây độc ở các chủng Salmonella 72 Bảng 3.8 Tỉ lệ phân bố các gen gây bệnh ở các loài phụ Salmonella khác nhau 73

Bảng 3.9 Tỉ lệ phân bố các các gen gây bệnh ở các chủng Salmonella đã khảo sát .73

Bảng 3.10 Kết quả biểu hiện các gen gây bệnh ở các chủng Salmonella 74

Bảng 3.11 Tỉ lệ biểu hiện các gen gây bệnh ở các loài phụ Salmonella khác nhau .75

Bảng 3.12 Tỉ lệ phân bố và sự biểu hiện các gen gây bệnh ở các chủng Salmonella đã khảo sát 75

Bảng 3.14 Kết quả khảo sát khả năng gây bệnh của các chủng thuộc loài phụ S.

PCR và phương pháp nuôi cấy 98

Bảng 3.22 Kết quả đánh giá độc lập qui trình PCR phân tích Salmonella trong

thực phẩm dựa vào gen mục tiêu invA 100

Bảng 3.23 Kết quả xác định các thông số kỹ thuật của phương pháp PCR phát hiện

Salmonella trong thực phẩm dựa vào gen invA được đánh giá độc lập bởi các phòng thí nghiệm khác nhau 100

Bảng 3.24 Ảnh hưởng của nồng độ MgCl 2 lên phản ứngPCR 2 cặp mồi nhân bản

đồng thời 2 gen invA và iagAB 102

Bảng 3.25 Ảnh hưởng của nhiệt độ bắt cặp lên phản ứng PCR 2 cặp mồi nhân bản

sao đồng thời hai gen invA và iagAB 102

Bảng 3.26 Mật độ tế bào Salmonella được nuôi cấy có thể phát hiện được bằng

phản ứng PCR 2 cặp mồi 103

Bảng 3.27 Kết quả khảo sát độ nhạy phản ứng PCR 2 cặp mồi để nhân bản gen

invA và iagAB ở mẫu thực phẫm bị gây nhiễm Salmonella 104

Hình 1.1 Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường XLD 11

Hình 1.2 Quá trình tiến hóa hình thành tính gây bệnh ở Salmonella 19

Hình 1.3 Cấu tạo các lớp tạo nên ống tiêu hóa 23

Hình 2.1 Kích thước các vạch của thang DNA 36

Hình 2.2 Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường phân lập XLD 40

Hình 2.3 Phản ứng ngưng kết huyết thanh của Salmonella 42

Hình 2.4 Đặc trưng sinh hoá của S enterica I 44

Hình 2.5 Dụng cụ phẩu thuật và chuột sau khi phẩu thuật 51

Hình 3.1 Phân tích sản phẩm phản ứng PCR phát hiện Salmonella spp., S enterica I bằng các cặp mồi invA1-invA2, fimA1- fimA2, iagAB1-iagAB2 và spvC1-spvC2 .61

Hình 3.2 Tín hiệu khuếch đại khi thực hiện phản ứng multiplex PCR đồng thời với hai cặp mồi invA1-invA2 và iagAB1- iagAB2 trên các chủng Salmonella và không phải Salmonella 67

Hình 3.3 Biểu hiện ở chuột bệnh và chuột khỏe mạnh 81

Hình 3.4 Tính chịu acid của các chủng Salmonella 86

Hình 3.5 Khả năng kháng nitrite của các chủng khảo sát 87

Hình 3.6 Khả năng kháng H 2 O 2 của các chủng Salmonella 89

MỞ ĐẦU

tâm bởi các nhà nghiên cứu bệnh học, dịch tễ học, vệ sinh môi trường và an toàn vệ

sinh thực phẩm Về bệnh học, Salmonella được quan tâm nhiều đến đặc điểm, cách

thức, liều lượng gây bệnh, đặc điểm phân loại, kháng nguyên, biểu hiện lâm sàng,phương pháp chẩn đoán và phương pháp điều trị… Về khía cạnh dịch tễ học và vệ

sinh môi trường, Salmonella được quan tâm đến đặc điểm phân bố trong môi

trường, đặc điểm truyền bệnh và gây dịch… Về an toàn vệ sinh thực phẩm,

Salmonella là chỉ tiêu được đặc biệt quan tâm vì khả năng gây bệnh rất nghiêm

trọng, gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm Tất cả các qui định về an toàn vệ sinh thựcphẩm đều không cho phép sự hiện diện của vi khuẩn này trong 25g thực phẩm

Giống Salmonella có hai loài chính là S enterica và S bongori được chia thành 2339 kiểu huyết thanh Trong số đó, loài S enterica được chia thành 6 loài phụ gồm 2321 kiểu huyết thanh được phân bố trong các loài phụ như sau: 1379 ở S enterica subsp enterica (I), 466 ở S enterica subsp salamae (II), 93 ở S enterica subsp arizonae (IIIa), 309 ở S enterica subsp diarizonae (IIIb), 64 ở S enterica subsp houtenae (IV), 10 ở S enterica subsp indica (VI) Loài S bongori (được coi

là loài phụ V) có 18 kiểu huyết thanh Các loài phụ cũng như các kiểu huyết thanh

của Salmonella phân bố không đồng đều trong tự nhiên Trong khi các loài phụ S enterica từ II đến VI là những vi sinh vật hiện diện thường xuyên trong đường ruột của các loài động vật lưỡng thê và bò sát thì loài phụ S enterica I thường xuyên

được tìm thấy ở người, động vật máu nóng và chim Một số kiểu huyết thanh lại chỉ

thích nghi với một ký chủ đặc hiệu như S pollurum/galinarum chỉ tìm thấy ở gia cầm và chim, S typhi chỉ tìm thấy ở người và các loài linh trưởng… Một số nghiên cứu khác cũng đã chỉ ra rằng Salmonella gây bệnh cho người chủ yếu nằm trong loài phụ S enterica I.

Mặt khác, các nghiên cứu đã công bố cũng cho thấy S weltevreden là kiểu

huyết thanh thường xuyên hiện diện trong nước ở các ao hồ nuôi thuỷ sản tại Anh,

Xứ Wales và Úc Kiểu huyết thanh này cũng thường xuyên được tìm thấy trong cácsông hồ và ao nuôi thuỷ sản ở các nước trong khu vực Đông Nam Á Nghiên cứucủa Trung tâm Kiểm soát dịch bệnh (CDC) Hoa Kỳ cho thấy kiểu huyết thanh này

bệnh của của kiểu huyết thanh này hầu như không có Như vậy một số dòng

Salmonella hiện diện thường xuyên trong môi trường tự nhiên là không gây hại cho

con người

Về khía cạnh vệ sinh an toàn thực phẩm, Salmonella là chỉ tiêu được đặc biệt

quan tâm vì khả năng gây bệnh cho người qua con đường thực phẩm Tuy nhiên cácnghiên cứu trong những năm gần đây cho thấy rằng không phải tất cả các dòng

Salmonella đều có khả năng gây bệnh cho người, mà chỉ có những dòng có mang

yếu tố gây bệnh và có khả năng chống lại hệ thống phòng vệ của vật chủ thì mới cókhả năng gây bệnh cho người Mặt dù vậy, yêu cầu về vệ sinh an toàn thực phẩm

của hầu hết các nước trên thế giới đều không cho phép sự có mặt của Salmonella trong 25g thực phẩm, không phân biệt dòng hay kiểu huyết thanh Salmonella bị

nhiễm có thực sự nguy hiểm cho con người hay không Trên thực tế các phương

pháp phân tích Salmonella trong thực phẩm hiện nay chỉ xác định đến giống, không phân loài hay kiểu huyết thanh (Salmonella spp.) Điều này đã gây nhiều khó khăn

và thiệt hại cho các nhà sản xuất và kinh doanh thực phẩm, đặc biệt là ngành thủysản

Các dẫn chứng nêu trên cho thấy cần xem xét lại một cách nghiêm túc quan

niệm cho rằng mọi Salmonella spp nhiễm vào thực phẩm đều nguy hiểm cho con người, cũng như cần có phương pháp hữu hiệu để phát hiện phân biệt Salmonella có khả năng gây bệnh với Salmonella khác trong thực phẩm Như vậy việc nghiên cứu xác định sự khác biệt giữa các dòng Salmonella gây bệnh với các dòng Salmonella

vô hại khác, đồng thời thiết lập phương pháp phát hiện phân biệt giữa chúng vớinhau có ý nghĩa rất lớn nhằm cung cấp cơ sở khoa học để xóa bỏ một phần rào cản

về yêu cầu Salmonella trong thực phẩm hiện nay.

Quy trình phân tích Salmonella trong thực phẩm cho đến nay vẫn chủ yếu sử

dụng phương pháp nuôi cấy Với phương pháp này, thời gian phát hiện là 4 - 6ngày, tốn nhiều công sức lao động, gây khó khăn trong việc phân tích nhanh cácmẫu thực phẩm nhiễm mầm bệnh và chẩn đoán nguyên nhân gây ngộ độc được nghi

ngờ do Salmonella gây ra Mặt khác, quy trình phân tích này không cho phép phân

Chain Reaction) được coi là phương pháp có tiềm năng thay thế phương pháp nuôi

cấy trong việc phát hiện các vi sinh vật gây bệnh, trong đó có Salmonella, vì có độ

nhạy và độ đặc hiệu cao Nhờ vào tính đặc hiệu này, có thể thiết kế quy trình PCR

để phát hiện phân biệt giữa nhóm Salmonella gây bệnh và nhóm không gây bệnh

hiện diện thường trực trong môi trường tự nhiên Tuy nhiên, để phương pháp PCRtrở thành một phương pháp tiêu chuẩn chính thức có thể dùng thay thế cho phươngpháp nuôi cấy, đang được xem là phương pháp chuẩn hiện nay, thì cần tiến hànhviệc xác nhận hiệu lực nhằm khẳng định các thông số kỹ thuật của một phươngpháp PCR là tương đương với phương pháp nuôi cấy Việc xây dựng được phươngpháp PCR chuẩn như vậy mở đường cho việc đưa phương pháp PCR trở thành tiêuchuẩn chính thức thay thế phương pháp nuôi cấy còn nhiều nhược điểm nêu trên

Để góp phần giải quyết các vấn đề nêu ra như trên, mục tiêu của luận án nàynhằm cung cấp thêm cơ sở khoa học và các công cụ ứng dụng cho việc phân biệt

các loài phụ S enterica I gây bệnh và các loài phụ Salmonella khác, phục vụ công tác giám sát chỉ tiêu Salmonella trong thực phẩm nói chung và trong thủy sản nói

riêng tại Việt Nam

Để thực hiện được mục tiêu này, trong giới hạn của luận án, các nội dung sauđây đã được khảo sát, nghiên cứu:

1 Nghiên cứu phương pháp phát hiện Salmonella spp và loài phụ gây bệnh

4 Xây dựng quy trình PCR phát hiện Salmonella spp và S enterica I ứng

dụng trong giám sát an toàn vệ sinh thực phẩm

Trong các nội dung này, nội dung xây dựng quy trình PCR chuẩn phát hiện

Salmonella spp trong thực phẩm là một bộ phận của đề tài khoa học công nghệ

trọng điểm cấp nhà nước “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử vào việc

trong các năm 2004-2005, do Trường ĐH Khoa học Tự nhiên (ĐH Quốc giaTP.HCM) làm cơ quan chủ trì, PGS.TS Trần Linh Thước làm chủ nhiệm.

CHƯƠNG 1.

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Vị trí phân loại và cách gọi tên Salmonella

Salmonella là vi khuẩn hình que, di động, Gram âm (-) thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaccae, có mối quan hệ di truyền chặt chẻ với E coli Salmonella được phát hiện và mô tả chi tiết lần đầu tiên vào năm 1880 bởi Eberth Năm 1884, Salmonella được nuôi cấy thành công bởi Gaffky Vào cuối những năm

1940, Edward và Ewing bắt đầu nghiên cứu thiết lập phương pháp xác định và phân

biệt giống Salmonella với các loài khác trong họ Enterobacteriaccea Cho đến nay, mặt dù sự phân loại và danh pháp của Salmonella đã có nhiều thay đổi nhưng

phương pháp đã được mô tả bởi hai tác giả trên vẫn còn đang được sử dụng rất phổbiến [2],[3]

Theo định nghĩa năm 1986 của Ewing, giống Salmonella được xếp vào họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaccae và thuộc tộc Salmonelleae [41], [74] Đặc

điểm sinh hóa chung của giống này là có khả năng sinh H2S, phản ứng methyl reddương tính, phản ứng lysine decarboxylase, ornithine decarboxylase và argininedehydrolase dương tính, không sinh indol, không có khả năng thủy phân urea, thửnghiệm Voges – Proskauer âm tính, không có khả năng khử amin của phenylalanine

và tryptophane, không có khả năng sinh acid từ các nguồn carbon như sucrose,adonitol, raffinose, α-methyl-glucoside Các chủng thuộc các loài phụ (subspecies,subsp.) I, II, IV và V không có khả năng sử dụng và tạo acid từ lactose nhưng cácchủng thuộc các loài phụ IIIa và IIIb có khả năng sử dụng và sinh acid từ nguồncarbon này Các chủng thuộc các loài phụ I, II và V có khả năng lên men và sinhacid từ dulcitol nhưng các chủng thuộc IIIa, IIIb và IV không sử dụng được dulcitol[41], [73], [74] Minor và cộng sự bổ sung đặc điểm của loài phụ VI là không sửdụng và không sinh acid từ inositol hay sorbitol, 22% có khả năng lên men đườnglactose, 67% lên men đường dulcitol Tác giả này cho rằng loài phụ V khác biệt với

các dòng khác của Salmonella Năm 1989, Reeves và cộng sự xếp loài phụ V thành loài thứ hai của giống Salmonella với tên gọi là Salmonella bongori Hiện nay giống Salmonella được chia thành hai loài là S enterica và S bongori [41].

Theo hệ thống phân loại như trên, cho đến nay nhiều quốc gia vẫn thống nhất

chia giống Salmonella thành hai loài và các loài phụ như sau [41]:

- S enterica subsp enterica (còn gọi là loài phụ S enterica I hay 1)

- S enterica subsp salamae (còn gọi là loài phụ S enterica II hay 2)

- S enterica subsp arizonae (còn gọi là loài phụ S enterica IIIa hay 3a)

- S enterica subsp diarizonae (còn gọi là loài phụ S enterica IIIb hay 3b)

- S enterica subsp houtenae (còn gọi là loài phụ S enterica IV hay 4)

- S enterica subsp indica (còn gọi là loài phụ S enterica VI hay 6)

- S bogori.

Trên thực tế, các dòng Salmonella được gọi tên không theo tên của loài hay

loài phụ mà thông thường được gọi tên theo kiểu huyết thanh (serotype) Sự phân

bố các kiểu huyết thanh theo các loài hay loài phụ như sau [41], [46]:

- S enterica subspecies enterica (I): 1379 serotypese

- S enterica subsp salamae (II): 466 kiểu huyết thanh

- S enterica subsp arizonae (IIIa): 93 kiểu huyết thanh

- S enterica subsp diarizonae (IIIb): 309 kiểu huyết thanh

- S enterica subsp houtenae (IV): 64 kiểu huyết thanh

- S enterica subsp indica (VI): 10 kiểu huyết thanh

- S bongori (V): 18 kiểu huyết thanh

Các kiểu huyết thanh thuộc loài phụ S enterica I thông thường được gọi theo

tên địa danh nơi phân lập, trong đó tên của kiểu huyết thanh được viết hoa và không

in nghiêng [41] Ví dụ: S enterica I có kiểu huyết thanh Typhimurium được gọi tên

là Salmonella Typhimurium Từ năm 1984, các tên kiểu huyết thanh không cần phải

viết hoa nữa

Trong luận án này tên của các dòng Salmonella được gọi theo một trong hai

cách như sau:

- Gọi theo loài phụ: ví dụ, Salmonella enterica I để chỉ cho loài phụ Salmonella enterica subsp enterica.

- Gọi theo kiểu huyết thanh: ví dụ, Salmonella typhimurium là S enterica I

có kiểu huyết thanh Typhimurium

Một số kiểu huyết thanh không được đặc tên thì gọi tên theo công thức kháng

nguyên của chúng Ví dụ: Salmonella enterica IIIb có kiểu huyết thanh 60:k:z được viết như sau: Salmonella 60:k:z.

Các loài phụ của loài S enterica được phân biệt dựa vào các đặc tính sinh

hóa như sau [41],[73],[74]:

- S enterica I không lên men lactose, lên men dulcitol sinh acid, sử dụng

được tartrate nhưng không sử dụng được galacturonate

- S enterica II không lên men lactose, lên men dulcitol sinh acid, có khả

năng dử dụng malonate, galacturonate, tartrate và làm tan gelatin

- S enterica IIIa lên men lactose sinh acid, không lên men dulcitol và

inositol, có khả năng sử dụng malonate nhưng không có khả năng sử dụnggalacturonate

- S enterica IIIb không lên men lactose trong 24 giờ nuôi cấy nhưng lên men

được sau 24 giờ nuôi cấy, không sử dụng dulcitol và inositol, sử dụng đượcmalonate

- S enterica IV không lên men lactose, inositol và dulcitol, có thể sử dụng

được salicin, phản ứng dương tính với kali cyanua (KCN), âm tính với ONPG (o nitrophenyl--D-galactopyranoside)

S enterica VI không lên men inositol và sorbitol Một số kiểu huyết thanh

trong nhóm này có thể lên men lactose và dulcitol, không sử dụng salicin, malonate,tartrate, sorbitol, làm tan gelatin

Trường hợp S bongori (hay còn gọi là Salmonella V), loài này có đặc điểm

sinh hóa như sau: không lên men lactose, inositol nhưng lên men dulcitol, phản ứngdương tính với kali cyanua (KCN) và ONPG

1.2 Đặc điểm sinh học và tính chất nuôi cấy

Salmonella có dạng hình que, kích thước khoảng 0,4 – 0,6 x 1,0 – 3,0µm, có

khả năng tăng trưởng cả trong điều kiện hiếu khí và kị khí, không có khả năng hình

thành bào tử, nhuộm Gram (-) Phần lớn Salmonella có khả năng di động nhờ lông roi; một số ít các kiểu huyết thanh không di động như S gallinarum và S pullorum

[2],[73]

Salmonella có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 5,2 - 46,2oC và pH từ3,7- 9,5, nhiệt độ tối ưu là 37C, pH tối ưu trong khoảng 6,8 - 7,2 Vi khuẩn này cótính chịu nhiệt kém, bị tiêu diệt ở nhiệt độ 50C trong 1 giờ, 70C trong 15 phút,

100C trong 5 phút Vi khuẩn này dễ dàng được nuôi cấy trên các môi trường thôngthường, phát triển thành các khuẩn lạc có đường kính trong khoảng 2 - 4mm, trơn

láng, bờ đều Khi phát tiển trong môi trường lỏng, Salmonella cho canh khuẩn đục

đều, lắng cặn khi kéo dài thời gian nuôi cấy và trên bề mặt môi trường có lớp vánmỏng [2],[3],[73]

Trên môi trường thạch XLD (Xylose Lysine Desoxycholate), khuẩn lạc

Salmonella điển hình có dạng trong suốt, hơi nhuốm đỏ, đôi khi có tâm đen, thường

có vùng đỏ hồng xung quanh (Hình 1.1) Trên môi trường thạch BPLS (Brilliant Green Phenol red Lactose Sucrose), Salmonella có khuẩn lạc trong suốt, có vùng đỏ

hồng xung quanh, không có tâm đen Trên môi trường BSA (Bismuth Sulphite

Agar), S typhi có khuẩn lạc dẹt, khô, đen nhánh, môi trường xung quanh chuyển

thành màu nâu đen và thường có ánh kim bạc phớt trên bề mặt môi trường Các

dạng Salmonella khác tạo khuẩn lạc xanh lá cây hoặc đen ướt, không có vùng nâu đen bao quanh Trên môi trường thạch MC (Mac Conkey Agar), Salmonella tạo

khuẩn lạc có dạng dẹt, trong, ở tâm hơi tím đỏ và làm biến đổi môi trường từ hồngsang hơi vàng [47]

Hình 1.1 Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường XLD

1.3 Đặc điểm kháng nguyên

Salmonella có 3 loại kháng nguyên chính là: kháng nguyên H (hay kháng

nguyên lông, flagella); kháng nguyên Vi (hay kháng nguyên vỏ, capsul) và khángnguyên O (hay kháng nguyên màng tế bào, somatic membrane) Cấu trúc kháng

nguyên của Salmonella được sử dụng để xác định nguồn gốc các chủng gây nên các

triệu chứng lâm sàng từ các mẫu bệnh phẩm hay từ các nguồn phân lập khác Kiểukháng nguyên được chia thành 9 nhóm từ A - I, mỗi nhóm gồm các kiểu khángnguyên được chia chi tiết hơn Cho đến nay đã có 2339 kiểu kháng nguyên của

Salmonella đã được xác định [2],[3],[74].

- Kháng nguyên H

Kháng nguyên H là các kháng nguyên lông (tiên mao), có thể được biểu hiện

ở dạng một pha duy nhất hay hai pha (pha 1 và pha 2): kháng nguyên pha 1 có tínhđặc hiệu chỉ gắn với kháng thể tương ứng; kháng nguyên pha 2 không đặc hiệu, cóthể gắn với các kháng thể khác loại Pha đặc hiệu của kháng nguyên H được dùng

làm tiêu chí bổ sung khi cần xác định các dòng Salmonella có cùng kiểu kháng

nguyên O

- Kháng nguyên Vi

Kháng nguyên Vi là loại kháng nguyên vỏ, hiện diện trên vỏ polysaccharide

ở bên ngoài và thường kết hợp với tính gây độc chuyên biệt cho vật chủ

- Kháng nguyên O

Kháng nguyên O là thành phần O-polysaccharide của phức hợp

lipopolysaccharide (LPS) của màng ngoài tế bào Salmonella LPS gồm 3 thành

phần: bên ngoài là màng O-polysaccharide, phần chính giữa (R) và một màng lipidbên trong LPS là nội độc tố được phóng thích khi tế bào bị ly giải, đóng vai trò

quan trọng trong sự gây bệnh của Salmonella Cấu trúc lặp lại một cách tự nhiên

của các tiểu đơn vị đường ở chuỗi O-polysacchaside quyết định tính đặc hiệu củakháng nguyên O và đặc tính gây bệnh của từng kiểu huyết thanh Những chủng

Salmonella kháng nguyên O được gọi là thể nhám (rough) bởi chúng có khuẩn lạc

xù xì, bị mất hay giảm đặc tính gây bệnh so với dạng hoang dại thể trơn (smooth)còn đầy đủ các chuổi trình tự O-polysaccharide [74]

1.4 Bệnh do Salmonella

Salmonella được coi là một trong những vi sinh vật gây bệnh rất nguy hiểm

cho người và động vật Các bệnh do vi khuẩn này gây nên thường là sốt thương hàn,nhiễm trùng máu, viêm ruột kết và nhiễm trung tâm Viêm ruột kết là một trong

những bệnh phổ biến nhất gây ra bởi Salmonella Các bệnh như nhiễm trùng máu và

xâm nhiễm trung tâm là những bệnh gây ra sau khi viêm ruột kết Sốt thương hàn

được gây ra bởi S typhi, S paratyphi và một số kiểu huyết thanh khác [6],[9].

Salmonella hiện diện khắp nơi trong tự nhiên như trong nước, trong đất, trên

gia cầm, các động vật nuôi, động vật hoang dại, các loài côn trùng, cá, tôm, trongthực phẩm… Tuy nhiên chỉ một số ít các chủng phân lập được xác định theo kiểuhuyết thanh [19],[74]

S enterica I là đối tượng gây bệnh rất quan trọng cho người và động vật bậc

cao Tất cả các kiểu huyết thanh được phân lập từ các mẫu bệnh phẩm của người

đều thuộc loài phụ này [9] Đây là nhóm tiến hóa cao nhất của giống Salmonella, có

thể xâm nhiễm chuyên biệt vào các mô sâu và xuyên thủng hệ thống phòng vệ củacác động vật có hệ miễn dịch hoàn hảo

Theo nghiên cứu tại Viện Vệ sinh phòng dịch Hà Nội [19],[29], các kiểu

huyết thanh S typhi, S typhimurium và S enteritidis là những kiểu huyết thanh

thường xuyên được phân lập từ các bệnh nhân tại Việt Nam Đây cũng là hai kiểuhuyết thanh gây bệnh thường xuyên được phân lập từ các nước phương Tây

Tại Mỹ, hằng năm có khoảng 40.000 trường hợp bị nhiễm bệnh do

Salmonella được báo cáo Tuy nhiên con số này được cho là chỉ chiếm 1-5% số

lượng nhiễm bệnh thật sự và ước tính có khoảng 2-4 triệu trường hợp nhiễm bệnhvới chi phí điều trị bệnh vào khoảng 2 tỉ USD Mặc khác, số người nhiễm bệnh

Salmonella ngày càng có xu hướng gia tăng kể từ sau chiến tranh thế giới thứ hai

đến nay Có nhiều nguyên nhân gây nên hiện tượng gia tăng số lượng người nhiễm

bệnh Salmonella, trong số đó có các nguyên nhân là sự gia tăng số lượng người già

trên 60 tuổi, sự thay đổi trong canh tác nông nghiệp, phân phối thực phẩm và ngàycàng có nhiều người tiêu thụ thực phẩm tươi sống hay chỉ qua phương thức nấu nhẹ

trước khi ăn Sự lan truyền của bệnh Salmonella cho người chủ yếu qua con đường

thực phẩm Tuy nhiên sự lây nhiễm trực tiếp giữa người và người hay động vật chongười đôi khi cũng diễn ra [19],[73]

1.5 Đặc điểm di truyền liên quan đến tính gây bệnh của Salmonella

1.5.1 Đặc điểm bộ gen

Cấu trúc bộ gen DNA của S typhimurium rất giống với E coli, gồm một

phân tử DNA vòng có kích thước khoảng 4 x 106bp dài khoảng 1,4mm, mã hoá cho

khoảng 4800 gen [9,10] Cho đến nay bộ gen của 2 kiểu huyết thanh S typhimurium và S typhi đã được giải mã Ngoài các vùng có trình tự tương đồng cao với E coli, ở Salmonella còn có sự hiện diện của các vùng gây bệnh PAI (pathogenicity islands) mã hóa cho nhiều nhân tố gây độc của Salmonella Các PAI

thường có hàm lượng GC rất khác so với phần còn lại của nhiễm sắc thể Các genthuộc vùng này được hình thành từ quá trình tiến hóa của vi khuẩn này [9],[45]

Bowe và cộng sự đã phát hiện ra rằng có ít nhất 4% bộ gen của S typhimurium cần

thiết cho quá trình xâm nhiễm, gây chết chuột và hầu hết các gen gây bệnh là cầnthiết cho giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm Số lượng lớn các gen gây bệnhcho thấy rằng sự sống sót trong vật chủ cần có sự cân bằng tinh tế của nhiều genhoạt động một cách chính xác tại đúng thời điểm và trong môi trường thích hợp[48],[51]

đại thực bào của vật chủ.

- SPI-2 là cụm gen dài 40kb tại vị trí 31 phút trong locus tRNAval, giúp

Salmonella xâm nhiễm và sống sót bên trong các đại thực bào Các thể đột biến trên

SPI-2 có độc lực giảm rất nhiều, chúng không thể nhân lên trong các cơ quan nhưgan, lách của vật chủ nhiễm bệnh, cũng như giảm khả năng vựợt qua mảng Peyer để

đi vào trong biểu mô ruột Các nghiên cứu in vitro cũng cho thấy rằng các thể đột

biến SPI-2 bị giảm khả năng sống sót trong đại thực bào và khả năng nhân lên trongcác tế bào bạch cầu đơn nhân

- SPI-3 là cụm gen được định vị tại locus 82 phút trên bộ gen, ngay sau salC,

một locus của tRNA Cụm gen này mã hóa cho 10 khung đọc mở ORF (open

reading frame) và 6 đơn vị phiên mã trong đó có operon mgtCB (mã hóa cho protein

MgtC và protein MgtB vận chuyển Mg2+, có vai trò giúp Salmonella sống sót trong

đại thực bào) [11]

- SPI-4 dài 27kb tại vị trí 92 phút trên DNA bộ gen Cụm gen này mã hóa

cho 18 protein được cho là có vai trò giúp Salmonella sống sót trong đại thực bào

vật chủ [57]

- SPI-5 được định vị tại locus tRNAserở vị trí 20 phút trên nhiễm sắc thể, mã

hóa cho các gen giúp Salmonella sống sót sót trong đại thực bào [57].

- SPI-6 định vị bên cạnh tRNAphe, giúp Salmonella tồn tại được trong đại thực bào Cụm gen này có hai khung đọc mở ORF rất giống các gen atsAB của Klebsiella aerogenes mã hóa cho arylsulfatase Ngoài ra còn có ORF mã hóa gen stmR được cảm ứng khi Salmonella hiện diện trong đại thực bào, bốn ORF khác

liên quan đến khả năng sống sót được trong đại thực bào [45],[48]

Các cụm SPI có đặc điểm chung là mang phần gen có liên quan về chứcnăng với nhau và cần thiết cho các kiểu hình gây bệnh chuyên biệt được hình thành

từ quá trình tiến hóa theo hướng tăng cường tính gây bệnh ở Salmonella Salmonella được tiến hóa qua 3 giai đoạn (Hình 2.2) [9].

1.5.3 Các gen gây độc

- invA

Locus inv hiện diện ở cụm gen SPI-1 gồm các gen giúp Salmonella xâm

nhiễm được vào các tế bào biểu mô ruột Một vài gen thuộc locus này được biểu

hiện và protein được tiết vào môi trường tương tác với biểu mô vật chủ Gen hilA

(hyper invasive locus) mã hóa cho protein HilA có vai trò trong điều hòa sự phiên

mã cac gen inv thông qua tín hiệu hàm lượng ôxi thấp ở ruột Gen invA là một thành viên của locus inv, có vị trí tại 59 phút trên nhiễm sắc thể của Salmonella Các đột biến trên gen invA làm giảm 500 lần khả năng xâm nhiễm tế bào biểu mô của Salmonella nhưng không ảnh hưỏng đến khả năng bám dính vào các tế bào này vào màng nhầy Gen invA được xác nhận là hiện diện trên hầu hết các chủng Salmonella

[25],[27],[63]

- iagAB

Gen iagA, còn gọi là gen hilA, mã hoá cho protein hoạt hóa sự phiên mã các gen gây xâm nhiễm ở Salmonella, đồng thời có ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến sự biểu hiện của các gen phoPQ Gen iagB, nằm liền kề ngay sau iagA, có chức năng chưa được xác định Các gen iagAB được chứng minh là chỉ hiện diện ở các kiểu huyết thanh thuộc loài phụ S enterica I [71],[72].

- Gen phoPQ

Gen pho PQ mã hóa cho 2 thành phần chức năng PhoP và PhoQ của hệ

thống điều hòa 2 thành phần (two components reguratory system) PhoP/PhoQ có

vai trò trong tính gây độc của Salmonella Đột biến trên một trong 2 gen phoP hoặc phoQ này đều làm tăng LD50 lên đến 104 lần và giảm khả năng sống sót cuả

Salmonella trong đại thực bào Hệ thống PhoP/PhoQ có vai trò hoạt hóa các gen,

trong đó sự hoạt hóa gen pag liên quan mật thiết đến sự sống sót của Salmonella trong đại thực bào và tăng sức đề kháng của Salmonella đối với kháng sinh [23].

PhoQ là một protein cảm biến Mg2+(Mg2+ sensor) Khi nồng độ Mg2+ đạtmức mM thì, thông qua PhoP, protein này sẽ ức chế phiên mã 25 locus trong đó có

các gen giúp sự tăng trưởng của Salmonella Ngoài Mg2+, Ca2+và Mn2+cũng đượccảm biến bởi PhoQ Hệ thống PhoP/PhoQ không chỉ liên quan đến tính gây bệnh

của Salmonella mà còn liên quan đến các đặc điểm khác ở vi khuẩn này [36],[40].

Salmonella trong môi trường có nồng độ ion Fe2+ở mức độc đối với tế bào [7]

- ssrAB

Gen ssrA mã hóa cho SsrA có vai trò cảm biến; gen ssrB mã hóa cho SsrB là

protein điều hòa của hệ thống điều hòa hai thành phần SsrA/SsrB Hệ thống nàyđiều hòa sự hình thành các thành phần của hệ thống tiết loại III (type III sorting

system) có vai trò trong sự nhân lên của Salmonella trong đại thực bào và khả năng truyền nhiễm khắp cơ thể chuột Gen ssrAB nằm trong cụm gen SPI-2 và chịu sự

điều hòa ở mức phiên mã bởi một thành phần của hệ thống điều hòa hai thành phầnEnvZ/OmpR Trong thể thực bào của đại thực bào, các chất có tính ôxi hóa mạnh lànguyên nhân gây hư hỏng DNA, protein và làm chết tế bào vi khuẩn Do đó, khảnăng sửa chữa các sai hỏng trên DNA và protein của vi khuẩn có quan hệ chặt chẽ

với tính gây bệnh của vi khuẩn SsrA giúp vi khuẩn chống lại môt phần tổn thương

do bị ôxi hóa bằng cách ngăn sự tạo thành các protein bất bình thường có độc tínhcho tế bào vi khuẩn [12,18]

- rpoS

Gen rpoS mã hóa cho nhân tố sigma RpoS có vai trò giúp các vi khuẩn thuộc Enterobacteriaceae sống sót trong pha ổn định và thích nghi với các điều kiện thay

đổi đột ngột của môi trường RpoS liên quan đến sự phiên mã của một họ gen gồm

50 gen Ở S typhimurium, RpoS điều khiển sự biểu hiện của các gen thuộc plasmid gây độc spv, cần cho quá trình lan nhiễm của mầm bệnh khắp vật chủ rpoS được

biểu hiện mạnh sau khi xảy ra quá trình thực bào cũng như khi vi khuẩn đi vàotrong các tế bào biểu mô Hàm lượng RpoS tăng làm gia tăng sự biểu hiện củaprotein điều hòa SpvR và làm tăng đáng kể sự phiên mã của các gen cấu trúc

spvABCD Các thể đột biến trên rpoS có sự biểu hiện của spv giảm đồng thời độc

lực cũng suy giảm [54],[70]

- recD

Gen recD mã hóa cho một exonuclease V trong phức hợp enzyme RecBCD

có vai trò trong tái tổ hợp di truyền và sửa chữa các hư hỏng trên DNA Để có thể

truyền nhiễm khắp cơ thể vật chủ, Salmonella phải sống sót và nhân lên được trong các thực bào Một trong các cơ chế giúp Salmonella tồn tại được trong thực bào là

khả năng sửa chữa sai hỏng trên DNA gây ra bởi các chất ôxi hóa mạnh do thực bào

tạo ra Các thể đột biến mất chức năng của RecA và RecBC ở S enterica sẽ bị mất

độc tính và có tính mẫn cảm cao với các chất ôxi hóa do thực bào tạo ra [32],[67]

- spvRABCD

Nhiều kiểu huyết thanh thuộc loài phụ S enterica I có mang một plasmid lớn

với số lượng bản sao thấp chứa các gen gây bệnh có kích thước từ 50 đến 90kb và

có một vùng chung dài 7,8kb được gọi là spv Vùng spv gồm 5 gen spvRABCD

được điều hòa phiên mã bởi nhân tố sigma RpoS SpvR là protein điều hòa hoạt hóa

cần cho sự biểu hiện của các gen spv khác SpvA là một protein 28kDa hiện diện trên màng ngoài của Salmonella không liên quan đến độc lực của vi khuẩn này.

SpvB là một protein màng, kích thước 66kDa, hiện diện ở màng trong, có liên quan

đến độc lực của Salmonella Các thể đột biến trên spvB không còn độc lực của Salmonella SpvB có hoạt tính ức chế sự polymer hóa của actin trong tế bào chủ và

có thể liên quan đến khả năng ức chế sự kết hợp của thể thực bào và lysosome trongquá trình thực bào SpvC là một protein 28kDa hiện diện trong tế bào chất SpvD có

kích thước 25kDa được tiết ra khỏi tế bào Các thể đột biến trên spvD và spvC ở Salmonella thể hiện kiểu hình mất độc lực [25],[54],[63] Nói chung locus spv giúp Salmonella tăng cường sự phân chia trong các tế bào biểu mô và có vai trò trong sự lan nhiễm của Salmonella vào gan và lách.

1.6 Đặc điểm tiến hóa về tính gây bệnh

Bằng các phương pháp điện di emzym đa locus, phân tích trình tự bộ gen,

phân tích rRNA và lai DNA-DNA người ta đã xác định giống Salmonella gồm hai nhánh tiến hóa với hai loài hoàn toàn khác biệt là S enterica và S bongori Hai loài

này khác biệt nhau về cấu trúc di truyền các gen thông thường và các cụm gen gây

bệnh SPI S enterica chứa cụm gen gây bệnh SPI-2, không có ở S bongori SPI-2

có tỉ lệ C+G khoảng 40%, thấp hơn tỉ lệ C+G 52% trên toàn bộ gen của S enterica.

Thí nghiệm trên chuột cho thấy việc gây đột biến trên vùng gen SPI-2 đã có tác

dụng làm yếu 10.000 lần tính gây bệnh của S typhimurium [9].

Trong quá trình tiến hóa, S enterica đã phân hoá thành các loài phụ khác nhau S enterica I có phổ xâm nhiễm rộng rãi nhất, được tìm thấy trong tất cả các loài động vật máu nóng S enterica II, IIIa, IIIb, IV, VI và VII chỉ xâm nhiễm được

vào trong các tế bào của động vật máu lạnh [48],[51]

1.6.1 Các bước tiến hóa về tính gây bệnh của giống Salmonella

Ba bước tiến hóa chính trong quá trình hình thành tính gây bệnh ở

Salmonella được minh họa trên Hình 1.2 [9],[51].

- Bước 1: tiến hóa theo hướng hình thành cụm gen SPI-1 là bước đầu tiên để

hình thành Salmonella phân biệt với E coli và những vi khuẩn đường ruột khác có quan hệ gần gũi với Salmonella Sự xuất hiện của cụm gen SPI-1 đã hình thành giống Salmonella trong họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae.

- Bước 2: là bước tiến hóa trong giống Salmonella để chia thành 2 loài S.

enterica và S bongori Các kiểu huyết thanh trong S enterica có thêm 1 cụm gen

gây bệnh SPI-2

Hình 1.2 Quá trình tiến hóa hình thành tính gây bệnh ở Salmonella.

- Bước 3: là bước tiến hoá trong quá trình thích nghi và gây bệnh cho vật

chủ S enterica I tiến hoá theo chiều hướng tăng cường khả năng thích nghi và gây

bệnh cho các động vật máu nóng Một số chủng trong loài phụ này tiến hoá theochiều hướng thích nghi chuyên biệt trong một nhóm ký chủ Sự tiến hóa này nhằmthích nghi chuyên biệt với một hệ miễn dịch đặc trưng của một nhóm ký chủ

1.6.2 Tiến hoá theo hướng tăng tính gây bệnh

Mặc dù S enterica có 1.367 kiểu huyết thanh khác nhau nhưng chỉ có một số

ít trong số này gây bệnh cho các động vật có vú bậc cao và có mức độ thích nghi

khác nhau trong vật chủ Những kiểu huyết thanh mất tính đặc hiệu vật chủ như S Typhymurium, S enteritidis thường xâm nhiễm và gây bệnh cho các động vật còn

non nhiều hơn đối với những động vật trưởng thành Điều này cho thấy chúng kém

Hình I: Mô hình tiến hoá của quá trình gây bệnh ở giống Salmonella Có ba giai đoạn

tiến hoá từ khí tách khòi E.coli

thích ứng đối với những động vật có hệ miễn dịch hoàn chỉnh Ngược lại các kiểuhuyết thanh đặc hiệu với vật chủ thì khả năng cao trong chọc thủng hệ thống phòng

vệ của động vật trưởng thành, có tính gây bệnh mạnh hơn và tỉ lệ gây tử vong rấtcao Mặc dù có giả thuyết cho rằng các dòng vi khuẩn gây bệnh có tỉ lệ gây chết cao

ở động vật có xương sống thường tiến hóa theo hướng hình thành những dạng ít gây

bệnh để thích nghi tốt hơn trong tế bào chủ, tuy nhiên S enterica lại tiến hóa theo hướng hình thành những dòng có khả năng gây tử vong cao hơn Ví dụ S typhi có

tính đặc hiệu rất cao với người, gây bệnh sốt thương hàn với tỉ lệ gây tử vong từ

2-32%, S typhimurium, S enteritidis có tỉ lệ gây tử vong khoảng 0,5% [9].

Mô hình toán học của Anderson và Hay cho phép tiên đoán rằng nếu nhân tố

gây bệnh ở dòng Salmonella có tính gây bệnh ở mức độ cao được chuyển vào một

dòng vi khuẩn gây bệnh cho một vật chủ cụ thể thì sự tiến hoá sẽ theo hướng tăng

mức độ gây bệnh Trong quá trình tiến hoá của các kiểu huyết thanh Salmonella

hướng vào người dường như có sự liên kết giữa tính gây bệnh cao và khả năng pháttriển thành bệnh mãn tính Một cá thể mang bệnh mãn tính có khả năng truyềnnhiễm cho một số lớn các cá thể khác, qua đó gia tăng mức độ lan truyền và tạo áplực chọn lọc để tiến hóa thành các chủng có tính gây bệnh với độc lực cao như

trường hợp của các kiểu huyết thanh Salmonella gây thương hàn và phó thương hàn

ở người [33],[52]

1.6.3 Loài phụ S entreica I tiến hóa theo hướng thích nghi với vật chủ là

người và động vật máu nóng

Các kiểu huyết thanh O thuộc 9 nhóm A, B, C1, C2, D, E1, E2, E3 và E4 của

Salmonella, theo hệ thống phân loại của Kauffmann White, là thuộc loài phụ S enterica I, theo hệ thống phân loại của Edwards và Ewing Đây là các nhóm thường xuyên được phân lập từ người và động vật máu nóng Ngược lại các loài phụ S enterica II, IIIa, IIIb, IV, VI và S bongori rất hiếm khi được phân lập từ người mà

chủ yếu được phân lập được từ các loài động vật máu lạnh và từ môi trường Trên95% các kiểu huyết thanh phân lập từ các mẫu bệnh phẩm thuộc loài phụ này Báocáo năm 1991 của Trung tâm Nghiên cứu Thú y và Dinh dưỡng (CNEVA) của Pháp

cho thấy loài phụ này chiếm 99,2% các chủng phân lập được từ động vật và người[50].

Các thí nghiệm gây nhiễm S enterica II hay III bằng đường miệng lên các

loài động vật như rắn, rùa hay thằn lằn cho thấy các loài phụ này chỉ gây các triệuchứng bệnh liên quan đến đường ruột, không xâm nhiễm sâu hơn trong cơ thể vật

chủ Ngược lại các kiểu huyết thanh thuộc S enterica I tạo được khuẩn lạc tại các

mô đường ruột của các loài động vật máu nóng và có thể nhân lên bên trong tế bào

ở màng trong của hệ tuần hoàn, thích nghi được với hệ thống không chuyên biệt củavật chủ Sự thích nghi của một kiểu huyết thanh trong một vật chủ cụ thể đòi hỏi

Salmonella phải thích nghi với tế bào bạch cầu đơn nhân của vật chủ đó và các bạch

cầu đơn nhân là một rào chắn quan trọng kháng lại sự xâm nhiễm của các kiểu

huyết thanh gây bệnh S typhi có thể sống sót trong các đại thực bào của người nhưng không thể sống trong các đại thực bào của chuột, ngược lại S typhimurium

có thể sống sót trong các đại thực bào của chuột nhưng không thể sống trong các đại

thực bào của người trong các thí nghiệm nuôi cấy in vitro Các nghiên cứu đã công

bố cho thấy khả năng gây bệnh của các kiểu huyết thanh Salmonella có mối liên hệ

trực tiếp với khả năng chống chịu lại các đại thực bào của vật chủ

1.6.4 Tiến hóa của protein có vai trò bám dính có liên quan đến phổ vật chủ

Các kiểu huyết thanh của Salmonella bắt đầu sự xâm nhiễm bằng sự bám

dính vào màng nhầy thành ruột của vật chủ thông qua các cấu trúc protein được

hình thành từ protein đơn vị invH được mã hóa bởi gen tương ứng hiện diện ở cụm

gen SPI-1 Khi đột biến bất hoạt gen này thì sự bám dính và sự xâm nhiễm của thể

đột biến bị giảm Ngược lại đột biến trên invA hay invE (có vai trò trong xâm

nhiễm) thì không ảnh hưởng đến sự bám dính của thể đột biến Việc so sánh hiệu

quả quá trình gây bệnh của thể đột biến trên invH với các thể đột biến trên các gen

khác trên SPI-1 cho thấy tính quan trọng của sự bám dính trong quá trình xâm

nhiễm của Salmonella lên các vật chủ khác nhau [42].

Ngoài invH, Salmonella còn mang một số gen mã hóa cho các protein khác

có vai trò trong sự bám dính như Pef, Lpf, Fim, Arg Sự đa dạng của các operon mã

hoá cho các protein bám dính có vai trò làm tăng phổ vật chủ do các protein này cóthể thay thế lẫn nhau trong việc nhận ra tế bào biểu mô của vật chủ Thí nghiệm

nuôi cấy mô ruột của chuột cho thấy các protein Pef, Lpf được mã hóa bởi pef và lpf

có vai trò trong việc gắn S typhimurium vào lông nhung của thành ruột và các

mảng Peyer Các nghiên cứu đã công bố cũng cho thấy protein bám dính đóng vai

trò chọn lọc để định hướng S enterica tập trung lên bề mặt thành ruột của động vật,

một cơ chế quan trọng cho việc xác định phổ vật chủ Các cấu trúc protein bám dính

được hình thành trên bề mặt tế bào của Salmonella và được nhận diện bởi các tế bào biểu mô ruột của vật chủ S typhi nhận diện receptor là cấu trúc xơ nang để gắn lên

tế bào biểu mô ruột Ngược lại, Salmonella typhimurium nhận diện một receptor

khác của tế bào biểu mô ruột Sự khác biệt về protein bám dính và receptor quyết

định phổ vật chủ khác nhau giữa S typhi và S typhimurium Sự trao đổi gen và sự mất đoạn giúp tạo ra các dạng protein bám dính mới giúp Salmonella có phổ tế bảo chủ mới trong quá trình tiến hóa của các kiểu huyết thanh S enterica [5],[34].

1.7 Sự tương tác giữa Salmonella và vật chủ

1.7.1 Cấu tạo của hệ tiêu hóa của người và động vật máu nóng liên quan

đến quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn

Các mầm bệnh xâm nhập qua đường thực phẩm nói chung, hay Salmonella

nói riêng, xâm nhiễm vào cơ thể vật chủ qua đường tiêu hóa Hệ tiêu hóa là một hệthống bao gồm các cơ quan tiêu hóa, bắt đầu từ miệng và kết thúc ở hậu môn Cùngvới các cơ quan này là hàng loạt các tuyến có chức năng tiết dịch tiêu hóa để tiêuhóa thức ăn Các cơ quan tiêu hóa bao gồm miệng, họng (hầu), thực quản, dạ dày,ruột non, ruột già, trực tràng và hậu môn Ruột non được chia ra làm 3 phần là tátràng, ruột chay, ruột hồi Gan và lá lách không thuộc ống tiêu hóa nhưng có quan

hệ mật thiết với hệ này Hệ tiêu hóa có dạng ống Ống tiêu hóa bao gồm bốn lớp,trong mỗi lớp có một loại mô chiếm ưu thế tạo nên chức năng chuyên biệt trong quá

trình tiêu hóa (Hình 1.3) [51] Bốn lớp này tính từ trong ra ngoài gồm:

Hình 1.3 Cấu tạo các lớp tạo nên ống tiêu hóa

- Lớp niêm mạc (mucusa)

Lớp niêm mạc bao gồm các lớp: (i) Lớp tế bào biểu mô tiếp xúc trực tiếp vớilồng ruột; (ii) Lớp lamina propria là một lớp mỏng gồm mô liên kết có hình khoanh,mang nhiều mạch máu, các hạch bạch huyết có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ

cơ thể; (iii) Lớp màng nhầy ngoài cùng, mỏng được cấu tạo bởi các tế bào cơ trơn

- Lớp dưới niêm mạc (submucosa)

Lớp dưới niêm mạc tương đối mỏng, có các mô liên kết chứa các mạch bạchhuyết và mạch máu Lớp dưới niêm mạc còn chứa các tuyến và mạng lưới thần kinhđiều khiển họat động của niêm mạc ruột

- Lớp cơ trơn

Lớp cơ trơn gồm hai lớp mỏng: (i) Lớp trong bao gồm các cơ trơn sắp xếpdạng tròn (cơ vòng); (ii) Lớp ngoài bao gồm các cơ sắp xếp song song theo chiềudọc (cơ dọc) Sự kết hợp của hai dạng cơ này làm cho ống tiêu hóa có khả năng codãn một cách uyển chuyển để nén và đưa thức ăn vào trong lồng ruột Giữa hai lớp

cơ này là mạng lưới thần kinh cơ ruột có vai trò rất quan trọng trong việc điều khiểnhoạt động của ống tiêu hóa

- Lớp áo vỏ (serosa)

Lớp áo vỏ là lớp ngoài cùng, có vai trò bao bọc và bảo vệ Lớp này bao gồmcác mô liên kết hình khoanh được bao phủ bởi một lớp biểu mô hình vảy

1.7.2 Sự tương tác giữa Salmonella và vật chủ

Khi Salmonella xâm nhập vào cơ thể sẽ gặp phải sự kháng cự của hệ thống

phòng vệ cơ thể Mỗi bộ phận của hệ tiêu hóa vật chủ đều có những thành phần hóahọc, những đặc tính vật lý và hệ thống miễn dịch chống lại sự xâm nhập của tác

nhân xâm nhập Để có thể gây bệnh, Salmonella phải thay đổi để phù hợp với môi

trường xung quanh và thích nghi với các tác nhân phòng vệ của vật chủ thông quaviệc phối hợp biểu hiện các gen Cùng với những thay đổi để thích nghi với các tác

nhân phòng vệ của vật chủ, Salmonella phải hoạt hóa được cơ chế gây độc chuyên

biệt nhằm chống lại, lẫn tránh, thậm chí điều khiển một cách có hệ thống toàn bộ hệmiễn dịch của cơ thể [33]

Quá trình xâm nhiễm của Salmonella được bắt đầu khi vật chủ tiêu thụ thức

ăn hay nước uống bị nhiễm khuẩn Sau khi vượt qua được dạ dày, Salmonella

xuống tới ruột non Sau khi đến phần cuối của ruột non, vi khuẩn phải thâm nhậpqua lớp niêm mạc trước khi gắn vào các tế bào biểu mô ruột Quá trình gắn vào tếbào biểu mô ruột được thực hiện nhờ các loại khuẩn mao trên tế bào vi khuẩn [35]

Những nghiên cứu ở mức hiển vi cho thấy các chủng Salmonella xâm chiếm

các tế bào biểu mô thông qua quá trình nhập bào Một khoảng thời gian ngắn saukhi vi khuẩn gắn vào lông tiếp xúc trên bề mặt tế bào biểu mô, bề mặt tế bào thay

đổi tạo nên các nang không bào bao quanh vi khuẩn Các nang mang Salmonella

được đưa vào cơ thể thông qua quá trình nhập bào Sự xâm nhập của vi khuẩn thôngqua quá trình nhập bào đòi hỏi phải có sự tổng hợp nhiều loại protein tế bào đồngthời ngăn cản việc tái sắp xếp bộ khung tế bào làm ngăn cản sự di chuyển của

không bào mang Salmonella vào bên trong [51].

Ngoài việc xâm nhiễm vào tế bào biểu mô, các kiểu huyết thanh Salmonella

gây ra bệnh viêm ruột còn cảm ứng tế bào biểu mô tiết các tín hiệu làm di chuyểncác bạch cầu trung tính vào bên trong lớp lumen ruột Các thí nghiệm trong mô hình

nuôi cấy in vitro cho thấy sự hấp thu thêm bạch cầu trung tính xuyên qua bề mặt lớp

tế bào biểu mô để đi vào lumen cần phải có sự tổng hợp một số protein ở cả tế bào

vi khuẩn và tế bào biểu mô của vật chủ Quá trình này có liên quan đến việc sảnxuất nhiều loại cytokines

Kent và cộng sự đã gây nhiễm Salmonella vào khỉ nâu và theo dõi sự xâm

nhiễm vào tế bào biểu mô ở nhiều cơ quan vào những thời điểm khác nhau Trong 4

ngày đầu, Salmonella xâm chiếm và phát triển trong ruột hồi, manh tràng, vùng

ngoại biên ruột kết, các nốt bạch huyết ở màng treo ruột, một số còn xâm chiếm

ruột chay, gan và lách Salmonella tiếp tục tồn tại trong các nốt bạch huyết ở màng treo ruột đến ngày thứ 7 Ở ruột kết, vào ngày thứ nhất và thứ 2, Salmonella xuyên

qua các nốt bạch huyết ở màng treo ruột để vào bên trong lớp niêm mạc Vào ngày

thứ 4, Salmonella được quan sát thấy ở tế bào biểu mô và bên trong các đại thực bào của phiến lamina propia Vào ngày thứ 7, các Salmonella ở niêm mạc sẽ khuếch

tán ra bên ngoài các tê bào, lớp lamina propia mang nhiều tế bào bị viêm hơn [5]

1.7.3 Cơ chế phòng vệ của vật chủ đối với sự xâm nhập của mầm bệnh

Ống tiêu hóa là nơi luôn tiếp xúc với nhiều mầm bệnh Mỗi nơi trong ốngtiêu hóa đều có cấu tạo đặc biệt, có các đặc tính sinh lý và sinh hóa phù hợp để ngăncản sự xâm nhiễm của các mầm bệnh Những hàng rào ngăn cản sự xâm nhiễm của

mầm bệnh tại các cơ quan trong ống tiêu hóa được trình bày tóm tắt trên Bảng 1.1

[51],[74]

- Các mảnh vỡ tế bào biểu mô trong niêm mạc

Trong điều kiện bình thường, các tế bào biểu mô liên tục bị tróc ra và đượcthay thế bằng các lớp tế bào biều mô mới Khi những tế bào này bị tróc ra, những visinh vật bám bên trên hay ở bên trong tế bào sẽ được bài tiết ra ngoài Nếu quá trìnhtróc ra bị cản trở, các mầm bệnh có thể tạo thành các ổ bệnh và xâm nhiễm quathành ruột

- Lớp glycolax

Glycolax là một lớp glycoprotein và polysaccharide bao phủ trên bề mặt tếbào biểu mô, là một lớp mỏng, có bề dày tương đương với kích thước vi khuẩn, cóvai trò như là một cái bẫy hóa học bắt lấy các vi sinh vật

Cơ quan phòng vệ Nhân tố phòng vệ

Tốc độ tiêu hoá thức ăn của dạ dày

Hệ vi sinh vật đường ruộtDịch nhầy

Sự tiết kháng thểCác nhân tố di truyền kháng sự xâm nhiễm

LactoferinLysozyme

Bảng 1.1 Sự phòng vệ của vật chủ chống lại sự xâm nhiễm của mầm bệnh

- Màng nhày

Màng nhày đóng vai trò như một rào cản vật lý, gây khó khăn cho vi khuẩntiếp cận với bề mặt tế bào biểu mô Ngoài ra màng nhầy còn có tác dụng bao phủlấy vi khuẩn và loại bỏ chúng thông qua quá trình chuyển động của nhu động ruột

- Môi truờng acid trong dạ dày

Bình thường pH trong dạ dày khoảng dưới 4 Lượng acid cao trong dạ dày sẽđược đổ vào ruột non để tạo nên một gradient pH giúp cho cơ thể phòng tránh hầuhết các vi sinh vật xâm nhập vào dạ dày, tá tràng, ruột chay và nửa trên của ruột hồi

Độ acid cao của dạ dày sẽ tiêu diệt hầu hết các mầm bệnh trước khi đến ruột non.Trên 99,9% vi khuẩn bị tiêu diệt sau 30 phút tiếp xúc với môi trường acid Sự thayđổi đặc tính acid của dạ dày do bệnh tật, phẩu thuật, thuốc và các hóa chất làm giảm

độ acid sẽ làm tăng khả năng sống sót của các mầm bệnh trong dạ dày, có thể gây ra

sự nhiễm khuẩn

- Mật

Mật có vai trò hòa tan lipid và bất hoạt các vi sinh vật có màng bao lipid Sựtắc nghẽn mật do sỏi mật có thể làm cho các mầm bệnh phát triển và gây bệnh ngay

tại phía dưới chỗ tắt nghẽn và trong ruột; muối mật bị tích luỹ phía trên chỗ tắtnghẽn gây ra viêm và phá huỷ thành túi mật.

- Kháng thể IgA

Các IgA được vận chuyển xuyên qua các tế bào biểu mô vào lòng ruột sẽngăn cản quá trình gắn và xâm nhiễm của vi khuẩn vào thành ruột

- Sự di chuyển của ruột

Quá trình chuyển động liên tục của ruột giúp cho quá trình hấp thu chất dịch;duy trì sự hiện diện các vi khuẩn đường ruột ở mức thích hợp, bảo vệ cơ thể khỏimầm bệnh bằng việc ngăn cản quá trình gắn của mầm bệnh vào các thụ quan trên bềmặt tế bào biểu mô

- Lớp Peyer

Lớp Peyer là nơi cư trú của các tế bào bạch huyết Khi Salmonella xuyên qua

các tế bào M sẽ được các tế bào này xử lý để trình diện kháng nguyên ra bên ngoàigiúp cho các tế bào bạch huyết nhận biết sự xâm nhiễm của vi khuẩn Ngoài ra, còn

có một số các bạch huyết cầu không chuyên biệt thường xuyên di chuyển qua lớpPeyer Thông thường có khoảng 1 - 2% các bạch huyết cầu tuần hoàn mỗi giờ tạonên một nguồn tế bào bạch huyết sẵn có nhằm tăng cường khả năng chống xâmnhập của các vi khuẩn

- Hệ vi sinh vật trong ruột

Khoảng 99,9% các vi sinh vật trong ống tiêu hóa là các loài kỵ khí thuộc các

giống Bacteroides, Prevotella, Clostridium, Peptostreptococcus Ngoài ra, trong ống tiêu hóa còn có sự hiện của các sinh vật hiếu khí thuộc các giống Escherichia, Proteus, Pseudomonas Các sinh vật này cạnh tranh về mặt dinh dưỡng và vị trí gắn

đặc hiệu của mầm bệnh từ đó ngăn cản sự xâm nhiễm mầm bệnh qua thành ruột.Ngoài ra các vi khuẩn còn tại ra các acid béo mạch ngắn có tác dụng tiêu diệt

Salmonella.

Ngoài các cơ chế phòng vệ của cơ thể như trên, sức chống đỡ của cơ thểtrước sự xâm nhập của mầm bệnh còn phụ thuộc nhiều vào trạng thái sức khoẻ, tìnhtrạng dinh dưỡng, trạng thái tinh thần, hoàn cảnh tự nhiên, hoàn cảnh xã hội Việc

thiếu dinh dưỡng đặc biệt là vitamin, protein làm tăng nguy cơ mắc bệnh cũng như

tử vong [51]

1.8 Triệu chứng bệnh do Salmonella

Những biểu hiện bệnh ở vật chủ khi Salmonella xâm nhiễm thường là viêm

ruột kết, nhiễm trùng máu và sốt thương hàn Mỗi kiễu huyết thanh khác nhauthường gây ra các triệu chứng bệnh khác nhau Mặt khác, nhiều kiểu huyết thanhkhác nhau lại có biểu hiện bệnh giống nhau Sau khi xâm nhiễm vào cơ thể người

và động vật, thời gian ủ bệnh thường khoảng 6 - 48 giờ, sau đó gây nên các triệuchứng như nhức đầu, chóng mặt, tiêu chảy và ói mửa Khi tiêu chảy có thể có sựxuất huyết, phân có mủ nhầy và chứa các mảnh niêm mạc ruột Ngoài ra còn có cáctriệu chứng khác như sốt, khó chịu và thường hay bị chuột rút Các triệu chứng trên

thường khỏi sau một tuần Vi khuẩn Salmonella có thể tồn tại trong phân khoảng 20

tuần đối với trẻ dưới 5 tuổi và khoảng 8 tuần đối với người lớn [2]

Sự biểu hiện bệnh thường rất nguy hiểm ở trẻ em và người già trên 50 tuổi.Kent và cộng sự cho rằng có rất ít trường hợp gây bệnh viêm ruột cấp tính gây ra

bởi Salmonella Quan điểm này cho đến nay vẫn được thừa nhận và đã được chứng minh là đúng đắn Một số báo cáo khác cho rằng ruột già là nơi vi khuẩn Salmonella

bám vào đầu tiên chứ không phải là ruột non Để tạo ra những biểu hiện bệnh ở vật

chủ, Salmonella cần phải sử dụng nhiều nhân tố khác nhau bao gồm các nhân tố

bám dính và xâm nhiễm vào trong tế bào, phức hợp lipopolisaccharide để tránh sựtấn công của thực bào, các nhân tố giúp vi khuẩn phân chia bên trong tế bào chủ vàđộc tố Sau khi xâm nhiễm vào đường ruột, vi khuẩn xâm chiếm tế bào ruột hồi,xâm nhập vào bên trong tế bào biểu mô ruột, tăng trưởng bên trong tế bào biểu mô

và hoá kén bên trong tế bào lympho [19]

Salmonella xâm nhiễm vào vật chủ qua thành ruột và vượt qua sự tấn công

của các thực bào Một số kiểu huyết thanh có khả năng tập trung bám trên thànhruột, di chuyển vào trong các lớp biểu mô và sống trong các đại thực bào Các tế

bào Salmonella này có thể được dẫn đến các cơ quan khác như tụy và gan nhờ hệ

bạch huyết Sự nhân lên của vi khuẩn trong các mô này gây nên các triệu chứng lâmsàng Một số kiểu huyết thanh khác có thể gây sốc cho vật chủ bởi độc tố của

chúng Tuy nhiên các triệu chứng bệnh đường ruột gây ra do Salmonella chỉ xuất hiện khi có xâm nhập của vi khuẩn vào các tế bào thành ruột Ví dụ các chủng S.

enteritidis có khả năng sản xuất một số độc tố, nhưng triệu chứng tiêu chảy chỉ xuấthiện khi có sự hủy hoại các tế bào biểu mô ruột bởi sự xâm nhiễm của vi khuẩn[51]

Tiêu chảy là một biểu hiện phổ biến khi bị nhiễm Salmonella Giannella và cộng sự đã cho thấy rằng bước xâm nhiễm của Salmonella vào nhu động ruột không

gây nên bệnh tiêu chảy; triệu chứng lâm sàng chỉ xuất hiện khi có sự tiết của các

protein thuộc locus SPI-I Khi đột biến trên sopB mã hoá cho SopB, là protein cần

thiết cho hoạt động của SPI-I, thì thể đột biến bị suy giảm đáng kể khả năng gâytiêu chảy [69] Một số nghiên cứu khác cho thấy rằng hoạt tính của độc tố tế bào và

độc tố đường ruột do Salmonella tiết ra có liên quan đến triệu chứng tiêu chảy Theo

Giannella và cộng sự, prostaglandine được tiết từ các mô ruột bị xâm nhiễm

Salmonella trong tế bào bạch cầu đa nhân (PMNs) đã hoạt hóa adenylate cyclase

trong các tế bào ruột, gây nên sự ức chế tính thấm của Na+và gia tăng sự tiết của Cl[45]

-1.9 Ý nghĩa của việc phân biệt loài phụ S enterica I với Salmonella spp trong

thực phẩm và thủy sản

Trong các yêu cầu về vi sinh đối với thực phẩm, Salmonella là một chỉ tiêu

phân tích đặc biệt nhạy cảm, do tính chất gây bệnh của một số kiểu huyết thanh

Salmonella đồng thời là một chỉ tiêu chỉ thị mức độ an toàn vệ sinh thực phẩm Tiêu chuẩn của các nước đều xếp Salmonella vào nhóm không được phép có mặt trong

thực phẩm, không phân biệt loài, loài phụ hay chủng đó có gây bệnh hay không

(Bảng 1.2) [1] Trong thực tế, các phòng phân tích vi sinh thực phẩm chỉ thực hiện các xét nghiệm để phát hiện xem mẫu thực phẩm có chứa Salmonella spp hay

không, không làm các xét nghiệm phân biệt loài, loài phụ hay định chủng Đây là

một rào cản rất lớn cho các nhà sản xuất và xuất khẩu thực phẩm nói chung và xuấtkhẩu thủy sản nói riêng Chỉ tính riêng năm 2008, lượng sản phẩm thủy sản của ViệtNam không đạt tiêu chuẩn xuất khẩu là 14.240 tấn, chiến 1,9% tổng sản lượng thủy

sản xuất khẩu Trong đó lượng hàng bị nhiễm Salmonella là 4.560 tấn, chiếm 32%

(Nguồn: Cục Quản lý Chất lượng nông lâm sản và thủy sản - 2008)

Bảng 1.2 Các yêu cầu về Salmonella trong các qui định an toàn vệ sinh thực phẩm

của một số nước [75]

TT Tổ chức/ nước Qui định về Salmonella trong thực phẩm Tài tiệu tham chiếu

1. Ủy ban Codex Không có Vi sinh vật hay độc tố ảnh

hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng

Codex stand.190-1995 Codex stand.191-1995

2. Hoa Kỳ Không có Salmonella spp trong thủy sản Luật thực phẩm 1997

3. EU Không có Salmonella spp trong 25g 98/83/EEC (2003)

4. Pháp Không có Salmonella spp trong 25g Tiêu chuẩn quốc gia

5. Italia Không có Salmonella spp trong 25g Tiêu chuẩn quốc gia

6. Úc Không có Salmonella spp trong 25g Tiêu chuẩn quốc gia

7. Canada Không có Salmonella spp trong 50g Tiêu chuẩn quốc gia

8. Việt Nam Không có Salmonella spp trong 25g 46/2007/QĐ-BYT

EU và Mỹ là hai thị trường nhập khẩu lớn của thủy sản Việt Nam, nhưng đâycũng là hai thị trường có yêu cầu về chất lượng rất nghiêm ngặt Đối với thị trường

EU, khi một lô hàng của một doanh nghiệp bị phát hiện có nhiễm Salmonella, nước

thành viên của EU sẽ trả lại lô hàng và thông báo khẩn cấp bằng hệ thống thông báonhanh với các nước thành viên khác, Uỷ Ban EU và các cửa khẩu để đình chỉ nhậpkhẩu các lô hàng tiếp theo của doanh nghiệp này vào thị trường EU Lệnh cấm đóchỉ được bãi bỏ khi cơ quan có thẩm quyền của Việt Nam kiểm tra và khắc phụchoàn toàn nguyên nhân gây nhiễm và 15 mẫu hàng tiếp theo được phòng kiểmnghiệm quốc gia của EU kiểm tra và xác nhận không có vi sinh vật gây bệnh [75]

Đối với thị trường Mỹ, khi phát hiện lô hàng bị nhiễm Salmonella, FDA sẽ

đưa tên doanh nghiệp sản suất vào danh sách cảnh báo tự động và thực hiện chế độkiểm tra nghiệm ngặt với số lượng mẫu tăng gấp đôi đối với 5 lô hàng cùng loại tiếptheo của doanh nghiệp này Nếu tất cả 5 lô đều đạt chất lượng thì tên của doanhnghiệp mới được đưa ra khỏi danh sách cảnh báo Điều này thật sự gây khó khăn rấtlớn cho hoạt động sản suất kinh doanh của các doanh nghiệp

Cho đến nay đã có những khảo sát về sự hiện diện của Salmonella trong các

nguồn nước nuôi trồng thủy sản và nước biển Tuy nhiên các nghiên cứu này chưa

được tiến hành ở Việt Nam Một số tác giả cho rằng Salmonella là vi sinh vật hiện

diện tự nhiên trong các vùng nước ở những vùng nhiệt đới Reilley và đồng sự cho

rằng Salmonella hiện diện 0,5-2,8% trong tổng sản lượng tôm xuất khẩu tại Đông

Nam Á Các nghiên cứu khác tại Philippine cho thấy rằng 3% sản lượng tôm đánh

bắt được bị nhiễm Salmonella; nếu chỉ phân tích trên các mẫu đầu tôm thì tỉ lệ mẫu

bị nhiễm Salmonella là 11% Tại Thái Lan, một số nghiên cứu trên các mẫu tôm được nuôi trong các hồ có bón phân gà cho thấy tỉ lệ mẫu bị nhiễm Salmonella lên đến 16% Tỉ lệ nhiễm Salmonella trong các nguồn tôm đánh bắt làm nguyên liệu như trên cho thấy khả năng có sự hiện diện các Salmonella trong thành phẩm là không tránh khỏi Tuy nhiên vấn đề đặt ra là các kiểu huyết thanh Salmonella phân

lập được trong các mẫu tôm và các mẫu nước như trên có thực sự nguy hiểm cho

con người hay không? Các nghiên cứu tại Anh, Wales và Úc cho thấy S.

weltevreden là kiểu huyết thanh thường xuyên được phát hiện trong các hồ nuôitôm Kiểu huyết thanh này cũng được phát hiện trong các hồ tôm tại các nước ĐôngNam Á Mặc dù vậy, số liệu thống kê bởi Trung tâm Kiểm soát Dịch bệnh CDC,

Hoa Kỳ, cho thấy S weltevreden này rất hiếm khi được phân lập từ các mẫu bệnh

phẩm, có nghĩa là kiểu huyết thanh này rất ít hay không có khả năng gây bệnh cho

người Như vậy, không phải tất cả các kiểu huyết thanh của Salmonella đều có khả

năng gây bệnh cho người Trong những năm gần đây việc nghiên cứu diễn biến và

đặc điểm của Salmonella trong môi trường nước nhằm tìm ra các kiểu huyết thanh

có có thể lan truyền các đặc điểm có hại và có khả năng gây bệnh cho con ngườiđang được quan tâm nhiều trên thế giới Tuy nhiên cho đến nay các bằng chứngkhoa học và các dữ liệu về vấn đề nay vẫn chưa thật đầy đủ Trong năm 2000, một

dự án được đề xuất để được nhận tài trợ bởi DANIDA (Danish InternationalDevelopment Agency) đặt vấn đề nghiên cứu phân loại các kiểu huyết thanh, các

kiểu phage và kiểu gen của Salmonella trong môi trường nước, hay các kiểu huyết

thanh phân lập được từ các sản phẩm thuỷ sản trên cơ sở các kỹ thuật sinh học phân