SỬ DỤNG ĐỘNG VẬT CHUYỂN GEN TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC: TRIỂN VỌNG VÀ VẤN ĐỀ

Trong hai thập kỷ qua, đã có nhiều nỗ lực sử dụng động vật để sản xuất tái tổ hợp protein của con người và các kháng thể đơn dòng. Tuy nhiên, gần đây chỉ có hai thuốc Thera peutic đầu tiên được phân lập từ sữa của động vật biến đổi gen, chất ức chế C1 ( Ruconest ) và antithrombin ( ATryn ), xuất hiện trên thị trường. Điều này tạo cảm hứng hy vọng rằng một số lượng đáng kể của protein tái tổ hợp mới tạo sử dụng công nghệ như vậy có thể trở thành có sẵn cho sử dụng thực tế trong tương lai gần. Trong bài đánh giá này, mô tả các phương pháp áp dụng để tạo ra động vật chuyển gen và thảo luận những lợi thế và hạn chế liên quan đến việc sử dụng chúng cho sản xuất protein tái tổ hợp của con người và các kháng thể đơn dòng.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HUẾ

Giảng viên hướng dẫn Học viên thực hiện

PGS TS Trần Quốc Dung Nguyễn Thị Hoài Phương

Hà Thị Nghĩa

Lớp: Động vật học và lý

luận-phương pháp – K24

SỬ DỤNG ĐỘNG VẬT CHUYỂN GEN TRONG CÔNG NGHỆ SINH HỌC:

TRIỂN VỌNG VÀ VẤN ĐỀ

O G Maksimenko1, A.V Deykin1, Yu M Khodarovich2, P G Georgiev1 *1Viện Gene Sinh học của Viện khoa học Nga, Vavilov St., 34/5, Moscow, Nga,119.3342

Shemyakin - Ovchinnikov Viện Bioorganic Hóa học của Viện khoa học Nga,

Miklucho - Maklai St., 16/10, Moscow, Nga, 117.997

* E - mail: georgiev_p@mail.ru

Đã nhận 2012/06/28

TÓM TẮT : Trong hai thập kỷ qua, đã có nhiều nỗ lực sử dụng động vật để sảnxuất tái tổ hợp protein của con người và các kháng thể đơn dòng Tuy nhiên, gầnđây chỉ có hai thuốc Thera - peutic đầu tiên được phân lập từ sữa của động vật biếnđổi gen, chất ức chế C1 ( Ruconest ) và antithrombin ( ATryn ), xuất hiện trên thịtrường Điều này tạo cảm hứng hy vọng rằng một số lượng đáng kể của protein tái

tổ hợp mới tạo sử dụng công nghệ như vậy có thể trở thành có sẵn cho sử dụngthực tế trong tương lai gần Trong bài đánh giá này, mô tả các phương pháp ápdụng để tạo ra động vật chuyển gen và thảo luận những lợi thế và hạn chế liênquan đến việc sử dụng chúng cho sản xuất protein tái tổ hợp của con người và cáckháng thể đơn dòng

TỪ KHÓA: bioreactor ; sản xuất protein sữa ; sản xuất kháng thể đơn dòng ;

protein tái tổ hợp ; thuốc chữa bệnh; động vật biến đổi gen

VIẾT TẮT: mAbs - kháng thể đơn dòng ; MI - vi tiêm trong nhân của DNA ; NT

chuyển nhân ; RP protein tái tổ hợp ; RHA albumin tái tổ hợp người; rhBChE

-butyrylcho - linesterase tái tổ hợp người; TA - động vật chuyển gen ; FDA - Thựcphẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ; EMEA - Cơ quan thẩm đinh y học Châu Âu; CHO -

tế bào buồng trứng chuột đồng Trung Quốc ; tế bào ES - tế bào gốc phôi ; UTR –vùng gen chưa dịch mã

Sau khi biểu hiện thành công protein tái tổ hợp (RPs ) đầu tiên ở vi khuẩn và nấmmen, rõ ràng là với một số lượng lớn như vậy các protein tái tổ hợp của con ngườikhông thể sản xuất có hiệu quả bằng hệ thống đó Như vậy, protein của con người không trải qua những sửa đổi sau phiên mãnhư ở tế bào vi khuẩn, và bản chất sự sửa đổi trong tế bào nấm men so với sự diễn

ra ở tế bào người là khác nhau Ngoài ra, các hệ thống biểu hiện có thể không phùhợp của một số protein tái tổ hợp phức tạp của con người Do đó, cộng đồng nghiêncứu phải đối mặt với những thách thức của việc phát triển các hệ thống biểu hiệnthay thế có khả năng đảm bảo sửa đổi chính xác trong protein tái tổ hợp Kết quả là

sự phát triển đồng thời của hai mô hình công nghệ ( dựa trên biến đổi gen động vật

và nuôi cấy tế bào động vật có vú) được bắt đầu

Sự sản xuất thành công động vật có vú chuyển gen đầu tiên bằng các vi tiêmcủa biến đổi gen cấu trúc vào nhân con ở hợp tử chuột được thực hiện hơn 20 nămtrước Một số lượng lớn động vật biến đổi gen (TAs) đã được tạo ra nhằm mục đíchkhoa học, để cải thiện vật nuôi và sản xuất protein tái tổ hợp Cho đến cuối thế kỷtrước, chuyển gen ở động vật đã được coi là mô hình triển vọng nhất cho sản xuấtprotein tái tổ hợp người và các kháng thể đơn dòng (MAbs ) Cho đến bây giờ, nuôicấy tế bào động vật có vú (tế bào buồng trứng chuột đồng Trung Quốc (CHO) đóngmột vai trò thống lĩnh trên thị trường sản xuất protein tái tổ hợp

Như vậy, 312 sản phẩm điều trị đã tạo ra, sử dụng các sinh vật sống được đưa vàothị trường Hoa Kỳ năm 2012 [10] Trong số đó có 193 sản phẩm đã thu được từ sử

dụng nuôi cấy tế bào động vật có vú, và 42 sản phẩm đã được sản xuất bằng cách

sử nuôi cấy tế bào chuột túi Trung Quốc Cho đến năm 2006, cơ quan thẩm định yhọc Châu Âu (EMEA) đã chấp thuận chất chống đông máu, các protein tái tổ hợpđầu tiên có nguồn gốc từ sữa dê chuyển gen [11] Sau đó, protein này được cụcQuản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) chấp thuận cho thương mạihóa, như một loại thuốc ngăn ngừa đông máu ở những bệnh nhân thiếu hụt chấtchống đông máu di truyền Năm 2011, EMEA đã phê duyệt sử dụng các chất ứcchế tái tổ hợp C1-esterase, lấy từ thỏ để điều trị phù mạch di truyền

Sự xuất hiện trên thị trường các sản phẩm điều trị đầu tiên sản xuất sử dụngcông nghệ chuyển gen động vật và sự tán thành sử dụng protein tái tổ hợp cho yhọc, cho thấy có thể tạo ra chỗ đứng đáng kể công nghệ sinh học trong tương laigần

Một số công ty công nghệ sinh học (PPL Therapeutics (Anh ), GTCBiotherapeutics (USA ) (được mua lại bởi LFB công nghệ sinh học, Pháp, năm

2010), Hematech (Mỹ ), Genzyme (Mỹ ), ZymoGenetics (Mỹ ), Nexia Công nghệsinh học (Canada), Pharming (Hà Lan), BioProtein Technologies (Pháp), Avigenics(Mỹ), Viragen (Mỹ), và TranXenoGen ( USA) đang tích cực phát triển công nghệnày Những đánh giá này bàn về các vấn đề chung đằng sau việc tạo ra động vậtchuyển gen để sản xuất protein tái tổ hợp người và các kháng thể đơn dòng.

CÁC PHƯƠNG PHÁP CHÍNH ĐƯỢC SỬ DỤNG ĐỂ SẢN XUẤT ĐỘNG VẬT CHUYỂN GEN

Các phương pháp hiện đại cho phép nhận được protein tái tổ hợp trong sảnxuất chăn nuôi có chứa các yêu cầu gen chuyển trong tất cả các tế bào của cơ thểcủa chúng và chuyển qua cho con cái của chúng gồm vi tiêm DNA trong nhân củahợp tử (MI) và chuyển nhân tế bào soma (NT) Ngày nay, vi tiêm DNA vào tiềnnhân của một hợp tử là phương pháp thường được sử dụng nhất[12] (Hình 1) Khi

nó đi vào nhân tế bào, DNA là tuyến tính có khả năng tích hợp vào hệ gen của cácdòng tế bào hoặc các sinh vật sống [13] ADN thường được tích hợp vào vùng gennghèo không hoạt động phiên mã và vào dị nhiễm sắc.Từ một đến một số hoặcthậm chí hàng trăm bản cấu trúc tiêm có thể tích hợp vào một vị trí gen

Công nghệ này ban đầu được thử nghiệm trên chuột, và nó vẫn còn là mộtphương pháp đáng tin cậy cho sản xuất các động vật biến chuyển gen Phươngpháp này đã được sử dụng đầu tiên để sản xuất động vật chuyển gen trong nôngnghiệp Tuy nhiên, vi tiêm (MI) hiện được sử dụng chủ yếu để sản xuất một số loàichuyển gen như chuột, thỏ và lợn Phương pháp này hiệu quả chưa cao do sự kếthợp của DNA tái tổ hợp vào hệ gen và sự sẵn có của hợp tử ở hai giai đoạn tiềnnhân Kết quả phụ thuộc vào việc thực hiện các quy trình phẫu thuật với số lượnglớn, trong đó đòi hỏi sự cần thiết phải giữ một số lượng đáng kể (200-300) của vậtnuôi thử nghiệm và thực hiện các kỹ năng xử lý động vật Hơn nữa, cách duy nhất

để xác định mức độ biểu hiện của gen chuyển tích hợp là xem xét động vật chuyểngen ban đầu và con cái của chúng Các chu kỳ sinh sản ở động vật lớn (bao gồm cảthời gian trước khi chúng trưởng thành sinh lý và nhu cầu để có được cái sản xuấtprotein tái tổ hợp trong sữa từ bản gốc con đực biến đổi gen) là khoảng 0,9 / 2,3năm đối với dê cái / đực, 1,0 / 2,3 năm cho lợn, và 2,3 / 4,5 năm cho bò Những hạnchế này làm tăng chi phí thu thập các động vật chuyển gen ban đầu và thời gian cầnthiết để tổ chức công việc.

Năm 1997, cừu vô tính được sản xuất bởi chuyển nhân (NT) của một tế bàotuyến vú soma vào một noãn bào [14] Thành tựu này mở ra khả năng phát triểnsản xuất động vật chuyển gen trong nông nghiệp rẻ hơn và dễ dàng hơn (Hình 1),

vì hầu hết các thao tác trong trường hợp này được chuyển từ một trang trại đếnphòng thí nghiệm, nơi gây nhiễm của các tế bào soma được thực hiện và nhân bản,đặc trưng bởi sự tích hợp của gen chuyển vào hệ gen được chọn Nhân của tế bàosoma sau đó được tiêm vào tế bào trứng đã phá bỏ nhân, được cấy vào cơ thể nhậncái, tế bào nguyên bào sợi thường được sử dụng cho chuyển nhân Đa số vật nuôilớn được tạo ra gần đây bằng chuyển nhân

Tuy nhiên, các tế bào chuyển trong trường hợp này được lựa chọn sử dụngcác gen kháng chất kháng sinh, làm phức tạp sự chấp thuận của sản xuất protein tái

tổ hợp bởi FDA và EMEA [15] Các ptotein màu xanh huỳnh quang (EGFP)thường được sử dụng tăng cường như là một tác nhân chọn lọc bổ sung để tănghiệu quả trong lựa chọn đó Hệ thống dựa trên vị trí tái tổ hợp đặc hiệu được sửdụng bổ sung để loại bỏ dấu chọn từ bộ gen của các dòng tế bào được lựa chọn Các tác dụng bất lợi của kỹ thuật chuyển nhân bao gồm tỷ lệ sống trong tửcung thấp và sức khỏe kém các động vật sơ sinh [12] Điều này làm cho nhân somatái lập trình chưa hoàn chỉnh, dẫn đến biểu hiện suy giảm nhiều của các gen cần

thiết cho sự tiến triển đúng đắn của phôi Hơn nữa, quá trình thu thập tế bào trứngphù hợp và kích hoạt trứng đòi hỏi đáng kể chi phí thời gian và nguồn lực tài chính Kết quả là, công ty AgroResearch ( New Zealand ) một trong những công tylớn trên thế giới chuyên về sử dụng chuyển nhân để sản xuất động vật chuyển gentrong nông nghiệp đã bác bỏ phương pháp này Các Công ty hiện đang phát triểncác phương pháp thay thế cho sản xuất động vật biến đổi gen trong nông nghiệp.

Sử dụng công nghệ chuyển gen vào vị trí đặc hiệu của phôi tế bào gốc (ES)

có thể là một thay thế cho các phương pháp vi tiêm và phương pháp chuyển nhân[18] Phương pháp này liên quan đến việc chèn của một gen chuyển vào hệ gen của

tế bào gốc phôi, tiếp theo là lựa chọn các dòng vô tính kết hợp đúng đắn với một

số bản sao theo yêu cầu, trước khi các tề bào gốc phôi được đưa vào trong khoangcủa một phôi nang, được cấy vào một cơ thể nhận cái

Sau khi những tế bào được cấy vào buồng trứng của chuột trưởng thành, đến30% những con chuột sơ sinh có thể mang gen chuyển Tất cả các xử lý động vật

có thể được thực hiện bằng phương pháp không phẫu thuật, được sử dụng rộng rãitrong chăn nuôi Việc sản xuất của gen đòi hỏi một số lượng phôi nang và bầy đànthử nghiệm tương đối nhỏ Tuy nhiên, phương pháp này có chỉ được hoàn thiện chochuột nhắt và chuột trưởng thành; dòng tế bào gốc phôi cho vật nuôi vẫn chưa thểđạt được Một cách tiếp cận tương tự liên quan đến việc chuyển đổi các tế bào gốc,tiền thân của tế bào tinh trùng, và tiếp theo họ ghép vào ống sinh tinh của con đực

bị vô sinh [19]

Các phương pháp khác để có được động vật chuyển gen là tương đối hiếm khi

sử dụng Vì vậy, các động vật chuyển gen có thể được sản xuất một cách hiệu quả

là sử dụng retrovirus có chứa các gen cần thiết [12].Để đạt được mục tiêu này, cáchợp tử đã được loại bỏ màng trong được nuôi cấy trong môi trường bổ sung với các

hạt lentivirus, tiếp theo là cấy ghép vào con cái Sự tích hợp của một đến nhiều bảnsao của gen chuyển xảy ra tùy thuộc vào titer lentivirus; gần như 100% của các con

có thể được biến đổi gen trong trường hợp này [12]

Những lợi thế của phương pháp này bao gồm việc sản xuất hiệu quả của bất

kỳ loài động vật chuyển gen nào và cơ hội để sản xuất động vật chuyển gen chỉmang một bản sao gen chuyển, mà đôi khi cần thiết để cho mục đích khoa học.Những nhược điểm chính của phương pháp này bao gồm không có khả năng sửdụng các intron hiện diện trong cấu trúc của gen và sự hạn chế chiều dài của cácgen chuyển (khoảng 8000 bp), được xác định bởi kích thước của các hạt virus Kếtquả là, nó là rất khó khăn để đạt được một mức độ cao về biểu hiện gen chuyển khi

sử dụng phương pháp này

Một phương pháp đầy hứa hẹn cho việc thu thập động vật chuyển gen là việc

sử dụng vector dựa trên các yếu tố di truyền di động, đó là tích hợp vào hệ gen củagen nhảy [12] Các gen mã hóa gen nhảy và gen chuyển hai bên bởi lặp đoạn cuốicủa transposase được tiêm vào hợp tử Phản ứng được xúc tác bởi enzimtransposase trong quá trình tích hợp một bản duy nhất của gen chuyển vào mộthoặc một số vị trí của bộ gen của động vật, phương pháp này đã được sử dụng đểsản xuất vật nuôi lớn (Ví dụ lợn [20] ) Hiệu quả của sự gắn của gen chuyển trongtrường hợp này phụ thuộc vào loại gen nhảy, chiều dài gen chuyển, vị trí của DNAtiêm, và có thể cao tới 50 % [ 20 ] Tuy nhiên, không có dữ liệu về mức độ biểuhiện của gen trong mục tiêu sản xuất các động vật chuyển gen bằng phương phápnày đã được thu được cho đến nay

Các nhóm phương pháp dựa trên lây nhiễm các cơ quan hoặc các mô của cơthể sinh vật với một bản sao bị lỗi adenovirus có chứa các gen của protein mục tiêunên được đề cập cụ thể Kết quả là việc sản xuất các prooteein tái tổ hợp ngắn hạn

không di truyền trong cơ quan hoặc mô đang được xem xét.Hiện nay, nó vẫn rấtkhó để so sánh hiệu quả các phương pháp mới và phương pháp truyền thống đểsản xuất động vật biến đổi gen.

CÁC VECTO BIỂU HIỆN ĐƯỢC SỬ DỤNG ĐỂ TẠO RA ĐỘNG VẬT BIẾN CHUYỂN GEN

Các vectơ biểu được sử dụng để sản xuất RP trong sữa chứa vùng điều hòacủa gen có protein sản phẩm bao gồm các phần chính của sữa nhất ví dụ phổ biến

về sau này bao gồm các quy định vùng của gen lactoglobulin cừu, các axit genprotein của động vật gặm nhấm (chuột, chuột) và thỏ, α-lactalbumin và α-S1-caseingen của con bò, và các gen β-casein dê [5] Một vector biểu hiện thường bao gồmmột vùng 5' dài (1-7 kb) trong đó bao gồm một promoter, chất hỗ trợ mô đặc biệt

có thể làm tăng biểu hiện ở tuyến vú, các phi mã hóa đầu tiên exon và intron nằmgiữa chúng (Hình 2A)

Hình 2: Sử dụng vectơ để sản xuất protein tái tổ hợp.

A Cấu trúc của vectơ được sử dụng trong việc sản xuất protein tái tổ hợp ở động vậtbiến đổi gen và các dòng tế bào

Các intron đầu tiên của gen có khả năng chứa các yếu tố quy định mà cóthể tăng cường phiên mã gen Các vector biểu hiện cũng bao gồm các khu vực 3'-(UTR) chưa được dịch của một gen, có kích thước có thể thay đổi từ 0,5 đến 10 kb

và thậm chí nhiều hơn Các 3'-UTR thường bao gồm cuối cùng không mã hóa exon

và intron, một vị trí polyadenin hóa và các trình tự liền kề, trong đó có tiềm năng

để tăng cường thúc phiên mã các khu vực 5' và 3' trong một vector có thể thuộc vềmột hoặc gen khác nhau

Trong số các promoter đã sử dụng để biểu hiện trong tuyến vú, các genpromoter β-casein là hiệu quả nhất và được sử dụng cho việc sản xuất các proteintrong tuyến vú của chuột, dê,

bò (Bảng 1)

Các vector thương mại phổ biến nhất để sản xuất protein tái tổ hợp trong sữacủa động vật biến đổi gen là pBC1 (Invitrogen) - được sản xuất bằng cách sử dụngpromoter nói trên (Hình 2B) Vector này cho phép để nhận được hầu hết các dòng

dê chuyển gen đặc trưng bởi một mức độ cao của sự sản xuất protein mục tiêu khuvực quy định của gen β-casein với chiều dài 6.2 kb và bao gồm một promoter và

một hormone phụ thuộc tăng cường kích thích các promoter chỉ có trong các tế bàotuyến vú được sử dụng trong vector này [31].

Cấu trúc của vector cũng bao gồm một 3'-khu vực của gen β-casein dài

7,8-kb, đảm bảo hiệu quả chấm dứt phiên mã Sau đó là cần thiết cho sự hình thành củamột mRNA ổn định mã hóa các mục tiêu protein và để phòng ngừa sự phiên mãcủa các vùng gen liền kề có khả năng gây ra hình thành các nhiễm sắc dồn nén bởi

sự can thiệp RNA Để tích lũy protein mục tiêu trong sữa, vùng mã hóa của genphải có các trình tự tín hiệu peptide cần thiết cho sự tiết Trình tự này có thể đượclấy từ bất kỳ gen mã hóa protein được tiết ra

Tùy thuộc vào mục đích, hoặc là một gen hoàn chỉnh với intron hoặc cDNA(gen bổ trợ) của nó hoặc một mini-gen chỉ chứa một số các intron được chèn vàovector Việc sử dụng của một gen với một cấu trúc exon-intron chưa sửa đổi chophép một để nhận được mức cao hơn nhiều protein mục tiêu trong sản xuất độngvật biến đổi gen so với việc sử dụng cDNA [32, 33] Ví dụ, lactoferrin gen conngười được thể hiện bằng cách sử dụng vector pBC1, trong một số nghiên cứu độclập (Hình 2B) nồng độ lactoferrin tái tổ hợp không quá 4 mg / ml sữa chuột và 0,7

mg / ml sữa dê biến đổi gen nếu cDNA đã được sử dụng để sản xuất các động vậtbiến đổi gen (Bảng 1) Chuột chuyển gen này được sản xuất bằng cách sử dụnglactoferrin bản địa gen với intron (dài 50 kb) nồng độ lactoferrin tái tổ hợp trongsữa của chúng là cao160 mg / ml (Bảng 1) Dê chuyển gen mang một bản sao cấutrúc nhưng hiện lên đến 10 mg / ml các lactoferrin con người tái tổ hợp trong sữacủa chúng được sản xuất [22] Sự khác biệt trong biểu thức lactoferrin tái tổ hợpbằng cách sử dụng αS1-casein promoter của bò là tương tự (Bảng 1) Ví dụ nàychứng minh rằng sự hiện diện của intron trong mã hóa khu vực của các kết quả genchuyển trong một gia tăng gấp hai lần lượng protein mục tiêu trong sữa

Bảng 1 So sánh sản xuất protein tái tổ hợp sữa mẹ ( RP ) ở động vật biến đổi gen( TA) sử dụng biến thể khác nhau của cấu trúc gen Các vị trí mà tại đó các cấu trúc được tích hợp vào gen đóng một vai trò rấtquan trọng trong việc bảo đảm hiệu quả gen chuyển biểu hiện DNA tiêm thườngđược kết hợp vào các vùng nghèo gen, được đặc trưng do gẫy DNA thường xuyên [

13 ] Các nhiễm sắc thể trong các vùng thường tạo nên một ảnh hưởng tiêu cực về

sự biểu hiện của gen chuyển tích hợp gần đó Ngoài ra, nhiều bản sao của các cấutrúc thường được tích hợp vào vị trí của bộ gen giống nhau dẫn đến đàn áp củaphiên mã do sự hình thành các chất dị nhiễm sắc trong các trình tự lặp đi lặp lại Một số yếu tố điều tiết được sử dụng để bảo vệ sự biểu hiện gen chuyển vàduy trì các mối quan hệ trực tiếp giữa số lượng bản sao và mức độ biểu hiện genchuyển ở động vật có vú nuôi cấy tế bào : vùng giàu A / T của ADN ; yếu tố điều

hòa ( UCOE ) kích hoạt các gen " hộ gia đình" [ 36 ] ; STAR - yếu tố có thể ngănchặn sự lây lan của dị nhiễm sắc thể [37 ]; và chất cách điện [38, 39 ].

Trong số các yếu tố điều đã đề cập, chất cách điện được sử dụng trong vectorcấu trúc để sản xuất động vật biến đổi gen Chất cách điện là những yếu tố quyđịnh chặn sự tương tác giữa yếu tố tăng cường và một promoter nếu nằm giữachúng [40, 41] Hơn nữa, một số chất cách điện có thể hoạt động như một ranh giớigiữa hoạt động phiên mã nhiễm sắc thể và chất dị nhiễm sắc Các chất cách điện

từ một cụm gen β-globin của gà (chất cách điện HS4 ) là một trong những chấtcách điện có xương sống được nghiên cứu mạnh mẽ nhất Nó dài 1200 bp và nằm

ở cuối 5'- β-globin locus [42] Một khu vực lõi 250-bp dài đặc trưng bởi hoạt độngcách điện hoàn toàn đã được tìm thấy ở trong đó

Phân đoạn này chứa các vị trí liên kết với các protein CTCF, mà chỉ là chất cáchđiện có xương sống đặc trưng protein [43] Các protein CTCF chịu trách nhiệm chokhả năng của các chất cách điện HS4 Nó cũng hỗ trợ các protein USF1 và USF2liên kết với các chất cách điện [44] Các chất cách điện HS4 trình tự cũng liên kếtvới các BGP1 / Vezf1 protein [45], trong đó bảo vệ các trình tự GC-phong phú củachất cách điện chống methyl hóa, dẫn đến một sự gián đoạn của việc gắn proteinchất cách điện cho ADN và kết quả là, để bất hoạt của các chất cách điện Theo môhình hiện tại, BGP1 / Vezf1 cũng chấm dứt các phiên mã yếu bắt đầu ở vùng dịnhiễm sắc, mà có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc bảo vệ các β-globinlocus chống lại sự lan truyền của nhiễm sắc thể không hoạt động [46] Các vectorpBC1 xây dựng bởi Invitrogen (USA) cho sản xuất động vật chuyển gen có chứahai bản 1.2-kb-dài chất cách điện HS4 tại 5'-cuối của vectơ (Hình 2B)

Một phân tích toàn diện về tác động của các chất cách điện HS4 về các hoạtđộng phiên mã của nhiều nhà tổ chức, bao gồm các promoter β - casein của dê và

WAP – promoter của thỏ, chứng minh rằng các chất cách điện đáng kể làm tăngmức độ biểu hiện gen chuyển và số lượng các dòng biến đổi gen có đặc điểm bởimột sản đáng kể của protein mục tiêu [22, 47-50] Trong khi đó, chất cách điệnHS4 không ảnh hưởng đến sự thay đổi của các biểu hiện gen chuyển và biểu hiệnngoài tử cung của nó ở các mô khác của cơ thể cũng không đảm bảo một tươngquan trực tiếp giữa số bản sao gen chuyển và mức độ biểu hiện Như vậy, chất cáchđiện HS4 hoạt động như một bộ điều chỉnh phiên mã phổ mà có thể được sử dụng

để làm tăng hoạt động của các promoter yếu Tuy nhiên, nó không cho phép để đạtđược hiệu quả biểu hiện gen chuyển độc quyền trong một tuyến vú, đó là quantrọng đối với việc sản xuất nhiều protein mục tiêu có thể ảnh hưởng xấu đến sứckhỏe của động vật chuyển gen Tăng kích thước của các trình tự trong cấu trúcgen chuyển có thể là một thay thế cho chất cách điện và các yếu tố quy định khác.Nhiều loài chứng tỏ gen protein sữa có mở rộng và khu vực 5'- 3' trong đó có thểchứa cả chất hỗ trợ mô đặc biệt và cách điện có khả năng cung cấp bảo vệ chống lại

sự ảnh hưởng của gen liền kề Ví dụ, một cấu trúc 50 - kb dài đã được tổng hợptrong đó mã vùng (3kb) của gen chuột WAP gồm 24 kb đã được thay thế bằng mộtphần cấu trúc của con người gen lactoferrin (29 kb ) [21] Kết quả là, chuyển gennhững con chuột đã được thu được có tuyến vú là đặc trưng bởi biểu hiện genchuyển mô đặc biệt, và sản xuất của lactoferrin con người tái tổ hợp trong sữa của

họ đã lên tới 30 mg / ml (Bảng 1 )

Một phương pháp để có được động vật chuyển gen là sự tích hợp của lớn phân đoạn DNA (lên đến 250 kb) vào hệ gen Vectors dựa trên nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn (bacmids), cho phép nhân bản của chuỗi dài lên đến 400 kb, có thểđược sử dụng để chuẩn bị các cấu trúc gen mở rộng[51, 52] Các vùng điều hòa của

mô gen đặc biệt có thể chiếm vùng gen lớn và là một phần của gen lân cận Ví dụ,

một số chất hỗ trợ mà kích thích các gen lợn WAP được tìm thấy 140 kb đi từ gene

mà họ điều chỉnh và được tách ra từ nó bởi các gen khác [53] Khi các mảnh ADN lớn được sử dụng, tất cả các yếu tố quy định của gen này có trong các gen chuyển Phương pháp cho phép để nhận được một động vật chuyển gen mà các gen chuyển biểu hiện tương ứng chặt chẽ với các biểu hiện của các đối tác nội sinh Ví

dụ, con bò biến đổi gen thể hiện các gen của con người và lactoferrin con người α - lactalbumin đã được sản xuất (Bảng 1 )

Nhìn chung, phương pháp này cho phép để đạt được mức độ biểu hiện gen chuyển ở một ổn định tương tự như của gen gốc Như vậy, mức sản xuất của lactoferrin và alpha - lactalbumin ở bò chuyển gen là 3,4 và 1,55 mg/ml, tương ứng(Bảng 1) Vấn đề liên quan với các gen khác, mà là một phần của cấu trúc bacmid

và biểu hiện có thể ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của các động vật chuyển gen Nó cũng cần được đề cập rằng việc sử dụng một bacmid không hoàn toàn ngăn chặn tác động của các gen xung quanh: các biểu hiện là một phần phụ thuộc vào các vị trí tích hợp bộ gen [54, 55] Trong trường hợp này, không có mối quan hệ có thể quan sát trực tiếp giữa số lượng các bản sao bacmid và mức độ biểu hiện Điều này

có thể là do thực tế là sự can thiệp RNA bắt đầu ảnh hưởng xấu đến biểu hiện gen trong một bacmid

SỬ DỤNG ĐỘNG VẬT CHUYỂN GEN SẢN XUẤT PROTEIN TÁI TỔ HỢP NGƯỜI

Kể từ đầu những năm 1990, các nỗ lực đã được thực hiện để sản xuất tổng hợp một loạt các protein của con người Hiện nay, protein được tạo từ nhiều nguồn gốc khác nhau (vi khuẩn, nấm men, các tế bào động vật có vú) Hầu hết các proteintái tổ hợp người được sản xuất từ nuôi cấy tế bào động vật có vú là các protein huyết tương Việc sử dụng các protein huyết tương tái tổ hợp phát triển mỗi năm,

phạm vi ứng dụng của nó càng mở rộng và việc sử dụng các mô người để cô lập các protein có nguồn gốc đang còn miễn cưỡng bởi các nguy cơ còn tồn tại của virus gây nhiễm, nguồn tài trợ ít và vấn đề về đạo đức con người.

Các yếu tố đông máu VII, VIII và IX được sử dụng để điều trị lâu dài các bệnh di truyền Sự đáp ứng miễn dịch cho các tác nhân trị liệu phát triển ở hầu hết các bệnh nhân theo thời gian, mặc cho sự thanh lọc protein sản xuất ở vi khuẩn hoặc nấm men có hiệu quả cao Thực tế nó tạo ra nhu cầu cần thiết cho việc thay thế thuốc với một loại thuốc tương tự ở một cách thức khác nhau Vì thế, việc sản xuất các yếu tố đông máu tái tổ hợp trong sữa của động vật chuyển gen có tầm quan trọng đáng kể trong y học

Bảng 2 cho thấy một số ví dụ về sữa động vật chuyển gen có chứa các yếu

tố đông máu của con người Điều trị bệnh máu trong nhiều trường hợp đòi hỏi phải

có một tương đối số lượng nhỏ (tính bằng gam ) của protein tái tổ hợp Kết cục là,một con thỏ biến đổi gen là tối ưu cho sản xuất protein tái tổ hợp : mỗi

thỏ cái chuyển gen có thể sản xuất khoảng 5 lít sữa hoặc 20 g protein tái tổ hợp mỗi năm

Các kết quả thu được chứng minh rằng sự hiện diện của các yếu tố đông máu không ảnh hưởng đến sức khỏe động vật và khả năng tiết sữa [74, 75]

Hàm lượng tối

đa của sản xuấtprotein TTHtrong sữa,mg/ml

Tài liệuthamkhảo

Albumin (gen

gốc)

Chất hoạt hóa casein (dê) + chất

β-cô lập

β-Dê/NT 0.07 [61]

Chất chống đông

máu (cDNA)

Chất hoạt hóa casein (dê)

β-Dê/MI 9.5 × 10^-5 [65]

Hóc môn tăng

trưởng (gen gốc)

Chất hoạt hóa casein (bò)

α-Chuột/MI 0.04 [67]

Erythropoietin

(cDnA)

Chất hoạt hóa lactoglobulin (bò)

Β-Chuột/Thỏ/

MI

0.3(chuột)0.5(thỏ)

[68]

Lysostaphin (gen

gốc)

Chất hoạt hóa lactoglobulin (cừu)

Β-Bò/NT 0.014 [69]

Lysostaphin

(cDnA)

Chất hoạt hóa lactoglobulin (cừu)

Β-Chuột/MI 1.3 [70]

Chất ức chế

C1-esterase (gen gốc)

Chất hoạt hóaWAP- (chuột)

Nhân tố gây đông

tụ IX (cDnA)

Chất hoạt hóaWAP- (chuột)

Nhân tố gây đông

tụ VIII (cDnA)

Chất hoạt hóaWAP- (chuột)

Thỏ/MI 0.1 [73,74] Không giống như các yếu tố đông máu VII, VIII và IX, nhu cầu đối vớialbumin tái tổ hợp được tính bằng tấn, albumin không chỉ được dùng trong y học,còn dùng trong công nghệ sinh học để làm ổn định điều hòa các protein khác

Albumin là protein huyết thanh chính trong máu, nó thường được phân lập từ huyếttương Sự sản xuất albumin tái tổ hợp tốn kém hơn việc cô lập từ huyết tương trongmáu, vì trong các ứng dụng y học thì khả năng tinh chế nó đòi hỏi rất cao Ngàynay, albumin tái tổ hợp được sản xuất chủ yếu ở nấm men Saccharomycescerevisiae (recombumintM) và Pichia pastoris (AlbrectM) Nhu cầu lớn củaalbumin tái tổ hợp đã xác định là chọn lựa những con bò biến đổi gen để sản xuất

ra nó Do đó, GTC Biotherapeutics (Mỹ) gần đây vừa tạo ra những con bò chuyểngen, nó sở hữu albumin tái tổ hợp người (rhAB) trong sữa ở mức độ trung bình là1-5 mg/ml [15] hoặc lên đến 30 kg bò tạo ra mỗi năm Nghiên cứu tương tự được

mô tả ở dòng bò chuyển gen có nồng độ RHA trong sữa cũng cao 48 mg/ml, nótương ứng với sự tích hợp của 250 bản sao chép trong cấu trúc Bò chuyển gen ởdòng này được đặc trưng bởi thời gian tiết sữa ngắn hơn và sự sụt giảm sản lượngcủa sữa Do đó, nó có thể được giả định rằng sự tạo ra rhAB trong sữa bò biến đổigen phải ở mức dưới 48 mg/ml

Một vài protein chẳng hạn như hocmon và các cytokine, có ảnh hưởng tiêucực đến sự tiết sữa và tình trạng của động vật chuyển gen Nó làm cho sự duy trìcủa đàn vật nuôi chuyển gen không chắc chắn Hầu hết các dự án có tiếng đượcđảm nhận bởi các công ty PharmAthene Inc (Mỹ) dưới chỉ thị của Bộ Quốc phòng,được liên kết với việc sản xuất butyrylcholinesterase (Bảng 2), enzyme có hoạt tínhcao thì nó có hiệu quả trong việc bảo vệ chống lại các chất độc phosphate hữu cơ.Kết quả là, đàn dê đã tạo ra có hàm lượng butyrylcholinesterase tái tổ hợp người ởtrong sữa là 1-5 mg/ml [59]

Vấn đề chủ yếu của công ty gặp phải là do bị ảnh hưởng của rhBche tiết sữa.Năng suất sữa của dê có gen biến đổi bị giảm xuống một cách đáng kể Chính vì

vậy, câu hỏi liên quan đến tính khả thi kinh tế trong việc sử dụng dê chuyển gen đểthu rhBche đã được đặt ra.

Có rất nhiều cách tiếp cận cho phép sản xuất protein tái tổ hợp nhưng điều

đó ảnh hưởng bất lợi đến sự tiết sữa và sức khỏe của động vật biến đổi gen; Tuynhiên, họ chỉ giải quyết vấn đề một phần Trước hết, vùng hoạt hóa chức năng ổnđịnh trong tuyến vú ở mức tương đối thấp có thể được chọn lựa Chẳng hạn như,nhân tố kích thích khuẩn lạc tế bào hạt tái tổ hợp người (rHG-CSF) được sản xuấtbằng cách sử dụng gen hoạt hóa β-casein không có yếu tố tăng cường phiên mã ở

dê chuyển gen (Bảng 2) [60] Tuy nhiên, nồng độ rHG-CSF trong sữa dê khôngvượt quá 0,05 mg/ml rHG-CSF được sản xuất trong sữa của chuột chuyển chứa0,02-0,04 mg/ml Vectơ biểu hiện chứa các vùng điều hòa 5’ của gen CSN1S1 ở dê(3387 bp), bao gồm các intron đầu tiên và vùng 3' của gen CSN1S1 ở bò (1518 bp)với exon không mã hóa 18 và 19, cũng được sử dụng [67] Kết quả chứng minhrằng những con chuột chuyển gen mang vector biểu hiện rHG-CSF chuyên biệttrong sữa, chứ không phải ở các mô khác Tuy nhiên, ở phương pháp tiếp cận này,mức protein tái tổ hợp trong sữa thấp làm giảm sự hấp dẫn về kinh tế

Phương án thay thế để sản xuất ra RPs, nó ảnh hưởng xấu đến chất lượng sảnphẩm của TAS, chính là sự nhiễm khuẩn của tuyến vú với vectơ sao chép bất hoạt

ở adenovirus Do đó, vector adenovirus được tạo ra để biểu hiện erythropoietinngười tái tổ hợp, được sản xuất tại các phòng thí nghiệm chuyển gen và động vậtnhân bản (Havana, Cuba) Nồng độ erythropoietin trong sữa của dê bị nhiễmadenovirus này khoảng 2 mg/ml, nhưng nó biểu hiện hoạt tính sinh học thấp,nguyên nhân có thể do thiếu sự glycosyl hóa sản phẩm protein ở phương pháp tiếpcận này [77] Sự sản xuất hormone tăng trưởng tái tổ hợp của con người từ chuột (2mg/ml) và dê (0,3 mg/ml) sử dụng các vector adenovirus đã được mô tả [78]

Một phương pháp tiếp cận tương tự đã được sử dụng trong trường hợp củalactoferrin tái tổ hợp ở người, có nồng độ trong sữa dê cũng cao 2 mg/ml [79] Mặc

dù sử dụng vectơ adenovirus động vật để tạo TAS biểu hiện các protein đích trongsữa đơn giản, nhưng phương pháp này không cho phép nhận được sự biểu hiện ổnđịnh của protein tái tổ hợp ở một mức độ đầy đủ cho việc sản xuất thương mại của

nó Mức độ biểu hiện cao (1,5-2 mg/ml) đã được quan sát riêng trong 25 ngày đầutiên của chu kỳ, có thể được giải thích bởi một trong hai cái chết tự nhiên của tếbào được chuyển nạp hoặc các phản ứng miễn dịch với nhiễm trùng

Cuối cùng, sản xuất các dạng không hoạt động của protein được coi là mộtcách tiếp cận đầy triển vọng Ví dụ, một vector biểu hiện chứa erythropoietincDNA tích hợp vào các exon thứ năm của gen lactoglobulin ở một con bò [68] theocách này, có một vùng có thể phân ra bởi IgA-protease giữa vùng mã hóa của haigen cấu trúc để mà sản xuất erythropoietin người tái tổ hợp Kết quả là, chuộtchuyển gen và thỏ được sản xuất mà trong sữa nồng độ của protein khảm tươngứng đạt là 0,3 và 0,5 mg/ml Sau khi phân cắt protein khảm bởi IgA-protease, cáchoạt tính của erythyropoietin đã được phục hồi và tiết sữa và sức khỏe của TASkhông bị ảnh hưởng Nó cũng có khả năng sử dụng đồng biểu hiện của RPS và mộtchất ức chế chặn hoạt động của nó Do đó, các prourokinase tái tổ hợp ở người thểhiện trong sữa gần như ngay lập tức biến đổi thành dạng chủ động, Urokinase nólàm cho phản ứng sinh học này không hi vọng đối với việc sản xuất dạng proteintherapeutic(prourokinase) Prourokinase được đồng biểu hiện với chất kìm hãm vikhuẩn serine protease trong sữa của những con chuột chuyển gen để phân giải [80].Điều này cho phép tinh chế sữa của những con chuột chuyển gen từ quá trìnhprouroki- Nase (Urokinase) và làm tăng đáng kể hiệu suất của dạng trị liệu củaprotein