Huyết nhung trơn là loài sống phụ. Cây thuộc nhóm đơn thân không có giả hành, mọc thẳng đứng dài 50 – 60 cm, thân cây to 5,0 mm với nhiều rễ dài và thòng làm nhiệm vụ hút chất dinh dưỡng, quang hợp. Lá có hình thuôn và phân thùy, dài 5 11 cm, rộng 1,5 cm, hẹp, màu lục đậm, đầu có 2 thùy không bằng nhau. Phát hoa nằm ngang, phân nhánh, mang nhiều hoa mọc song song với lá và thẳng gốc với rễ. Hoa to 4 cm, không thơm, có màu đỏ đậm, cánh hoa cạnh cao bằng nửa lá đài ở giữa, vàng cam, có đốm đỏ, lá đài cạnh to nhất. Hoa thường nở vào mùa nắng, nhiều nhất vào tháng 2, tháng 3 5, 6. Có 12 chủng rải rác từ miền Trung Quốc xuống đến Đông Dương, Thái Lan, Malaysia, Philippinesis. Phân nửa chúng được thuần dưỡng phổ biến như Ren.coccinea, Ren.monichica, Ren.imschootiana, Ren.Philippinnesis và Ren.clongata 7.
Trang 1LỜI CAM ĐOAN
Tôi cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kì công trình nào khác.
Tác giả
Nguyễn Thị Hoài Phương
Trang 2CW : Coconut water (nước dừa)
IBA : Indole 3 - butyric acid
I&Y : Ichihashi & Yamashita
Trang 3MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
1 Đặt vấn đề 1
2 Mục tiêu đề tài 2
3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Sơ lược về cây hoa phong lan 3
1.2 Tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới và Việt Nam 4
1.2.1 Trên thế giới 4
1.2.2 Trong nước 4
1.3 Tình hình nghiên cứu hoa lan trên thế giới và Việt Nam 5
1.3.1 Trên thế giới 5
1.3.2 Ở Việt Nam 6
1.3.2.1 Nghiên cứu về thu nhập, chọn tạo và đánh giá nguồn gen 6
1.3.2.2 Một số nghiên cứu về nhân giống in vitro hoa lan 6
1.4 Một số vấn đề cơ bản trong nghiên cứu nhân giống in vitro 7
1.4.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro hoa lan 7
1.4.1.1 Môi trường nuôi cấy 7
1.4.1.2 Điều kiện nuôi cấy 8
1.4.1.3 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật 8
1.4.2 Các con đường nhân giống in vitro các loài lan 9
1.4.2.1 Nhân giống từ hạt 9
1.4.2.2 Nhân giống in vitro từ các cơ quan của cây lan 13
1.5 Giới thiệu về lan Huyết nhung trơn 16
1.5.1 Đặc điểm hình thái 16
1.5.2 Phân bố 16
1.5.3 Thực trạng 16
1.5.4 Một số nghiên cứu liên quan 16
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1 Đối tượng và nguyên liệu 18
2.2 Phương pháp nghiên cứu 18
Trang 42.2.1 Nhân nhanh protocorm 18
2.2.2 Nhân nhanh chồi in vitro 19
2.2.3 Kéo dài chồi in vitro 19
2.2.4 Tạo rễ - hình thành cây in vitro 19
2.2.5 Huấn luyện cây con và đưa ra ngoài trồng vưòn ươm 19
2.2.6 Bố trí thí nghiệm và xử lí số liệu 20
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 21
3.1 Đánh giá ảnh hưởng của chất ĐHST và nước dừa đến khả năng nhân nhanh protocorm 21
3.2 Đánh giá ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng nhân chồi in vitro 25
3.3 Đánh giá ảnh hưởng chất ĐHST đến khả năng kéo dài chồi in vitro 27
3.4 Đánh giá ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ in vitro 29
3.5 Huyến luyện cây con và đưa ra ngoài trồng vườm ươm 31
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 32
1 Kết luận 32
2 Đề nghị 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO 33
Trang 5DANH MỤC CÁC BẢNG
3.1 Ảnh hưởng của chất ĐHST và nước dừa đến khả năng nhân nhanh
3.2 Ảnh hưởng của KIN, NAA đến khả năng nhân chồi in vitro của lan
3.3 Ảnh hưởng chất BA, NAA đến khả năng kéo dài chồi in vitro sau 12
3.4 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ in vitro sau 8 tuần nuôi
3.5 Đánh giá khả năng sống sót của cây con khi đưa ra trồng vườn ươm
Trang 6DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH
2.1 Cây lan Huyết nhung trơn ngoài tự nhiên
18
3.1 Ảnh hưởng của KIN, NAA đến khả năng nhân nhanh protocorm
3.2 Ảnh hưởng của nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến
khả năng nhân nhanh protocorm sau 8 tuần nuôi cấy 24
3.3 Ảnh hưởng của KIN, NAA đến khả năng nhân chồi in vitro sau
3.4 Ảnh hưởng chất BA, NAA đến khả năng kéo dài chồi in vitro sau
3.5 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ in vitro sau 8 tuần nuôi
Trang 7Cùng với sự phát triển nhanh chóng của xã hội, nhu cầu về hoa trên thế giớinói chung và ở Việt Nam nói riêng đang ngày càng gia tăng Chính vì thế hoa tươiđang trở thành một loại sản phẩm mang giá trị kinh tế cao và chiếm vị trí đặc biệttrên thị trường [31] Trong đó, hoa lan là một trong những loài hoa được nhiềungười ưa chuộng bởi lẽ nó mang một vẻ đẹp sang trọng, thuần khiết, sự đa dạng về
màu sắc, hình dáng và hương thơm quyến rũ [7] Huyết nhung trơn (Renanthera imschootiana Rolfe) là một trong những loài phong lan đẹp và quý hiếm [68, 77,
79] Hoa thường nở vào mùa hạ, có màu đỏ và nổi tiếng với những đặc điểm trangtrí độc đáo Ở Việt Nam, Huyết nhung trơn phân bố chủ yếu ở một số tỉnh TâyNguyên và Nam Trung Bộ như Kontum, Lâm Đồng, Khánh Hòa Tuy nhiên, sốlượng nhiều loài lan trong tự nhiên, trong đó có loài Huyết nhung trơn đang có xuhướng giảm đi bởi ảnh hưởng bất lợi của điều kiện môi trường và nạn khai thác bừabãi Bên cạnh đó, trong tự nhiên cây lan thường nhân giống chủ yếu bằng hình thứcsinh sản vô tính (nhân chồi) hoặc bằng hạt với hệ số nhân và khả năng này mầm rấtthấp [57] Điều này đã góp phần làm cho nhiều loài lan đang đứng trước nguy cơtuyệt chủng
Nhân giống in vitro bằng kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật được xem là
phương pháp hữu hiệu nhất trong việc nhân nhanh và bảo tồn nhiều loài lan quýhiếm [4, 68, 78] Đã có nhiều tác giả trong và ngoài nước nhân giống các loài lan
quý hiếm này bằng phương pháp nhân giống in vitro (Nguyễn Văn Song và cs,
(2011); Nguyễn Thị Sơn và cs, (2012); Vũ Ngọc Lan và cs, (2013); Luan và cs,(2006)) [18, 10, 19, 55] Năm 2014, tác giả Phạm Thị Thu và cs đã lần đầu tiên tiến
hành nghiên cứu sự nảy mầm in vitro và nhân nhanh protocorm loài lan Huyết
nhung trơn với hệ số nhân protocorm tương đối cao [27] Tuy nhiên, những nghiêncứu tiếp theo để hoàn thiện quy trình nhân giống loài lan này vẫn chưa đề cập đến
Chính vì vậy, việc hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro loài lan Huyết nhung
trơn là rất cần thiết, từ đó có thể vừa bảo tồn được loài lan này không bị tuyệtchủng, vừa cung cấp số lượng lớn cây lan cho thị trường tiêu thụ cây cảnh
Xuất phát từ những cơ sở trên, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu hoàn
thiện quy trình nhân giống in vitro loài lan quý hiếm Huyết nhung trơn (Renanthera imschootiana Rolfe)”.
Trang 8+ Nhân nhanh protocorm
+ Tái tạo chồi từ protocorm
+ Kéo dài chồi in vitro
+ Tạo rễ in vitro hình thành cây hoàn chỉnh
- Xác định được giá thể để ra cây thích hợp
3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài
3.1 Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp các dẫn liệu khoa học mới về nhângiống vô tính cây lan Huyết nhung trơn bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào, gópphần làm phong phú hơn cơ sở dữ liệu về các kĩ thuật nuôi cấy của cây hoa lan
3.2 Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ giúp chúng tôi đề xuất một quy trình nhângiống cây lan Huyết nhung trơn bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào, góp phần sản xuấtcây giống có hiệu quả cao, chất lượng tốt, khắc phục được những hạn chế củaphương pháp nhân giống truyền thống Ứng dụng vào sản xuất sẽ góp phần phụctráng giống, góp phần bảo tồn và nâng cao hiệu quả kinh tế của ngành sản xuất hoalan Huyết nhung trơn
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
Trang 91.1 Sơ lược về cây hoa phong lan
Họ phong lan được đánh giá là một trong những loài hoa cao cấp trongvương quốc thảo mộc, bao gồm 750 chi và hơn 25.000 loài khác nhau [8] Lan làloại cây thân thảo, thân leo sống lâu năm Những loài sống chủ yếu trên môi trườngđất, có thân dạng củ, rễ chùm được gọi là địa lan, sống trên vách đá gọi là thạch lan,sống trên thân cây tách khỏi mặt đất được gọi là phong lan cùng với những loài mớiđược khám phá và mô tả theo từng năm Họ phong lan có sự phân bố khá rộng lớn,trải dài từ đường xích đạo cho đến Bắc Cực, từ đồng bằng cho đến các vùng núibăng tuyết nên giữa các loài có sự khác biệt nhau [29]
Các loài lan có thể xếp thành hai nhóm: [25]
- Nhóm đa thân (polypodial) bao gồm các chi như Dendrobium, Cymbidium, Cattleya… Cây đa thân gồm rất nhiều giả hành Mỗi giả hành có một số lá bao che
và mang rễ ở đáy Đáy lá to tạo thành bẹ bao quanh giả hành, ở nách lá của mỗi bẹ
lá có thể có chồi mà mỗi chồi có thể phát triển thành cành mang hoa (phát hoa) haytạo cơ quan dinh dưỡng mới (giả hành mới)
- Nhóm đơn thân (monopodial) bao gồm các chi như: Monkara, Vanda, Aerides,… Thân luôn mọc cao về phía đỉnh.Sự mọc dài của đỉnh không giới hạn
nên cây chỉ có một thân phát triển vô hạn theo chiều thẳng đứng Sự phát triển nàychỉ ngừng khi đỉnh ngọn bị tổn thương, lúc đó chồi bên sẽ xé rách bẹ lá để mọc dài
ra thành nhánh Các nhánh này cũng phát triển vô hạn định về phía đỉnh Có thân
cây lan cao với các lóng dài, lá mọc xa nhau (Vanda), có những cây lá khít nhau
hơn, thân ngắn lại (lan Đai châu, Hồ điệp)
Việt Nam với vị trí địa lý, địa hình đặc trưng của kiểu khí hậu nhiệt đới giómùa nên hoa lan rất phong phú và đa dạng Mặc khác, sự tiếp nhận ba luồng thựcvật di cư vào từ ba hướng: từ phía Nam lên, từ Tây Bắc xuống, từ Tây Tây Nam đãlàm cho hoa lan Việt Nam phong phú, đa dạng thêm rất nhiều và được xem là nơitập trung nhiều lan đẹp trên thế giới
1.2 Tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới và Việt Nam
1.2.1 Trên thế giới
Trang 10Hiện nay nhu cầu về hoa lan trên thị trường thế giới rất lớn, ngày càng tăng.Các nước có truyền thống sản xuất hoa lan như Anh, Pháp, Mỹ, Thái Lan, ĐàiLoan , hàng năm thu được hàng chục triệu đô la Mỹ từ nguồn xuất khẩu hoa lan.Hoa lan đang là mặt hàng xuất khẩu quan trọng, mang lại nguồn lợi kinh tế cao chonhiều quốc gia, đặc biệt ở một số nước Châu Á
Từ năm 1957, Thái Lan, Indonexia bắt đầu phát triển nuôi trồng lan quy môngày càng lớn phục vụ cho xuất khẩu Có thể nói Thái Lan là một nước điển hìnhcho ngành nuôi trồng và xuất khẩu hoa lan ở các nước châu Á với sản phẩm chủ lực
là lan Dendrobium, đã cho doanh thu mỗi năm từ xuất khẩu gần 600 triệu USD
[26] Trong những thập niên cuối thế kỉ 20, ở châu Âu, lan trở thành một mặt hàngthương mại, từ Anh sang Pháp… sau đó lan sang Mỹ Nước có tốc độ phát triển lankhá nhanh là Trung Quốc Vào đầu thập kỷ 80, Trung Quốc bắt đầu nhập nội lan HồĐiệp Năm 2002, sản lượng lan Hồ điệp của Trung Quốc là 3 triệu cây, bao gồm 50
- 60 xí nghiệp có quy mô lớn, trong đó Quảng Đông có hơn 10 công ty sản xuất 1,2triệu cây (chiếm 40% sản lượng lan Hồ điệp của Trung Quốc) Hiện nay đối với cácnước châu Âu, hoa lan là cây trồng có giá trị kinh tế cao, với diện tích sản xuất chưa
đầy 500 ha lan Hồ điệp (Phalaenopsis), hàng năm Đài Loan đã thu về 35 triệu USD
từ xuất khẩu sản phẩm hoa này [15] Ngày nay, thị trường xuất khẩu hoa lan trên thếgiới ngày càng mở rộng Kim ngạch thương mại hoa lan cắt cành thế giới năm 2000đạt 150 triệu, trong đó Nhật Bản là nước nhập khẩu hoa lan cắt cành số một thếgiới, thứ hai là Ý, tiếp theo là Pháp…[18]
1.2.2 Trong nước
Tại Việt Nam ngành sản xuất kinh doanh hoa kiểng nói chung và lan nóiriêng trong vòng 10 năm trở lại đây rất phát triển, với nhiều chủng loại Tham giasản xuất gồm nhiều thành phần kinh tế (cá thể, tập thể, nhà nước, liên doanh hoặc100% vốn đầu tư nước ngoài) Tuy nhiên sản xuất còn chưa được áp dụng khoa học
kỹ thuật nên ngành trồng hoa lan nói riêng vẫn chưa thực sự phát triển, sản xuất lan
ở Việt Nam mới chỉ phát triển mạnh mẽ ở các tỉnh phía Nam, đặc biệt là thành phố
Đà Lạt và thành phố Hồ Chí Minh [3]
1.3 Tình hình nghiên cứu hoa lan trên thế giới và Việt Nam
1.3.1 Trên thế giới
Trang 11Ngày nay, nhờ kỹ thuật nhân giống hiện đại bằng phương pháp nuôi cấy mô
đã hỗ trợ cho phương pháp nhân giống cổ truyền theo kiểu tách chiết, nên đã nhânđược số lượng lớn lan giống cung cấp cho thị trường Ban đầu Morel khám phá raphương pháp nuôi cấy mô thành công là loài lan đa thân Năm 1970, N.Vajrabhaya
và T.Vajrabhaya đã cấy mô thành công loài lan đơn thân Năm 1974, các nhà khoahọc đã cấy mô thành công hầu hết các loại lan thuộc nhóm đơn thân khác và cũngnhờ có phương pháp nuôi cấy mô tế bào, các cây lan đã chọn lọc từ phương pháp laihữu tính được nhân rất nhanh có thể đáp ứng nhu cầu sản xuất, kinh doanh Để đạtđược thành công đó thì trong nuôi cấy mô, môi trường có vai trò rất quan trọngtrong quá trình nuôi cấy, nó cung cấp chất dinh dưỡng đảm bảo cho sự sinh trưởng
và phát triển của mô Và nghiên cứu cho thấy, môi trường dinh dưỡng thích hợp choviệc nuôi cây là môi trường MS (Marushige - Shoog, 1962), VW (Vacine – went,1949), KC (Knudsonc)…[14]
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về lan bằng phương pháp nhân
giống in vitro, những kết quả của các công trình nghiên cứu góp phần rất lớn vào
việc bảo tồn cũng như nhân nhanh nhiều loài lan quý hiếm Vào năm 2000,
Sheelavantmath và cs (2000) đã thành công trong việc nghiên cứu nhân giống in vitro loài lan Geodorum densiflorum (Lam.) Schltr - một loài lan quý hiếm Những năm tiếp theo, H.N.Murthy và cs (2005) đã nhân giống in vitro loài lan Aerides crispum – một loài lan quý hiếm ở Ấn Độ Năm 2010, Basker và cs đã nghiên cứu nhân giống loài lan hiếm Epiphytic [37] Cũng trong năm đó, Chyuam - Yih Ng và cs đã nhân giống một loài lan có nguy cơ tuyệt chủng Paphiopedilum
rothschildianum ở núi Kinabalu, Sabah Malaysia [41] Sana Asghar và cs (2011) đã
nghiên cứu nhân giống cây phong lan Dendrobilum Nobile var Emma trắng [34].
Trong một tạp chí của Ấn Độ cũng nói về bài nghiên cứu của Sharma U., Rama Rao
V., Mohan JSS và Reddy AS., nhân giống in vitro cây phong lan quý Dendrobilum microbuibon A.Rich có tác dụng làm thuốc chữa đau bụng, dạ dày [70]
1.3.2 Ở Việt Nam
1.3.2.1 Nghiên cứu về thu nhập, chọn tạo và đánh giá nguồn gen
Trang 12Việt Nam là nước có khí hậu gió mùa nóng ẩm, được thiên nhiên ưu đãi vìkhắp vùng rừng núi từ Nam chí Bắc, từ đồng bằng đến tận cao nguyên, nhiều vùngnổi tiếng có nhiều giống lan quý hiếm được thế giới công nhận Chính vì vậy đã cónhững nghiên cứu về lan ở Việt Nam rất sớm Nhà truyền giáo người Bồ Đào Nha,
đã mô tả cây lan ở Việt Nam lần đầu tiên vào năm 1789, trong cuốn “Flora cohin chinensis” và sau này đã được Bentham và Hooker ghi lại trong cuốn “Genera Planterum” (1862 - 1883) [9].
Bên cạnh đó cũng có 1 số nhà khoa học Việt Nam cũng có bước đầu nghiêncứu về lan như: GS Phạm Hoàng Hộ với 289 loại được mô tả và vẽ hình trong cuốn
“Cây cỏ Việt Nam” [5] Năm 1996 - 1997, Nguyễn Xuân Linh và tập thể cán bộ
trung tâm hoa cây cảnh viện di truyền Nông Nghiệp đã thu thập được 88 loài hoalan thuộc 34 chi, trong 88 loài có 30 loài có khả năng nở hoa tại Hà Nội Chúngđược xem là nguồn gen quý cho công tác lai tạo giống sau này [12] Nguyễn XuânLinh và cs (2001) khi đánh giá khả năng sinh trưởng, phát triển của một số giốngphong lan Hồ điệp nhập từ Hà Lan đã đi đến kết luận: Các giống lan Hồ điệp nhậpnội đều có khả năng sinh trưởng, phát triển và cho ra tỉ lệ hoa tốt hơn các giống cónguồn gốc từ hạt [11]
1.3.2.2 Một số nghiên cứu về nhân giống in vitro hoa lan
Nhân giống bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật là một trong
những kĩ thuật nhân giống được áp dụng phổ biến ở Việt Nam trong những nămqua Việc nghiên cứu áp dụng công nghệ này đã mở ra một bước mới về cải tiếngiống cây trồng và nhân giống vô tính Nó còn là phương tiện cho các nhà chọngiống rút ngắn giai đoạn chọn lọc Hiện nay, việc nhân giống bằng phương phápnày đang tiếp tục mở rộng và nghiên cứu trên nhiều đối tượng thực vật Theonghiên cứu của Nguyễn Văn Song (2011), đã nghiên cứu nhân giống bằng kĩ thuật
in vitro ở loài lan Kim điệp (Dendrobium chrysotoxum) - một loài lan rừng có nguy
cơ bị tuyệt chủng [18] Hoàng Thị Giang và cs (2010) đã nghiên cứu nhân giống in vitro và nuôi trồng giống lan Hài quý Paphiopedilum hangianum perner Gurss (Hài
hằng) thu nhập ở Việt Nam [2] Vào năm tiếp theo (2012), Nguyễn Thị Sơn và cs đã
nhân giống in vitro loài lan Hoàng thảo long nhãn (Dendrobium fimbriatum Hook.)
là loài lan đẹp được sử dụng làm cảnh và làm thuốc, đang đe dọa tuyệt chủng [19]
Trang 13Nguyễn Thị Pha và cs năm 2011, tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro lan Hồ
điệp từ mầm ngủ phát hoa không qua giai đoạn tạo mô sẹo [16] Nguyễn Quang
Thạch và cs (2005) đã thiết lập quy trình nhân giống in vitro lan Hồ điệp Phalaenopsis [23].
1.4 Một số vấn đề cơ bản trong nghiên cứu nhân giống in vitro
1.4.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro hoa lan
1.4.1.1 Môi trường nuôi cấy
Thành phần hóa học của môi trường nuôi cấy thay đổi tùy theo mỗi loài cây,
bộ phận nuôi cấy, thậm chí mỗi kiểu gen và mục đích nuôi cấy (nuôi cấy mô sẹo,huyền phù tế bào, tế bào trần, bao phấn, hạt phấn) Các môi trường khoáng cơ bảnthường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là MS (1962), B5 (1968), SH(1972) hoặc White (1963) [13] Môi trường được sử dụng nhiều để nuôi cấy hoa lan
là VW (1949) và KC (1946)
Theo Morel (1960), môi trường KC (1946) rất tốt để nuôi cấy hầu hết cácloài lan [31] Tuy nhiên hiện nay môi trường cơ bản MS (1962) được xem là môitrường có hàm lượng và thành phần các muối khoáng phong phú hơn cả Vì thế hầuhết các thí nghiệm nuôi cấy mô đều được thực hiện trên môi trường này Trong nuôicấy mô, tế bào thực vật, đường được xem là nguồn cung cấp carbon quan trọng giúpcác tế bào phân chia, tăng trưởng sinh khối Hai dạng thường được sử dụng nhất làsaccharose và glucose, nhưng saccharose phổ biến hơn Saccharose là cacbonhydratephổ biến nhất trong vỏ cây và nhựa cây tham gia trong việc kiểm soát quá trình pháttriển [39, 45]
Bên cạnh đó, nhiều dung dịch hữu cơ phức tạp có thành phần không xác địnhnhư CW, dịch chiết được bổ sung vào môi trường nuôi cấy nhằm tăng cường sựsinh trưởng và phát triển của mô cấy Trong CW có chứa cytokinin, myo - inositol
và các hợp chất có hoạt tính auxin có hiệu quả tốt đối với sự phát triển của mô nuôicấy CW thường được bổ sung vào môi trường từ 10 - 25% để giúp cho quá trìnhkích thích tạo callus và protocorm Ngoài ra, CW còn có khả năng giảm bớt sự tiếthợp chất phenol của mẫu cấy [38]
1.4.1.2 Điều kiện nuôi cấy
Trang 14Để tăng hiệu quả của kỹ thuật nuôi cấy in vitro, ngoài thành phần môi trường
thì điều kiện nuôi cấy như ánh sáng, nhiệt độ, pH cũng phải được tối ưu hóa
- Ánh sáng: Chất lượng ánh sáng (chất lượng quang phổ), số lượng (photonthông lượng) và thời gian chiếu sáng có ảnh hưởng sâu sắc đến sự phát triển và phátsinh hình thái của các mô nuôi cấy [44, 72] Nhìn chung, đèn huỳnh quang là nguồnánh sáng chính cho việc duy trì nuôi cấy mô [44] Ánh sáng phải được sử dụng liêntục với quang chu kỳ là 16 giờ, 18 giờ hoặc 24 giờ tùy loài [14] Nhiều nghiên cứucho thấy ánh sáng đóng vai trò quan trọng trong việc tạo hình thái cây nuôi cấy mô.Trong giai đoạn tạo chồi ban đầu và nhân chồi tiếp theo, cường độ ánh sáng chỉ cần
1000 lux Nhưng trong giai đoạn tạo rễ, cây cần nhiều ánh sáng, cường độ ánh sángcao từ 3000 – 10.000 lux để kích thích cây chuyển từ giai đoạn dị dưỡng sang tựdưỡng [1]
- Nhiệt độ: Là nhân tố có ảnh hưởng rõ rệt đến sự phân chia tế bào và cácquá trình trao đổi chất của mô nuôi cấy, đồng thời nó có ảnh hưởng tới sự hoạt độngcủa auxin, do đó làm ảnh hưởng đến khả năng ra rễ của cây con được nuôi cấy.Nhiệt độ thích hợp để nuôi cấy các loài hoa lan khác nhau thường không giốngnhau Ở các loài lan đa thân, nhiệt độ thích hợp là 22 ± 10C hoặc 26 ± 30C đối vớilan đơn thân [52]
- Độ pH: pH của môi trường là yếu tố rất quan trọng, ảnh hưởng đến sự phátsinh hình thái của mẫu nuôi cấy tại các giai đoạn khác nhau Sự ổn định pH của môitrường là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào Giá trị của pH trong môi trườngthích hợp cho sinh trưởng và phát triển của nhiều loài thực vật biến đổi từ 5,5 – 6,0[14, 35]
1.4.1.3 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Chất điều hòa sinh trưởng của thực vật được chú ý vào năm 1928 khi Wentphát hiện vai trò của auxin lên khả năng phát triển tế bào của lúa mạch, đã mở đầucho việc phát hiện, ứng dụng chất điều hòa sinh trưởng của thực vật vào nuôi cấy
mô [28]
Việc bổ sung một hoặc nhiều chất ĐHST như auxin, cytokinin,… là rất cầnthiết để kích thích sự sinh trưởng phát triển và phân hóa cơ quan, cung cấp sức sống
Trang 15tốt cho mô và các tổ chức Tuy vậy, yêu cầu của những chất này thay đổi theo từngloài thực vật, loại mô, hàm lượng chất ĐHST nội sinh của chúng [4].
- Nhóm auxin
Chất auxin tự nhiên được tìm thấy nhiều ở thực vật là IAA IAA có tác dụngĐHST kéo dài tế bào, điều khiển sự hình thành rễ NAA và 2,4-D cũng đóng vai tròquan trọng trong sự phân chia mô và trong quá trình tạo rễ IAA kích thích sự ra rễ
và kìm hãm sự phát triển callus Ngược lại, 2,4-D kích thích sự hình thành callus vàkìm hãm sự hình thành rễ trong môi trường nuôi cấy tại nồng độ cao Mặc dù cùngnhóm chất auxin nhưng hai chất này lại có tính chất đối kháng NAA được Went vàThimann (1937) tìm ra Chất này có tác dụng làm tăng hô hấp của tế bào và mô nuôicấy, tăng hoạt tính enzim và ảnh hưởng mạnh đến trao đổi chất của nito, tăng khảnăng tiếp nhận và sử dụng đường trong môi trường nuôi cấy [30]
- Nhóm cytokinin
Cytokinin là chất ĐHST có tác dụng làm tăng sự phân chia tế bào Cáccytokinin thường gặp là BA, KIN KIN được Shoog phát hiện ngẫu nhiên trong khichiết xuất axit nucleic KIN là dẫn xuất của base nito adenin, BA là cytokinin tổnghợp nhân tạo nhưng có hoạt tính mạnh hơn KIN BA và KIN có tác dụng kích thíchphân chia tế bào, kéo dài thời gian hoạt động của tế bào phân sinh và làm hạn chế
sự già hóa của tế bào [59]
Nếu tỉ lệ Auxin/Cytokinin thấp thì sẽ kích thích thành lập chồi, ngược lại thì
sẽ hình thành rễ, còn nếu ở một mức độ cân bằng thì thuận lợi cho sự phát triển môsẹo Vì vậy chúng ta có thể sử dụng Cytokinin kết hợp với Auxin theo một tỉ lệ nào
đó để thu được các sản phẩm như mong muốn [22]
1.4.2 Các con đường nhân giống in vitro các loài lan
1.4.2.1 Nhân giống từ hạt
Hiện nay, một số loài lan quý hiếm bị đe dọa tuyệt chủng trong tự nhiên đã
được bảo tồn nhờ phương thức nảy mầm từ hạt [50] Với công nghệ nhân giống in vitro hiện nay hệ số nhân giống từ một trái lan là một số rất lớn, từ vài ngàn đến một
triệu cây con [13]
Trong thời gian qua, đã có một số tác giả trong và ngoài nước nghiên cứunhân giống bằng hạt ở các loài lan khác nhau Năm 1922 Knudson ở Mỹ, thành
Trang 16công trong việc thay thế nấm bằng môi trường thạch để gieo hạt Knudson nhậnthấy rằng với các chai cấy có chứa thạch và muối khoáng thích hợp thì sự nảy mầm
của lan là rất lớn Gieo hạt in vitro có thể làm cho các hạt chưa chín nảy mầm và
việc khử trùng cả quả dễ dàng hơn Khi quả đã chín 2/3 có thể khử trùng quả bằngthuốc tẩy và cồn Sau đó dùng dao tách vỏ và hạt rồi tiến hành cấy lên trên môitrường thích hợp trong điều kiên vô trùng Sau khi hạt nảy mầm từ 30 - 60 ngày thìchuyển sang môi trường mới [52]
Park và cs (2000) đã gieo Calanthe sieboldii vào một trong ba môi trường:
MS; MSH (tức là các muối vô cơ của MS cộng với các yếu tố hữu cơ của Schenk vàHildebrandt); Hyponex Kết quả thu được sự nảy mầm và protocorm phát triển trênmôi trường MS và MSH trong vòng 8 tuần, nhưng phần trăm nảy mầm thấp Việc
bổ sung các putrescine (1,0 mg/L) hoặc adenine sulfate (25 mg/L) vào môi trườngMSH đã tăng cường sự nảy mầm Protocorm được cấy chuyền trên môi trường bổsung Hyponex đã phát triển thành cây con sau 12 tuần nuôi cấy Sau đó, cây conđược chuyển ra trồng ngoài tự nhiên [64]
Shiau và cs (2002) nghiên cứu nhân giống lan Kim tuyến (Anoectochilus formosanus) một loài thảo dược truyền thống tại Đài Loan, Trung Quốc… Hạt được
nảy mầm trên môi trường MS bổ sung 0,2% AC và 8% bột chuối Hạt giống nảymầm được nhân nhanh chồi trong môi trường nuôi cấy ½ MS bổ sung 2,0 mg/L BA.Cấy chuyển sang môi trường MS bổ sung 0,2% AC; 8% bột chuối; 2,0 mg/L BA và0,5 mg/L NAA để tạo rễ Kết quả khoảng 90% cây giống sống sót khi chuyển sangtrồng với giá thể dớn [71]
Nghiên cứu của Bhadra và Hossain (2003) khi nuôi cấy hạt giống
Geodorum densiflorum (Lam.) Schltr trên môi trường MS 0,8% agar và PM thì sau
45 – 60 ngày, hạt nảy mầm và phát triển trực tiếp thành cây con trên môi trường MS
Geodorum densiflorum đã được nhân giống in vitro [39]
Vào năm 2006, Luan và cs, đã nuôi cấy hạt một số loài Dendrobium sp.
Dactylorhiza fuchsia, tỉ lệ hạt nảy mầm cao đạt được trên các môi trường: ½ MSchứa 0,5 mg/L NAA, 20% CW và 3% saccharose; MS có 20% CW, 0,1 % AC và3% saccharose; môi trường Hyponex chứa vitamin, 30% dịch chiết cà chua, 0,1 %
Trang 17AC và 3% saccharose; môi trường VW có 0,5 mg/L BA, 0,5 mg/L NAA, 15% CW,1,0 % AC và 3% saccharose [55]
Năm 2008, Taniguchi và cs đã nghiên cứu nhân giống in vitro lan Cypripedium macranthos Var rebunense - một loài hoa có nguy cơ tuyệt chủng tại
Nhật Bản Hạt từ quả lan đã nảy mầm trên môi trường và môi trường MS bổ sung3% sucose Sau đó protocorm được cấy chuyển sang môi trường MS cơ bản để tạo
cây hoàn chỉnh Sau 7 năm, cây in vitro hoàn chỉnh đã ra hoa [73] Pinaki Sinha và Shyamal K Roy (2008) nghiên cứu nhân giống lan Vanda teres (Roxb.) thông qua
tạo protocorm từ hạt lan đã được khử trùng Hạt lan nảy mầm trong vòng 40 - 45ngày trong môi trường Vacin và Went với 1,0 mg/L BAP + 0,5 mg/L NAA + 2,0%sucrose + 2 g/L peptone Chồi tái sinh tốt nhất từ protocorm đã được tìm thấy trêncùng một môi trường có bổ sung 10% nước dừa Các cây con tiếp tục phát triển trênmôi trường 2 g bột/L chuối + 100 mg/L casein thủy phân đã được thêm vào Câycon giống hệt nhau với chồi mập và rễ được thu được trên môi trường ½ MS, không
có bổ sung chất kích thích sinh trưởng [69] Tawaro và cs (2008) đã nghiên cứu
nhân nhanh loài Cymbidium findlaysonianum Lindl từ hạt giống Hạt nảy mầm tốt
nhất trên môi trường VW có bổ sung 15% CW; 5% bột chuối; 5% bột khoai tây;0,2% AC và 20 g/L saccharose Số lượng protocorm tăng 4 lần khi được nuôi cấytrên môi trường VW bổ sung 15% CW và 20 g/L saccharose Các cây con được tiếptục phát triển trên môi trường VW bổ sung 15% CW, 5% bột chuối và 5% bột khoaitây trong vòng 3 tháng [74]
Cũng trong năm 2008, Hossain đã nuôi cấy hạt lan Epidendrum ibaguense
trên môi trường M và PM có bổ sung 2,0 g/L peptone với tỉ lệ nảy mầm khoảng
90% Hệ thống rễ in vitro phát triển mạnh mẽ trong môi trường ½ PM và M có bổ sung 0,5 - 1,0 mg/L IAA Cây in vitro được chuyển ra trồng ở nhà kính có tỉ lệ sống
sót đạt 90% [48]
Nguyễn Thanh Tùng và Trương Thị Bích Phượng (2010), đã nhân giốngthành công cây lan Hoàng thảo thân gãy Nguyên liệu được sử dụng cho việc nuôicấy là hạt lan còn nằm trong vỏ sau ba đến bốn tháng thụ phấn Sau khi hạt đượckhử trùng cấy lên môi trường cơ bản có BA, KIN hay NAA để thăm dò khả năngnảy mầm Sau đó là quá trình nhân nhanh chồi và thể chồi, tạo rễ rồi chuyển cây
Trang 18con in vitro hoàn chỉnh ra khỏi phòng nuôi để huấn luyện thích nghi với điều kiện
bên ngoài Cây con được trồng trên giá thể rêu nước và dương xỉ ở chế độ ánh sáng50% và tưới phun sương trong quá trình sinh trưởng Sau một tháng trồng ở vườnươm, tỉ lệ sống đạt tới gần 91% [20]
Nguyễn Văn Song và cs (2011), đã nghiên cứu nhân nhanh in vitro lan Kim điệp (Dendrobium chrysotoxum) Nguyên liệu sử dụng là hạt của quả lan 3 tháng
tuổi Môi trường thích hợp cho nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là MS bổsung 20 g/L saccharose; 8 g/L agar; 15% CW và 2,0 mg/L BA Môi trường nhânnhanh protocorm tốt nhất là MS bổ sung 20 g/L saccharose; 8 g/L agar, 15% CW và2,0 mg/L BA Môi trường MS bổ sung 30 g/L saccharose; 8 g/L agar; 1,0 g/L AC;15% CW; 2,0 mg/L BA và 1,0 mg/L NAA thích hợp nhất cho tái sinh chồi từ
protocorm và sinh trưởng của chồi in vitro [18] Nghiên cứu của Hoàng Thị Giang
và cs (2011) trên cây lan Hài hằng (Paphiopedilum hangianum) cho thấy môi
trường RE thích hợp cho hạt nảy mầm (58 - 67%) Môi trường nhân nhanhprotocorm là môi trường RE có bổ sung 15% CW và 100 g/L chuối cho hệ số nhâncao nhất (4,3 lần) Môi trường này cũng rất có hiệu quả để tạo chồi Bổ sung 0,4 -0,6 mg/L NAA vào môi trường cho khả năng ra rễ tốt nhất Các kết quả thí nghiệmngoài nhà kính cho thấy: cây đạt tiêu chuẩn ra vườn ươm cao 3 - 4 cm, có từ 3 - 4
lá, 4 - 5 rễ; trồng trên giá thể dớn; chế độ dinh dưỡng NPK (30:10:10) với lượngbón là 1,0 g/L và chế độ phun 2 lần/tuần [2]
Năm 2012, Nguyễn Thị Sơn và cs tiến hành nghiên cứu trên đối tượng lan
Hoàng thảo long nhãn (Dendrobium fimbriatum Hook.) Đây là loài lan đẹp được sử dụng làm cảnh và làm thuốc, và đang bị đe dọa tuyệt chủng Việc nhân giống in vitro với mục đích bảo tồn và phát triển nguồn gen loài lan quý Kết quả nghiên cứu
đã chỉ rõ: Nguyên liệu sử dụng là quả lan 3 tháng tuổi, môi trường thích hợp chonảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là môi trường MS + 100 ml ND + 10gsaccharoza + 6,0g agar/lít môi trường Môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất làmôi trường KC + 100 ml ND + 10g sacaroza + 60g khoai tây + 6,0g agar/lít môitrường Môi trường MS + 100 ml ND + 20g sacaroza + 60g chuối chín + 6,0g
agar/lít môi trường là thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi in vitro Môi trường tạo
cây hoàn chỉnh là RE + 10 g sacaroza + 1,0 g THT + 6,0g agar/lít môi trường [19]
Trang 19Năm 2013, Vũ Ngọc Lan và Nguyễn Thị Lý Anh đã tiến hành nghiên cứu trên
loài lan bản địa (Dendrobium nobile Lindl) Nguyên liệu sử dụng là quả lan 5 tháng
tuổi thu thập tại Hòa Bình, đang được nuôi trồng tại Viện Sinh học Nông nghiệp,trường ĐH Nông Nghiệp Hà Nội Quả lan được khử trùng tối ưu là nhúng quả trongcồn 96% rồi đốt trên ngọn lửa đèn cồn Môi trường gieo hạt thích hợp là: MS + 100
ml nước dừa + 10g sucrose + 6,0g agar môi trường Nhân nhanh in vitro bằng nuôi
cấy mô kinh điển: Môi trường nhân nhanh protocorm tối ưu là KC + (100ml nướcdừa + 10g saccaroza + 6g agar) / lít; HSN 4,2 lần/8 tuần nuôi cấy Môi trường nhânnhanh cụm chồi tốt nhất là MS + (100 ml ND+10g saccharose + 6g agar) / lít, HSNchồi 3,08 lần/8 tuần nuôi cấy [10]
1.4.2.2 Nhân giống in vitro từ các cơ quan của cây lan
Trịnh Cẩm Tú và Bùi Trang Việt (2006), đã sử dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro
để nghiên cứu sự phát triển của phát hoa Dendrobium Sonia Mô phân sinh hoa tự là
vị trí phát sinh cơ quan liên tục với một vùng nhỏ các tế bào gốc đa năng Đời sống
và hoạt động của mô phân sinh hoa tự liên quan đến số nụ hoa trên phát hoa đượcquan sát bằng cách sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh hoa tự trên môi trường
Ma (Chatelet 1992) có bổ sung zeatin 1,0 mg/L, 0,5 mg/L IAA và 1,0 mg/L GA3.Trên môi trường này, mô phân sinh hoa tự có thể kéo dài đời sống tới trên 8 tuầnđồng thời vẫn tiếp tục duy trì hoạt động tạo mới các mô phân sinh hoa Với 5,0 mg/
L BA, mô phân sinh hoa tự phát hoa tạo cụm chồi dinh dưỡng thay vì tiếp tục pháthoa [21]
Kalimuthu và cs (2006) đã thành công trong sử dụng đỉnh chồi và đốt thân
của Vanilla planifolia để nhân chồi và tạo rễ trên môi trường MS bổ sung 1,0 mg/L
BA và 15 % CW [49]
Phùng Văn Phê và cs (2010), đã nghiên cứu nhân nhanh chồi in vitro loài lan Kim tuyến (Anoectochilus roxburghii Wall Lindl.) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro Môi trường phù hợp nhất để nhân nhanh chồi lan Kim tuyến in vitro là Knud* Thểchồi 8 tuần tuổi từ phôi hạt chín và chồi từ thể chồi cao từ 2 - 3 cm là phù hợp nhất
để nhân nhanh trong môi trường thích hợp Knud* bổ sung 0,5 mg/L BA + 0,3 mg/LKIN + 0,3 mg/L NAA + 10% CW + 100 g/L dịch chiết khoai tây + 2% saccharose +0,7 % agar + 0,05% AC [17]
Trang 20Năm 2012, Nguyễn Quang Thạch, Phí Thị Cẩm Miện đã tiến hành nghiên
cứu nhân nhanh in vitro loài lan Kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) Cơ
quan vào mẫu phù hợp nhất là thể chồi và mắt đốt ngang thân được khử trùng vàđưa vào các môi trường nền khác nhau (MS, Knud, Knudson) Tiếp đó, các chồi vàmắt đốt được chuyển sang môi trường nền thích hợp có bổ sung BA, KIN, αNAAtrong 4 tuần Môi trường thích hợp nhất để nhân nhanh thể chồi và mắt đốt ngangthân là Knud* + 0,5 mg/L BAP + 0,3 mg/L KIN + 0,3 mg/L αNAA + 20 g/Lsucrose + 0,5 g/L than hoạt tính + 7g agar/L cho hệ số nhân chồi là 6,55 chồi/mẫu
Các chồi có chiều cao từ 3 - 4 cm được sử dụng để ra rễ in vitro Tỉ lệ ra rễ là 100%
và số rễ/chồi (4,21 rễ/chồi) đạt cao nhất trên môi trường có bổ sung 1,0 mg/LαNAA [24] Cũng trong năm 2012, Nguyễn Thanh Tùng và cs đã áp dụng nuôi cấy
lát mỏng tế bào trong nhân giống in vitro cây lan Hoàng thảo thân gãy (Dendrobium aduncum) – một loài lan rừng có giá trị của Việt Nam Nguyên liệu
ban đầu là lát cắt mỏng đoạn thân theo chiều ngang (tTCL - traverse thin cell layer)
của chồi in vitro Các tTCL được cảm ứng tạo protocorm - like bodies (PLB) trên
môi trường cơ bản ½ MS có bổ sung riêng lẻ BAP hay bổ sung kết hợp BAP vàNAA Môi trường tối ưu cảm ứng protocorm - like bodies là môi trường ½ MS bổsung 0,5 mg/L BAP cho 29,85 protocorm - like bodies/lát mỏng sau 8 tuần nuôicấy Cụm protocorm - like bodies được cấy lên môi trường MS có bổ sung TDZ,kinetin, NAA riêng lẻ hay kết hợp để tái sinh chồi Môi trường MS bổ sung kinetin3,0 mg/L kết hợp với NAA 0,3 mg/L cho tỉ lệ tái sinh chồi cao nhất đạt 5,67
chồi/mẫu Chồi in vitro được cấy lên môi trường MS bổ sung NAA để cảm ứng tạo
rễ Nồng độ NAA 2,0 mg/L là thích hợp nhất cho việc tạo rễ in vitro với kết quả 9,18 rễ/chồi Cây con in vitro tái sinh đầy đủ được huấn luyện và trồng lên giá thể,
saccharose, 0,1% AC và sự phối hợp của 6 μM NAA và 9 μM BA cho khả năng táiM NAA và 9 μM NAA và 9 μM BA cho khả năng táiM BA cho khả năng tái
Trang 21sinh cao, chồi cảm ứng hình thành và phát triển tốt (73%) Khoảng 75% các phần
của mô lá loài lan T latifolia cảm ứng tốt và hình thành 5 chồi trong vòng 5 tuần
trên môi trường MS bổ sung 3% saccharose, 0,1 % AC và sự phối hợp của 3 μM NAA và 9 μM BA cho khả năng táiMIAA và 6 μM NAA và 9 μM BA cho khả năng táiM BA [42]
Năm 2011, Niknejad A và cs tiến hành nghiên cứu tái sinh in vitro từ protocorm mô sẹo của Phalaenopsis gigantea thông qua mô lá Phần lá từ in vitro cây non được nuôi cấy trên môi trường New Dogashima (NDM) có bổ sung
cytokinin (6 -Benzylaminopurine (BAP), Thidiazuron (TDZ), và Kinetin (KIN) vớinồng độ 0,01; 0,1; 0,5 và 1,0 mg/L riêng lẻ và kết hợp với NAA (auxin a-naphthaleneacetic axit) với nồng độ 0,01; 0,1; 0,5 và 1,0 mg/L Đánh giá khả năngnhân nhanh mô sẹo và protocorm – like - bodies (PLBs) trong vòng 6 - 8 tuần nuôicấy Môi trường cảm ứng tối ưu nhất là 0,1 mg/L TDZ kết hợp với 1,0 mg/L NAA[60]
Năm 2013, Devi HS và cs, nghiên cứu tái sinh lan Aerides odorata Lour từ
mẫu lá và cho thấy phản ứng đáng kể trong môi trường ½ MS vừa bổ sungthidiazuron (TDZ) và 6 - benzylaminopurine (BAP) Callus được hình thành sau 60ngày nuôi cấy trên môi trường bổ sung 1,0 mg/L TDZ Mô sẹo được hình thành chỉtrong môi trường có chứa axit acetic α - naphthalene (NAA) Tần số mô sẹo caonhất trong môi trường có chứa 2,0 mg/L (NAA), (85,71 ± 0,21) Chồi tái sinh có sốlượng cao nhất ở môi trường có nồng độ cao hơn của NAA (2,0 mg/L) và BAP (4,0mg/L) (4,80 ± 0,18) Qua đó cho thấy ảnh hưởng kết hợp của cytokinin khi có sựkết hợp với auxin Các chồi tiếp tục cấy lên môi trường ra rễ, bổ sung NAA (0,5mg/L) và ½ MS, cho thấy tỉ lệ cảm ứng rễ cao nhất Hơn 95% các cây con sống sót
trong điều kiện ex in vitro [43].
Trong năm vừa qua, việc nhân giống các loài lan dược liệu quý được đẩy
mạnh nghiên cứu trên các đối tượng thuộc chi Dendrobium, Cymbidium, Rhynchostylis, Aerides… Pant và cs (2012) đã nghiên cứu nhân nhanh loài Dendrobium primulinum Lindl bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro Mẫu cấy bật chồi
sớm và sinh trưởng nhanh trên môi trường MS có bổ sung 1,5 mg/L BA với giá trịtrung bình 4,5 chồi/mẫu Môi trường nhân nhanh chồi là MS bổ sung 1,5 mg/L BA
và 0,5 mg/L NAA Môi trường tạo rễ tốt nhất là MS bổ sung 0,5 mg/L IAA Gần
Trang 2270% cây con sống sót khi đem trồng thử nghiệm với giá thể xơ dừa, dớn theo tỉ lệ2:1 [70].
1.5 Giới thiệu về lan Huyết nhung trơn
1.5.1 Đặc điểm hình thái
Huyết nhung trơn là loài sống phụ Cây thuộc nhóm đơn thân không có giảhành, mọc thẳng đứng dài 50 – 60 cm, thân cây to 5,0 mm với nhiều rễ dài và thònglàm nhiệm vụ hút chất dinh dưỡng, quang hợp Lá có hình thuôn và phân thùy, dài 5
- 11 cm, rộng 1,5 cm, hẹp, màu lục đậm, đầu có 2 thùy không bằng nhau Phát hoanằm ngang, phân nhánh, mang nhiều hoa mọc song song với lá và thẳng gốc với rễ.Hoa to 4 cm, không thơm, có màu đỏ đậm, cánh hoa cạnh cao bằng nửa lá đài ởgiữa, vàng cam, có đốm đỏ, lá đài cạnh to nhất Hoa thường nở vào mùa nắng, nhiềunhất vào tháng 2, tháng 3 [5, 6] Có 12 chủng rải rác từ miền Trung Quốc xuống đếnĐông Dương, Thái Lan, Malaysia, Philippinesis Phân nửa chúng được thuần dưỡngphổ biến như Ren.coccinea, Ren.monichica, Ren.imschootiana, Ren.Philippinnesis
và Ren.clongata [7]
1.5.2 Phân bố
Trên thế giới Huyết nhung trơn phân bố ở Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam,New Guinea, Malaysia, Indonesia, Philippines và quần đảo Solomon [77, 78, 79] ỞViệt Nam, Huyết nhung trơn được phân bố chủ yếu ở Nam và Trung Nam Bộ, cácvườn quốc gia như Kon Ka Kinh, Lâm Đồng, Đồng Nai [54]
1.5.3 Thực trạng
Huyết nhung trơn là loài lan quý hiếm đang bị đe dọa và nằm trong sách đỏ
IUCN, cũng như trong Sách đỏ thực vật của Ấn Độ, Huyết nhung trơn nổi tiếng vớinhững đặc điểm trang trí độc đáo của nó [66] Chính vì vậy, phương thức nảy mầm
hạt lan in vitro cũng là một phần quan trọng của chương trình bảo tồn và nhân giống
các loài lan hiếm, cung cấp cây con cho rừng cho chương trình phục hồi rừng táisinh [58]
1.5.4 Một số nghiên cứu liên quan
Huyết nhung trơn (Renanthera imschootiana Rolfe) là một loài lan quý hiếm
đang bị đe dọa do khai thác quá mức và mất môi trường sống phù hợp Vì vây, việcbảo tồn và nhân giống thông qua phương pháp nuôi cấy mô là rất cần thiết Hiệnnay, trên thế giới đã có một số nghiên cứu về loài lan này
Trang 23Theo Seeni S và cs (1922), nghiên cứu sự tái sinh từ lá của loài lan có nguy
cơ tuyệt chủng này Chồi lan Huyết nhung trơn được nuôi cấy trên môi trường bổsung 2% sucrose, 2 g/L peptone, 44,4 mM benzyladenine (BA) và 10,7 axit mMnaphthaleneacetic (NAA) thì tỉ lệ phát sinh đạt 10 chồi/protocorm Khi cấy truyềnlên môi trường có bổ sung thêm 10% nước dừa và 35 g/L bột chuối chín thì có ảnhhưởng tích cực đến khả năng tạo chồi, số lượng chồi trung bình cao nhất đạt 40chồi/protocorm trong 12 tuần Các chồi tiếp tục cấy lên môi trường ra rễ, bổ sung4,4 mM BA, 10.7 mM NAA và 1% than hoạt tính cho thấy tỉ lệ cảm ứng rễ cao nhất[68]
Kunlin Wu và cs (2014), đã nghiên cứu nhân nhanh in vitro loài này từ hạt.
Hạt giống sau 150 ngày thụ phấn là giai đoạn tối ưu cho nuôi cấy in vitro Hạt nảy
mầm đạt 93,1% trên MS cơ bản, có bổ sung 0,5 mg/L α - naphthaleneacetic acid(NAA), 20% nước dừa (CW), 1,0 g/L peptone, 10 g/L sucrose và 1,0g/L than hoạttính (AC) Trên môi trường MS cơ bản có bổ sung 1,0 mg/L BA, 0,5 mg/L NAA,1,0 mg/L peptone, 10 g/L sucrose và 20% CW là thích hợp cho nhân nhanhprotocorm - like – bodies (PLBs ) Trong đó tỉ lệ tăng sinh PLB là 2,88 Trên môitrường MS cơ bản có chứa 1,0 mg/L NAA, 1,0 mg/L peptone, 100 g/L chuối đồngchất (BH), và 1,0 g/L AC là thích hợp cho sự hình thành cây non và 95,67% của câycon phát triển từ PLBs trong vòng 60 ngày nuôi cấy Môi trường MS cơ bản có 0,5mg/L NAA, 1,0 g/L peptone, 20 g/L sucrose, 150 g/L BH, và 1,0 g/L AC là thích
hợp cho sự phát triển in vitro của cây con, cây con cao khoảng 2,0 cm Khi đưa cây
huấn luyện ngoài nhà kính thì 95% cây con sống sót sau 60 ngày [78]
Tại Việt Nam, công trình nghiên cứu của Phạm Thị Thu và cs (2014) cũng
tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro lan Huyết nhung trơn Nguyên liệu sử
dụng là hạt lan có đường kính 2,0 cm, dài khoảng 8,0 cm Khử trùng bằng dungdịch HgCl2 1%, (NaOCl) 5% trong thời gian 15 phút cho hiệu quả khử trùng tốtnhất Tỉ lệ mẫu sống sót đạt 81,25 % Trên môi trường MS có 3% sucrose; 0,8%agar; bổ sung 2,0 mg/L KIN là môi trường thích hợp nhất để tạo thành thểprotocorm của hạt sau khi nảy mầm Môi trường MS cơ bản có 2,0 mg/L KIN kếthợp 0,75 mg/L NAA là môi trường thích hợp nhất để nhân nhanh protocorm của lanHuyết nhung trơn [27]
