NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA KERATINASE TRONG TẾ BÀO ESCHERICHIACOLI VÀ BACILLUS

9 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 7 Sơ đồ nghiên cứu biểu hiện gen Ker trong E.coli và B.subtilis 22 Hình 8 Sơ đồ tái tổ hợp gen Ker và promoter của gen α-amylase của chủng B.. Các kỹ thuật tá

1

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

HOÀNG THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA

KERATINASE TRONG TẾ BÀO

ESCHERICHIACOLI VÀ BACILLUS

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2014

2

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

HOÀNG THỊ THU HIỀN

NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA

KERATINASE TRONG TẾ BÀO

ESCHERICHIA COLI VÀ BACILLUS

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60420122

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn chính: TS Nguyễn Huy Hoàng

Người hướng dẫn phụ: PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân

Hà Nội – Năm 2014

1.3.1 Chủng chủ E coli 18

1.3.2 Chủng chủ Bacillus subtilis Error! Bookmark not defined

1.4 Ứng dụng của keratinase Error! Bookmark not defined

1.4.2 Ứng dụng trong công nghiệp Error! Bookmark not defined

1.4.3 Đối với môi trường sinh thái Error! Bookmark not defined

1.4.4.Ứng dụng trong y, dược học Error! Bookmark not defined

1.5 Tình hình nghiên cứu Error! Bookmark not defined 1.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới Error! Bookmark not defined

1.5.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam Error! Bookmark not defined

PHầN II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ERROR! BOOKMARK NOT DEFINED

2.1 Nguyên liệu Error! Bookmark not defined 2.2.Phương pháp Error! Bookmark not defined

2.2.1 Tách chiết DNA tổng số của chủng vi khuẩn Error! Bookmark not defined

2.2.2.Phản ứng PCR Error! Bookmark not defined

2.2.3 Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn Error! Bookmark not defined

2.2.4 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose Error! Bookmark not defined

4

2.2.5 Điện di protein trên gel Polyacrylamide (SDS-PAGE) Error! Bookmark not defined

2.2.6 Thiết kế vector biểu hiện trong E Coli Error! Bookmark not defined

2.2.7 Biến nạp vào tế bào E.coli Error! Bookmark not defined

2.2.8 Biểu hiện keratinase tái tổ hợp trong E.coli BL21 (DE3) Error! Bookmark not

defined

2.2.9 Tổ hợp gen ker bằng phương pháp Megaprimer Error! Bookmark not defined

2.2.10 Thiết kế vector biểu hiện keratinase trong B.subtilis 168M Error! Bookmark not defined

2.2.11 Biến nạp vectormang gen keratinase tái tổ hợp trong B.subtilis 168M

Error! Bookmark not defined

2.2.12 Biểu hiện keratinase tái hợp trong B.subtilis 168M Error! Bookmark not defined

2.2.13 Thử hoạt tính keratinase Error! Bookmark not defined

PHầN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ERROR! BOOKMARK NOT

DEFINED

3.1 Kết quả tách ADN tổng số Error! Bookmark not defined 3.2 Nhân gen keratinase bằng PCR Error! Bookmark not defined

3.3.Biểu hiện gen keratinase trong E.coli Error! Bookmark not defined

3.3.1 Tách dòng gen KerE trong vector pJET1.2 để biểu hiện trong E.coli Error!

Bookmark not defined

3.3.2 Kết quả phân tích trình tự gen Error! Bookmark not defined

3.3.3 Thiết kế vector biểu hiện trong E.coli Error! Bookmark not defined

3.3.4 Biểu hiện gen Ker trong E.coli BL21 Error! Bookmark not defined

3.4 Biểu hiện gen kerB trong tế bào B.subtilis 168MError! Bookmark not defined

3.4.1 Tái tổ hợp gen KerB bằng phương pháp Megaprimer Error! Bookmark not defined

5

3.4.2 Tách dòng tổ hợp gen keratinase bằng vector pTZ57RT trong E.coli TOP10F’

Error! Bookmark not defined

3.4.3 Thiết kế vector biểu hiện trong Bacillus subtilis Error! Bookmark not defined 3.4.4 Biểu hiện keratinase trong tế bào Bacillus subtilis 168M Error! Bookmark not

defined

3.5 Xác định hoạt tính keratinase tái tổ hợp từ E.coli BL21 và B.subtilis 168MError!

Bookmark not defined

PHầN IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ERROR! BOOKMARK NOT

6

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tri ân và sâu sắc tới TS Nguyễn Huy Hoàng – Phó viện

trưởng, Viện Nghiên cứu hệ gen, Viện KH&CN Việt Nam, là người thầy_người anh đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cùng em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Em xin chân thành cảm ơn tới PGS TS Nguyễn Thị Hồng Vân – cô giáo đã tận

tình hướng dẫn em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn

Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, em đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo tận tình của các cán bộ Phòng Hệ gen học chức năng, viện Nghiên cứu hệ gen Đặc biệt là

Th.S Nguyễn Thu Hiền đã giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu và tiến hành thí

nghiệm

Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo nghiên cứu giảng dạy tại Khoa Sinh, Khoa đào tạo sau đại học – Trường Đại học KHTN đã truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích trong suốt 2 năm qua

Cuối cùng, em xin gửi tới bố, mẹ và những người thân trong gia đình lòng biết ơn sâu sắc, cảm ơn những người bạn đã chia sẻ khó khăn thử thách trong cuộc sống và công việc để em có được kết quả này

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, tháng 08 năm 2014

7

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

B.subtilis Bacillus subtilis

bp Base pair(c

DNA Deoxyribonucleic acid

E.coli Escherichia coli

EtBr Ethidium Bromide

IPTGIsopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

8

Bảng 3 Thành phần gel cô 5% và gel tách 10% polyacrymide 25

Bảng 4 Thành phần phản ứng cắt với enzymeXhoI và BamHI 26

Bảng 5 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR1a 29

Bảng 6 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR2 30

Bảng 7 Hoạt tính của keratinase từ các chủng nghiên cứu 48

9

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 7 Sơ đồ nghiên cứu biểu hiện gen Ker trong E.coli và

B.subtilis

22

Hình 8 Sơ đồ tái tổ hợp gen Ker và promoter của gen α-amylase

của chủng B subtilis 168M bằng phương pháp

10

Hình 17 Plasmid pHT43 mang tổ hợp [Bspr.Ker] được cắt kiểm

tra bằng SmaI và KpnI

45

Hinh 18 Kết quả kiểm tra hoạt tính các tế bào B subtilis 168M tái

tổ hợp mang vector tái tổ hợp pHT43[Bspr.Ker]

46

11

MỞ ĐẦU

Ngày nay, ngành công nghệ sinh học chiếm vị trí quan trọng trong nền kinh tế nước ta Trong đó, công nghệ DNA tái tổ hợp đang được chú trọng đầu tư và là công nghệ then chốt của lĩnh vực công nghệ sinh học Công nghệ DNA tái tổ hợp ra đời dựa trên cơ sở các thành tựu của sinh học phân tử Các kỹ thuật tái tổ hợp DNA cho phép phân lập và khuếch đại một gen từ genome của một sinh vật để có thể nghiên cứu, biến đổi và chuyển nó vào trong một cơ thể sinh vật khác Việc nâng cao hoạt tính và khả năng tổng hợp enzyme bằng kỹ thuật tái tổ hợp DNA hiện đang được ứng dụng rộng rãi Trong đó có tạo dòng và sản xuất keratinase

Keratinase là enzyme có khả năng thủy phân các protein cứng, các cấu trúc phức tạp trong lông, tóc, móng, sừng Nhiều nghiên cứu ghi nhận rằng keratinase là thành viên của nhóm protease serine Đây là nhóm enzyme thương ma ̣i , có nhiều ứng dụng quan trọng trong các ngành công nghiê ̣p, trong các quá trình công nghệ sinh học liên quan đến chất thải có chứa keratin, các ngành công nghiệp gia cầm và công nghệda

Với sự bùng nổ của ngành công nghiệp gia cầm, hàng năm tồn đọng hàng tấn lông

gà trong tự nhiên, điều này gây nên tình trạng ô nhiễm môi trường Trong khi đó, lông gà chiếm khoảng 90% là keratin, việc thủy phân keratin đem lại được những ứng dụng to lớn, có thể làm phân bón , keo, tạo ra các axit amin hiếm như serin , cystein và prolin, đặc biệt là tạo ra thức ăn chăn nuôi Tuy nhiên, nếu xử lý lông vũ bằng các loại hóa chất như những phương pháp trước đây sẽ làm mất hàm lượng axit amin của thức ăn và rất tốn kém Trong khi đó, nếu sử dụng keratinase trong quá trình thủy phân lông vũ để sản xuất thức ăn chăn nuôi sẽ không làm mất hàm lượng dinh dưỡng của nó mà giá thành rẻ và làm giảm ô nhiễm môi trường

Hiê ̣n nay, keratinase được thu từ nhiều nguồn khác nhau như nấm , xạ khuẩn, vi khuẩn Trong đó, nhóm vi khuẩn có kh ả năng sinh keratinase cao, hoạt tính keratinase đã

được ghi nhận rộng rãi đối với các chủng từ chi Bacillus và Streptomyces Tuy nhiên, khả

năng sinh tổng hợp keratinase từ các chủng hoang dại còn hạn chế, hoạt tính của enzyme thấp và thường lẫn tạp chất Do đó để đáp ứng nhu cầu ngày càng tăng của keratinase thì trọng tâm là nâng cao trình độ sản xuất keratinase tái tổ hợp thông qua tách dònggenvà

12

biểu hiện gen Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu tách dòng và hiện gen keratinase

từ vi khuẩn Gram dương, xạ khuẩn hay nấm men trong hệ biểu hiện E.coli, B.subtilis hoặcP.pastoris Ở Việt Nam hiện nay việc nghiên cứu keratinase còn hạn chế, chưa có

cơ sở nào sản xuất keraitnase ở quy mô công nghiệp Vì vậy với mục đích tìm ra được chủng vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng sinh karatinase cao để có thể đưa vào sản xuất với

qui mô lớn, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự biểu hiện gen mã hóa keratinase trong tế bào Escherichiacoli và Bacillus”

 Mục tiêu đề tài

Nghiên cứu tạo chủng vi khuẩntái tổ hợp có khả năng sinh keratinase cao nhằm ứng dụng trong nông nghiệp và công nghiệp

 Nội dung nghiên cứu

- Chọn dòng gen biểu hiện keratinase từ chủng vi khuẩn hoang dại

- Thiết kế vector tái tổ hợp biểu hiện trong E.coli và B.subtilis

- Biểu hiện gen mã hóa keratinase trong E.coli và B.subtilis

- Đánh giá mức độ biểu hiện của chủng tái tổ hợp so với chủng hoang dại

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.Keratin

Keratin là một hợp chất sừng, thành phần chính trong da, tóc, lông, móng tay, móng guốc, sừng, răng và len (Hình 1).Đây là protein có cấu trúc bền vững, khó hòa tan, chứamột lượng lớn sulfua, các axitamin, đặc biệt là cystein (chiếm 24%), ngoài ra có các axit amin khác như: glycin, alanin, serin và valin Ngoài các liên kết hydro nội phân tử và liên phân tử, keratin còn có hàm lượng lớn lưu huỳnh trong cystein Chính các cystein có thể tạo thành cầu disulfide.Những cầu nối này được tạo từ các nguyên tử lưu huỳnhliên kết với nhau, do đó nó không dễ dàng hòa tan, không dễ dàng bị phân hủy bởi các enzyme thông thường như: trypsin, pepsin, và papain… Tùy thuộc số lượng liên kết

10 nm, chúng liên kết với nhau qua cầu disulfide, hydro với các muối cũng như các liên kết khác.Từ các sợi keratin có chứa hàm lượng lưu huỳnh lớn đã được ép thành các bó keratin lớn hơn.

Keratin có 2 dạng cấu trúc xoắn α và gấp nếp β[50],α-keratin chủ yếu được tìm thấy trong động vật có vú còn β-keratin tạo thành các chuỗi polypeptide dạng mảnh có chủ yếu trong da các loài bò sát và các loài chim Cấu trúc của α và β-keratin trong tóc và lông có thể thấy khi chiếu xạ tia bằng tia X

Anpha- keratin (α-keratin): có trong tóc (kể cả lông cừu), sừng, móng tay, móng chân, và

móng guốc của động vật có vú Cấu tạo là các sợi đơn protein liên kết với nhau bằng liên kết hydro

Beta keratin (β-keratin): Cótrong móng tay và móng vuốt của loài bò sát, họ vỏ

chelonians (ba ba, rùa, …), và trong lông, mỏ, móng vuốt của chim và nhím, được hình

thành chủ yếu trong các tấmβ Cấu trúc β cứng, chắc hơn cấu trúc α do các tấm β được

nối với nhau bằng các cầu nối disulfide (Hình 2)

14

Hình 2 Cấu trúc xoắnα và gấp nếp β của keratin

Dựa vào số lượng sulfur, keratin có thể được chia thành 2 dạng keratin “mềm” và keratin “cứng”[45] Keratin mềm có thể tìm thấy trong da, có ít cầu nối disulfur và mềm dẻo hơn và có thể dễ dàng phá vỡ còn keratin cứng tìm thấy ở lông vũ, tóc, móng guốc,

có nhiều cầu nối disulfur và không thể kéo dài ra, keratin cứng không hòa tan trong nước,

và khó phân hủy hơn Trong tóc chủ yếu được cấu tạo bởi keratin cứng Keratin tồn tại phổ biến nhất hiện nay trong da động vật, sừng, tóc, lông với thành phần là các axit aminnhư: glutamic, lysin, cystein, alanin và tyrosinđây hầu hết là những axit amin cần thiết mà cơ thể không tự tổng hợp được,đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì và phát triển cơ thể Mặc dù rất khó phân hủy bởi những enzyme thông thường nhưng các chất thải keratin có thể bị phân hủy bởi vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm do chúng tạo ra các protease – keratinase

Thủy phân keratin từ vi sinh vật đã được nghiên cứu từ năm 1959[28], tuy nhiên

cơ chế thủy phân từ vi khuẩn vẫn chưa được nghiên cứu nhiều.Việc giảm cầu nối disulfur

có thể có ảnh hưởng đáng kể đến sự phân hủy keratin[9],[40]Keratinase là enzyme, có khả năng phân hủy cấu trúc protein keratin khó tan Các keratinase tham gia thủy phân các chất thải keratin từ lông vũ trong công nghiệp chăn nuôi gia cầm đã tạo ra các sản phẩm có giá trị như thức ăn chăn nuôi, phân bón, các polymer và các axit amin hiếm như serin, cystein và prolin

1.2 Keratinase

Keratinasethuộcnhómcácprotease kiềm cókhả năng hoạt động mạnh trênkeratinkhông hòa tan Enzyme này đóng vai tròquan trọngtrongviệc thủy phân cấu

15

trúc phức tạp của keratin có tronglông vũ, tóc, lông cừu, collagenvàcasein,trong việc loại bỏcác rác tắc nghẽntrong cáchệ thốngxử lý nước thải Keratinase ở vi sinh vật chủ yếu enzyme ngoại bào khi sinh trưởng trên môi trường có chứa cơ chất keratin và đôi khi cũng có keratinase nội bào, chúng giúp cho enzyme thủy phân cầu disulfit, sulfite hoặc thiosulfate có trong các cơ chất Keratinase ngoại bào thủy phân cấu trúc keratin trong sừng, lông, móng bằng cách giảm các cầu disulfide của keratin, quá trình này có sự hiện diện của các chất khử như natri sulfit, DTT (dithiothreitol), mercaptoethanol, glutathion, cysteinvà thioglycolate

Keratinase được tạo ra từ nhiều nguồn vi sinh vật khác nhau vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm Các enzyme này được tạo ra trong quá trình phân hủy các cơ chất như keratin trong tóc, lông, sừng, …Các đặc tính về hóa sinh và lý sinh của keratinase là rất đa dạng Phần lớn keratinase hoạt động ở điều kiện tối ưu là pH trung tính tới kiềm và nhiệt độ từ 300C đến 600C Hơn nữa kerainase có tiềm năng ứng dụng lớn trong nông nghiệp, dược học và các lĩnh vực y sinh học, được ứng dụngtrong cáchệ thốngnước thải, thực phẩm, dệt may, dược phẩm,mỹ phẩm, keratinasecũngđượcsử dụng trong ngành công nghiệpthuộc datrongquá trìnhtẩy lôngcủadađộng vậtthay vìxử lýchúngvớisodium sulfide Ngoài ra, sử dụng keratinase trong sinh khối sinh học có thể giải quyết một phần nào đó về chuyển đổi năng lượng và tái sử dụng các nhiên liệu

Keratinase là enzyme thương mại do hình dạng cấu tạo có tới 97% giống với protease kiềm(Hình 3) và nó cũng bị ức chế bởi các thuốc ức chế giống như ức chế protease serine[5].Khối lượng phân tử tùy theo từng loại sinh vật có thể dao động từ 18 đến 35 kDa đối với protease serine có khối lượng phân tử nhỏ hoặc lớn hơn 90 kDa đối với protease serine có khối lượng lớn

16

Hình 3: Cấu tạo phân tử của enzyme Keratinase

Ðến nay, keratinase được nghiên cứu chủ yếu có nguồn gốc từ vi khuẩn, trong đó

Bacillus được nghiên cứu nhiều nhất Nhiều chủng B licheniformis và B subtilis được

mô tả có khả năng thủy phân keratin, những loài khác như B pumilus và B cereus cũng

có khả năng tổng hợp keratinase Sinh tổng hợp keratinase cũng được nghiên cứu ở xạ

khuẩn, chủ yếu là từ các chi Streptomyces Nhóm vi khuẩn này được phân lập từ các

vùng đất khác nhau, có khả năng thủy phân một loạt các chất chứa keratin như tóc, len và lông

Tính chất:

Keratinase thuỷ phân thành các axit amin:

Với tính chất thuỷ phân của keratinase, nó phá vỡ cầu nối disunfua của keratin làm đứt liên kết của vòng xoắn Như vậy, sau khi thuỷ phân hợp chất keratin trong lông vũ đã được phân huỷ và chia nhỏ thành các axit amin và peptit ngắn Khi đó protein keratin mang đầy đủ các tính chất của protein tan như là: Tính hoà tan, kết tủa, điện ly lưỡng tính, thuỷ phân và phản ứng màu đặc trưng Keratinase chủ yếu tấn công vào các liên kết disulfide (S-S), làm suy giảm các protein dạng sợi fibrin, elastin, collagen và sợi protein khác

pH và nhiệt độ:

Keratinase hoạt động được ở nhiệt độ từ 30oC - 80oC nhưng nhiệt độ tối ưu là: 50oC

và enzyme này được ổn định khi bảo quản ở -20o

C[60] Keratinase bền vững trong khoảng pH từ 6,0 - 9,0 nhưng pH tối ưu là 7,5 [51].;