Luận văn thạc sĩ ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình tạo sản phẩm kombucha từ chè PT10

rất nhiều nghiên cứu về kombucha như: các nghiên cứu về thành phần các chất,vitamin có trong kombucha; tác dụng của kombucha trong việc bảo vệ cơ thểcon người tránh các tác hại của hóa c

Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI 2

BÙI THỊ THỦY

ẢNH HƯỞNG CỦẠ MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG TỚI QUÁ TRÌNH TẠO SẢN PHẨM KOMBUCHA TỪ

CHÈ PT10

Chuyên ngành : Sinh thái học

Mã số : 60 42 01 20

LUẬN VĂN THẠC sĩ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung

Trong quá trình tìm hiểu, nghiên cứu và hoàn thành luận văn tốt nghiệp,tôi đã nhận được những lời chỉ bảo, hướng dẫn tận tình của các thầy cô giáo,các anh chị em và các bạn Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin bày

tỏ lòng biết ơn tới:

PGS TS Đinh Thị Kim Nhung - Người đã trực tiếp hướng dẫn, dạy bảo,động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ phòng Vi sinh trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban giám hiệu, Phòng sau đại học, các Phòng, Ban trường ĐHSP Hà Nội 2 đãtạo các điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong quá trình làm việc

Cùng với đó là sự biết ơn chân thành tới những người thân trong giađình, bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tàinày

Hà Nội, tháng 8 năm 2015

Hoc viên

Bùi Thị Thủy

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, dưới sựhướng dẫn của PGS.TS Đinh Thị Kim Nhung Luận văn này không có sự trùnglặp với các đề tài khác.

Hà Nội, tháng 8 năm 2015

Hoc viên

Bùi Thị Thủy

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

là trà "thủy sâm" hay còn gọi là kombucha.Thực ra đây chính là một loại thứcuống có từ rất lâu được gọi tên là "The remedy for immortality" nghĩa là

"phương thuốc trường sinh" Thủy sâm thực sự chỉ là một loại giấm phát triểndưới dạng một váng nhầy dày, dai và màu trắng Loại giấm này sinh sôi nhanhtrong môi trường nước chè pha đường

Khi các vi sinh vật được nuôi trong một môi trường trà dược, cung cấp

đủ nitrogen, vitamin và khoáng chất cùng những chất dinh dưỡng căn bản khácnhư đường Chúng phát triển và biến đổi đường thành gluconic acid, đồng thờisản xuất ra một lượng nhỏ alcohol sau đó biến đổi thành acetic acid tạo cho tràmột vị ngọt và có mùi chua của rượu táo lên men [8] Thành phẩm ‘trà’ sau

cùng chứa trung bình từ 0.5 đến 1% alcohol, acetic acid và một lượng nhỏ acid

như: lactic acid, malic acid, malonic acid, citric acid và oxalic acid và rât giàuvitamin như: Bl, B2, B3, B6, B12, vitamin c và một so hợp chất có tác dụngkháng sinh, sát trùng và giải độc Ngoài ra trong môi trường lên men còn có thể

có hyaluronic acid, chondroitin-sulfate acid, mukoitin sulfate, heparin

Ở Việt Nam, trên thị trường đã có bán các loại kombucha dưới dạngđóng chai, đồ hộp, nước giải khát nhập khẩu từ nước ngoài Trên thế giới, đã có

6

rất nhiều nghiên cứu về kombucha như: các nghiên cứu về thành phần các chất,vitamin có trong kombucha; tác dụng của kombucha trong việc bảo vệ cơ thểcon người tránh các tác hại của hóa chất, tia phóng xạ Tuy nhiên, ở Việt Namcác công trình nghiên cứu về kombucha vẫn còn khá khiêm tốn, đặc biệt là vềkhu hệ vi sinh vật, về ảnh hưởng của điều kiện môi trường đối với quá trình lênmen kombucha,đặc biệt chưa có nghiên cứu nào về giống chè PT10, chính vì

vậy tôi quyết định lựa chọn đề tài "Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới

quá trình tạo sản phẩm kombucha từ Chè PT10".

2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng cho quá trình lên men tạo sản phẩm kombucha từ Chè PT10

3 Nội dung nghiên cứu

3.1. Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men và vi khuẩn có khả nănglênmen kombucha từ Chè PT10

3.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới quá trình lên menkombucha

3.3. Xây dựng quy trình lên men kombucha từ Chè PT10 quy mô phòng thí nghiệm

4 Ý nghĩa khoa học và ỷ nghĩa thực tiễn

Từ Chè PT10 đã phân lập 25 mẫu nấm men và 20 mẫu vi khuẩn, tuyển

chọn được chủng Saccharomyces M Ị và Acetobacter x 4phù hợp cho quá trình

lên men korabucha; Xác định được tỉ lệ giữa vi khuẩn/nấm men là 2/1 với hàm lượng giống 14%thích họp nhất cho quá trình lên men kombucha; Tìm được môi trường dinh dưỡngthích họp gồm: glucose 100g/l; (NH4)2S04 0,06%; KH2P040,05%; MgS04.7H20 0,05%; nồng độ chất khô 20% và thời gian lên men 7 ngày cho quá trình tạo sản phẩm kombucha từ Chè PT10

8

NỘI DUNG Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giói thiêu về kombucha

1.1.1 Nguồn gốc

Kombucha đã được sử dụng phổ biến qua hơn 200 năm ở vùng ViễnĐông và khoảng hơn 100 năm ở Đông Âu Một số tài liệu ghi chép cho thấy cómột số cư dân sống tại vùng Caucase đã thọ trên trăm tuổi Những người sốngtrường thọ như vậy còn tìm thấy tại một số làng mạc ở Poltaya, Ukraine, TâyTạng và Tây Ban Nha Những người trường thọ ở Nga cho biết họ sống lâu nhưvậy nhờ từ hàng trăm năm nay họ có thói quen dùng loại trà lên menkombucha Thời xưa người Kargasoks tin tưởng rằng trà nấm này có tác dụnggiúp họ được sống khỏe và kéo dài tuổi xuân Cho nên khi một nữ du kháchquý tộc người Nhật đến thăm thắng cảnh ở làng Kargasok, trông thấy nhữngngười già ở đây khoẻ mạnh lạ thường, gương mặt họ không có nếp nhăn và ít lộ

vẻ già nua Bà lấy làm ngạc nhiên và hỏi rõ thì được biết dân chúng ở đây cóthói quen uống kombucha hằng ngày Bà đã xin một ít nấm để làm giống vàmang về Nhật rồi sau đó chia với bạn bè cùng sử dụng Sau nhiều tuần lễ, cácbạn của bà đều vô cùng khen ngợi về sự hữu hiệu của loại nấm này Do đó trànấm này được truyền bá nhiều nơi trên Nhật Bản [42],

1.1.2 Đặc điểm cẩu tạo

Nghiên cứu về vi sinh vật cộng sinh trong kombucha cho thấy:kombucha thực sự là một tập hợp cộng sinh của nấm men và vi khuẩn acidacetic [24], [28], [36] Các vi khuẩn acetic chính được tìm thấy trong các loại

nấm trà: Acetobacter xyỉinum [16], Acetobacter aceti, Acetobacter

pasteurianus [23], Gluconobacter oxydans [22], [29], Ngoài ra còn có thể có

các chủng Lactobacillus, Brettanomyces, Pediococcus, Bacterium gỉuconicum Chính sự có mặt của các chủng Acetobacter (đặc biệt là

Acetobacter xylinum) đã hình thành nên cấu trúc của kombucha Acetobacte rxyỉỉnum có khả năng tạo màng hemicellulose khá dày và chắc, tạo màu xanh

với thuốc nhuộm iod và H2SO4 Kombucha còn được gọi là nấm trà Chúngsinh trưởng tốt trong môi trường nước trà đường Bởi vậy, thường được sửdụng để lên men dung dịch trà đường, nên gọi là nấm trà Trong quá trình lênmen kombucha sẽ tạo ra một lóp màng mỏng trên bề mặt dịch trà và dần dầntăng bề dày, hình thành nên một kombucha thứ hai (thường gọi là kombuchacon) tách biệt với kombucha ban đầu.Hình dạng và kích thước của kombuchaphụ thuộc vào hình dạng tiết diện của bình chứa [42], [45]

Hình l.l.Kombucha Hình 1.2 Lớp màng kombucha 1.1.3 Hệ vỉ sinh vật trong kombucha

1.1.3.1 Acetobacter

Giống vi khuẩn Acetobacter thuộc họ Pseudomonadaceae, phân bố rộng

rãi trong tự nhiên và có thể phân lập được các vi khuẩn này từ không khí, đất,nước, lương thực thực phẩm, giấm, rượu, bia, hoa quả Có khoảng 20 loài

thuộc giống Acetobacter đã được phân lập và mô tả, trong đó có nhiều loài có ý

nghĩa kinh tế

* Đặc điểm chung của chủng Acetobacter

Chủng Acetobacter có dạng hình que, tùy điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ,

thành phần môi truờng nuôi cấy) mà các vi khuẩn Acetobacter có thể sinh ra

các tế bào có hình thái khác biệt dạng kéo dài hoặc phình to ra Kích thước thayđổi tùy loài (0.3-0.6 X 1.0-8.0pm).Có thể di động (có tiên mao đơn hoặc chumao) hoặc không di động (không có tiên mao) Hiếu khí bắt buộc, chịu được độ

acid cao.Vi khuẩn Acetobacter có khả năng đồng hoá nhiều nguồn thức ăn

cacbon khác nhau nhưng không sử dụng được tinh bột Tế bào đứng riêng lẽhoặc kết thành từng chuỗi Có khả năng tạo thành váng trên môi trường lỏngváng thay đổi tùy loại

Acetobacter xylỉnum: tạo thành váng cellulose khá dày và chắc Acetobacter orleanoe: tạo thành váng mỏng nhưng chắc Acetobacter pasteurianum: tạo thành váng khô và nhăn nheo Acetobacter suboxydans: tạo

thành váng mỏng dễ tan rã Acetobacter có khả năng đồng hoá muối (NH4)+ vàphân giải pepton Một số loài đòi hỏi một số acid amin nhất định như acidpantothenic và các chất khoáng K, Mg, Ca, Fe, p, s ở dạng muối vô cơ, hữu

cơ hoặc họp chất hữu cơ Do đó bia, dịch tự phân nấm men, nước mạch nha,nước trái cây là nguồn dinh dưỡng rất tốt cho sự phát triển của vi khuẩn

Acetobacter Ngoài khả năng oxy hoá ethanol thành acid acetic, một số loài Acetobacter còn tổng hợp được vitamin Bi, vitamin B2, oxy hoá sorbit thànhđường sorbose (dùng trong công nghiệp sản xuất vitamin C) [4], [45],

1.1.3.2 Nấm men

* Hình thái và cấu tạo tế bào

Te bào nấm men thường có dạng hình cầu, ovan, elip, hình trụ kíchthước rất lớn gấp từ 5 - 10 lần tế bào vi khuẩn Kích thước trung bình: chiềudài: 9 - 10|im, chiều rộng: 2 - 7|im Hình dạng và kích thước tế bào thay đổi,không đồng đều ở các loài khác nhau, ở các lứa tuổi khác nhau và điều kiệnnuôi cấy khác nhau Nấm men là sinh vật đon bào, tế bào nấm men cũng nhưnhiều loại tế bào khác được cấu tạo chủ yếu từ các phần cơ bảnnhư: glucan,

protein, lipid và một số thành phần nhỏ khác như kitin Màng nguyên sinhchất: gồm các họp chất phức tạp như protein, phospholipit, enzymepermeaza Chất nguyên sinh: thành phần cấu tạo chủ yếu là nước, protit, gluxit,lipit và các muối khoáng, enzyme và có các cơ quan trong đó Nhân tế bào vànhững thành phần cơ quan con khác: không bào, ty lạp thể, riboxom, [4], [45].

* Sự sinh sản của nấm men

Nấm men có một số hình thức sinh sản: nảy chồi; phân đôi; sinh sảnbằng bào tử và hình thành bào tử (tiếp họp đẳng giao, tiếp họp dị giao, sinh sảnđơn tính) [4]

* Phân loại nấm men

Chủ yếu có hai lóp: nấm men thật (Ascomyces) và nấm men giả (Fungiimporfecti) [4], [45]

Lớp nấm men thật (Ascomyces): phần lớn nấm men dùng trong công

nghiệp thuộc lóp Ascomyces, đa số thuộc giống Saccharomyces; giống

Endomyces; giống Schizosaccharomyces.

Lớp nấm men giả (Fungi imporfecti): Crytococm (toscula, tornlopsis);

Mycoderma; Candida; Geotrichum (đã được xếp vào lóp nấm mốc); Rhodotorula.

* Các quá trình sinh lí của tế bào nấm men

Nấm men cũng như các sinh vật sống khác cần oxy, hydro, cacbon,nitơ,phospho, kali, magiê [4], [45],

Dinh dưỡng cacbon: nguồn cacbon cung cấp là các loại đường khácnhau: saccharose, maltose, lactose, glucose Dinh dưỡng oxy, hydro: đượccung cấp cho tế bào từ nước của môi trường nuôi cấy hay dịch Dinh dưỡngnitơ: nấm men không có men ngoại bào để phân giải protein, nên không thểphân cắt albumin của môi trường mà phải cung cấp nitơ ở dạng hòa tan, có thể

là đạm hữu cơ hoặc vô cơ Dạng hữu cơ thường dùng là acid amin, pepton,

amid, urê Đạm vô cơ là các muối amon khử nitrat, Sulfat Các vitamin và chấtkhoáng: chất khoáng có ảnh hưởng to lớn đến hoạt động sống của nấm men.Phospho: có trong thành phần nucleoprotein, polyphosphat của nhiều enzymecủa sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu, chúng tạo ra liên kết cónăng lượng lớn Magiê: tham gia vào nhiều phản ứng trung gian của sự lênmen sắt: tham gia vào các thành phần enzyme, sự hô hấp và các quá trình khác.Kali: chứa nhiều trong nấm men, nó thúc đẩy sự phát triển của nấm men, thamgia vào sự lên men rượu, tạo điều kiện phục hồi phosphorin hóa của acidpyruvic Mangan: đóng vai trò tương tự như magiê.

* Quá trình sinh trưởng và phát triển

Trong quá trình nuôi cấy, trong điều kiện dinh dưỡng đầy đủ, tế bào nấmmen tăng nhanh về kích thước và đồng thời sinh khối được tích lũy nhiều Cácnấm men sinh sản bằng phương pháp nhân đôi thường cho lượng sinh khối rấtlớn sau một thời gian ngắn Trong trường họp sinh sản theo phương pháp nàythì trong dịch nuôi cấy sẽ không có tế bào già Vì rằng tế bào được phân chiathành hai, cứ như vậy tế bào lúc nào cũng ở trạng thái đang phát triển Te bàochỉ già khi môi trường thiếu chất dinh dưỡng và tế bào không có khả năng sinhsản nữa Tuy nhiên đa số nấm men sinh sản bằng phương pháp nảy chồi nênhiệntượng phát hiện tế bào già rất rõ.Khi chồi non tách khỏi tế bào mẹ để sốngđộc lập thì nơi tách đó trên tế bào mẹ tạo thành một vết sẹo.vết sẹo này sẽkhông có khả năng tạo ra chồi mới Cứ như vậy tế bào mẹ sẽ chuyển thành tếbào già theo thời gian [4], [45]

Đe xác định số lượng tế bào nấm men phát triển theo thời gian hiện nayngười ta dùng nhiều phương pháp khác nhau như: xác định số lượng tế bàobằng phương pháp đếm trực tiếp trên kính hiển vi hay trên mặt thạch Đo độđục của tế bào trong dung dịch nuôi cấy trên cơ sở xây dựng một đồ thị chuẩncủa mật độ tế bào [4]

Quá trình sinh trưởng của nấm men trong nuôi cấy không liên tục sinhtrưởng theo một đường cong gồm 4 pha: pha tiềm phát (pha lag): nấm menthích nghi với môi trường, số lượng tế bào chưa tăng Pha lũy thừa (pha log):nấm men sinh trưởng với tốc độ lớn nhất và không đổi, số lượng tế bào trongquần thể tăng lên rất nhanh Phacân bằng: số lượng nấm men đạt cực đại vàkhông đổi theo thời gian Phasuy vong: số tế bào trong quần thể giảm dần do tếbào trong quần thể bị phân hủy ngày càng nhiều, chất dinh dưỡng cạn kiệt.

1.1.3.3 Giống vi khuẩn lên men lactic

Vi khuẩn lên men lactic thuộc họ Lactobacterỉum Đây là những trực

khuẩn, cầu khuẩn không tạo bào tử và hầu hết không di động, hô hấp tùy tiện.Chúng có khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đôi nhưng không

có khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột Sự phát triển của nócần có sự có mặt của pepton, acid amin hay muối amon Quá trình lên men xảy

ra tốt nhất trong môi trường acid pH từ 5,5 -ỉ- 6, khi pH nhỏ hơn 5,5 quá trìnhlên men bị dừng lại Nhiệt độ thích họp cho quá trình lên men từ 15 -í- 50°c.

Tuy nhiên mỗi loài có khoảng nhiệt độ thích hợp khác nhau, nếu nhiệt độ lớnhơn 80°c vi khuẩn lactic bị tiêu diệt hoàn toàn [45],

1.2 Cơ sở khoa học của quá trình lên men kombucha

Theo kết quả nghiên cứu về thành phần cấu tạo của kombucha thì quátrìnhlên men dịch trà có thể xảy ra như sau:

* Lên men ethanol

Lên men rượu là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men,chúng sẽ chuyển hóa đường lên men thành ethanol và CC>2.Quá trình lên menrượu chia làm hai thời kỳ chính: thời kỳ phát triển sinh khối và thời kỳ lên menchuyển đường thành rượu và CƠ2 Sau khi được vận chuyển vào trong tế bàochất, đường hexose được chuyển hóa theo chu trình đường phân để tạo thànhacid pyruvic Tiếp theo acid pyruvic sẽ được chuyển hoá thành acetaldehyde rồi

thành ethanol.Dihydroxyacetone phosphat là một sản phẩm trung gian trongchu trình đường phân, họp chất này có thể chuyển hoá thành glyxerol.Trongmôi trường pH acid, glycerol chỉ được tạo ra với hàm lượng nhỏ Ngược lại,trong môi trường pH kiềm lượng glycerol sinh ra sẽ tăng lên rất nhiều vàglycerol sẽ trở thành một trong những sản phẩm chủ yếu của quá trình lên men.

Cơ chế phân giải đường trong tế bào nấm men được trình bày ở hình 1.3

Phương trình tổng quát của quá trình lên men trong môi trường pH acid:

C6H1206 + 2ADP +2PĨ -> 2C2H5OH + 2C02 + 2ATP

Sự chuyển hóa đường hexose thành ethanol và khí C02 diễn ra trong tếbào chất của nấm men Đây là quá trình trao đổi năng lượng của nấm men trongđiều kiện kỵ khí Ethanol và C02 trong tế bào chất sẽ được nấm men thải vàomôi trường lên men Ngoài ra, tế bào nấm men còn tổng họp và thải vào dịchlên men hàng trăm sản phẩm phụ và sản phẩm lên men khác, những họp chấtnày được tìm thấy với hàm lượng rất nhỏ, chúng được chia thành 4 nhóm:glyxerol cùng rượu bậc cao, aldehyde, acid hữu cơ và este.Trong quá trình lênmen ethanol, nhiều acid hữu cơ được tạo thành (The Moll, 1990) Một số acidhữu cơ được sinh tổng hợp từ chu trình Krebs, nếu như quá trình lên menkhông diễn ra trong điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt, các acid hữu cơ chiếm hàmlượng cao nhất trong dịch lên men là: acid citric, malic, acetic, lactic [45]

ị Hexokinaza Glucose — 6 — phösphar

ị_ Ph otph o glu CO za IS ornera za

Fructose — 6 — phosphat

I PhosphoFnictokhiaza Fructos e — 1.6 — dipho sphat I

Aldolaza

Glyceraldehyd — 3 — ph.osph.at ^

Dihydro aceton phosphat

ị Glyceraldehyd ph 0 sph 1t d ehydro g enaza

Acid — 1.3 — diphösphoglvceric

Acid — 3 —

phosphoglvceric

ị Pho sphoglvcerat-mutaza

Acid — 2 — phosphoglycenc ị Enoiaza

Acid phosph0en olpyruLvic

* Lên men acetic

Lên men acid acetic là quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic dưói tácdụng của vi khuẩn

C2H5OH + 02-> CH3CHO (Acetaldehyde) + H20

CH3CH0 + H20 -> CH3CH(OH)2 (Hydrat acetaldehyde) CH3CH(OH)2 +

02 -> CH 3 COOH + H 2 O

* Lên men ỉactic

Lên men lactic là một quá trình trao đổi năng lượng Các phân tử ATPđược hình thành trong quá trình chuyển hóa cơ chất sẽ được vi khuẩn giữ lạitrong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi chất và sinh trưởng của vi sinhvật Ngược lại, các sản phẩm như acid lactic, ethanol, C02 được vi khuẩn thảivào môi trường lên men Kết quả là hàm lượng acid lactic tích lũy trong môitrường lên men ngày càng tăng, làm giảm pH môi trường và kéo theo nhữngbiến đổi hóa lý khác Bản chất là quá trình chuyển hóa đường thành acid lacticnhờ vi sinh vật

Phương trình phản ứng:

C6H1206 -> CHaCHOHCOOH + 94kcalTrong quá trình lên men lactic ngoài sản phẩm acid lactic (lên men đồnghình), acid acetic, ethanol, C02 (lên men dị hình) trong dịch lên men còn xuấthiện cả trăm hợp chất hóa học mới khác.Một số hợp chất trong nhóm trên rất dễbay hơi.Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc góp phần hình thành nên mùi

vị đặc trưng cho những sản phẩm lên men lactic

Phương trình tổng quát:

C6H I2O6 -> CH3CHOHCOOH + CH3COOH + C2H5OH + C00H(CH2)2C00H+C02

Lượng sản phẩm phụ tạo thành hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinhvật, vào môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh: acid lactic thườngchiếm 40% lượng đường đã được phân hủy, acid succinic 20%, ethanol chiếm

10%, acid axetic 10% và các loại khí gần 20%

* Bản chất sinh hóa của quá trình tạo váng cellulose của vi khuẩn acetic

Quá trình hình thành cellulose được nhà bác học Muhlethaler sử dụngkính hiển vi điện tử để nghiên cứu và cho rằng: đầu tiên các tế bào vi khuẩn sẽtiết ra chất nhầy bao bọc xung quanh chúng, tiếp đó là sự hình thành các sợicellulose được polymer hóa từ các đơn phân glucose ở vị trí a-1,6 dưới tác dụngcủa enzyme có trong bao nhầy Các sợi này ngày càng dầy lên và được kết nốivới nhau tạo thành lóp cellulose bên trong bao nhầy.Lóp cellulose này sau đóđược thoát ra khỏi tế bào hoàn toàn

Dung dịch môi trường ban đầu có dạng huyền phù mịn, chuyển sangdạng rời rạc sau đó lại kết thành khối lớn hơn dạng gel chứa các tế bào vi khuẩnbên trong đó Bộ khung của gel là mạng lưới cellulose với thành phần chủ yếu

là nước Nó được hình thành ở mức tối đa chỉ 30 phút sau khi có sự tiếp xúc

giữa vi khuẩn Acetobacter xylỉum với glucose và oxy.

Polysaccaride của vi sinh vật thường được tích tụ đáng kể trong các môitrường lỏng Tất cả các oligo và polysaccaride được tổng họp bằng cách kéo dàichuỗi saccaride có trước nhờ vào việc thêm vào đơn vị monosaccharide Đơn vịđược hoạt hóa thường là dẫn xuất của các uridin diphotphate nhưng đôi khicùng với các nucleotide, nucleotide, purin và các pirimidin khác

1.3 Giói thiệu về trà lên men kombucha

Đây là một loại thức uống được lên men trong dung dịch trà đường bởikombucha Kombucha có thể sử dụng một số loại trà để lên men, nhưng không

sử dụng được trà thảo mộc vì kombucha dễ bị hỏng khi lên men trà có nhiềutinh dầu.Một số loại trà có chứa dầu thơm, có thể làm cho kombucha bị chếthoặc bị ảnh hưởng xấu Sử dụng các loại trà khác nhau sẽ cho ra những loạithức uống với những hương vị khác nhau [44],

1.3.1 Thành phần của trà đường lên men

Khi các vi sinh vật được nuôi trong môi trường trà dược, cung cấp đủnitrogen, vitamin và khoáng chất cùng những chất dinh dưỡng căn bản khácnhư đường Chúng phát triển và biến đổi đường thành gluconic acid, đồng thờitạo thành một lượng nhỏ alcohol chính lượng alcohol này sau đó biến đổi thànhacetic acid tạo cho trà có vị ngọt và có mùi chua của rượu táo lên men Thànhphẩm trà sau cùng chứa trung bình 0.5 - 1% alcohol, một lượng nhỏ acid lactic,acid malic, acid acetic, acid malonic và acid oxalic Lượng vitamin B trongthành phẩm khá cao.Trà lên men kombucha được xác định là có khả năngkháng khuẩn mạnh Khả năng chống vi khuẩn được quan sát thấy trong cácmẫu lên men có chứa tong so acid là 33g/l (trong đó acid acetic chiếm 7g/l)

Tuy nhiên, Candida albicans không bị ức chế bởi kombucha.Nghiên cứu này

cũng chỉ ra khả năng kháng khuẩn của kombucha là nhờ acid acetic [44], [48]

1.3.2 Công dụng của trà đường lên men

Kombucha đã được Cục quản lí thực phẩm và dược phẩm của Mỹ(FDA) chứng nhận là an toàn đối với con người [43] Việc sử dụng rộng rãithức uống từ kombucha đã được nghiên cứu qua nhiều tài liệu trong suốt thế kỷqua Dạng kombucha lỏng và dạng đặc cũng được nghiên cứu và kết quả banđầu cho thấy trong dịch trà này có chứa chất kháng sinh (diệt khuẩn và kìmhãm vi khuẩn) có tác dụng chống lại một số vi sinh vật gây bệnh và đã được sửdụng cho mục đích điều trị trong thuốc thú y và thuốc cho người Đầu thế kỷ

XX, chủ yếu là những nghiên cứu y học của người Đức, chứng minh kombucha

có tác dụng điều tiết đường ruột và có ảnh hưởng tốt đến chức năng nói chungcủa cơ thể, nhưng cũng dần có hiệu quả cụ thể trong những trường hợp như rốiloạn tiêu hóa, táo bón, tri, sỏi thận, các vấn đề về túi mật, tiểu đường,cholesterol, cao huyết áp, xơ cứng động mạch, đau đầu, mệt mỏi Theo nhiềunghiên cứu trên thế giới thì trà kombucha có nhiều lợi ích đối với con người,

thường được tìm mua ở các cửa hàng thực phẩm chức năng Tác dụng của tràkombucha dựa trên các thành phần sau: acid lactic: cần thiết cho hệ thống tiêuhóa Giúp cho việc lưu thông máu, cân bằng độ acid và kiềm trong cơthể.Trong kombucha, acid này tồn tại ở dạng có lợi nhất (lactic - L) Acidacetic: là 1 chất bảo quản chống lại sự xâm nhập của vi khuẩn có hại Acidusnic: là 1 loại chất kháng sinh tự nhiên, giúp chống lại nhiều loại virus Có báocáo cho rằng môi trường nuôi cấy kombucha có chứa acid usnic nhưng kết quảchưa được xác nhận.Acid oxalic là một chất bảo quản hiệu quả và cung cấpnăng lượng.Acidgluconic tạo ra bởi vi khuẩn, có lợi cho người mắc các bệnh

như nhiễm nấm Candỉda Acid malic giúp giải độc gan.Acid butyric tạo ra bởi

nấm men, bảo vệ màng tế bào, kết họp với acid gluconic tăng cường thành ruột

chống lại kí sinh trùng, trong đó có nhiễm nấm như Candỉda Các họp chất

tanin trong trà: có khả năng kháng khuẩn và phòng chống bệnh ung thư, làmchậm quá trình lão hóa Caffein trong thành phần của trà có khả năng giảm mệtmỏi, căng thẳng, giảm cảm giác buồn ngủ, cung cấp năng lượng hoạt động cho

cơ thể.Trà kombucha còn tốt cho da đầu và tóc, kích thích sự phát triển của tóc[7], [44], [45]

1.3.3 Một số lưu ý khi sử dụng

Với những bệnh nhân trong giai đoạn điều trị ung thư do xạ trị hoặc hóatrị, nếu dùng trà cần sự giám sát của thầy thuốc Do trà chứa quá nhiều acidlactic, uống trong một thời gian dài có thể dẫn đến đau khóp, chóng mặt vàviêm xoang Trẻ em có thể dùng nhưng liều lượng thay đổi theo tuổi, cân nặng

và quan trọng cần phải được pha loãng với nhiều nước, không nên cho trẻ dưới

2 tuổi uống Phụ nữ có thai không nên dùng vì có đến 1% lượng cồn trong nướctrà Không nên uống trong thời gian cho con bú vì gây đau bụng cho trẻ sơ sinh.Người tiểu đường chỉ nên dùng trà đang lên men vì hầu hết lượng đường bịbiến đổi, tuy nhiên nếu ủ men trà với quá ít đường (dưới 50 gam/lít) thì khóxuất hiện các đặc tính hữu ích của trà kombucha Vì vậy người tiểu đường cũng

không nên uống nhiều.Trà korabucha gây loãng máu, cần giảm liều và chú ýngưng một tuần trước khi phẫu thuật; phụ nữ bị rong kinh cũng cần thận trọng

và nên ngưng sử dụng trước kinh kỳ tối thiểu một tuần.Men trà kombucha cóthể bị hư và mất hết tác dụng nếu ủ không đúng quy cách [44], [45], [46]

1.4 Nguyên liệu

1.4.1 Nguồn gốc và đặc tính thực vật

Cây chè có tên khoa học là Camellia sinensis, có nguồn gốc ở khu vực

Đông Nam Á, nhưng ngày nay nó được trồng phổ biến ở nhiều nơi trên thếgiới, trong các khu vực nhiệt đới và cận nhiệt đới Chèlà loài cây xanh lưu niênmọc thành bụi hoặc các cây nhỏ, thông thường được xén tỉa để thấp hơn 2 métkhi được trồng để lấy lá Nó có rễ cái dài, hoa màu trắng ánh vàng, đường kính

từ 2,5 - 4cm, với 7-8 cánh hoa Hạt của nó có thể ép để lấy dầu Cả lá và chồicủa cây trà đều được sử dụng để sản xuất các sản phẩm trà xanh, trà đen, tràđỏ Lá dài từ 4 - 15cm Lá tươi chứa khoảng 4% caffein Lá non và các lá cóxanh lục nhạt được thu hoạch để sản xuất trà khi mặt bên dưới của chúng còncác sợi lông tơ ngắn màu trắng, các lá già có màu lục sẫm ở các độ tuổi khácnhau của lá trà tạo ra các sản phẩm trà khác nhau về chất lượng, do thành phầnhóa học trong các lá này là khác nhau Thông thường, chỉ có lá chồi và 2 đến 3

lá mới mọc gần thời gian đó được thu hoạch để chế biến Việc thu hoạch thủcông bằng tay diễn ra đều đặn sau khoảng 1 đến 2 tuần [40],

1.4.2 Phương pháp sản xuất trà xanh

Trà xanh được chế biến từ trà tươi, qua các quá trình sau:

Trà tươi —» diệt men —» vò trà —»làm khô —» sao lăn gia nhiệt tạohình —» phân loại —» sao hương —» phân loại —» sản phẩm

Trong quá trình sản xuất trà xanh, tùy theo từng phương pháp diệt menkhác nhau và phương pháp làm khô khác nhau mà chia ra nhiều loại theo tínhchất, hương vị đặc biệt của nó [40],[45]

1.4.3 Đăc điểm của trà xanh

Ngoại hình: xoăn chặt, màu xanh đen Màu nước xanh tươi hoặc xanhvàng Hương: hương thơm đặc trưng của trà tươi Vị chát đậm

Do quá trình diệt men làm đình chỉ hoạt động của enzym, nên các thànhphần trong trà xanh rất ít bị biến đổi, hàm lượng polyphenol trích ly trong nước

là 30 - 40%, các vitamin và khoáng chất vẫn được giữ lại (đặc biệt là vitaminC) Vì vậy, giá trị dinh dưỡng của trà xanh tương đối cao Trà xanh có khả năngchống ung thư cao, tác dụng tương tự như trà tươi [40]

1.4.4 Giá trị và thành phần hóa học của lá chè tươi

Từ lâu, trà xanh không chỉ được dùng là nguyên liệu nước giải khát tốtcho sức khỏe con người mà trà xanh còn là một trong những loại thảo dược có

ý nghĩa rất quan trọng trong việc duy trì sức khỏe tốt của cơ thể.uống trà xanh

có tác dụng tránh đau đầu, trầm cảm, tinh thần được minh mẫn sảngkhoái.Ngoài ra uống trà xanh có tác dụng phòng ngừa và điều trị đa xơ cứng,chống lại một số bệnh như tiêu chảy, tả lỵ, thương hàn Đặc biệt trà xanh là mộtnguồn tự nhiên của chất chống oxy hóa, là chất sát khuẩn có thể giảm nhiễmtrùng [1], [9],

> r

Bảng 1.1 Thành phân hóa học chủ yêu của lá chè tươi

Các chất có trong thành phần hóa học của lá chè tươi, một mặt tham giatrực tiếp vào sự hình thành chất lượng trà sản phẩm (như pectin, caffeine ) Mặtkhác quan trọng hơn là qua sự biến đổi hóa học (như sự biến đổi của tannin,protein, glucid ) để tạo nên các tính chất đặc trưng cho trà sản phẩm Thànhphần hóa học của lá chè rất đa dạng và phong phú về số lượng các chất, đồng

Acid hữu cơ (Citric, malic, oxalic ) 0 , 5 - 0 , 6

Đường (glucose, fructose, raffmose,

Chất xơ (cellulose, hemicellulose, lignin) 7 - 2 0

thời cũng có chứa một lượng lớn các chất có giá trị sinh học cao mà có tính chấtđặc trưng cho sản phẩm trà.Các nhóm chất có ý nghĩa lớn đó là họp chất phenolthực vật, các họp chất chứa nito và hệ enzyme có sẵn trong trà [1].

1.4.5 Đăc điểm của chè PT10

Tuyên Quangđược biết đến không những là cái nôi của khu di tích lịch sửTân Trào mà còn nổi tiếng với những sản phẩm chè như Bát Tiên, PT10, NgọcThúy, trong đó có giống chè PT10 được quan tâm và trồng nhiều bởi PT10 làgiống chè lai cho năng suất cao Đặc điểm hình thái lá: màu xanh đậm, hìnhtrứng, chóp lá nhọn, bề mặt phẳng nhẵn, thế lá hơi xiên.Đặc điểm hình thái búp:màu xanh vàng, lông tơ nhiều, chiều dài búp 3,8cm.Nước trà sau khi pha có màuvàng đậm có hương thơm, uống lúc đầu chát gắt, có vị đắng sau có vị ngọt kéodài, pha nhiều lần vẫn đậm [13]

1.5 Tình hình nghiên cứu kombucha ở trong và ngoài nước

1.5.1 Trên thế giới

ở trên thế giới đã có rất nhiều các bài báo, các nghiên cứu về kombuchađược đăng trên tạp chí quốc tế Đó là các bài báo, các công trình nghiên cứu vềtác dụng của trà kombucha đối với sức khỏe, các nghiên cứu về phân lập hệ visinh vật trong trà kombucha Đầu tiên phải kể đến các bài báo, các nghiên cứu

về tác dụng của kombucha và các nghiên cứu sinh hóa: Bacinskaja (1914) vàcộng sự cho rằng kombucha tốt cho hệ tiêu hóa, điều chỉnh các hoạt động đườngruột, đặc biệt là chống táo bón Đen năm 1927, Madaus đã có những nghiên cứu

và đưa ra kết luận nấm kombucha và các sản phẩm chuyển hóa của nó có tácđộng tích cực trong việc tái sinh vách tế bào, một phương thuốc tuyệt vời chobệnh xơ vữa động mạch[49] Vào năm 1987, Veronika Carstens trong nghiêncứu của mình đã chỉ ra: kombucha có tác dụng giải độc cơ thể, cải thiện chứcnăng hệ miễn dịch [48], Reiss, J (1994) đã tìm hiểu ảnh hưởng của các loạiđường khác nhau lên quá trình trao đổi chất của nấm trà [33].Năm 2006,

Steinkraus K H và cộng sự đã có những nghiên cứu về hoạt động kháng sinhcủa trà nấm kombucha [36] Năm 2007, Velicanski và cộng sự đã cho biết hoạtđộng kháng khuẩn và chống oxy hóa của kombucha [38] Jayabalan R và cộng

sự (2010) đã nghiên cứu về đặc điểm sinh hóa của nấm trà [27] Cavusoglu K.,Gluer p (2010) đã phát hiện tác dụng bảo vệ của nấm trà kombucha trên nhiễmsắc thể gây ra bởi bức xạ gamma trong tế bào bạch huyết ngoại vi của con ngườitrong ống nghiệm [18] Yapar K và cộng sự (2010) đã có những nghiên cứu vềtác dụng bảo vệ của nấm trà kombucha đối với chuột bạch tạng bị nhiễm độc dophenol [39] Các nghiên cứu về định danh các chủng vi sinh vật trong kombucha

và ứng dụng của các chủng được phân lập từ kombucha cũng đã có từ rất lâu: Từ

năm 1928, Hermann đã định danh hai chủng Bacterium xyỉinum và B xylinoides

và B gluconicum Các nhà nghiên cứu còn xác định được kombucha là một sự họp tác cộng sinh giữa Bacterium xylinum cùng các vi khuẩn khác, với những tế bào nấm men thuộc chủng Saccharomyces, tạo thành một khối như tổ chim Vào năm 1973, List và cộng sự đã phân lập được Acetobacter ketogenum; Pichia

fermentans; Saccharomyces apiculatus; s.ludwigli; B.xylỉnoỉdes; Schizosaccharomyces pombe từ dịch nuôi cấy kombucha [47], Năm 2001,

Kurtzman CP và cộng sự đã phân lập được một chủng nấm men mới từ

kombucha và đặt tên là Zygosaccharomyces kobuchaensis [29].Vào năm 2006,

Dutta D và cộng sự đã có công trình nghiên cứu về khả năng cố định đạm của

chủng Acetobacter nitrogen nifigens sp.nov được phân lập từ trà kombucha

[21].Đen năm 2007, Dutta D và cộng sự đã có công trình nghiên cứu về khả

năng cố định đạm và sản xuất cellulose của Gỉuconacetobacter kombucha sp.nov

được phân lập từ kombucha [16] Nguyen, Vu Tuan; Flanagan và cộng sự vàonăm 2008 đã có những nghiên cứu về đặc tính của màng BC bởi chủng

Gluconacetobacter xylỉnus phân lập từ kombucha [32].

Các nghiên cứu về kombucha ở trên thế giới rất phong phú, đa dạng.Mặc

dù vậy, những nghiên cứu về ảnh huởng của điều kiện môi truờng lên quá trìnhlên men hầu nhu là rất ít, không đầy đủ.

1.5.2 Ở Vỉêt Nam

Hiện nay các nghiên cứu về kombucha ở Việt Nam còn khá mới mẻ, chođến nay các công trình nghiên cứu về kombucha có rất ít Theo Vũ Văn Chuyênthì từ năm 1969, ở Thái Nguyên và Hà Nội, nguời ta đã phổ biến cho nhau dùngnuớc thủy hoài sâm để bồi duỡng và phục hồi sức khỏe, chống lại bệnh tật Từnăm 1994 đến nay, ở tỉnh Bình Định và một số nơi khác ở miền Nam đang luuhành một loại nuớc uống có tính chất giải khát đặt tên là “trà giấm” có tác dụngbồi bổ, tăng cuờng sức khỏe, làm cho ăn ngon miệng, ngủ yên giấc và chữa đuợcnhiều bệnh, nhất là bệnh huyết áp cao, chứng mất ngủ Theo tác giả Nguyễn LânDũng thì kombucha là một dạng cộng sinh giữa nấm men và vi khuẩn sinh acidgluconic Sản phẩm này có thể tụ nhân giống bằng nuớc chè đuờng.Có lợi chosức khỏe tuơng đuơng nhu sữa chua.Nhiều công bố đã nói về tác dụng chữa bệnhhiểm nghèo nhung không có cơ sở khoa học nào chứng thực nhu vậy uống chỉ

có lợi cho sức khỏe, nhất là cho đuờng tiêu hóa, không có tác hại gì [46],[48],Theo tác giả Lê Kim Phụng, nguyên giảng viên Truờng Đại học Y duợcthành phố Hồ Chí Minh, nguời đã có một số bài viết về thủy sâm, cho biết: "Hiệnnay ở nuớc ta đang xuất hiện một loại thuốc bổ ở dạng lỏng nhu trà mà mọinguời gọi là trà "thủy sâm", thực ra đây chính là một loại thức uống có từ rất lâuđuợc gọi tên là "the remedy for immortality", nghĩa là "phuơng thuốc truờngsinh" Thủy sâm thực sự chỉ là một loại cái giấm phát triển duới dạng một vángnhầy dày và dai, màu trắng Loại giấm này sinh sôi nhanh trong môi truờng nuớcchè (trà)

pha đường Cũng theo tác giả Lê Kim Phụng, lợi ích từ trà thủy sâm rất nhiều

"Hầu hết những người uống trà korabucha sẽ thấy khỏe hon sau một tháng hoặcsớm hon, rõ rệt nhất là sự gia tăng năng lượng, giúp nam nữ cải thiện chức năng

sinh dục và cải thiện làn da, làm tăng tính đàn hồi cho da, giúp tóc mọc dày hon,gia tăng thị lực, cải thiện vị giác, giải độc cơ thể, nhiều người cho biết nhữngbệnh mạn tính khó chữa như viêm khóp, thấp khóp, chàm, tổ đỉa, vẩy nến, dịứng, mệt mỏi kinh niên, rối loạn tiêu hóa, huyết áp cao, thiểu năng tuần hoànnão, trầm cảm, thiếu ngủ, cholesterol cao và ngay cả bệnh ung thư cũng thấythuyên giảm rõ rệt khi họ sử dụng trà kombucha Qua nhiều thế kỷ và số lượngngười sử dụng loại trà này trên thế giới càng ngày càng gia tăng chính là mộtminh chứng cho thấy trà kombucha đã mang lại các lợi ích rõ ràng" [41].Lương

y Đinh Công Bảy, Tổng thư ký Hội Dược liệu thành phố Hồ Chí Minh, cho biếtông cũng nghe nói đến thủy sâm, tuy nhiên do chưa nghiên cứu nên chưa thể trảlời về công dụng thực sự của loại trà này Theo tác giả Hà Văn Hùng, Phó Việntrưởng Viện Y dược học dân tộc thành phố Hồ Chí Minh cũng cho rằng cho đếnnay viện cũng chưa có công trình nào nghiên cứu về thủy sâm nên không biết rõthành phần và công dụng của nó [48].Chuyên gia về dược liệu Phan Đức Bình,Phó chủ tịch Hội Bảo vệ người tiêu dùng thành phố Hồ Chí Minh cho biết,những quảng cáo kiểu trà kombucha có khả năng “cải lão hoàn đồng, tái tạo tóc,ngừa ung thư, trị bách bệnh ” đều không có những bằng chứng xác thực [48].ỞViệt Nam, cũng đã có một số công trình nghiên cứu về kombucha như: Vào năm

2012, Lê Nguyễn Thị Hồng Ngọc và cộng sự đã có công trình nghiên cứu

“Nghiên cứu hệ vi sinh vật của trà kombucha và hiệu quả tác dụng trên một sốchỉ tiêu sinh lý chuột” Kết quả nghiên cứu này đã chỉ ra hệ vi sinh vật trongkombucha bao gồm: vi khuẩn acetic, vi khuẩn lactic và nấm men, đồng thời khảosát tác dụng của kombucha trên một số chỉ tiêu sinh lý của chuột như: cân nặng,tổng lượng hồng cầu, tổng lượng bạch cầu, sức khỏe của chuột thí nghiệm qua

mô hình bơi kiệt sức.Sản phẩm kombucha có tác dụng tăng cường sức khỏe,không gây ảnh hưởng xấu tới các chỉ tiêu sinh lý của chuột [40].Đến năm 2013,Tôn Nữ Liên Hương thuộc khoa Khoa học Tự nhiên, Đại học cần Thơ đã có

những nghiên cứu về: ảnh hưởng của thời gian chế biến tới một số tính chất vàhoạt tính sinh học của trà giấm kombucha Nghiên cứu của tác giả đã cho biết:tính chất vật lý, hóa học, hàm lượng của các họp chất hữu cơ có hoạt tính trongtrà giấm kombucha được chế biến từ trà đóng gói hiệu lipton và từ trà đóng góihiệu trà xanh Một số hoạt tính sinh học của trà giấm kombucha: tính khángkhuẩn, kháng oxy hóa, độc tính trên tế bào ung thư, theo thời gian lưu mẫu, trêntừng loại trà giấm [47] Gần đây nhất là các đề tài “Nghiên cứu một số chủngnấm men lên men kombucha từ trà Shan Tuyết Hà Giang” của Lâm Thị HồngLiên trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 năm 2013 và đề tài “Nghiên cứu một sốchủng vi khuẩn lên men kombucha từ trà Thái Nguyên” của Lê Thị Huệ trườngĐại học Sư phạm Hà Nội 2[6], [10].Chủ yếu là các nghiên cứu về tác dụng củakombucha Các nghiên cứu về mối quan hệ cộng sinh giữa nấm men và vi khuẩncũng như ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đối với quá trình lên men

kombucha từ chè (Camellỉa sinensis) PTlOhầu như là chưa có.

Chương 2 VẶT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu

2.1 Nguyên liệu, thiết bị, hóa chất

Ethanol, glucose, fructose, sacrose, lactose

Cao men, pepton, (NH4)2S04

Box vô trùng (Haraeus)

Máy lắc Orbital Shakergallenkump (Anh)

Máy li tâm Sorvall (Mỹ)

Micropipet Jinson (Pháp)

Máy đo pH

Cân (Precisa XT 320M - Thuỵ Sĩ)

Máy cất nước 2 lần (Hamilton - Anh)

Kính hiển vi quang học

Tủ lạnh Daewoo, tủ lạnh sâu, hộp lồng, ống nghiệm, bình tam giác, quetrang, lamen, đèn cồn và nhiều dụng cụ hoá sinh thông dụng khác

2.1.3 Các loại môi trường

* Môi trường HanXen (môi trường phân lập)Pepton: 10g MgS04.7H20: 2g

Nước máy: lOOOml

2.2 Phương pháp nghiên cứu

Cách làm: môi trường phân lập được khử trùng và được phân bố vào cáchộp vô trùng petri để nguội theo phương pháp Pasteur Dịch trà được pha loãng

từ 10 1 - 10"10 bằng nước cất Dùng pipet đã vô trùng nhỏ 1, 2 giọt huyền phù với

độ pha loãng từ 10"7 - 10"9 lên bề mặt thạch rồi dùng bàn trang vô trùng dàn đều.Gói kín lại và nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 28-30°C trong ba ngày Sau ba ngàytrên bề mặt thạch sẽ xuất hiện các khuẩn lạc với đặc điểm: to, tròn, lồi, màutrắng, nhẵn, bóng đặc trưng cho nấm men

Glucose: 50g

KH2PO4: 3g

Pepton: 10g MgS04.7H20: 2g

Trà xanh PT10: 20g

b Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram

Nhuộm Gram là phương pháp nhuộm sử dụng hai hay nhiều loại thuốcnhuộm trên một tiêu bản nhằm quan sát và định loại tế nấm men dựa trên khảnăng hình thành trong tế bào họp chất bền vững của protit đặc biệt với thuốcnhuộm kiềm và iốt

Tiến hành: Lấy các khuẩn lạc trong các ống thạch nghiêng có khả năng lên

men kombucha làm vết bôi trên lam kính nhuộm tế bào theo phương pháp nhuộmGram Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu và kính hiển vi quang học OlympusCH-2 (độ phóng đại 1000 lần)

2.2.1.2 Phương pháp phân lập vỉ khuẩn và quan sát hình thái tể bào trên tiêu bản nhuộm Gram

a Phân lập vi khuẩn theo phương pháp Vinogradski

Để có được chủng vi khuẩn chúng tôi tiến hành phân lập từ nguồn nguyênliệu là kombucha Trước hết cần thực hiện quá trình lên men kombucha từ tràPT10 thu được mẫu màng lên men giấm tự nhiên

Cách làm: lấy dịch lên men kombucha lắc đều bằng máy vôntex trong 10phút thu được huyền phù vi sinh vật Pha loãng dịch huyền phù ở các nồng độkhác nhau từ 10'1 đến 10'8 Dùng pipet hút 50pl mẫu ở các độ pha loãng 10"3đến

108 nhỏ lên mặt môi trường thạch vô trùng trong hộp petri, dùng que trang trangđều Sau đó ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ thích hợp trong 2-3 ngày Dựa vào sự khácnhau của hình thái khuẩn lạc tiến hành tách một số khuẩn lạc đặc trưng ra khỏimôi trường phân lập, cấy thuần sau đó chuyển sang thạch nghiêng bảo quảntrong tủ 4°c [3], [4],

b Quan sát hình thái tế bào trên tiêu bản nhuộm Gram

Nhuộm Gram là phương pháp nhuộm sử dụng hai hay nhiều loại thuốcnhuộm trên một tiêu bản nhằm quan sát và định loại tế bào vi khuẩn dựa trên khảnăng hình thành trong tế bào hợp chất bền vững của protein đặc biệt với thuốcnhuộm kiềm và iốt

Để tiến hành phương pháp nhuộm Gram cần lấy mẫu từ các chủng đã qua

sơ tuyển làm tiêu bản Khi đó tùy vào màu của tiêu bản thu được giúp ta phânbiệt được vi khuẩn Gr' hay Gr+ Nếu sau khi nhuộm kép tế bào bắt màu hồng thì

đó là vi khuẩn Gr', bắt màu tím là vi khuẩn Gr+ Bản chất của hiện tượng bắt màukhác nhau này là do chất nguyên sinh của tế bào vi khuẩn Gr+ được cấu tạo từmột loại protein đặc biệt, chứa muối nucleatmagie có khả năng tạo với tímgeltian và lugol một loại phức chất bền, khó bị rửa trôi, khi quan sát tiêu bản trênkính hiển vi tế bào vi khuẩn Gr+ bắt màu tím geltian Vi khuẩn Gr' không có khảnăng giữ màu này nên dễ bị rửa trôi bởi cồn Chỉ khi nhỏ fucshin vi khuẩn Gr'mới bắt màu hồng của fucshin [3], [4], [5].Sau đó soi tiêu bản dưới vật kính dầu

và kính hiển vi quang học Olympus CH-2 (độ phóng đại 1000 lần)

2.2.1.3 Phương pháp xác định sổ lượng tể bào vi sinh vật

a Phương pháp đếm khuẩn lạc

Lấy lml dịch huyền phù có chứa nấm men, pha loãng theo phương

pháp pha loãng giới hạn rồi dùng micropipet hút 0,1 ml pha loãng rồi trang

đều trên môi trường thạch đĩa Nuôi ở 30°c sau 3 ngày đếm số khuẩn lạc

(CFU) trong môi trường đĩa petri, từ đó xác định số lượng tế bào nấm men

trong 1 ml dịch nuôi cấy ban đầu theo công thức

_ , 1000 1 100

10"

Trong đó: N- Tống so CFU trong 1 mỉ dịch nuôi cấy ban đầu.

A- Sổ CFU trung bình đếm được trên mỗi đĩa petri.

10 n - Độ pha loãng dịch nuôi cẩy[3], [4], [5].

b Phương pháp xác định tế bào bằng buồng đếm Goriaev

Đây là phương pháp đếm trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật có trongmẫu phân tích Pha loãng dịch huyền phú vsv đến 10 n, nhỏ một giọt dịch huyềnphù ở độ pha loãng (n) vào giữa khung đếm và đậy lá kính, di chuyển nhẹ khungđếm cho dịch chiếm đầy khoang Đếm số lượng tế bào theo các ô theo đường

chéo hoặc theo các góc ở trung tâm khung đếm Thường đếm 4 ô lớn ở 4 góc và

1 ô lớn ở trung tâm của khung đếm để tính số lượng tế bào trung bình của ô lớn.Sau đó dùng công thức sau để tính số tế bào trong lml lúc đầu:

N=A X 25: V : n

Trong đó: N - số lượng tế bào trong lml dịch huyền phù lúc đầu

A - số lượng tế bào trung bình trong 1 ô lớn V - thể

tích của 1 ô lớn n - độ pha loãng của mẫu ( 10' n )

25 là số ô lớn của toàn khung đếm [4]

2.2.1.4 Bảo quản chủng giống

Các khuẩn lạc sau khi phân lập và cấy chuyển sang môi trường giữ giốngtrong ống thạch nghiêng, nuôi 2 ngày ở tủ ấm 30°c Sau đó giữ trong tủ lạnh 4°c

dùng cho nghiên cứu tiếp theo, cấy chuyền giữ giống trên thạch nghiêng định kỳmỗi tháng một lần

2.2.2 Phương pháp hóa sinh

2.2.2.1 Phát hiện hoạt tính catalase

Nhỏ một giọt H202 3% lên bề mặt khuẩn lạc, nếu thấy hiện tượng sủi bọtkhí thì chủng vi khuẩn đó được coi là có hoạt tính catalase (catalase +) Ngượclại, chủng vi khuẩn đó không có hoạt tính catalase (catalase- ) [2], [5], [11],

2.2.2.2 Phát hiện khả năng oxy hoá rượu etylỉc thành acid

acetic Nuôi cấy chủng vi khuẩn trên môi trường có thành phần

(g/1):

Xanh Bromophenol (BPB) 0,04%: 20ml

Phân môi trường vào các ống nghiệm (4-5ml), để nguội khoảng 30°c cấy

vi khuẩn nghiên cứu mới hoạt hoá, nuôi 7 ngày trong điều kiện thích hợp Quansát thấy môi trường chuyển sang màu vàng là dương tính, không đổi màu là âmtính

Pha dung dịch BPB 0,04%: cân 0,1g BPB nghiền nhỏ trong cốc sứ, sau đó

bổ sung 14,9 ml NaOH 0,00IN hoà tan cho đều Đổ tất cả vào bình định mứcthêm nước cho đến khi thể tích đạt 250ml [5].

2.2.2.3 Phát hiện khả năng oxy hoá acid acetic

Sử dụng môi trường sau để thử khả năng oxy hoá acid acetic của vi khuẩntuyển chọn

Thành phần (g/1): Cao nấm men : 10g Canxi acetat: 10g

Thạch : 20g Nước máy: 1000ml

Quan sát hiện tượng nếu xung quanh khuẩn lạc có vòng phân giải canxi làphản ứng dương tính, ngược lại là âm tính [3], [4], [5]

2.2.2.4 Phát hiện khả năng chuyến hóa glycerol thành dihydroxyacetone

Để phát hiện khả năng hình thành dihydroxyacetone từ glycerol Chúngtôi tiến hành trên môi trường bao gồm thành phần sau:

2.2.2.5 Sinh trưởng trên môi trường

Hoyer Thành phần môi trường: (g/1)

lượng tế bào trên buồng đếm.

2.2.2 ố Xác định độ cồn

* Nguyên tắc

Độ cồn là số ml rượu etylic nguyên chất trong lOOml rượu thử, ở nhiệt độ

đúng 15°c Nếu rượu có tinh cặn ít hơn 0,5g/lít độ cồn có thể đo thẳng độ rượu

bằng rượu kế Nếu rượu có tinh cặn lớn hơn 0,5g/lít, phải cất lấy dung dịch cồn

và đo độ cồn trên dịch cất Độ cồn được quy định ở nhiệt độ 15°c, nếu đo ở nhiệt

Lấy chính xác 250ml rượu cần thử, tốt nhất là ở 15°c, nếu không, phải

đo nhiệt độ và ghi chép để sau này các thao tác đều làm ở cùng một nhiệt độ.Cho vào bình cầu của dụng cụ chưng cất và cất lấy ít nhất là khoảng 200ml Chú

ý đừng để cho cồn bay hơi ra bị mất, bằng cách cho đầu ống sinh hàn cắm vàotrong lOml nước cất và ống sinh hàn dài được làm lạnh bằng nước lạnh khôngquá 20° c Đe cho dịch cất trở lại nhiệt độ bằng nhiệt độ của rượu lúc đầu Chothêm nước cất cùng ở nhiệt độ ấy vào đủ 250ml Cho dịch cất vào ống đong vàtra bảng để đưa độ cồn thật về độ cồn chính xác ở 15°c.

2.2.2.7 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường, nitơ, dinh dưỡng

khoáng đến quá trình lên men kombucha

* Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn đường

Tiến hành thí nghiệm với các hàm lượng đường khác nhau ở môi trườnglên men (MT3), các chỉ tiêu khác vẫn giữ nguyên [12], [33], Theo dõi quá trìnhlên men và phân tích chỉ tiêu đánh giá: hàm lượng CO2 thoát ra (g/1000 ml),hàm lượng cồn trong dịch lên men sau 168h, sau đó chọn ra môi trường lên men

có hàm lượng đường tốt nhất để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.

* Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ

Tiến hành thí nghiệm với các hàm lượng ni tơ khác nhau ở môi trường lênmen (MT3), các chỉ tiêu khác vẫn giữ nguyên Nguồn nitơ sử dụng (NH4)2S04nguồn nitơ này được chọn ở mức 0,04-0,1%[12] Theo dõi quá trình lên men vàphân tích chỉ tiêu đánh giáhàm lượng trong dịch lên men sau 168h Sau đó lựachọn môi trường có hàm lượng (NH4)2S04 cho lên men kombucha tốt nhất và sửdụng cho các thí nghiệm tiếp theo

* Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn magie

Nguồn magie tôi sử dụng là MgS04.7H20, giống như ở môi trường cơ bản(MT3) nhưng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng củaMgS04.7H20đến quá trình lên men kombucha Tôi tiến hành thay đổi hàm lượngMgS04.7H20từ 0,03-0,09% [12] Các yếu tố còn lại của môi trường giữ nguyên.Theo dõi quá trình lên men và phân tích chỉ tiêu đánh giáhàm lượng cồn trongdịch lên men sau 168h Sau đó lựa chọn môi trường có hàm lượngMgS04.7H2Ocho lên men kombucha tốt nhất và sử dụng cho các thí nghiệm tiếptheo

* Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn photpho

Nguồn photpho tôi sử dụng là KH2P04, giống như ở môi trường cơ bản(MT3) nhưng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng của

KH2P04 đến quá trình lên men kombucha Tôi tiến hành thay đổi hàm lượng

KH2P04 từ 0,03-0,09% [12] Các yếu tố còn lại của môi trường giữ nguyên Theodõi quá trình lên men và phân tích chỉ tiêu đánh giáhàm lượng cồn trong dịch lênmen sau 168h Sau đó lựa chọn môi trường có hàm lượng KH2PO4 cho lên menkorabucha tốt nhất và sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo

2.22.8 Xác định hàm lượng chất khô hòa tan bằng phương pháp sẩy đến khối lượng không đổi

* Kết quả

Công thức tính độ acid:

0T VNaOH.lOO

10Trong đó: VNaOH: số ml dung dịch NaOH 0,1N cần thiết để trung hòa [45].

2.2.3 Phương pháp cảm quan

Sử dụng cơ quan cảm giác của con người để tìm hiểu mô tả và định lượng