NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN LÚA PHÂN LẬP TỪ ĐẤT TẠI HUYỆN THOẠI SƠN TỈNH AN GIANG

Các chất kháng sinh CKS được dùng để tiêu diệt nấm, vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng như bệnh đạo ôn, bệnh khô vằn, vàng lụi ở lá lúa, bệnh thối cổ rễ ở các cây có tác dụng nhanh, dễ phân

ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH AN GIANG TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG

ỦY BAN NHÂN DÂN TỈNH AN GIANG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG

ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP CƠ SỞ

NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM GÂY BỆNH ĐẠO ÔN

TRÊN LÚA PHÂN LẬP TỪ ĐẤT

TẠI HUYỆN THOẠI SƠN, TỈNH AN GIANG

CƠ QUAN CHỦ TRÌ CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI

Khưu Phương Yến Anh

CƠ QUAN CHỦ QUẢN

Đề tài nghiên cứu khoa học “Nghiên cứu xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa phân lập từ đất tại huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang” do tác giả Khưu Phương Yến Anh, công tác tại Khoa Sư phạm thực hiện

Tác giả đã báo cáo kết quả nghiên cứu và được Hội đồng Khoa học và Đào tạo trường Đại học An Giang thông qua ngày 18/08/2015

Nguyễn Thị Thanh Xuân Nguyễn Sĩ Lâm

TÓM TẮT

Bệnh đạo ôn (rice blast disease) là bệnh gây hại quan trọng nhất trên cây lúa,

tác nhân gây bệnh là nấm Pyricularia oryzae Cav Đề tài được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn được hai chủng xạ khuẩn có hoạt tính đối kháng nấm Pyricularia

oryzae gây bệnh đạo ôn hại lúa Kết quả đã phân lập được 80 chủng xạ khuẩn khác

nhau từ đất ở các ruộng lúa thuộc 6 xã huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang Trong đó,

có 21 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm đạo ôn, chiếm tỉ lệ 26,25% Đánh

giá khả năng đối kháng bằng phương pháp khoan lỗ thạch với 4 lần lặp lại cho thấy

2 chủng xạ khuẩn có khả năng kháng nấm P.oryzae mạnh nhất là ĐMB-40 (17,88

mm) và VKB-09 (14,69 mm) Chủng xạ khuẩn ĐMB-40 được phân loại là loài Streptomyces recifensis, VKB-09 thuộc loài Streptomyces laurentii Hai chủng xạ

khuẩn đều sinh enzym cellulase và chitinase Kết quả thử nghiệm trên lúa trong nhà lưới, cả 2 chủng xạ khuẩn ĐMB-40 và VKB-09 đều có khả năng đối kháng bệnh đạo

ôn lá và đạo ôn cổ bông qua 2 lần phun vào 25 NSS và 65 NSS

CAM KẾT KẾT QUẢ

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các số liệu trong công trình nghiên cứu này có xuất xứ rõ ràng Những kết luận mới về khoa học của công trình nghiên cứu này chưa được công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Long Xuyên, ngày 03 tháng 09 năm 2015

Người thực hiện

Khưu Phương Yến Anh

MỤC LỤC

Trang Trang phụ bìa

Chấp nhận của hội đồng i

Tóm tắt ii

Cam kết kết quả iii

Mục lục iv

Dang sách bảng vi

Danh sách hình vii

Danh mục các từ viết tắt viii

CHƯƠNG 1 – GIỚI THIỆU 1

1.1 Tính cần thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Đối tượng nghiên cứu 2

1.4 Nội dung nghiên cứu 2

1.5 Những đóng góp của đề tài 2

CHƯƠNG 2 – TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 4

2.1 Sơ lược về xạ khuẩn 4

2.1.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn 4

2.1.2 Đặc điểm sinh lý- sinh hóa của xạ khuẩn 6

2.1.3 Đặc điểm phân loại xạ khuẩn 7

2.1.4 Vai trò của xạ khuẩn 7

2.2 Bệnh đạo ôn trên lúa 8

2.2.1 Triệu chứng bệnh đạo ôn trên lúa 8

2.2.2 Nguyên nhân gây bệnh đạo ôn trên lúa 10

2.2.3 Cơ chế phát sinh và phát triển bệnh đạo ôn lúa 10

2.2.4 Biện pháp phòng trị bệnh đạo ôn lúa 12

2.3 Khả năng đối kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa của xạ khuẩn 13

2.3.1 Sự hình thành khả năng đối kháng của xạ khuẩn 13

2.3.2 Cơ chế tác động của xạ khuẩn đối kháng nấm gây bệnh cây trồng 13

2.3.3 Tình hình nghiên cứu chất đối kháng từ xạ khuẩn 15

CHƯƠNG 3 – PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18

3.1 Vật liệu 18

3.2 Phương pháp nghiên cứu 20

3.2.1 Phương pháp thu mẫu đất 20

3.2.2 Phương pháp phân lập xạ khuẩn theo Vinogradski 21

3.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính đối kháng nấm Pyricularia oryzae của xạ khuẩn 22

3.2.4 Phương pháp xác định hoạt tính enzym của xạ khuẩn bằng cách đo đường kính vòng thuỷ phân 23

3.2.5 Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái và định danh xạ khuẩn 24

3.2.6 Thử nghiệm khả năng đối kháng nấm P oryzae gây bệnh đạo ôn trên lúa từ dịch nuôi xạ khuẩn 24

3.2.7 Xử lý thống kê 27

CHƯƠNG 4 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

4.1 Phân lập, tuyển chọn các chủng có khả năng đối kháng nấm Pyricularia oryzae 28

4.2 Kết quả nghiên cứu đặc điểm hình thái và phân loại 2 chủng xạ khuẩn 29

4.3 Khả năng sinh enzym của 2 chủng xạ khuẩn 35

4.4 Kết quả khả năng đối kháng nấm P oryzae trên lúa từ dịch nuôi xạ khuẩn 37

4.4.1 Kết quả hoạt tính đối kháng của dịch nuôi xạ khuẩn ở các nồng độ khác nhau 37

4.4.2 Kết quả đánh giá khả năng kháng bệnh đạo ôn trên lúa của dịch nuôi xạ khuẩn trong nhà lưới 38

CHƯƠNG 5 – KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 43

5.1 Kết luận 43

5.2 Hạn chế 43

5.3 Khuyến nghị 43

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

PHỤ LỤC 46

DANH SÁCH BẢNG

Trang

Bảng 1: Kết quả vòng đối kháng nấm Pyricularia oryzae của 21 chủng xạ khuẩn 29

Bảng 2: Đặc điểm hình thái và phân loại 2 chủng xạ khuẩn 30 Bảng 3: Kết quả Search Blast trình tự gen 16s rRNA của chủng ĐMB-40

trên GenBank 33 Bảng 4: Kết quả Search Blast trình tự gen 16s rRNA của chủng VKB-09

trên GenBank 34 Bảng 5: Hoạt tính enzym cellulase và chitinase của 2 chủng XK (D-d; mm) 35

Bảng 6: Vòng đối kháng nấm P.oryzae của dịch nuôi XK ở các

nồng độ khác nhau (D-d; mm) 38 Bảng 7: Tỉ lệ diện tích bệnh trên lá 30, 40, 50 và 60 NSS (%) 39 Bảng 8: Tỉ lệ giảm bệnh trên lá vào 30, 40, 50 và 60 NSS (%) 40 Bảng 9: Tỉ lệ bệnh thối cổ bông và tỉ lệ giảm bệnh thối cổ bông vào 85 NSS (%) 41

DANH SÁCH HÌNH

Trang

Hình 1: Các kiểu hệ sợi của xạ khuẩn 5

Hình 2: Khuẩn lạc xạ khuẩn 5

Hình 3: Các dạng chuỗi sinh bào tử của xạ khuẩn 6

Hình 4: Bào tử của xạ khuẩn 6

Hình 5: Dấu hiệu bệnh đạo ôn ở lúa 9

Hình 6: Vùng bị thiệt hại năng suất lúa do nhiễm đạo ôn 9

Hình 7: Cành sinh bào tử và bào tử nấm Pyricularia oryzae 10

Hình 8: Chu kỳ phát triển của nấm đạo ôn 11

Hình 9: Cơ chế đối kháng nấm (A) và cấu trúc (B) của Kasugamycin 14

Hình 10: Cơ chế tác động (A) và cấu trúc (B) của Validamycin lên Rhizoctonia solani 15

Hình 11: Vị trí lấy mẫu ở các xã thuộc huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang 21

Hình 12: Vòng đối kháng P.oryzae của xạ khuẩn ĐMB-40 và VKB-09 28

Hình 13: Mặt trước và sau khuẩn lạc của xạ khuẩn ĐMB-40 31

Hình 14: Cuống sinh bào tử và bào tử xạ khuẩn ĐMB-40 (40X) 31

Hình 15: Mặt trước và sau khuẩn lạc của xạ khuẩn VKB-09 31

Hình 16: Cuống sinh bào tử và bào tử xạ khuẩn VKB-09 (40X) 31

Hình 17: Vòng hoạt tính enzym cellulase của xạ khuẩn ĐMB-40 và VKB-09 37

Hình 18: Vòng hoạt tính enzym chitinase của xạ khuẩn ĐMB-40 và VKB-09 37

Hình 19: Dịch nuôi xạ khuẩn 7 ngày 67

Hình 20: Xuất hiện bệnh sau 20NSS 67

Hình 21: Nghiệm thức NT1 50NSS 68

Hình 22: Nghiệm thức NT2 50NSS 68

Hình 23: NT3 50NSS 68

Hình 24: NT4 50NSS 68

Hình 25: NT5 50NSS 68

Hình 26: Vết bệnh cấp 5 ở NT1 69

Hình 27: Đạo ôn cổ lá (trái) và cổ bông (phải) ở nghiệm thức NT1 69

Hình 28: Đạo ôn cổ gié và cổ bông ở nghiệm thức NT1 (ĐC-) 69

Hình 29: Bào tử và khuẩn lạc nấm đạo ôn P.oryzae 69

Hình 30: Khuẩn lạc một số chủng xạ khuẩn 71

Hình 31: Thu mẫu tại ruộng xã Định Mỹ 71

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Chất kháng sinh : CKS Đồng bằng sông Cửu Long : ĐBSCL Kính hiển vi : KHV Ngày sau khi sạ : NSS Nghiệm thức : NT

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU

1.1 TÍNH CẦN THIẾT CỦA ĐỀ TÀI

Cây lúa là một trong các cây lương thực chính ở Việt Nam cũng như trên thế giới Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) là vựa lúa lớn nhất, trong đó An Giang

có diện tích nông nghiệp chủ yếu là trồng lúa Bệnh đạo ôn (rice blast disease) là bệnh gây hại quan trọng nhất trên cây lúa, còn được gọi là bệnh cháy lá lúa Khi dịch đạo ôn xảy ra thiệt hại đến năng suất và sản lượng làm ảnh hưởng đến kinh tế Tác

nhân gây bệnh là nấm Pyricularia oryzae Cav Bệnh có thể tấn công mọi giai đoạn

của cây lúa, bắt đầu từ giai đoạn sau khi gieo sạ cho đến trước trổ gọi là bệnh cháy

lá, gây hại trên cổ lá gọi là thối cổ lá, gây hại trên cổ bông gọi là thối cổ bông làm lép hạt, đôi khi bệnh có thể gây lem vỏ hạt lúa Bệnh nặng sẽ làm mất trắng năng suất nếu không phát hiện sớm và phòng trị kịp thời

(http://www.haiduongdost.gov.vn/index.php?option=com_content&view=article&catid=303:khoa-hc-va-cong-ngh&id=2049)

Hằng năm thường có 2 thời điểm xuất hiện bệnh nhiều nhất là vào tháng 11 –

12 và tháng 5 – 6 dương lịch, dịch bệnh đạo ôn gây thiệt hại về năng suất ảnh hưởng

rất lớn đến nền kinh tế của tỉnh nhà và đời sống của nông dân Bệnh bộc phát mạnh

trên lúa từ 20 – 30 ngày tuổi Các vùng lúa có diện tích bị nhiễm bệnh cao là huyện

Thoại Sơn và Châu Thành Bệnh phát sinh nhiều trên các ruộng trồng giống lúa OM4218 và IR50404 (http://www.ciheam.org/)

Ở Việt Nam, thời tiết khí hậu nóng ẩm rất thuận lợi cho bệnh đạo ôn trên lúa phát triển Vụ lúa hè thu 2012, ĐBSCL đã có hơn 70.000 hecta lúa bị bệnh đạo ôn Tại nhiều nơi, nông dân phải phá bỏ, gieo sạ lại hàng trăm hecta lúa do bị nhiễm bệnh trên 25% Trong vụ đông xuân 2012 – 2013, theo nhận định của Cục Bảo vệ Thực Vật, bệnh đạo ôn lá và bệnh đạo ôn cổ bông tiếp tục phát sinh phát triển, có một số diện tích bị nhiễm bệnh đạo ôn lá với tỷ lệ cao trên 20% trên những chân ruộng sạ dày, bón thừa phân đạm, gieo trồng giống nhiễm Theo Trung tâm Bảo vệ Thực vật phía Nam, vào thời điểm cuối tháng 1 năm 2013 toàn khu vực phía Nam có 56.818 hecta lúa bị nhiễm bệnh bệnh đạo ôn lá và 4.675 hecta nhiễm bệnh đạo ôn cổ bông với tỷ lệ bệnh 5% – 15%

(http://www.hoptri.com/vi/quy-trinh-giai-phap/item/178-bien-phap-phong-tru-benh

dao-on-hai-lua) Hiện nay, biện pháp phòng trừ bệnh đạo ôn phổ biến là dùng thuốc hóa học Tuy nhiên, thuốc hóa học là tác nhân gây ô nhiễm môi trường và ảnh hưởng sức khoẻ con người Do đó, việc hạn chế khả năng phát tán và gây bệnh của nấm

Pyricularia oryzae dựa vào khả năng đối kháng của các vi sinh vật (VSV) như vi

khuẩn, nấm, xạ khuẩn (XK) nhằm đưa ra phương pháp tối ưu phòng trừ bệnh đạo ôn lúa bằng chế phẩm VSV là công việc cấp bách của các nhà khoa học

Sử dụng xạ khuẩn có hoạt tính đối kháng nấm, vi khuẩn gây bệnh trong bảo

vệ thực vật là quan điểm chiến lược trong bảo vệ cây trồng Xạ khuẩn là VSV sống hoại sinh, hầu hết các loài không gây bệnh cho người, động vật và cây trồng Vì vậy, việc tìm kiếm các chủng XK có hoạt tính đối kháng cao và tạo chế phẩm kháng sinh kháng nấm áp dụng vào công tác bảo vệ thực vật có tầm quan trọng đặc biệt Các chất kháng sinh (CKS) được dùng để tiêu diệt nấm, vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng như bệnh đạo ôn, bệnh khô vằn, vàng lụi ở lá lúa, bệnh thối cổ rễ ở các cây có tác dụng nhanh, dễ phân hủy, có tính đặc hiệu cao, chỉ tiêu diệt một hoặc một số sâu bệnh nhất định mà không ảnh hưởng đến các loài có ích khác và đặc biệt còn có khả năng ức chế các vi sinh vật đã kháng thuốc hóa học, làm chất kích thích tăng trưởng

ở một số nồng độ nhất định như kích thích khả năng nảy mầm của hạt CKS thường

ở dạng bột hoặc dung dịch có bổ sung các chất độn để làm tăng độ bền, có thể trộn lẫn vào đất, phun trực tiếp lên thực vật, dùng xử lý hạt giống để tiêu diệt mầm bệnh bên trong và ngoài hạt (Lương Đức Phẩm, 2011)

Do đó, đề tài “Nghiên cứu xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa phân lập từ đất tại huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang” được

thực hiện nhằm góp phần vào xu hướng tiến tới một nền nông nghiệp sạch và bền vững hiện nay

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Phân lập và tuyển chọn được 2 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm

Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn trên cây lúa, nhằm ứng dụng trong phòng trừ

bệnh đạo ôn lúa

1.3 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

Xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa được phân lập từ các

mẫu đất ruộng tại huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang

1.4 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

 Phân lập xạ khuẩn từ các mẫu đất ruộng tại huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang

 Tuyển chọn 2 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng mạnh với nấm Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn trên lúa

 Xác định đặc điểm hình thái, khả năng sinh enzym và định danh đến loài 2 chủng

xạ khuẩn đã được lựa chọn

 Bước đầu thử nghiệm khả năng đối kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa từ dịch nuôi xạ khuẩn đã tuyển chọn trong nhà lưới

1.5 NHỮNG ĐÓNG GÓP CỦA ĐỀ TÀI

 Đối với lĩnh vực khoa học và công nghệ có liên quan

Bồi dưỡng, đào tạo cán bộ khoa học, tăng cường kiến thức về kỹ thuật, công nghệ Thông qua đề tài nghiên cứu góp phần tạo điều kiện cho sinh viên ngành Sư phạm

Sinh, Công nghệ Sinh học tham gia nghiên cứu, thực hiện chuyên môn yêu thích

 Đối với tổ chức chủ trì và các cơ sở ứng dụng kết quả nghiên cứu

- Bổ sung vào bảo tàng giống VSV các chủng xạ khuẩn có khả năng ứng dụng cao trong thực tiễn của tỉnh An Giang

- Các chủng xạ khuẩn phân lập được làm cơ sở khoa học cho nghiên cứu và giảng dạy trong trường đại học

 Đối với kinh tế - xã hội và môi trường

- Các chủng xạ khuẩn phân lập được ứng dụng sản xuất chế phẩm đối kháng có

nguồn gốc từ vi sinh vật có khả năng chống nấm gây bệnh đạo ôn lúa giúp nông dân

có thể giảm bớt chi phí sản xuất, tăng năng suất cây trồng, làm giàu dinh dưỡng cho đất

- Có thể giảm bớt lượng chi phí nhập khẩu các loại kháng sinh có giá thành rất cao Góp phần phát triển kinh tế cho nông dân, giảm bớt lượng thuốc hóa học ảnh hưởng sức khỏe con người, làm đất chai sạn và môi trường bị ô nhiễm

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

2.1 SƠ LƯỢC VỀ XẠ KHUẨN

2.1.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetes) là một nhóm vi khuẩn thật (Bacteria) phân bố rất

rộng rãi trong tự nhiên Phần lớn xạ khuẩn là các tế bào Gram (+), hiếu khí, hoại sinh, có cấu tạo dạng sợi, phân nhánh (khuẩn ty) (Nguyễn Lân Dũng, 2012)

Xạ khuẩn có trong đất, nước, rác, phân chuồng, bùn, thậm chí cả trong cơ chất mà vi khuẩn và nấm mốc không phát triển được Sự phân bố của xạ khuẩn phụ thuộc vào khí hậu, thành phần đất, mức độ canh tác và thảm thực vật Trong mỗi g đất thường có trên 1 triệu xạ khuẩn (tính theo số khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch) (Bùi Thị Hà, 2008)

Xạ khuẩn có cấu trúc tế bào tương tự như vi khuẩn Gram (+), toàn bộ cơ thể chỉ là một tế bào bao gồm các thành phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân và các thể ẩn nhập

Thành tế bào của XK có kết cấu dạng lưới, dày 10 – 20 nm có tác dụng duy trì hình dạng của khuẩn ty, bảo vệ tế bào và chủ yếu cấu tạo từ các lớp glucopeptide bao gồm các gốc N – axetyl glucozamin liên kết với N – axetyl muramic bởi các liên kết 1,4 – β glucozit, gồm 3 lớp: lớp ngoài cùng dày khoảng 60 – 120 Å, lớp giữa rắn chắc dày khoảng 50 Å, lớp trong dày khoảng 50 Å Thành tế bào XK không chứa cellulose và chitin nhưng chứa nhiều enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào

Dưới lớp thành tế bào là màng sinh chất dày khoảng 50 nm được cấu tạo chủ yếu bởi 2 thành phần là photpholipit và protein Chúng có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình trao đổi chất và quá trình hình thành bào tử của XK Tế bào chất của

XK có chứa mezoxom, thể nhân, và các vật thể ẩn nhập gồm các hạt poliphotphat và polisacarit Nhân của tế bào XK không có cấu trúc điển hình, chỉ là những nhiễm sắc thể không có màng Khi còn non, toàn bộ tế bào chỉ có 1 nhiễm sắc thể sau đó hình thành nhiều hạt rải rác trong toàn bộ hệ khuẩn ty

(Nguyễn Lân Dũng, 2012)

Đa số XK có cấu tạo dạng sợi, các sợi kết với nhau tạo thành khuẩn lạc có nhiều màu sắc khác nhau: trắng, vàng, nâu, tím, xám Màu sắc của XK là một đặc

điểm phân loại quan trọng Đường kính sợi của XK khoảng từ 0,1 – 0,5 μm Có thể

phân biệt được hai loại sợi khác nhau Sợi khí sinh là hệ sợi mọc trên bề mặt môi trường tạo thành bề mặt của khuẩn lạc XK, từ đây phát sinh ra bào tử Sợi cơ chất là sợi cắm sâu vào môi trường làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng Sợi cơ chất sinh

ra sắc tố thấm vào môi trường, sắc tố này thường có màu khác với màu của sợi khí sinh Đây cũng là một đặc điểm phân loại quan trọng Một số XK không có sợi khí sinh mà chỉ có sợi cơ chất, loại sợi này làm cho bề mặt xạ khuẩn nhẵn và khó tách ra

khi cấy truyền Loại chỉ có sợi khí sinh thì ngược lại, rất dễ tách toàn bộ khuẩn lạc khỏi môi trường (hình 1) (http://voer.edu.vn/m/xa-khuan-actinomycetes)

Hình 1 Các kiểu hệ sợi của xạ khuẩn ( Nguyễn Lân Dũng, 2012)

Khuẩn lạc XK thường có cấu tạo 3 lớp: lớp vỏ ngoài có dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong Khuẩn lạc XK thường rắn chắc, xù xì, có thể có dạng da, dạng phấn, dạng nhung, dạng vôi phụ thuộc vào kích thước bào tử Trường hợp không có sợi khí sinh khuẩn lạc có dạng màng dẻo Kích thước khuẩn lạc thay đổi tùy loài XK và tùy điều kiện nuôi cấy Khuẩn lạc thường

có dạng phóng xạ, một số có dạng những vòng tròn đồng tâm cách nhau một khoảng nhất định Nguyên nhân của hiện tượng vòng tròn đồng tâm là do XK sinh ra chất ức chế sinh trưởng, khi sợi mọc qua vùng này chúng sinh trưởng yếu đi, qua được vùng

có chất ức chế chúng lại sinh trưởng mạnh thành vòng tiếp theo, vòng này lại sinh ra chất ức chế sinh trưởng sát với nó khiến khuẩn ty lại phát triển yếu đi Cứ thế tạo thành khuẩn lạc có dạng các vòng tròn đồng tâm (hình 2)

Hình 2 Khuẩn lạc xạ khuẩn ( Nguyễn Lân Dũng, 2012)

Bào tử XK được hình thành trên các nhánh phân hóa của khuẩn ty khí sinh gọi là cuống sinh bào tử Đó là cơ quan sinh sản đặc trưng cho XK, có nhiều dạng khác nhau: thẳng, lượn sóng, xoắn, mọc đơn, mọc vòng … (hình 3) Trên mỗi cuống

sinh bào tử mang từ 30 – 100 bào tử, đôi khi có thể mang tới 200 bào tử, nhưng cũng có khi chỉ mang 1 – 2 bào tử Sự hình thành bào tử ở XK có thể xảy ra do sự

kết đoạn hoặc do sự cắt khúc của cuống sinh bào tử Bào tử XK có nhiều hình dạng khác nhau, thường có hình trụ, ovan, hình cầu, hình que với kích thước trung bình

khoảng (0,7 – 0,9 × 0,7 – 1,9) µm Kích thước của bào tử thay đổi khác nhau tùy

loài, tùy cá thể trong loài thậm chí ngay trên cùng một chuỗi bào tử Bề mặt bào tử

XK có thể nhẵn, có gai, khối u, nếp nhăn hay dạng tóc (hình 4) Bào tử XK được

bao bọc bởi màng mucopolysaccharide giàu protein với độ dày khoảng 300 – 400 Å,

gồm có 3 lớp, giúp cho bào tử tránh được những ảnh hưởng bất lợi của ngoại cảnh như: nhiệt độ, độ ẩm, pH… Hình dạng, kích thước của chuỗi bào tử và cấu trúc màng có thể thay đổi khi nuôi cấy trên những môi trường có nguồn nitơ khác nhau

(Nguyễn Lân Dũng, 2012)

Hình 3 Các dạng chuỗi sinh bào tử của xạ khuẩn

(Chuỗi bào tử xạ khuẩn chi Streptomyces: A, B, C, D; chi Nocadiopis: E)

Xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật dị dưỡng, chúng sử dụng đường, rượu, axit hữu cơ, lipit, protein và nhiều hợp chất hữu cơ khác để làm nguồn cacbon, muối nitrat, muối amôn, urê, amino axit, pepton để làm nguồn nitơ Tuy nhiên, khả năng hấp thụ các chất này không giống nhau ở các loài hay các chủng khác nhau Phần lớn XK là nhóm VSV hiếu khí, ưa ẩm, một số ít ưa nhiệt, nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng là 25 – 30 0

C Tuy nhiên, nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp CKS thường chỉ nằm trong khoảng 18 – 28 0C Độ ẩm thích hợp đối với XK dao động trong khoảng 40 – 50%, giới hạn pH trong khoảng 6,8 - 7,5 XK không có giới tính (Bùi Thị Hà, 2008)

C

B

A

XK có khả năng hình thành enzym, vitamin, chất kích thích sinh trưởng và các CKS nên được ứng dụng vào trong nhiều lĩnh vực của đời sống Các sản phẩm trong quá trình trao đổi chất như CKS, độc tố, enzym… có thể được tích lũy trong sinh khối tế bào XK hay được tiết ra môi trường lên men Hệ sợi cơ chất có thể tiết vào môi trường các loại sắc tố, thường có màu xanh, tím, hồng, nâu, đen… có sắc tố chỉ tan trong nước, có sắc tố chỉ tan trong dung môi hữu cơ (Nguyễn Hoàng Minh Huy, 2006)

2.1.3 Đặc điểm phân loại xạ khuẩn

Phân loại theo phương pháp truyền thống: Cũng như đối với vi khuẩn, việc

phân loại XK hiện nay chủ yếu dựa vào phân tích trình tự gen mã hóa cho 16S rRNA Bên cạnh đó, các đặc điểm về hóa phân loại, hình thái, các đặc điểm sinh lý, sinh hóa thường được kết hợp để định danh XK một cách chính xác đến tên loài.Trong các đặc điểm hóa phân loại, thành phần hóa học của thành tế bào được coi là đặc điểm quan trọng nhất Các đặc điểm khác như thành phần đường, menaquinone, photpholipit, axit béo của tế bào và tỷ lệ GC trong ADN genom cũng mang tính đặc trưng cho loài và có ý nghĩa quan trọng trong phân loại XK Các đặc điểm sinh lý, sinh hoá thường được kết hợp sử dụng trong phân loại xạ khuẩn là khả năng đồng hoá các nguồn cacbon và nitơ, nhu cầu các chất kích thích sinh trưởng, khả năng phân hủy các chất khác nhau nhờ hệ thống enzym Bên cạnh đó, các chỉ tiêu khác như mối quan hệ với pH, nhiệt độ, khả năng chịu muối và các yếu tố khác của môi trường, mối quan hệ với chất kìm hãm sinh trưởng và phát triển khác nhau, tính chất đối kháng và nhạy cảm với CKS, khả năng tạo thành CKS và các sản phẩm trao đổi chất đặc trưng khác của XK cũng được tiến hành phân tích đồng thời

(Nguyễn Lân Dũng, 2012)

Phân loại theo phương pháp hiện đại: Các nhà khoa học trên thế giới đều

cho rằng mức độ tương đồng về trình tự rRNA phản ánh mối quan hệ tiến hóa giữa các cá thể VSV Tất cả các loài VSV trong sinh giới đều sử dụng cùng một cách tổng hợp protein nhờ các riboxom Vì vậy người ta đã tiến hành so sánh trình tự nucleotit của gen mã hoá rRNA ở các VSV khác nhau để xác định mối quan hệ giữa chúng rRNA là phân tử lý tưởng cho các nghiên cứu về tiến hoá của VSV vì: Phân

tử này có mặt trong mọi tế bào VSV Thực hiện cùng một chức năng là cấu thành nên riboxom, bộ máy tổng hợp protein của tế bào Có kích thước vừa phải (1500 bp)

để tiến hành các nghiên cứu phả hệ Là một trong những cao phân tử xuất hiện sớm nhất trong lịch sử tiến hóa Cấu trúc của rRNA thay đổi rất chậm theo thời gian, hay nói cách khác các gen mã hoá cho chúng được bảo tồn rất tốt trong quá trình tiến hoá Mặc dù mang tính bảo thủ cao, các gen mã hóa cho rRNA cũng chứa những vùng có mức độ bảo thủ thấp hơn, dễ có sự sai khác giữa các loài sinh vật khác nhau Dựa vào những vùng bảo thủ trong gen mã hoá cho rRNA, các nhà khoa học

đã thiết kế các cặp mồi vạn năng để có thể khuếch đại toàn bộ chiều dài của gen, bao gồm cả các vùng biến đổi So sánh sự khác biệt giữa các vùng này, người ta có thể chỉ ra được những sự khác biệt giữa các loài gần gũi (Nguyễn Lân Dũng, 2012)

2.1.4 Vai trò của xạ khuẩn

Xạ khuẩn là nhóm VSV phân bố rộng rãi trong đất, chúng tham gia vào các quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ trong đất như cellulose, tinh bột v.v góp phần khép kín vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên Đặc tính này còn được ứng dụng trong quá trình chế biến phân hủy rác v.v Nhiều XK có khả năng sinh chất kháng sinh Đặc điểm này được sử dụng trong nghiên cứu sản xuất các CKS dùng trong y học, nông nghiệp và bảo quản thực phẩm (http://voer.edu.vn/m/xa-khuan actinomycetes)

Xạ khuẩn có vai trò chống nấm gây hại cây trồng: Từ lâu các nhà khoa học

đã nghiên cứu tuyển chọn các chủng XK có khả năng ức chế nấm bệnh thực vật Theo Kamada (1974), khi điều tra VSV đối kháng trong đất ở Nhật Bản cho thấy nơi

nào có nhiều XK thì ở đó các loài Fusarium biến mất nhanh Thông thường một loài

xạ khuẩn đối kháng (XKĐK) có thể ức chế nhiều loài nấm gây bệnh và được sử dụng như tác nhân chống bệnh cây bằng biện pháp sinh học Tuy nhiên khi sử dụng các chủng có hoạt phổ rộng phải chú ý tránh XK ức chế luôn cả khu hệ sinh vật có lợi trong vùng rễ Không phải tất cả XK có hoạt tính kháng nấm in vitro đều thể hiện trong đất (khoảng 4% – 5%) nhưng chúng có vai trò quan trọng trong việc ức chế nấm gây bệnh và ngăn ngừa khả năng nhiễm bệnh cho cây Đây là quy luật cân bằng sinh học trong tự nhiên Nếu sự cân bằng mất đi, lập tức sẽ nảy sinh ra bệnh khi trong đất có mầm gây bệnh

Xạ khuẩn ngoài việc chống nấm bằng cách tiết chất đối kháng còn sinh enzym tác động lên hệ VSV như enzym chitinase tác động lên thành tế bào nấm mốc, các enzym phân giải hợp chất hữu cơ khó tan như cellulase giúp phân giải cellulose tạo thành phân bón hữu cơ cho cây trồng Dùng để sản xuất nhiều enzym như protease, amylase, cellulase, chitinase… một số axit amin và axit hữu cơ Ngoài ra, nhiều loài XK còn sinh ra các chất kích thích sinh trưởng đối với thực vật cũng như các loài VSV có lợi cho đất

Một số chủng XK vừa kháng được các nấm gây bệnh vừa giết được tuyến trùng hại cây trồng XK còn tham gia tích cực vào các quá trình chuyển hoá nhiều hợp chất trong đất, nước Một số XK có thể gây bệnh cho người, động vật

(Lương Đức Phẩm, 2011)

2.2 BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN LÚA

2.2.1 Triệu chứng bệnh đạo ôn trên lúa

Bệnh đạo ôn (cháy lá) có thể phát sinh ở hầu hết các giai đoạn sinh trưởng của lúa và có thể gây hại ở cổ lá, lá, lóng thân, cổ bông, gié và hạt

- Trên lá: Bệnh gây hại chủ yếu giai đoạn mạ – đẻ nhánh Lúc đầu vết bệnh chỉ là những chấm nhỏ, màu xanh xám, sau lớn lên có dạng hình thoi (mắt én) đặc trưng, viền nâu, tâm màu xám trắng Trên các giống nhiễm đốm bệnh rất to, ngược lại giống kháng thì vết bệnh chỉ cở bằng đầu kim Bệnh nặng, các vết bệnh liên kết lại làm lá bị cháy khô

- Trên cổ lá, thân và cổ bông: triệu chứng ban đầu cũng có màu xám xanh sau chuyển sang nâu, do nấm tấn công vào mạch dẫn gây cản trở việc vận chuyển các chất dinh dưởng nuôi lá, thân và hạt làm cho lá, thân dễ gãy, hạt bị lép, lửng

- Trên hạt: bệnh xảy ra vào giai đoạn trổ, vết bệnh trên hạt cũng có dạng mắt én, viền nâu, tâm xám trắng Nếu bệnh tấn công sớm sẽ làm hạt bị lép, lửng Nếu ẩm độ không khí cao, chỗ vết bệnh sẽ mọc một lớp nấm mốc màu xám xanh, dễ bị gãy, làm ruộng lúa trở nên xơ xác (hình 5) Lúa sẽ bị cháy rụi hoàn toàn nếu bị nhiễm bệnh sớm ở giai đoạn đẻ nhánh, nhất là khi gặp điều kiện thời tiết thuận lợi cho bệnh và bón phân không hợp lý (Nguyễn Phú Dũng, 2005)

Vết bệnh mới và sau trên lá; Bệnh hại trên đốt thân, cổ bông; Ruộng lúa bệnh nặng

Hình 5 Dấu hiệu bệnh đạo ôn ở lúa

Nguồn: http://www.thaibinhseed.com.vn/cach-phong-tri-benh-dao-on-hai-lua

Ở Nhật Bản, từ năm 1953 – 1960, thất thu sản lượng lúa do bệnh cháy lá hằng năm trung bình là 2,98% Riêng trong năm 1960, thất thu do bệnh cháy lá chiếm 24,8% trong tổng thiệt hại Đối với bệnh thối cổ gié, nếu vượt 10% gié bị nhiễm bệnh sẽ thất thu năng suất 6% và 5% hạt sẽ có phẩm chất kém Theo ước tính của FAO thiệt hại do bệnh này gây ra làm giảm năng suất lúa trung bình từ 0,7% – 17,5%, những nơi thiệt hại nặng có thể làm giảm đến 80% (hình 6)

Hình 6 Vùng bị thiệt hại năng suất lúa do nhiễm đạo ôn (Chấm đỏ cho thấy

các quốc gia hoặc khu vực nơi bệnh đạo ôn đã được báo cáo)

Nguồn: internet

Ở Việt Nam, theo thống kê của viện Bảo vệ thực vật trên toàn quốc thiệt hại

do nấm bệnh đạo ôn gây ra đối với cây lúa hàng năm mất khoảng 10% – 25% Ở các

tính phía Nam, diện tích nhiễm đạo ôn trên lá là 16.773 hecta, trong đó diện tích nhiễm nặng là 10 hecta Bệnh đạo ôn hại cổ bông nhiễm 5.847 hecta (Bộ NN và PTNT, 2014)

2.2.2 Nguyên nhân gây bệnh đạo ôn trên lúa

Tác nhân gây hại là nấm Pyricularia oryzae thuộc họ Moniliales, lớp nấm

Bất Toàn Abe (1911) và Kinishi (1933) cho rằng nấm đạo ôn sinh trưởng thích hợp

ở nhiệt độ 25 – 28 0C và ẩm độ không khí là 93% trở lên Bào tử của nấm rất nhỏ, có

thể phát tán và bay cao đến 24 m, thậm chí đến 10.000 m dễ lây lan cho các ruộng lân cận trong khu vực Nấm phát triển tốt trong điều kiện mát từ 24 – 28 0C, ẩm độ cao >80%, biên độ nhiệt giữa ngày và đêm cao sẽ dễ phát sinh thành dịch Bào tử nấm nảy mầm khi gặp lớp nước tự do trên lá hay không khí bão hòa nước, ở 24 0

C bào tử cần 6 giờ, vượt quá 28 0C bào tử phát triển kém Bào tử xâm nhập vào tế bào

lá bằng cách mọc thành đĩa áp, chọc thủng vách tế bào lá lúa Ngoài ra, bào tử còn tiết ra độc tố pyricularin gây độc cho cây Cây lúa là ký chủ chính, bệnh có thể lưu tồn trên các cây ký chủ phụ mọc quanh ruộng như các loài cỏ lồng vực, đuôi phụng,

cỏ chỉ, lúa ma, lúa chét (Lương Đức Phẩm, 2011)

Quan sát trên kính hiển vi cho thấy cành bào tử phân sinh hình trụ, đa bào,

đầu cành thon và hơi gấp khúc Nấm thường sinh ra các cụm cành từ 3 – 5 chiếc Bào tử có hình quả lê hoặc hình nụ sen, thường có từ 2 – 3 ngăn ngang, bào tử

không màu (hình 7)

2.2.3 Cơ chế phát sinh và phát triển bệnh đạo ôn trên lúa

2.2.3.1 Cơ chế xâm nhiễm của nấm Pyricularia oryzae

Trên bề mặt vết bệnh, bào tử được tạo ra ở ẩm độ không khí từ 93% trở lên

Ẩm độ càng cao tốc độ sinh trưởng càng nhanh Bào tử nảy mầm khi có lớp nước tự

do hay ẩm độ không khí bão hòa Trên bề mặt nước, 80% lượng bào tử có thể nảy mầm được và sau 24 giờ có khả năng sinh sản Theo kết quả nhóm giải mã gen nấm gây bệnh đạo ôn do Ralph Dean thuộc Đại học Bắc Carolina (Mỹ) đứng đầu xác

Hình 7 Cành sinh bào tử và bào tử nấm Pyricularia oryzae

Nguồn: http://www.hoptri.com/vi/quy-trinh-giai-phap/item/

định Pyricularia oryzae có hơn 11.000 gen và tiết ra gần 800 protein để xâm nhập

và lây nhiễm sang lúa Nấm sử dụng một loại thụ thể mới để phân biệt lúa với các thực vật khác Những thụ thể này nằm trên bào tử của nấm

Trên bề mặt lá, bào tử nảy mầm xâm nhiễm trực tiếp qua lớp cutin và biểu bì qua sự tạo trực tiếp đĩa bám và vòi xâm nhiễm, khuẩn ty nấm có thể xâm nhiễm trực tiếp qua khí khổng Vòi xâm nhiễm phát triển từ đĩa bám sau khi xâm nhập vào tế bào sẽ tạo thành một túi và từ đó khuẩn ty lan vào các tế bào cây (hình 8)

Trong cây bệnh hay trong môi trường nuôi cấy, người ta trích được hai loại độc tố: α – picolinic axit (C6H5NO2) và một chất khác được gọi tên là piricularin (C18H14N2O3) Nếu bôi piricularin lên một vết thương cơ học trên lá lúa, sẽ tạo một đốm cháy giống như vết bệnh cháy lá Piricularin còn làm cây bệnh và tập trung coumarin làm cây lúa không phát triển Piricularin bị chlorogenic axit và ferulic axit làm mất độc tính Ngoài ra, nấm còn tạo ra hai loại độc tố khác là pyriculol và tenuazonic axit.(Nguyễn Phú Dũng, 2005)

2.2.3.2 Điều kiện phát sinh và phát triển bệnh

Sự phát sinh và phát triển của bệnh phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố ngoại cảnh và mức độ nhiễm bệnh của giống

Ảnh hưởng của thời tiết, khí hậu: Bệnh này thường phát triển mạnh trong

điều kiện khí hậu mát mẻ, ẩm độ cao, mưa nhỏ kéo dài, đêm sương mù nhiều Đặc biệt trong vụ lúa Đông Xuân tại vùng ĐBSCL vào tháng giêng – tháng hai dương lịch, bệnh này sẽ gây hại trên diện rộng trùng vào lúc lúa đứng cái đến trổ Các vùng

Hình 8 Chu kỳ phát triển của nấm đạo ôn

Nguồn: Nấm Pyricularia oryzae truy cập từ http://blog.zing.vn/

thường xuyên bị bệnh cháy lá hằng năm như Tiền Giang, An Giang, Đồng Tháp và Sóc Trăng Tuy nhiên, điều kiện khô hạn làm cây lúa thiếu nước, quá trình trao đổi chất kém, khả năng hấp thu dinh dưỡng yếu, cây lúa không chống chọi được bệnh Ở những vùng cao nguyên, điều kiện khô hạn thiếu nước kết hợp với đêm sương mù nhiều, biên độ nhiệt lớn sẽ làm cho bệnh này càng dễ phát sinh mạnh.

Ảnh hưởng của đất: những ruộng nhiều mùn, trũng ẩm, khó thoát nước,

những vùng đất kém màu mỡ, đất nhẹ, giữ nước kém và những ruộng lúa có lớp đất sét nông rất phù hợp cho bệnh đạo ôn phát triển và gây hại

Ảnh hưởng của phân bón: Ba loại phân N-P-K đều có ảnh hưởng rất lớn đến

việc phát sinh bệnh nếu bón không cân đối Thông thường, bón dư thừa phân đạm sẽ làm tăng bệnh, dư phân lân không thấy rõ ảnh hưởng lên bệnh Tuy nhiên, nếu bón thêm phân lân trên vùng đất phèn sẽ hạn chế bệnh cháy lá rất rõ ràng Phân kali có ảnh hưởng rất phức tạp trên sự phát triển của bệnh cháy lá; bón dư thừa đạm và kali đều làm tăng bệnh; bón đạm vừa phải kết hợp đủ lượng kali thì sẽ giảm bệnh rất rõ

Do đó, trong giai đoạn sau trổ nếu ruộng bị nhiễm bệnh cháy lá họặc thối cổ bông thì không được bón thêm phân bón lá có nitrat kali

Mật độ gieo sạ cũng có liên quan đến khả năng phát triển của bệnh cháy lá

Gieo sạ càng dày, tán lá lúa càng nhiều, khả năng che khuất càng lớn, ẩm độ dưới tán lá càng cao, điều kiện khí hậu càng thuận lợi cho nấm cháy lá phát triển

Ảnh hưởng của giống lúa: ngoài các yếu tố nêu trên thì đặc tính của giống

cũng có ảnh hưởng tới mức độ phát triển của bệnh Những giống nhiễm bệnh nặng (giống mẫn cảm) sẽ tạo điều kiện cho bệnh gây hại và lây lan trên diện rộng

(Hà Huy Niên, 2007)

2.2.4 Biện pháp phòng trị bệnh đạo ôn trên lúa

Hiện nay, biện pháp hóa học được sử dụng phổ biến trong việc phòng trừ bệnh đạo ôn vì cho hiệu quả nhanh, dễ sử dụng Tuy nhiên, nếu sử dụng không đúng, không hợp lý, sử dụng lâu dài sẽ gây ảnh hưởng xấu tới môi trường, tăng khả năng hình thành tính kháng thuốc của sâu bệnh, tiêu diệt thiên địch, phá vỡ cân bằng sinh thái, gây nhiều dịch hại mới Biện pháp phòng trừ dịch hại tổng hợp IPM (Integrated Pest Management) được xem là biện pháp chính trong kiểm soát dịch hại Chọn giống tốt, kháng bệnh khử lẫn tạp hạt cỏ trước khi gieo Dùng biện pháp sạ hàng, bón phân cân đối N-P-K, không bón thừa phân đạm, nên bón phân đạm theo theo nhu cầu cây lúa Sau mùa thu hoạch, cày vùi rơm rạ để trả lại nguồn hữu cơ cho đất đồng thời diệt được mầm bệnh, hạn chế đốt rơm vì biện pháp này chỉ trả lại một

số chất khoáng có trong tro, đất dần dần kém màu mỡ, mau suy kiệt Vệ sinh đồng ruộng bằng cách thu gom, tiêu diệt lúa rày, cỏ dại mọc ven bờ là nơi lưu tồn và lây lan mầm bệnh sau này Giữ mực nước đầy đủ thường xuyên trên mặt ruộng tùy theo nhu cầu nước theo từng giai đoạn của cây lúa, tránh để ruộng khô nước khi bệnh cháy lá xảy ra Cần thăm đồng thường xuyên, phát hiện kịp thời khi bệnh mới xuất hiện (Nguyễn Văn Đĩnh, 2004)

2.3 KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG NẤM GÂY BỆNH ĐẠO ÔN TRÊN LÚA CỦA

XẠ KHUẨN

2.3.1 Sự hình thành khả năng đối kháng của xạ khuẩn

Sự đối kháng giữa các VSV trong đất là cơ sở của biện pháp sinh học phòng chống bệnh cây Các nghiên cứu cho thấy cơ chế cơ bản và quan trọng nhất của sự đối kháng bởi VSV đối với mầm bệnh là do sản sinh ra các chất kháng sinh (CKS) (Gnanamanickam và Mew, 1989) Sự có mặt của xạ khuẩn đối kháng trong đất làm giảm rõ rệt tỉ lệ bị bệnh của cây Một trong những đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng hình thành chất kháng sinh Trong số 8000 CKS hiện nay thì trên thế giới có trên 80% là có nguồn gốc từ XK, chủ yếu là từ các chủng thuộc chi

Streptomyces Đa số chất kháng sinh từ XK đều có phổ kháng sinh rộng, kềm hãm

hoặc ức chế sự sinh trưởng và phát triển của nhiều loài VSV khác nhau Một loại XKĐK có thể ức chế một vài loại nấm gây bệnh nhưng có những loài hoạt động rộng có thể ức chế nhiều tác nhân gây bệnh có trong đất (Lê Gia Hy, 2010)

Ngoài việc sinh các CKS dùng trong y học thì XK còn sinh ra các chất đối kháng VSV gây bệnh hại cây trồng (như vi khuẩn héo lá, nấm thực vật, nấm đạo ôn, nấm thối cổ rễ…) Đã có nhiều tác giả nghiên cứu ứng dụng XK vào việc phòng trừ bệnh trên cây trồng như: Nguyễn Đình Hải, 2012; Trịnh Thới An, 2014; Kiều Hữu Ảnh và cs, 2003; Lê Gia Hy và cs, 2005…

Chất kháng sinh (Antibiotic) là những chất có tính chống lại các VSV hại, chúng có hoạt tính sinh lý cao có tác động chọn lọc và được các VSV tiết ra đưa vào môi trường sống trong mối quan hệ đối kháng với các sinh vật khác, trong đó vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn là những VSV sinh ra nhiều chất kháng sinh nhất (Lương Đức Phẩm, 2011) CKS có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số VSV khác một cách có chọn lọc ngay khi ở nồng độ thấp, có thể can thiệp vào hoạt động sinh

lý của một chất khác bằng cách kết hợp đặc hiệu với thụ thể, kềm hãm hoặc ức chế

sự phát triển của VSV khác (http://dictionary.reference.com/browse/antagonist)

Sự hình thành và các con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh: CKS được tổng hợp từ một, hai, ba chất trao đổi bậc một khác nhau, hay bằng cách polyme hóa các chất trao đổi bậc 1, sau đó có thể tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác

để tạo thành các dạng kháng sinh khác nhau CKS còn là chất tham gia cạnh tranh của XK trong môi trường sống tự nhiên Nhiều chủng XK có khả năng tổng hợp đồng thời hai hay nhiều CKS có cấu trúc hóa học và có tác dụng tương tự nhau Quá trình sinh tổng hợp CKS phụ thuộc vào cơ chế điều khiển đa gen, ngoài các gen chịu trách nhiệm tổng hợp CKS, còn có cả các gen chịu trách nhiệm tổng hợp các tiền chất, enzym và cofactor (Bùi Thị Việt Hà, 2006)

2.3.2 Cơ chế tác động của xạ khuẩn đối kháng nấm gây bệnh gây trồng

Kasumin (Kasugamycin) C14H28ClN3O10: là một kháng sinh aminoglycoside

được phân lập lần đầu vào năm 1965, từ Streptomyces kasugaensis, một chủng Streptomyces tìm thấy gần ngôi đền Kasuga ở Nara, Nhật Bản Kasugamycin được

phát hiện bởi Hamao Umezawa Kasugamycin được biết đến như một loại thuốc có

thể ngăn chặn sự phát triển của nấm đạo ôn Nó ngăn chặn những sự tổng hợp protein và kết khối lại của aminoacyl – RNA hòa tan tới riboxom trong sợi nấm (hình 9) Giống như rất nhiều các loại thuốc kháng sinh tự nhiên được biết, Kasugamycin ức chế sự tăng sinh của nấm bằng cách ức chế tổng hợp protein ở bước khởi đầu của dịch mã, quá trình ức chế được cho là xảy ra bởi sự cạnh tranh trực tiếp với sự chuyển khởi RNA (http://en.wikipedia.org/wiki/Kasugamycin)

Theo Vũ Triệu Mân năm 1998, thuốc ở dạng tinh chế, tan trong nước Thuốc được sản xuất thành dạng dung dịch 2%, dạng bột thấm nước 2% và 5%, dạng hạt 2% và dạng hỗn hợp có tên là Kasuran 50WP (5% Kasumin + 75,6% CuOCl = 45% Cu) pha nước ở nồng độ 0,1% để phòng trừ bệnh phấn trắng, bệnh thối dưa chuột, dưa hấu, một số bệnh vi khuẩn và nấm hại chè, cam, chanh, cà chua, khoai tây; Kasurabcide (1,2% kasumin + 20% Fthalide) dạng bột thấm nước dùng 1,5 kg/ha trừ đạo ôn, đốm sọc, vi khuẩn hại lúa (Nguyễn Hoàng Minh Huy, 2006)

Streptomyces griseoviridis chủng 61 được sử dụng phòng trừ những bệnh gây ra bởi Pythium, Fusarium, nấm mạng nhện Botrytis Khi phun, những bào tử đã sấy và thể sợi Streptomyces nảy mầm và bắt đầu để bám chắc vào và vòng quanh rễ

cây, chúng cạnh tranh với nấm hại cây trồng về không gian sống và thức ăn bằng việc tranh lấy vùng sống quanh rễ cây nhưng chúng không gây hại cho cây (www.sodohydro.com/)

Validamycin (C20H35NO13): đã được mô tả vào năm 1970 bởi tác giả Nhật

Bản (Iwasa et al., 1970) là một chất chuyển hóa thứ cấp của Streptomyces sp chủng

số T-7545, được tìm thấy trong một mẫu đất thu thập được từ các thành phố của Nhật Bản Akashi, Hyogo Prefecture Xạ khuẩn này đã được xác định là

Streptomyces hygroscopicus var Limoneus.Validamycin được dùng để trừ nấm Rhizoctonia solani (hình 10) gây bệnh khô vằn hại lúa (http://www.toxicology.cz/)

B

A Hình 9 Cơ chế đối kháng nấm (A) và cấu trúc (B) của Kasugamycin

Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/Kasugamycin

2.3.3 Tình hình nghiên cứu chất đối kháng từ xạ khuẩn

Người đầu tiên đặt nền móng cho hoạt tính đối kháng của VSV là Alexander Fleming - nhà sinh vật học người Anh, đã phát hiện ra penicilin vào tháng 10 năm

1928 Năm 1945, A Fleming, E Chain và H W Florey đã được nhận giải thưởng Nobel vì đã khám phá ra giá trị to lớn của penicilin mở ra kỉ nguyên mới trong y học

- kỉ nguyên kháng sinh Cho đến ngày nay, trên thế giới và Việt Nam đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về khả năng đối kháng của VSV trong đó xạ khuẩn là đối tượng được nghiên cứu rất nhiều và đã đạt được một số thành tựu nhất định

Năm 1999, kháng sinh lospomal HA – 92 ra đời, được tách chiết từ xạ khuẩn

Streptomyces CDRLL-312 tác dụng ngăn chặn cholesterol, tăng sức đề kháng đối với

các chất độc của chuột, ngoài ra kháng sinh này còn có hoạt tính chống nấm gây bệnh mạnh

Ở Trung Quốc, ngay từ những năm 1930, đã sử dụng xạ khuẩn và các chất trao đổi của chúng để nghiên cứu hạn chế các bệnh thực vật Từ năm 1950, đã chọn

được chủng 5406 trong 400 chủng xạ khuẩn phân lập được từ đất vùng rễ cây bông

và cỏ linh lăng ức chế Rhizoctonia solani và Verticillicum alboatrum gây bệnh thối

rễ cây bông non và ứng dụng trong phòng bệnh cho 6 triệu ha bông Cho đến năm

B

A

Hình 10 Cơ chế tác động (A) và cấu trúc (B) của Validamycin lên

Rhizoctonia solani Nguồn: http://www.vipesco.com.vn/kythuatchitiet.php?Id=72

1991, chất kháng sinh “120” từ chủng Streptomyces hygroscopycus var bejinggernsis phòng, chống cho 330 triệu ha cây trồng và chỉ số bệnh giảm 50% –

98,9% tùy theo từng loại bệnh

Ở Nhật Bản, việc sử dụng xạ khuẩn sinh kháng sinh trong bảo vệ thực vật đã

được biết đến từ lâu như Blastisidin S sản xuất từ S griserochromogenes, Kausugamixin từ S kasuganensis, Validamycin từ S hygrocopycus chống bệnh khô

vằn rất có hiệu quả Năm 2003, yatakemycin đã được tách chiết từ xạ khuẩn

Streptomyces sp TP – A0356 bằng phương pháp sắc kí cột Kháng sinh này có khả năng kiềm hãm sự phát triển của nấm Aspergillus và Candida albicans Chất này

còn có khả năng chống lại các tế bào ung thư có giá trị Mic là 0,01 – 0,3 mg/ml

Ở Liên Xô, Levorin và Trichotexin trừ nấm Vertillum dehliae gây bệnh héo

rũ bông có hiệu quả cao Ở Bungari, những chủng xạ khuẩn chống nấm thường

thuộc nhóm màu xám và các loài S griseus, S albus, S candidus…

Năm 2002, ở Ấn Độ đã phân lập được chủng xạ khuẩn Streptomyces sp 201

có khả năng sinh kháng sinh mới là z-methylheptyl iso-nicotinate có khả năng kháng

được nhiều loại nấm gây bệnh như Fusarium oxysporum, F solani

Tại Hàn Quốc (2007) phân lập được loài xạ khuẩn Streptomyces sp C684

sinh kháng sinh laidlomycin, chất này có thể tiêu diệt cả những tụ cầu đã kháng methicillin và các cầu khuẩn kháng vancomycin

Ở Việt Nam, Đỗ Thu Hà (2004), nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam – Đà Nẳng đã phân lập được 2 chủng xạ khuẩn là

Streptomyces nashvillensis QN-23 và Streptomyces globosus QN-24 có khả năng kháng các loại nấm kiểm định là A niger, P oryzae, F oxysporum

Bùi Thị Việt Hà (2006) nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam, đã ứng dụng phân loại xạ khuẩn đến mức phân tử để xác định được các chủng xạ khuẩn là Streptomyces antimycoticus chống nấm Sclerotium rolfsii gây bệnh mốc trắng ở cà chua, Streptomyces diastatochromogenes có hiệu quả tốt trong phòng chống bệnh lở cổ rễ và thối bắp do Rhizoctonia solani gây ra trên bắp cải, Streptomyces hygroscopicus có hiệu quả tốt đối với việc phòng chống bệnh khô vằn (Rhizoctonia solani) ở lúa với hiệu lực gần xấp xỉ validacin

Bùi Thị Hà (2008) Từ các mẫu đất khác nhau đã phân lập và thuần khiết

được 80 chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces, trong số đó có 30 chủng có hoạt

tính kháng nấm gây bệnh trên chè ở các mức độ khác nhau, chiếm tỷ lệ 37,5% Đã tuyển chọn được 2 chủng xạ khuẩn có hoạt tính mạnh nhất trong số 30 chủng có

hoạt tính kháng nấm, kháng được cả 2 chủng nấm gây bệnh trên chè là CT – 2E và

CT – 5X, đồng thời cũng có khả năng kháng các nấm kiểm định

Lê Thu Hiền và cs (2012), phân lập và tuyển chọn được 10 dòng vi khuẩn và

xạ khuẩn có khả năng đối kháng cao với nấm Fusarium oxysporum gây bệnh héo vàng cà chua, dưa chuột Hiệu quả ức chế nấm trong phòng thí nghiệm đạt 85% –

86%, hiệu quả ức chế bệnh héo vàng cà chua, dưa chuột trong nhà lưới đạt 65% – 67%

Nguyễn Đình Hải (2012), nghiên cứu chủng xạ khuẩn

VN08A12-Streptomyces toxytricini có tiềm năng ứng dụng trong xử lý bệnh bạc lá lúa và thân

thiện với môi trường Kết quả nghiên cứu cho thấy tác động của chủng xạ khuẩn nghiên cứu trên động vật nuôi thí nghiệm (chuột bạch) và một loài cây nông nghiệp quan trọng (cây đậu xanh) cho thấy chủng xạ khuẩn không gây hại cho các sinh vật trong môi trường sống

Trịnh Thới An (2014), đã phân lập được 30 chủng xạ khuẩn từ đất trồng rau màu tại xã Phước Hậu, huyện Cần Giuộc, tỉnh Long An, trong đó có 1 chủng sinh

chất kháng nấm Pythium sp gây hại trên rau màu mạnh

Lê Minh Tường và Ngô Thị Kim Ngân (2014), đã tiến hành phân lập và đánh

giá khả năng đối kháng của các chủng xạ khuẩn đối với nấm Rhizoctonia solani gây

bệnh đốm vằn trên lúa Kết quả nghiên cứu này đã phân lập được 216 chủng xạ khuẩn, trong đó có hai chủng xạ khuẩn là có khả năng ức chế mạnh và ổn định đối

với sự phát triển của khuẩn ty nấm R.solani gây bệnh đốm vằn trong điều kiện

phòng thí nghiệm

Lê Minh Tường và Trần Thị Thu Em (2014), đã phân lập được 26 chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa ở ĐBSCL, trong đó có 3 chủng có khả năng đối kháng mạnh với nấm bệnh khi nghiên cứu trong phòng thí nghiệm

Cho đến thời điểm hiện nay vẫn chưa có nghiên cứu nào đi sâu vào lĩnh vực

xạ khuẩn đối kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên cây lúa trong nhà lưới và ngoài đồng ruộng

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 VẬT LIỆU

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm gây bệnh đạo ôn trên lúa được phân lập từ các mẫu đất ruộng tại xã Vĩnh Khánh, xã Vĩnh Trạch, xã Định Thành, xã Định Mỹ, xã Vĩnh Phú, xã Vĩnh Chánh thuộc huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang

 Hoá chất

Hóa chất dùng trong các thí nghiệm: K2HPO4, KH2PO4, KI, MgSO4.7H2O, KNO3, NaCl, FeSO4.7H2O, MnCl2, Na2CO3, ZnSO4, agar, tinh bột tan, CMC (Carboxyl Methyl Cellulose), chitin, glucose, …

(Trung Quốc), máy nghiền mẫu (Đức)

- Các dụng cụ thí nghiệm: thước đo khuẩn lạc, lò điện, bình tam giác, ống nghiệm,

đĩa petri, đèn cồn, diêm quẹt, que trang, que cấy, giấy quỳ, giấy lọc, giấy báo cũ, lame, lammel, bông mỡ, bông thấm nước, …

3.1.2 Nguyên liệu

 Các mẫu đất được lấy ở các độ sâu 5 - 10 cm tại các ruộng lúa

 Chủng nấm kiểm định Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ôn lúa nhận từ phòng thí

nghiệm Vi sinh - Trường Đại học An Giang

 Lúa giống Jasmine 85 (cấp giống nguyên chủng) do công ty Bảo Vệ Thực Vật An Giang sản xuất

 Thuốc trừ đạo ôn lúa: Kasumin 2L

 Phân bón: Ure 46%, Super lân 16%, Kali 60%

 Chậu trồng, đất trồng và các vật liệu khác

 Sử dụng môi trường ISP 4 (International Streptomyces Project 4) để phân lập xạ khuẩn, môi trường Gause 1 nuôi cấy xạ khuẩn xác định hoạt tính đối kháng, môi trường Gause 2 (dịch thể) nuôi cấy xạ khuẩn xác định hoạt tính enzym, môi trường

PDA (Potato Dextrose Agar) dùng để nuôi cấy nấm Pyricularia oryzae, môi trường thân lúa để thu bào tử nấm Pyricularia oryzae, và các môi trường thử hoạt tính

enzym của xạ khuẩn

- Môi trường ISP 4 có thành phần (g/L)

- Tinh bột tan : 10 g

- KH2PO4 : 1,0 g

- Môi trường thân lúa (Nguyễn Thị Thanh Xuân, 2003)

- Môi trường thử hoạt tính enzym bằng phương pháp khuếch tán trên thạch

- Môi trường thử hoạt tính chitinase (Lê Duy Linh, 1997)

* Cách chiết chitin từ vỏ, đầu tôm

 Vỏ, đầu tôm rửa sạch, sấy khô

 Xử lý tách protein bằng dung dịch NaOH 4% ở 70 0

C – 75 0C/ 4 giờ, sau đó rửa sạch bằng nước cất

 Tách khoáng bằng dung dịch HCl 8% ở 26 0

C – 30 0C/ 16 giờ, rửa sạch

 Sấy khô, xay nhuyễn thành dạng bột, bảo quản trong lọ thủy tinh

- Môi trường thử hoạt tính cellulase (Trần Thanh Thủy, 1999)

3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Phương pháp thu mẫu đất

- Chọn điểm thu mẫu đất: tại huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang chọn 06 xã: Vĩnh

Khánh, Vĩnh Trạch, Định Thành, Định Mỹ, Vĩnh Phú, Vĩnh Chánh (hình 11) Mỗi

xã chọn 03 ruộng lúa, mỗi ruộng thu 03 mẫu đất ở ba vị trí khác nhau để đại diện cho toàn mẫu ruộng Vị trí thứ nhất là đất dưới ruộng, vị trí thứ hai là đất ẩm nơi tiếp giáp giữa mặt ruộng và bờ đê, vị trí thứ ba là đất khô trên bờ đê

- Cách lấy mẫu: Dùng dao lấy khoảng 10 – 50 g đất cách bề mặt từ 5 – 10 cm ở ba

vị trí trên, để vào túi nilon đã khử trùng, buộc kín lại Ngoài túi dán nhãn ghi rõ ngày, nơi lấy mẫu

- Mẫu đất được mang về phòng thí nghiệm, tiến hành phơi khô mẫu trong điều kiện

tự nhiên Sau đó, nhặt bỏ rác, đá, các xác hữu cơ và đem mẫu nghiền trong cối thủy tinh rồi tiến hành sàng qua rây có đường kính 2 mm Mẫu đất nghiền xong được đựng trong các túi nilon kín và bảo quản trong tủ lạnh 4 0

C

Hình 11 Vị trí lấy mẫu ở các xã thuộc huyện Thoại Sơn, tỉnh An Giang

Nguồn: internet

3.2.2 Phương pháp phân lập xạ khuẩn (Nguyễn Lân Dũng, 1983)

- Cân 10 g đất cho vào bình tam giác 250 mL chứa 90 mL nước cất vô trùng, lắc trên máy lắc 30 phút

- Dùng pipet vô trùng hút 1 mL dịch đất sang ống nghiệm có chứa 9 mL nước vô trùng và tiếp tục pha loãng đến 10-2, 10-3 10-6

- Từ mỗi nồng độ pha loãng ở các nồng độ 10-3 đến 10-6, nhỏ 0,1 mL sang đĩa petri chứa môi trường ISP 4 Dùng que trang chang đều, đậy đĩa petri, gói lại rồi lật sấp và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 28 – 30 0C trong 7 ngày Tiến hành quan sát và phân biệt khuẩn lạc xạ khuẩn với các loại vi sinh vật khác

- Từ các khuẩn lạc được làm sạch cấy truyền sang ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng ISP 4, tiếp tục nuôi ở điều kiện trên trong 7 ngày Bảo quản trong tủ lạnh 4 0C để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo

3.2.3 Phương pháp xác định hoạt tính đối kháng nấm Pyricularia oryzae của xạ

khuẩn

 Nguyên tắc: Hoạt tính đối kháng của XK thể hiện thông qua kích thước vòng đối

kháng (vòng tròn trong suốt bao quanh khuẩn lạc) Chất đối kháng do XK tiết ra sẽ

ức chế sự phát triển của nấm đạo ôn, làm đạo ôn không phát triển được tạo thành vòng đối kháng

 Phương pháp thỏi thạch

 Mục đích: Tuyển chọn sơ bộ các chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm Pyricularia oryzae mạnh nhất từ các chủng phân lập được

 Cách tiến hành

- Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause 1 trong đĩa petri 7 ngày

- Dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch chứa xạ khuẩn đặt vào đĩa petri chứa

môi trường PDA Sau đó cấy chấm điểm nấm P oryzae vào 2 phía đối diện thỏi

- Từ ống thạch nghiêng, giống được cấy truyền sang các bình tam giác dung tích 250

mL chứa 100 mL môi trường Gause 1 dịch thể và nuôi lắc 220 vòng/phút trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng

- Giống phát triển được cấy truyền với tỷ lệ 10% sang bình tam giác dung tích 250

mL chứa 80 mL môi trường Gause 1 dịch thể Quá trình lên men kéo dài 7 ngày ở nhiệt độ phòng trên máy lắc 220 vòng/phút Sau đó xác định hoạt tính đối kháng nấm của dịch nuôi xạ khuẩn

- Sử dụng khoan nút chai vô trùng, khoan lỗ trên đĩa môi trường PDA Dùng que cấy

vô trùng, cấy chấm điểm nấm Pyricularia oryzae được nuôi 3 ngày trên môi trường

PDA (đặc) vào 2 phía đối diện của lỗ thạch Sau đó hút 0,1 mL dịch nuôi cấy xạ khuẩn nhỏ vào lỗ thạch mới khoan Để ở nhiệt độ phòng, sau 3 ngày tiến hành kiểm tra kết quả dựa vào kích thước vòng đối kháng (D – d, mm), D là đường kính vòng đối kháng và d là đường kính lỗ thạch Kết quả là giá trị trung bình của 4 lần lặp lại

 Cách tiến hành

- Thu dịch enzym thô từ môi trường lỏng: Xạ khuẩn sau khi được nuôi trên môi

trường Gause 2 dịch thể, ly tâm ở 5000 vòng/ phút trong 15 phút, chiết dịch trong thu được enzym thô

- Chuẩn bị môi trường thử hoạt tính hai loại enzym cellulase và chitinase Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các lỗ thạch trên các đĩa petri

- Dùng pipet vô trùng nhỏ 0,1 mL dịch enzym vào các lỗ khoan Nhỏ 0,1 mL nước cất làm đối chứng Giữ các hộp petri ở tủ lạnh 4 0

C trong 1 – 2 giờ, sau đó chuyển sang giữ trong tủ ấm trong 24 giờ Sau 24 giờ dùng thuốc thử lugol nhỏ lên bề mặt thạch và đo đường kính vòng phân giải bằng thước đo khuẩn lạc

 Kiểm tra kết quả

- Sau khi nhuộm màu lugol, nếu xạ khuẩn có hoạt tính cellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh lỗ khoan chứa dịch enzym do cellulose bị phân giải, vùng cellulose chưa

bị phân giải có màu tím hồng nhạt Nếu xạ khuẩn có hoạt tính chitinase, vùng chitin

bị phân giải trở nên trong suốt, vùng chưa phân giải có màu nâu đỏ đậm

- Hoạt tính enzym được xác định bằng giá trị D – d (mm) D là đường kính vòng phân giải, d là đường kính lỗ thạch

- Kết quả là giá trị trung bình của 4 lần lặp lại và thí nghiệm bố trí lặp lại 2 lần

3.2.5 Phương pháp quan sát đặc điểm hình thái và định danh xạ khuẩn

Tiến hành nuôi cấy 2 chủng xạ khuẩn được tuyển chọn trên môi trường Gause 1, quan sát các đặc điểm hình thái của xạ khuẩn Sau đó, gởi 2 chủng xạ khuẩn định danh đến loài bằng phương pháp sinh học phân tử tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử - Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Cần Thơ

- Quan sát đại thể: Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause 1 ở nhiệt

độ phòng, sau 7 ngày lấy ra quan sát các đặc điểm: Kích thước khuẩn lạc để biết tốc

độ phát triển, hình dạng, đặc điểm của bề mặt, mép khuẩn lạc, màu sắc khuẩn lạc mặt phải, mặt trái, màu sắc của môi trường do sắc tố xạ khuẩn tạo ra

- Quan sát vi thể: Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gause 1 có đặt

lamel nghiêng 450 trên bề mặt môi trường Sau 7 ngày nuôi ở nhiệt độ phòng lấy lamel ra quan sát hình dạng cuống sinh bào tử, bào tử dưới kính hiển vi

3.2.6 Thử nghiệm khả năng đối kháng nấm P oryzae gây bệnh đạo ôn trên lúa

từ dịch nuôi xạ khuẩn

Thí nghiệm 1 : Xác định hoạt tính đối kháng của dịch nuôi xạ khuẩn ở các nồng

độ khác nhau

 Mục đích thí nghiệm: Xác định được nồng độ dịch nuôi xạ khuẩn có hoạt tính đối

kháng nấm mạnh nhất để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo

 Chuẩn bị thí nghiệm: Nuôi cấy 2 chủng xạ khuẩn đã được tuyển chọn trong môi

trường Gause 1 dịch thể theo phương pháp như mục 3.2.3 Thu dịch nuôi cấy xạ khuẩn, pha loãng đến các nồng độ 30%, 50%, 80%, 100% Đối chứng (ĐC) sử dụng nước cất

 Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí với 9 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức 4

lần lập lại và thí nghiệm được bố trí 2 lần:

(1) Nghiệm thức 1: cấy nấm P oryzae, nước cất (ĐC)

(2) Nghiệm thức 2: cấy nấm P oryzae, dịch nuôi xạ khuẩn 1 – 30%

(3) Nghiệm thức 3: cấy nấm P oryzae, dịch nuôi xạ khuẩn 1 – 50%

(4) Nghiệm thức 4: cấy nấm P oryzae, dịch nuôi xạ khuẩn 1 – 80%

(5) Nghiệm thức 5: cấy nấm P oryzae, dịch nuôi xạ khuẩn 1 – 100%

(6) Nghiệm thức 6: cấy nấm P oryzae, dịch nuôi xạ khuẩn 2 – 30%

(7) Nghiệm thức 7: cấy nấm P oryzae, dịch nuôi xạ khuẩn 2 – 50%

(8) Nghiệm thức 8: cấy nấm P oryzae, dịch nuôi xạ khuẩn 2 – 80%

(9) Nghiệm thức 9: cấy nấm P oryzae, dịch nuôi xạ khuẩn 2 – 100%

 Kết quả: xác định hoạt tính đối kháng nấm P oryzae của dịch nuôi cấy 2 chủng xạ

khuẩn ở các nghiệm thức trên theo phương pháp khoan lỗ thạch

Số liệu được thống kê và xử lý bằng phần mềm thống kê SPSS 16.0, phân tích ANOVA ở mức ý nghĩa 0,05

Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng kháng bệnh đạo ôn trên lúa của dịch nuôi xạ khuẩn

 Chuẩn bị thí nghiệm

- Các chậu đất trồng được làm sạch cỏ, bơm nước và làm bằng mặt trước khi trồng

- Ngâm giống, ủ giống: Lúa giống Jasmine 85, thời gian sinh trưởng 93 – 98 ngày Giống lúa được khử trùng bề mặt bằng biện pháp 3 sôi 2 lạnh trong 15 phút, sau đó hạt lúa được phơi khô, ủ 60 giờ Hạt nảy mầm tốt đem gieo thành hàng trong chậu (cao 30 cm, rộng 35 cm, dài 50 cm), mỗi chậu gieo 12 hạt

- Nhân mật số nấm đạo ôn: các đĩa nấm được nuôi trên đĩa petri chứa môi trường thân lúa đặt trong tủ tối, nhiệt độ 29 – 30 0C trong 5 ngày để nấm phát triển hệ sợi và tạo bào tử Rửa đĩa petri nuôi nấm để lấy bào tử bằng nước cất vô trùng, thêm vài giọt Tween 80 để tăng khả năng bám dính các bào tử lên lá mạ, sau đó lấy 1 giọt dung dịch bào tử đưa lên lame quan sát dưới kính hiển vi (pha loãng mẫu nếu cần thiết) để sao cho có khoảng 50 bào tử trên một quang trường kính hiển vi, tương đương 105

bào tử trên 1 mL dung dịch Sử dụng bình phun 3 atm/cm2 để phun cho lúa

- Thu dịch nuôi hai chủng xạ khuẩn thô: từ ống thạch nghiêng, xạ khuẩn được cấy truyền sang các bình tam giác dung tích 500 mL chứa 250 mL môi trường Gause 1 dịch thể, nuôi lắc 220 vòng/phút trong 7 ngày ở nhiệt độ phòng để thu dịch nuôi xạ khuẩn thô, ly tâm, pha theo nồng độ được xác định ở thí nghiệm 1, mỗi chậu phun

100 mL dịch nuôi XK Sử dụng thuốc trừ đạo ôn Kasumin 2L làm đối chứng dương (ĐC (+))

- Cách nhiễm nấm bệnh: Sử dụng phương pháp phun dịch bào tử nấm đạo ôn vào 16 ngày sau khi sạ (NSS), tương ứng với giai đoạn lúa đã có 3 – 4 lá thật phát triển, phun mỗi chậu 3 mL dung dịch bào tử Sau khi chủng nấm các chậu lúa được phủ bao tải ẩm, phun giữ ẩm thường xuyên và giữ nhiệt độ 24 – 26 0C trong 24 giờ Sau

đó phun sương tạo độ ẩm cao cho đến cuối thí nghiệm

- Thời điểm phun dịch nuôi xạ khuẩn: Lần 1: 25 ngày sau khi sạ (NSS), lần 2: 65 NSS

- Cây lúa trong thời gian thí nghiệm được chăm sóc, tưới tiêu theo chế độ chăm sóc cây lúa bình thường chia ra 3 lần bón: 10, 20, 45 NSS

 Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí ở khu nhà lưới – trại thực nghiệm

Trường Đại học An Giang Trồng lúa trong chậu theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, bố trí thành 5 nghiệm thức, mỗi nghiệm thức có 4 lần lặp (mỗi lần lặp lại là 1 chậu), bao gồm:

(2) Nghi

(5) XK 1 + 50% XK 2)

 Chỉ tiêu theo dõi

a Chỉ tiêu về bệnh trên lá: được ghi nhận vào lúc 30, 40, 50, 60 ngày sau khi sạ

(NSS) Chọn ngẫu nhiên 3 cây/ chậu, mỗi cây lấy ra 1 chồi, lấy tất cả các lá từ trên xuống để đo kích thước vết bệnh, phân cấp các vết bệnh trên lá và tính diện tích vết bệnh trên các lá riêng biệt, quan sát theo tiêu chuẩn đánh giá và công thức của Pinnschmidt và cs (1993)

 Đánh giá theo bảng phân cấp sau

Cấp 1 Chiều dài vết bệnh <0,3 cm với diện tích là 0,02 cm2

Cấp 2 Chiều dài vết bệnh 0,3 – 0,5 cm với diện tích là 0,04 cm2

Cấp 3 Chiều dài vết bệnh 0,7 – 0,9 cm với diện tích là 0,09 cm2

Cấp 4 Chiều dài vết bệnh 1,3 – 1,7 cm với diện tích là 0,21 cm2

Cấp 5 Chiều dài vết bệnh >1,7 cm với diện tích là 0,45 cm2

 Đánh giá bệnh theo công thức sau

- Tỉ lệ diện tích bị bệnh trên lá (TLDTB): đánh giá bệnh theo công thức sau

Trong đó:

 Y: % diện tích bệnh

 a1,… , an: diện tích bệnh ở cấp 1,… n

 X1,… Xn: số vết bệnh ở cấp 1,…n

 L: tổng diện tích lá quan sát (diện tích lá = dài x rộng x 0,75)

- Tỉ lệ diện tích bệnh trên lô (TLDTB) (%): đây là chỉ tiêu quan trọng để đánh giá

hiệu quả đối kháng của các hóa chất gây đối kháng Tỉ lệ diện tích bệnh được tính theo công thức sau

- Tỉ lệ giảm bệnh so với đối chứng (TLGB) (%): biểu hiện hiệu quả đối kháng so

với đối chứng và được tính theo công thức sau

b Chỉ tiêu về bệnh trên cổ bông: lấy chỉ tiêu bệnh trên bông lúc 85 NSS Chọn

ngẫu nhiên mỗi chậu 3 cây lúa, quan sát và đếm tất cả các bông, ghi nhận và tính theo công thức Tsai (1988):

Trong đó:

 X: trung bình mức độ bệnh trên bông

 n1: số bông bị bệnh 100% (có vết bệnh trên cổ bông)

- Tỉ lệ giảm bệnh trên bông (TLGBTB) (%): biểu hiện hiệu quả đối kháng

P.oryzae trên bông được tính theo công thức sau

Trong đó:

 TLGBTB: tỉ lệ giảm bệnh trên bông

 XĐC: tỉ lệ bệnh thối cổ bông trên nghiệm thức đối chứng

 XNT: tỉ lệ bệnh thối cổ bông trên nghiệm thức có xử lí đối kháng

3.2.7 Xử lý thống kê

Các số liệu trong thí nghiệm được xử lý thống kê bằng chương trình SPSS (Statistical Program Scienetific System) dùng cho Window phiên bản 16.0 Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức xác xuất 0,05 của các giá trị được biểu hiện bằng các mẫu tự kèm theo qua phép kiểm định Duncan

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG XẠ KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG

ĐỐI KHÁNG NẤM Pyricularia oryzae

Tiến hành lấy mẫu đất ruộng tại các xã thuộc huyện Thoại Sơn, đã phân lập

được 80 chủng xạ khuẩn khác nhau, được kí hiệu theo quy ước: 3 chữ cái đầu là viết

tắt tên xã (ĐT: Định Thành, VK: Vĩnh Khánh, VT: Vĩnh Trạch, ĐM: Định Mỹ, VC: Vĩnh Chánh, VP: Vĩnh Phú) và vị trí lấu mẫu (A: vị trí dưới mặt ruộng, B: vị trí bờ

đê, C: vị trí tiếp giáp giữa mặt ruộng và bờ đê), các số từ 0 đế 80 là thứ tự chủng phân lập được

Sau khi thử khả năng đối kháng của 80 chủng xạ khuẩn đối với nấm P oryzae gây bệnh đạo ôn theo phương pháp khuếch tán trên thạch, đã tuyển chọn sơ

bộ được 21 chủng có hoạt tính kháng nấm P oryzae ở các mức độ khác nhau, chiếm

tỷ lệ 26,25% So sánh với tỷ lệ chủng xạ khuẩn kháng nấm gây bệnh đạo ôn đã công

bố trước đây của Lê Minh Tường (2014) là 10% khi khảo sát các chủng xạ khuẩn trên đất trồng lúa ở một số tỉnh ĐBSCL, tỷ lệ chủng xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm đạo ôn của đề tài có phần cao hơn Hiệu quả đối kháng của 21 chủng XK đối

với nấm P oryzae trong điều kiện phòng thí nghiệm được trình bày ở bảng 1, phụ

lục 1

Kết quả phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn cho thấy đất ruộng trồng lúa là đất giàu dinh dưỡng, có độ ẩm, pH thích hợp nên XK phát triển mạnh Xạ khuẩn có khả năng đối kháng nấm đạo ôn đều phân bố ở các ruộng cả 6 xã của huyện Thoại Sơn,

và vị trí mặt ruộng có số lượng xạ khuẩn nhiều hơn 2 vị trí còn lại Điều này có thể giải thích do xạ khuẩn là VSV hiếu khí, do đó lớp đất mặt là nơi có nguồn O2 và nguồn thức ăn là xác bã rơm, rạ, động vật, vỏ xác tôm cua, cá…đang bị phân hủy Đồng thời, với điều kiện đất ruộng có lượng nước ra vào thường xuyên, lớp đất mặt luôn giữ được độ ẩm thích hợp cho các chủng xạ khuẩn sinh trưởng phát triển 21

chủng XK thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của sợi nấm P oryzae với nhiều mức độ khác nhau.Trong đó, 2 chủng VKB-09 và ĐMB-40 thể hiện khả năng ức chế

nấm gây bệnh đạo ôn mạnh với đường kính vòng đối kháng lần lượt là 14,62 mm và 16,17 mm, kết quả này cao hơn khảo sát của Lê Minh Tường năm 2014 là 9,8 mm

Hình 12 Vòng đối kháng P oryzae của xạ khuẩn ĐMB-40 và VKB-09

Bảng 1 Kết quả vòng đối kháng nấm Pyricularia oryzae của 21 chủng xạ khuẩn

thạch với chủng nấm P.oryzae là: ĐMB-40 (17,88 mm) và VKB-09 (14,69 mm),

được thể hiện ở hình 12

Như vậy, môi trường sống ở ruộng lúa có đầy đủ các yếu tố cần thiết cho xạ

khuẩn sinh trưởng và phát triển Chúng sử dụng các chất hữu cơ sẳn có để tồn tại, ức