Nghiên Cứu Các Điều Kiện Công Nghệ Tối Ưu Cho Quá Trình Thu Hồi Beta - Cyclodextrin

Cyclodextrin đợc sản xuất từ tinh bột bằng phản ứng vòng hoá các chuỗi glucopyranoza mạch thẳng nhờ enzim cyclodextrin glucozyltransferaza.. - Trong công nghiệp dợc CD đợc ứng dụng rất n

Danh mục các bảng biểu

2 Bảng3 1: Xác định thời gian đun sôi diệt enzym 33

3 Bảng 3.2: Xác đinh thời gian hấp để diệt enzym 35

5 Bảng 3.4:Xác định nồng độ enzym AMG thích hợp 35

6 Bảng3 5.Xác định thời gian thuỷ phân thích hợp cho quá trình thủy phân 40

7 Bảng 3 6 ảnh hởng của tỷ lệ than hoạt tính lên màu của dịch sau tẩy màu 43

8 Bảng 3.7 ảnh hởng của nồng độ dịch đến quá trình kết tinh -CD.CD 45

9 Bảng 3.8 ảnh hởng của lợng nhân cấy đến quá trình kết tinh 46

10 Bảng 3.9: ảnh hởng của thời gian tới quá trình kết tinh -CD.CD. 48

11 Bảng 3.9: theo dõi quá trình kết tinh ở nhiệt độ phòng 40

Danh mục các hình vẽ

2 Hình 1.2 Sơ đồ các phản ứng do CGTaza xúc tác (hình tròn biểu thị phân

tử glucoza, đầu màu trắng là đầu khử) a) Phản ứng thuỷ phân, b) phản

ứng trao đổi, c) Phản ứng vòng hoá, d) Phản ứng kết hợp

16

3 Hình 1.3 Mô hình trung tâm hoạt động của CGTaza từ B.circulans 18

6 Hình 3.3 : sắc ký đồ của dịch sau thủy phân bằng AMG 42

7 Hình 3.4: Sắc ký đồ của mẫu phân tích tinh thể -CD.CD sau khi sấy 52

8 Hình 3.5 Sơ đồ quy trình công nghệ sản xuất -CD.CD từ tinh bột sắn 53Danh mục từ viết tắt

Tiến tới thế kỉ 21, thế kỷ của ngành công nghệ sinh học phát triển thì

những sản phẩm của ngành công nghệ sinh học cũng đợc lên ngôi, một ví dụ điển

hình của sản phẩm sinh học là Cyclodextrin Cyclodextrin là những

oligosaccharit mạch vòng đợc tạo nên bởi các glucopyranoza nối với nhau bằng

liên kết  -CD 1,4 glucozit Cyclodextrin đợc sản xuất từ tinh bột bằng phản ứng

vòng hoá các chuỗi glucopyranoza mạch thẳng nhờ enzim cyclodextrin

glucozyltransferaza Sản phẩm thu đợc thờng là hỗn hợp của ba loại cyclodextrin

chủ yếu là α -CD , β-CD và γ-CD.cyclodextrin với tỷ lệ phụ thuộc vào nguồn gốc enzim và

thời gian phản ứng Hiệu suất chuyển hoá thờng trong khoảng 20-CD 30% [3] Cấutrúc vòng của cyclodextrin cho phép nó tạo phức bao dạng khách thể -CD chủ thể vớinhiều hợp chất hữu cơ Sự tạo phức bao này dẫn đến làm thay đổi tính chất lý hoácủa phân tử chất khách thể Nhờ đó, cyclodextrin đợc ứng dụng rộng rãi trongnhiều ngành công nghiệp khác nhau Trong công nghiệp thực phẩm, cyclodextrin

đợc dùng làm chất mang hữu hiệu cho các hơng liệu vốn dễ bị mất trong quá trìnhchế biến và bảo quản hoặc dùng để loại cholesterol hoặc các mùi vị khó chịu khỏisản phẩm Trong công nghệ dợc phẩm, cyclodextrin đợc dùng để ổn định các hoạtchất, làm tăng khả năng hoà tan và khả năng hấp thụ thuốc đồng thời làm giảmtác dụng phụ của thuốc Trong công nghiệp hoá học, cyclodextrin đợc dùng đểxúc tác một số phản ứng Trong công nghiệp mỹ phẩm, cyclodextrin góp phầnlàm ổn định màu và mùi thơm của sản phẩm Cyclodextrin cũng đợc ứng dụngtrong nông nghiệp để sản xuất các loại thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu…

Mặc dù cyclodextrin có rất nhiều ứng dụng nhng tại Việt Nam vẫn cha cómột đơn vị nào nghiên cứu sản xuất cyclodextrin Cyclodextrin sử dụng tại ViệtNam hoàn toàn nhập ngoại từ các nớc nh Nhật Bản, Trung Quốc, Mĩ với giáthành cao Trong khi nguồn nguyên liệu chính để sản xuất cyclodextrin là tinhbột sắn thì tại Việt Nam lại có sản lợng rất lớn (năm 2005 sản lợng sắn xuất khẩucủa Việt Nam đứng thứ 2 thế giới chỉ sau Thái Lan), ngoài ra nguồn nguyên liệuthứ hai để sản xuất cyclodextrin là enzim thì trong thời kì kinh tế thị trờng mở thìrất dễ nhập mà giá thành lại hạ, hơn nữa nguồn nhân công tại Việt Nam rất rồirào Chính vì vậy việc nghiên cứu sản xuất Cyclodextrin là một việc làm cần thiết

để: Giảm nhập ngoại, chủ động trong sản xuất, tiết kiện đợc ngoại tệ, tận dụng đ-CD

ợc nguồn nguyên liệu sẵn có trong nớc, giải quyết việc làm cho một số lao

động…Hiện nay tại viện Công Nghiệp Thực Phẩm đã tiến hành sản xuất đợccyclodextrin hỗn hợp Để nâng cao giá trị của sản phẩm, cho nên đề tài này đã kếthừa những thành quả trên thế giới và trong nớc để tiếp tục tiến hành nghiên cứu

một công đoạn trong quá trình sản xuất cyclodextrin đó là “Nghiên cứu các điều kiện công nghệ tối u cho quá trình thu hồi Beta - cyclodextrin”

Chơng I : tổng quan

I.1 Giới thiệu về cyclodextrin

Cyclodextrin (CD) là những oligosacarit mạch vòng đợc tạo nên bởi các

đơn vị glucopyranoza hình ghế 4C1 nối với nhau bằng liên kết -CD.1,4-CD.glucozit

CD (còn đợc gọi là dextrin Schardinger) đã đợc biết đến từ hơn 100 năm

nay Năm 1881, CD lần đầu tiên đợc sản xuất từ tinh bột bằng vi khuẩn Bacillus amylobacter Năm 1903, cấu trúc và tính chất của các hợp chất này đã đợc biết

đến qua mô tả của Schardinger [38] Sau đó, Tilden và Hudson (1939) đã chứngminh enzim cyclodextrin glucosyltransferaza, chiết xuất từ môi trờng nuôi cấy vi

khuẩn Bacillus macerans, là tác nhân chuyển hoá tinh bột thành CD Từ năm

1950 cho tới nay, rất nhiều nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu các tính chấtcủa CD, cũng nh việc sản xuất và ứng dụng nó

I.1.1 Cấu tạo và cấu trúc của CD

Có tất cả gần 30 loại CD, nhng có 3 loại CD thờng gặp là -CD.CD, -CD.CD và

-CD.CD chứa tơng ứng 6, 7 và 8 đơn vị glucopyranoza trong phân tử Các CD lớnhơn (đến 31 đơn vị glucoza) và các CD nhỏ hơn (ít hơn hoặc bằng 5 đơn vịglucoza) đều rất kém bền [10] Kích thớc và thể tích lỗ hang của các CD do sốphân tử glucoza trong vòng CD quyết định

Trong vòng CD, các gốc glucoza đợc xắp xếp sao cho các nhóm hydroxylbậc 2 (C2 và C3) nằm về một phía của vòng, còn các nhóm hydroxyl bậc 1 (C6)nằm ở phía bên kia Kết quả là tạo ra phân tử có dạng hình nón cụt với phía chứa

C6 hẹp hơn do khả năng quay tự do của C6 [9] (Hình 1.1) Cấu trúc này đợc giữchặt bởi các liên kết hydro giữa các nhóm hydroxyl bậc 2 của các gốc glucoza kềnhau [3] Các nhóm hydroxyl bậc 1 và bậc 2 hớng ra bên ngoài mạch vòng, trongkhi đó mặt trong là các nguyên tử hydro không cực (ở C3 và C5) và các nguyên tửoxi cầu nối Nhờ có cấu trúc phân tử nh vậy nên CD có bề mặt bên ngoài là tơngtác háo nớc trong khi không gian bên trong lại kị nớc Cấu trúc này cho phép CDtạo phức bao bền vững với các phân tử kỵ nớc (các chất hữu cơ, muối halogen

…)

Cấu trúc của CD đợc mô tả nh hình 1.1:

Hình 1 1 Cấu trúc và kích thớc của CD.

I.1.2 Tính chất của CD

1740,10,17414,2

255 -CD 26012,33

11357116,0 -CD 6,615,479

2620,140,2621,85

255 -CD 26512,2

12978177,5 -CD 8,317,579

4720,20,47223,2

240 -CD 24512,08

+ Khả năng tan trong nớc

Trong phân tử CD, các nhóm hydroxyl đều hớng ra bên ngoài, do đó CD

có khả năng tan trong nớc Khi nhiệt độ tăng, độ tan của CD tăng: ở 25C, độ tancủa -CD.CD là1,85 g/100ml (bảng 1.1) và ở 50C, độ tan là 5,628 g/100ml [14]

ở -CD.CD, các nhóm hydroxyl ở C2và C3 của các phân tử glucoza kề nhauquay theo hớng làm cho tơng tác giữa chúng rất chặt chẽ, nên chúng tơng tác kémvới các phân tử nớc ở dung môi bên ngoài Vì vậy độ hoà của -CD.CD tơng đối thấp

Các phân tử khách thể có ảnh hởng đáng kể đến độ tan của CD Một sốhợp chất có thể tạo phức không tan với CD trong khi đó số khác có thể tạo phứctan rất tốt, thậm chí tan tốt hơn CD khi cha tạo phức Hiện tợng này là do cácphân tử khách thể tơng tác với các CD và làm thay đổi hớng quay của chúng Vìvậy, có trờng hợp phức tạo thành từ một chất khách thể với -CD.CD có thể kém tanhơn phức với -CD hay -CD.CD

Khi CD bị biến đổi (thay thế các nhóm hydroxyl bằng metyl hoá, aminhoá, este hoá, ete hoá), độ hoà tan có thể tăng hoặc giảm Chẳng hạn, biến đổinhóm 2-CD hoặc 3-CD.hydroxyl của CD sẽ phá vỡ cầu nối hydro ở miệng vòng CD, làmcho các nhóm hydroxyl tơng tác tốt hơn với nớc, do đó CD trở nên tan tốt hơn

+ Khả năng tan trong các dung môi hữu cơ

Nhìn chung, CD không tan trong hầu hết các dung môi hữu cơ, tuy nhiênchúng tan trong một số dung môi hữu cơ phân cực và aprotic (chẳng hạn metanol,etanol, propanol, isopropanol, axeton )

I.1.2.2 Tính chất hoá học

+ Độ bền hoá học

So với các oligosacarit mạch thẳng thì các CD là những phân tử rất bền Cácaxít mạnh nh axít clohydric có thể thuỷ phân CD, tạo ra hỗn hợp các oligosaccaritkhác nhau (từ mạch thẳng do phân tử CD bị mở vòng cho đến tận glucoza) Tốc

độ thuỷ phân tăng khi nhiệt độ tăng nhng chậm hơn 3 -CD 5 lần so với cácoligosacarit mạch thẳng tơng ứng [5] Trong môi trờng axít yếu nh các axít hữucơ, sự thuỷ phân hầu nh không xảy ra

Cũng nh các oligosaccarit và polisaccarit không có tính khử khác, CDkhông bị thuỷ phân bởi bazơ, thậm chí ở nhiệt độ cao và trong dung dịch kiềm

đặc (trong dung dịch NaOH 0,35N, ở 70C không thấy có sự thuỷ phân CD)

CD khá bền với nhiệt độ, tia UV hay IR Với các tác nhân oxi hoá, CD cóthể bị oxi hoá làm mở vòng glucoza, nhng không tạo ra formaldehyt hay axítfocmic (vốn là các chất độc) do CD không có tính khử

+ Khả năng biến đổi hoá học

Bằng phơng pháp hoá học hoặc enzim có thể thay thế các nhóm hydroxylcủa CD bằng các nhóm khác (metyl, amin, este, ete ) Khi đó đờng kính của CDkhông bị thay đổi nhng chiều sâu của các lỗ hang giảm xuống [5] Mục đích củacác biến đổi này là nhằm làm thay đổi độ hoà tan, thay đổi khả năng tạo phức (độbền phức, độ chọn lọc khách thể) hoặc thêm các nhóm có chức năng đặc hiệudùng xúc tác

I.1.2.3 Phức bao từ CD

"chủ thể", các phân tử đợc bao bọc bên trong đợc gọi là phân tử "khách thể" Cácphân tử khách thể sẽ đợc bao bọc một phần hay toàn bộ vào trong lỗ hang củaphân tử chủ thể CD [9] Nhìn chung, một phân tử CD sẽ bao chứa đợc một phân

tử khách thể Trong trờng hợp chất khách thể có khối lợng phân tử nhỏ hơn hoặclớn hơn, tỷ lệ đó có thể là 1/2 hay 2/1

Kích thớc lỗ hang khác nhau của các CD làm cho chúng ít nhiều có tínhchất chọn lọc khi tạo phức với các phân tử có kích thớc khác nhau Chẳng hạn,phân tử phenyl ăn khớp hoàn toàn với lỗ hang của -CD.CD, nhng với lỗ hang của -CD

CD vẫn còn trống một khoảng không nhỏ do đó phân tử phenyl có thể lung laynhẹ bên trong lỗ Với lỗ hang lớn hơn của -CD.CD, vòng phenyl càng lung lay hơn

do phần khoảng không còn trống lớn hơn.Trong nhiều trờng hợp, những phân tửliên kết đợc với -CD.CD cũng sẽ liên kết với -CD.CD, những phân tử liên kết với -CD.CD

sẽ liên kết với -CD.CD Để phức tạo thành đợc bền, phân tử khách thể cần đợc baokhít bởi lỗ hang CD

I.1.3 ứ ng dụng của phức bao CD

Do có cấu tạo đặc biệt nên CD có khả năng tạo phức bao với nhiều hợpchất, qua đó thay đổi các tính chất lý hoá của chúng.Phức bao CD có thể làm:-CD Thay đổi phản ứng hóa học của phân tử chất khách thể

+ Tạo độ bền cho những chất nhạy cảm với ánh sáng hay oxy

+ Phối trộn đợc các phân tử hoạt động mạnh mà không có bất chắc nào.+ Lựa chọn phản ứng bằng cánh bao bọc các nhóm định chức

-CD Gắn cố định các chất dễ bay hơi

+ Cải tiến quá trình tàng trữ và bảo quản

+ Giảm lợng chất thơm cần thiết nhờ giảm tổn thất

+ Thiết lập đợc công thức về liều lợng cần thiết tốt hơn

-CD Thay đổi các tính chất lý hóa

+ Tăng độ hòa tan hoặc khả năng tạo nhũ cho một số chất

- Trong công nghệ thực

Sử dụng CD để sản xuất dầu ăn, chất thơm, chất màu, vitamin,… -CD.CD đ-CD

ợc dùng để loại bỏ cholesteron trong chất béo của sữa, cũng nh để vận tải các chấtthơm

Nhìn chung tác dụng lớn nhất của CD trong công nghiệp thực phẩm là vừa

có khả năng cố định hơng đồng thời cũng có khả năng che giấu mùi khó chịu chothực phẩm

- Trong công nghiệp dợc

CD đợc ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp dợc với khả năng nổi bật làlàm tăng hoạt tính sinh học của thuốc (thông qua làm tăng độ hoà tan, độ bền, độhấp thụ và làm giảm tác dụng phụ của thuốc)

CD đợc dùng rộng rãi trong các công thức thuốc giảm đau, thuốc chốngnhiễm trùng, thuốc chống dị ứng, co giật, thuốc lợi niệu, các chất chống nghiện [5]

- Trong các quá trình chuyển hoá sinh học và lên men

CD có thể tạo phức với các chất độc hay các chất cạnh tranh sinh học làmgiảm các yếu tố ức chế enzim hoặc vi sinh vật Ngoài ra, CD có thể làm tăng độhoà tan của các cơ chất hữu cơ vốn ít tan trong nớc, tạo điều kiện nâng cao hiệusuất của quá trình

CD có khả năng tạo phức không tan với một số sản phẩm của quá trìnhchuyển hoá do đó có thể dùng để tách chọn lọc sản phẩm

- Trong công nghệ môi trờng

CD đóng vai trò quan trọng trong công nghệ môi trờng nhờ tác dụng làmhoà tan các chất ô nhiễm hữu cơ, hấp thụ và loại bỏ các chất hữu cơ cũng nh cáckim loại nặng từ đất, nớc và không khí bằng quá trình tạo phức

- Trong công nghiệp mỹ phẩm

Tác dụng của CD trong công nghiệp mỹ phẩm là làm ổn định và kiểmsoát hơng thơm, tăng độ tan, chuyển các chất dạng lỏng thành dạng rắn CD đợcứng dụng rộng rãi trong kem đánh răng, kem dỡng da, giấy vệ sinh

- Trong nông nghiệp và công nghiệp hoá học

Phức của CD với nhiều hoá chất phục vụ nông nghiệp nh thuốc diệt cỏ,thuốc trừ sâu, trừ nấm làm tăng độ bền và độ tan của các sản phẩm trên Các

CD làm tăng năng suất ngũ cốc ở những hạt giống đợc sử lý bằng -CD.CD thì sựnảy mầm chậm lại vài ngày nhng năng suất lại cao hơn 20 – 40%so với mẫu đốichứng [5] Trong công nghiệp hoá học, CD đợc dùng rộng rãi để tách các isome,enantiome hay xúc tác các phản ứng Về mặt xúc tác, các CD có thể đợc biến đổi

để có tác dụng xúc tác bắt chớc theo cơ chế của enzim hoặc ảnh hởng đến hoạttính xúc tác của enzim theo hớng kìm hãm hay xúc tiến phản ứng

Tóm lại, nhờ vào cấu trúc đặc biệt của mình, CD đóng góp một phần quantrọng trong nghiên cứu cũng nh trong các lĩnh vực công nghiệp từ mỹ phẩm, thựcphẩm đến dợc phẩm

I.1.4 Phơng pháp sản xuất CD

CD đợc sản xuất bằng con đờng enzim nhờ quá trình chuyển glycozyl hóanội phân tử bằng enzim cyclodextrin glucanotransferaza từ các α-CD.glucan nh tinhbột

Về nguyên liệu, có thể sử dụng các nguồn tinh bột khác nhau nh bột sắn,ngô, gạo, khoai tây, bột mì…[13] Tinh bột trớc hết đợc dịch hóa để phân cắtmạch tinh bột tạo ra các dextrin thích hợp cho quá trình vòng hóa (nhng hạn chếtạo đờng khử) và dịch có độ nhớt phù hợp Theo nhiều nghiên cứu, để phù hợp vớiquá trình CD hóa, dịch tinh bột sau dịch hóa phải có DE thấp, trong khoảng từ 2 -CD

10, tốt nhất là từ 2 -CD 5 [13] Quá trình dịch hóa có thể đợc thực hiện bằng enzimα-CD.amylaza hay CGTaza với điều kiện thích hợp với từng enzim Sau quá trình dịchhóa, phải làm nguội dịch đến nhiệt độ thích hợp cho enzim CGTaza hoạt động tạoCD

Sản phẩm của quá trình CD hoá thờng là một hỗn hợp của α-CD., β-CD., γ- CD

enzim và thời gian phản, khi sử dụng enzim CGTaza làm enzim vòng hóa thì th -CD.ờng thu đợc tỉ lệ giữa α-CD., β-CD., γ- CD tơng ứng là 42, 44 và 14[5] Sau quá trình

CD hóa, cần vô hoạt enzim và tiến hành, tẩy màu, lọc, cô đặc, sấy để nhận đ ợcsản phẩm "thô" là hỗn hợp của các CD với các oligosacarit khác Nếu muốn nhận

đợc từng CD tinh khiết phải qua các công đoạn khác nh kết tinh, dùng chất tạophức chọn lọc (dùng dung môi tricloetylen hoặc brombenzen để kết tủa các CDnhng phơng pháp này có thể gây độc), rồi nhả phức và kết tinh hay dùng phơngpháp siêu lọc Với phơng pháp dùng màng lọc kéo dài nhng cho ta sản phẩm β-CD

CD có độ tinh khiết là 100%, nhng phơng pháp này đắt tiền mà phức tạp Nếukhông nhất thiết độ tinh khiết của sản phẩm là 100% thì để đơn giản và kinh tế cóthể thu hồi CD bằng phơng pháp kết tinh

I.2 tinh bột

I.2.1 cấu trúc phân tử tinh bột

Tinh bột là polysacarit có nhiều trong củ, quả, hạt kích thớc của chúng phụthuộc vào dạng nguyên liệu và dao động trong khoảng khá lớn, có thể từ 1 -CD 120

 m Kích thớc trung bình của tinh bột các loại hạt vào khoảng 10 -CD.15  m Hạttinh bột thờng có dạng hình tròn, hình bầu dục hay đa giác

Hạt tinh bột không đồng nhất mà cấu tạo từ hai polysacarit: amyloza vàamylopectin Tùy theo dạng nguyên liệu và nguồn gốc của chúng, hàm lợngamyloza có thể từ 10 -CD 30%, còn amylopectin 70 -CD 90%

Về cấu tạo hoá học cả amyloza và amylopectin đều có chứa các đơn vị cấutạo là monosacarit glucoza Trong amyloza các gốc glucoza gắn kết với nhau nhờliên kết  -CD 1,4 -CD glucozit thông qua cầu oxi giữa nguyên tử cacbon thứ nhất củaglucza này (nguyên tử cacbon mang tính khử) và nguyên tử cacbon thứ t củaglucoza kia, tạo nên một chuỗi dài 200 -CD 1000 gốc glucoza, vì thế amyloza chỉgồm những mạch thẳng Phân tử amyloza bao gồm một số chuỗi xếp song songvới nhau, trong đó các gốc glucoza của từng chuỗi cuộn vòng lại tạo thành hìnhxoắn ốc Trong các phân tử amylopectin, các gốc glucoza gắn kết với nhau khôngchỉ nhờ liên kết  -CD 1,4 glucozit mà còn nhờ liên kết  -CD 1,6 -CD glucozit, vì vậyamylopectin có cả cấu trúc mạch nhánh, thông thờng có 20 -CD.30 gốc glucoza giữahai điểm phân nhánh Phân tử amylopectin chỉ có một đầu khử duy nhất

I.2.2 tinh bột sắn

Tinh bột sắn có hai thành phần cấu tạo trong đó amyloza chiếm 30% vàamylopectin chiếm 70%, tinh bột sắn có nhiệt độ hồ hoá là 650C -CD 680C, kích thớchạt tinh bột sắn từ 5 -CD 28  m, trung bình 16  m Tinh bột sắn có màu trắng, dịchbột khi hồ hoá có màu trong hơi ngả về xám Tinh bột sắn không có mùi đặc trng,khi hồ hoá dậy mùi đặc trng dễ phân biệt với các loại hồ tinh bột khác Khi hồ

hóa thì độ nhớt tăng nhanh, độ dính rất rất cao so với tinh bột khoai lang và cácloại củ khác.

Tinh bột sắn đợc sử dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm nh dùng

trực tiếp để sản xuất miến, hạt trân trâu hoặc dùng làm nguyên liệu thông qua cáctác nhân hoá học, sinh học để sản xuất các sản phẩm biến tính nh glucoza,maltoza, cồn, mì chính, dextrin…

Trong sản xuất  -CD CD dạng bột thì đi từ nguyên liệu là tinh bột sắn hồhoá dới tác dụng của enzim cyclodextrin glucanotransferaza, vòng hoá tạo  -CD

CD, xử lý và thu hồi  -CD CD vì vậy cần nghiên cứu điều kiện tối u cho enzim xử

lý dịch  -CD CD và điều kiện tối u cho quá trình kết tinh  -CD CD

I.3 enzym

I 3.1 Enzim cyclodextrin glucozyltransferaza (CGTaza)

I.3.1.1 Giới thiệu vè enim CGTaza và nguồn sinh tổng hợp CGTaza

Enzim Cyclodextrin glucozyltransferaza (CGTaza) hay còn gọi làcyclodextrin glucanotransferaza, danh pháp quốc tế là 1,4-CD.α-D-glucan 4-CD.α-CD.D-CD.(1,4-CD.α-CD.D-CD.glucano)transferaza (EC 2.4.1.19) là enzim thuộc họ α-CD.amylaza [24].Enzim này còn đợc xếp vào loại exo-CD enzim và không có khả năng đi qua các

điểm phân nhánh trong phân tử tinh bột Sản phẩm chính dới xúc tác của CGTazatrên tinh bột là α-CD., β-CD., γ-CD CD và các dextrin phân nhánh phân tử lợng cao (gọi làdextrin giới hạn CGTaza) Trong khi các enzim amylaza chủ yếu là thuỷ phân cáccầu nối glycozit trong phân tử tinh bột thì CGTaza chủ yếu là xúc tác phản ứngchuyển glucozyl hoá với hoạt tính thuỷ phân tơng đối thấp

CGTaza đợc sinh tổng hợp từ nhiều chủng vi khuẩn thuộc giống Bacillus,

nh B.macerans, B.ohbensis, B.stearothermophilus, B.firmus, B licheniformis, B.agaradhaerens… và từ các chủng khác nh Flavobacterium sp., Klebsiella pneumoniae, Brevibacterium, Micrococcus sp.[10] Các chủng này còn đợc đột

biến hay tái tổ hợp gen nhằm có đợc một đặc tính mong muốn nào đó

Enzim từ các nguồn khác nhau có tính chất và độ đặc hiệu sản phẩm khác

nhau Enzim tạo α-CD CD chủ yếu là các enzim từ B.macerans, B.stearothermophilus và Klebsiella oxytoca Enzim sản xuất β-CD.CD là các enzim

từ B.circulans, B.licheniformis, B.megaterium, B.ohbensis, các Bacillus sps kiềm tính và Thermoanaerobacter sp Còn γ-CD.CD đợc tạo chủ yếu từ các enzim của B.firmus, B subtilis, Bacillus sp AL6 [11].

I.3.1.2 Cơ chế tác dụng của CGTaza

Cơ chế xúc tác của CGTaza rất phức tạp Nhìn chung có thể thấy giai đoạn

đầu là khử trùng hợp phân tử tinh bột, tiếp theo đó là giai đoạn chuyển glucozylhoá nội phân tử [5] CGTaza có thể xúc tác 4 phản ứng (hình 1.3) với tốc độ khácnhau:

Hình 1.2 Sơ đồ các phản ứng do CGTaza xúc tác (hình tròn biểu thị phân tử glucoza, đầu màu trắng là đầu khử) a) Phản ứng thuỷ phân, b) phản ứng trao

ở đây G(n) là chất cho

G(m) là chất nhận

x là số gốc glucoza đợc trao đổi

Phản ứng này cũng gặp ở một số enzim khác thuộc họ α-CD.amylaza nhamylomaltaza (EC 2.4.1.25)

Hình 1.3 Mô hình trung tâm hoạt động của CGTaza từ B.circulans [5].

Bevetto (1988) đã đa ra giả thiết là: enzim này có hai trung tâm Một trungtâm chịu trách nhiệm gắn chất cho (gồm 5 tâm phụ và đảm nhận sự thuỷ phân, làphần nằm giữa tâm phụ thứ ba và thứ t) và một trung tâm chịu trách nhiệm gắnchất nhận (có ái lực mạnh đối với một gốc glucoza tận cùng của đầu không khử,nằm ở điểm cách khoảng 2 đơn vị glucoza) (hình 1.3) Sự thuỷ phân sẽ xảy ra saukhi đã chuyển glucozit đến tận gốc glucoza không khử tận cùng [5]

Nh vậy hoạt tính tạo vòng chỉ là một phần trong các hoạt tính xúc tác củaCGTaza Điều đó làm cho các phản ứng tạo CD từ tinh bột do CGTaza xúc tác cóhiệu suất không cao Nh trên có thể thấy, phản ứng tạo vòng xuất phát từ sựchuyển glucozyl hoá nội phân tử và là phản ứng đợc dùng để tạo CD từ các chuỗitinh bột có nhiều hơn 6 gốc glucopyranozyl Từ các chuỗi cơ chất có từ 2 đến 6

đơn vị glucoza (từ maltotrioza đến maltopentoza), CGTaza có khả năng tổng hợpnên các oligome có phân tử lợng lớn hơn bằng phản ứng trao đổi (2) (nhờ phảnứng này mà CGTaza có thể đợc sử dụng để chuyển các oligosacarit từ các chấtcho nh cyclodextrin hay tinh bột đến các chất nhận khác, tạo ra các hợp chấtglucozyl khác nhau, sau đó mới tạo CD bằng phản ứng vòng hoá (3) Phản ứngkết hợp (4), cũng là phản ứng chuyển glucozyl hoá nội phân tử, làm mở vòng CD

và chuyển các maltooligosacarit tạo ra đến các chất nhận nh là maltoza Trong

Tâm để gắn đầu mạch không khử

Tâm xúc tác

Chuỗi α-CD.glucan

Tâm để gắn mạch α-CD.glucan

dịch phản ứng tạo CD, phản ứng kết hợp sẽ xảy ra sau khi có mặt CD và một số

đồng cơ chất khác, nh glucoza, maltoza và maltotrioza Đây là phản ứng cạnhtranh với phản ứng tạo vòng, làm giảm hiệu suất tạo CD Vì vậy trong sản xuất

CD, dịch tinh bột có DE càng thấp sẽ cho hiệu suất tạo hàm lợng CD càng cao[10]

CGTaza và một số α-CD.amylaza khác đợc coi là enzim loại exo (enzim ngoạiphân tử) vốn phân cắt mạch tinh bột từ đầu không khử của chúng Nhng cácnghiên cứu về tác động của CGTaza trên amiloza đã cho thấy enzim này tấn côngcác cơ chất có phân tử lợng lớn theo lối endo Vì vậy CGTaza vẫn có thể phân cắt

dễ dàng các mạch tinh bột có phân tử lợng lớn Tuy nhiên, đứng về phơng diệntạo CD, các chuỗi amiloza dài không phải là cơ chất tốt nhất của enzim này

Các yếu tố ảnh hởng đến hoạt động xúc tác của CGTaza cũng tơng tự nh

đối với một enzim nói chung Đó là nồng độ dịch tinh bột, nồng độ enzim, pH,nhiệt độ, các chất hoạt hoá và kìm hãm…

I.3.2 Enzim Glucoamilaza (enzim đờng hóa):

I.3.2.1 giới thiệu về ezim Glucoamilaza và các nguồn sinh tổng hợp glucoamilaza:

Glucoamilaza  -CD 1,4 glucan-CD glucohydrolaza Glucoamilaza có khả năngcắt đứt từng đơn vị glucoza từ đầu không khử của tinh bột Khi thủy phân tinh bộtbởi glucoamilaza cũng có thể tạo ra oligosaccharit Glucoamilaza cũng có thểthủy phân liên kết -CD 1,6 – glucozit trong các oligo và các polisacarit Do đó còn

có tên gọi hệ thống  1,4 : 1,6 – glucan 4 : 6 glucohydrolaza Ngoài raglucoamilaza còn có khả năng phân cắt mối liên kêt  -CD 1,2 và -CD 1,3 –

glucozit Glucoamilaza cũng có khả năng phân cắt glucogen, amilopectin, dextringiới hạn, izomaltoza, maltoza đến glucoza chính vì vậy mà nó đợc gọi là enzim

đờng hóa [1]

Glucoamilaza có nhiều ở vi sinh vật, gan động vật Vào năm 1948Glucoamilaza đã đợc carman và langlykbe tìm thấy trong canh trờng nuôi cấynấm mốc Rhizopus và aspergillus Năm 1956 glucoamilaza đã đợc kitahara và

katushina tách ra lần đầu tiên từ chủng nấm mốc Aspergilus awamori.[7]

Glucoamilaza có trong dịch tiêu hóa của ngời, động vật và có cả trong hạtnảy mầm đặc biệt glucoamilaza có nhiều trong nấm mốc và nấm mem

Glucoamilaza có nguồn gốc từ nấm mốc có tính bền nhiệt cao, nhng có thểlẫn transglucozilaza là enzim có khả năng thực hiện chuyển hóa các nhómglucozit đến phân tử oligsacarit để tổng hợp nên các oligosacarit có trọng lợng

phân tử cao hơn và có chứa các liên kêt  -CD 1,6 glucozit Trong quá trình thủyphân tinh bột thì transglucozilaza là enzim không có lợi.

Cho đến nay ngời ta thu nhận glucoamilaza chủ yếu từ các giống nấm mốc

aspergillus, Rhizopus và một loài của neurospora …

I.3.2.2 Tác dụng của enzim trong thủy phân tinh bột:

Glucoamilaza là một exoenzim (enzim ngoại phân tử) do nó có tác độngmột cách có trật tự lên mạnh tinh bột, lần lợt tách từng gốc glucoza ra khỏi mạch

từ đầu không khử Glucoamilaza thủy phân theo cơ chế đa mạch Trong quá trìnhthủy phân, glucoamilaza phân cắt các liên kết -CD.1,4 glucozit và -CD 1,6 glucozit tạo raglucoza và các oligosacarit Sau đó nó lại phân cắt tiếp các oligosacarit bắt dầukhông khử tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucoza

Khả năng thủy phân tinh bột thành glucoza của các loai enzimglucoamilaza thu đợc từ các nguồn khác nhau thì khác nhau

I.3.3 Các yếu tố chính ảnh hởng đến hoạt động của enzim

Có nhiều yếu tố ảnh hởng đến hoạt động của enzim nh nhiệt độ, pH, nồng

độ cơ chất, nồng độ enzim, các chất kìm hãm, các chất hoạt hóa…

I.3.3.1 ảnh hởng của nồng độ cơ chất

Năm 1913, leonon Michaelisvà Maud Menten đã đa ra mô hình để giảithích tính chất động học của phản ứng enzim và đã lập đợc phơng trình biểu diễnmỗi quan hệ giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất của enzim

Đặc điểm quan trọng nhất của mô hình này là: mở đầu phản ứng cần tạophức trung gian enzim – cơ chất (ES) Sau đó phức ES chuyển hóa tiếp thành tạothành sản cuối cùng của phản ứng và enzim tự do, enzim lại kết hợp với phân tửcơ chất khác bắt đầu vòng xúc tác mới

ảnh hởng của nồng độ cơ chất đối với enzim đợc thể hiện qua phơng trìnhMichaelis-CD.Menten:[6]

 

] [

.

max

S K

S v v

[S] : nồng độ cơ chất

Km : Hằng số Michaelis, thể hiện ái lực giữa enzim và cơchất

Nh vậy ở nồng độ cơ chất rất thấp, v phụ thuộc tuyến tính vào [S] ở nồng

độ cơ chất lớn, vận tốc phản ứng đạt cực đại và không phụ thuộc [S] Nếu nồng độcơ chất bằng Km thì vận tốc phản ứng bằng một nửa vận tốc cực đại [6]

I.3.3.2 ảnh hởng của nồng độ enzim

Đối với các enzim nói chung, trong điều kiện thừa cơ chất, vận tốc phảnứng phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzim:

v = k [E] với [E] là nồng độ enzim

Cũng có trờng hợp khi nồng độ enzim quá lớn, vận tốc phản ứng tăngchậm

I.3.3.3 ảnh hởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hởng rất nhiều đến hoạt độ của enzim,đôi khi còn ảnh hởngtới chiều hớng phản ứng Nhiệt độ mà tại đó hoạt độ của enzim là cao nhất gọi lànhiệt độ tối u của enzim (topt) mỗi một loại enzim có một nhiệt độ tối u khácnhau Nhng nhiệt độ topt của mỗi enzim không cố định mà có thể thay đổi tùy cơchất, pH môi trờng, thời gian phản ứng… nhiệt độ mà tại đó enzim bị mất hoàntoàn hoạt tính xúc tác gọi là nhiệt độ tới hạn, nhiệt độ tới hạn của enzim thờngkhoảng trên 700C ở nhiệt độ này enzim bị biên tính, ít có khả năng phục hồi đợchoạt độ Ngợc lại ở 00C hoạt độ của enim bị giảm nhng lại có thể phục hồi khi đa

về nhiệt độ bình thờng

I.3.3.4 ảnh hởng của pH môi trờng

pH có ảnh hởng rất lớn đến hoạt độ của enzim, thông thờng pH tối u choenzim hoạt động là 7 Tuy nhiên cũng có một số enzim có pHopt rất thấp (pepxin,proteinaza axit của vi sinh vật…) hoặc khá cao (subtlizin, pHopt > 10) pH tối ucủa enzim cũng không cố định mà phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nh cơ chất,tính chất của dung dịch đệm, nhiệt độ

I.3.3.5 ảnh hởng của các chất kìm hãm

Hoạt độ của enzim có thể bị thay đổi dới tác dụng của một số chất có bản

chất hóa học khác nhau Các chất làm giảm hoạt độ của enzim nhng không bịchuyển hóa bởi enzim gọi là chất kìm hãm hoặc ức chế Các chất này có thể làcác ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ kể cả protein

I.3.3.6 ảnh hởng của các chất hoạt hóa

Các chất hoạt hóa làm tăng hoạt độ xúc tác của enzim Các chất hoạt hóathờng có bản chất khác nhau, có thể là các anion, các ion kim loại nằm từ ô thứ1đến ô thứ 55 của bảng nguyên tố tuần hoàn mendeleev hoặc các chất hữu cơ cócấu tạo phức tạp hơn làm nhiệm vụ chuyển nhóm hydro hoặc những chất có khảnăng phá vỡ một số liên kết tiềm enzim hoặc các chất có tác dụng phục hồi nhữngnhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzim Tuy nhiên tác dụng hoạt hóachỉ có giới hạn ở những nồng độ xác định, vợt quá giới hạn này có thể làm giảmhoạt độ của enzim

Chơng II: Nguyên liệu và phơng pháp nghiên cứu

II.1 nguyên liệu

xỉ 1,2 g/ml Sản phẩm AMG không chứa transglucosidaza Theo khuyến cáo củanhà sản xuất thì AMG hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 600C và pH 4,5[1].II.1.3 Than hoạt tính

-CD và các thiết bị khác của phòng thí nghiệm

ii.3 phơng pháp nghiên cứu

II.3.1 Phân tích DE:

Xác định DE theo phơng pháp axit dinitrosalicylic của Miller

II.3.1.3 Hoá chất

-CD Thuốc thử DNS là hỗn hợp DNS (2-CD.Hydroxy-CD.2,5-CD dinitrobenzoic axit-CD.C7H4N2O7)0,25 g

Và muỗi Tartrat kép (KNaC4H4O6 4H2O 75 g, pha trong 50 ml dung dịch Natrihydroxit (NaOH) 2N (4 g NaOH trong 50ml nớc cất) định mức đến 250ml bằngnớc cất.Để 1-CD 2 ngày cho ổn định, lọc qua giấy lọc Bảo quản trong bình có đậylắp, tối màu

-CD Glucoza tinh khiết (>99%)

II.3.1.4 Tiến hành

+ Dựng đồ thị chuẩn glucoza

-CD Pha dãy dung dịch glucoza chuẩn có nồng độ 1, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 50 mM.-CD Cho 1ml mỗi dung dịch chuẩn trên vào ống nghiệm khô sạch

-CD Thêm vào mỗi ống nghiệm 3ml thuốc thử DNS

-CD Đun sôi mẫu 5 phút, làm lạnh nhanh đến nhiệt độ phòng

-CD Đo mật độ quang của mẫu ở bớc sóng 570nm , mẫu đối chứng là nớc cất

-CD Vẽ đờng chuẩn glucoza, với trục tung là mật độ quang, trục hoành là nồng độglucoza

+ Xác định hàm lợng đờng khử trong mẫu

Mẫu dung dịch đem phân tích, nếu cần phải pha loãng sao cho mật độquang nằm trong khoảng 0,2 -CD 0,8 Pha hỗn hợp phản ứng rồi đo mật độ quang

nh phần dựng đồ thị chuẩn Từ kết quả đo đợc và căn cứ vào đờng chuẩn, xác

định đợc hàm lợng glucoza trong mẫu

trong đó: a: lợng đờng khử trong mẫu đo (g)

b: tỷ lệ pha loãng mẫuc: nồng độ phần trăm chất khô (oBx)

II.3.2 Xác định hàm lợng CD trong mẫu

Hàm lợng CD trong mẫu đợc xác định theo phơng pháp hoá học củaVikmon

II.3.2.1 Cơ sở phơng pháp

Dựa trên phản ứng giữa CD và thuốc thử phenolphtalein trong dung dịch

Na2CO3(vốn có mầu hồng) CD làm giảm màu hồng của thuốc thử, do đó hàm l-CD.ợng của nó trong mẫu tỷ lệ nghịch với cờng độ màu của hỗn hợp phản ứng

II.3.2.2 Hoá chất

-CD Dung dịch phenolphtalein dự trữ 1% pha trong dung dịch cồn 60%

-CD Dung dịch thuốc thử phenolphtalein 0,02% pha trong dung dịch Na2CO3 5mM.Chỉ pha ngay trớc khi sử dụng (pha từ dung dịch dự trữ)

-CD Dung dịch NaOH 30mM

-CD CD chuẩn (dạng bột trắng) của hãng Wako (Nhật bản)

Phần iii: kết quả nghiên cứu và thảo luận

Để sản xuất ra β-CD.CD thì đề tài này đã kế thừa kết quả của các nghiên cứutrớc đó đã đa ra các điều kiện thích hợp để tạo ra dịch CD hóa có nhiều CD nhất

Quy trình công nghệ sản xuất dịch CD đợc miêu tả ở hình 3.1:

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình sản xuất dịch CD(46)

Thuyết minh quy trình công nghệ sản xuất dịch CD hóa:

-CD Chuẩn bị dịch để dịch hóa:

+ Dịch tinh bột 10% pha trong đệm natriaceta – photphat pH 5.5

+Bổ sung 2%v/w (so với hàm lợng tinh bột) enzim CGTaza(sử dụng chếphẩm có tên thơng mại là toruzim, của hãng Novo Đan Mạch)

-CD Dịch hóa:

+ Nhiệt độ dịch hóa là: 800C

+Thời gian dịch hóa là: 15 phút

Sau quá trình dịch hóa thu đợc dịch sau dịch hóa có Bx = 10, DE = 3

-CD Dịch sau dịch hóa đợc làm nguội xuống khoảng 600C

CGTaza 1%

CGTaza 2%

Dịch tinh bột 10% pha trong đệm Na-CD.p pH 5,5

Dịch hóa 80oC, 15 phút

CD hóa 55oC, 8h

Dịch CD hóa