Genetic analysis for the resistance to small brown planthopper (laodelphax striatellus fallén) in two rice varieties

Genetic analysis for the resistance to small brown planthopper Laodelphax striatellus Fallén in two rice varieties B y Le Quang Tuyen A Dissertation Submitted to Nanjing Agricultural U

Genetic analysis for the resistance to small brown

planthopper (Laodelphax striatellus Fallén) in two rice

varieties

B y

Le Quang Tuyen

A Dissertation Submitted to Nanjing Agricultural University

In Partial Fulfillment of the Requirements for the

Doctoral Degree

Supervised by Professor

Wan Jianmin

College of Agronomy Nanjing Agricultural University Nanjing 210095, P R China

原 创 性 声 明

本人郑重声明：所呈交的学位论文、是本人在导师的指导下、独立进行研究工作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外、本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰 写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体、均已在文中以明确方式标明。 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。

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本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定、同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版、允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索、可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编学位论文。

保密□、在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密□。

（请在以上方框内打“√”）

学位论文作者（需亲笔）签名： 年 月 日

导师（需亲笔）签名： 年 月 日

目 录

目 录

摘 要 I ABSTRACT III 英文缩略表 V

第一章 文献综述 1

第一节稻飞虱的生物学特性及其危害 1

1 灰飞虱 Laodelphax striatellus (Fallén) 2

1.1 灰飞虱的形态特征 2

1.2 灰飞虱的生活习惯特性 2

1.3 灰飞虱的分布、发生及危害 3

1.3.1 灰飞虱对水稻直接取食造成损失 3

1.3.2 灰飞虱对水稻条纹病毒病的传毒机制及其危害 4

1.3.3 灰飞虱对水稻黑条矮缩病病毒的传毒特性及其危害 6

1.4 灰飞虱的遗传多样性研究 8

2 褐飞虱 Nilaparvata lugens (Stål) 8

2.1 褐飞虱的生物学特性 8

2.2 褐飞虱在世界的分布和危害 8

3 白背飞虱 Sogatalla furcifera (Horváth) 11

3.1 白背飞虱的生物学特性 11

3.2 白背飞虱的分布及其危害 11

第二节水稻抗稻飞虱遗传基础研究 12

1 水稻抗褐飞虱遗传基础研究 12

2 水稻品种对白背飞虱抗性的遗传分析 14

3 水稻抗灰飞虱遗传基础研究 15

第三节植物抗虫的三种类型 16

1 植物对害虫的抗生性机制 16

2 植物对害虫的趋避性机制 16

3 植物的耐虫性机制 17

第四节本研究的目的及意义 19

第二章 水稻品种 Rathu Heenati 抗灰飞虱基因的分子定位 21

1 材料与方法 22

1.1 材料 22

1.2 灰飞虱的饲养与繁殖 23

1.3 抗灰飞虱鉴定 23

1.3.1 苗期集团接种法 （Standard Seedling-box Screening Test） 23

1.3.2 趋避性检测 25

1.3.3 抗生性检测 25

1.4 DNA 样品制备 26

1.5 SSR 标记分析 26

1.5.1 试剂 26

1.5.2 PCR 反应体系 27

1.5.3 PCR 反应程序 27

1.5.4 SSR 标记的 PCR 产物检测 27

1.6 连锁图谱的构建 27

1.7 QTLs 定位 28

1.8 数据分析 28

2 结果与分析 29

2.1 亲本 Rathu Heenati 和 02428 表现 29

2.1.1 亲本和对照品种的抗虫性表现 29

2.1.2 SSR 分子标记在基因组的分布频率 30

2.2 利用 02428/Rathu Heenati F2 群体检测灰飞虱抗性 QTL 30

2.2.1 F2 群体分子遗传连锁图谱的构建 30

2.2.2 苗期集团鉴定检测 F2 群体中抗灰飞虱 QTL。 32

2.2.3 F2 群体中灰飞虱趋避性相关 QTL 检测 35

2.2.4 抗生性 QTL 定位 36

2.3 利用 02428/Rathu Heenati//02428 BC1 群体分析水稻抗灰飞虱 QTL 38

2.3.1 BC1分子遗传连锁图谱的构建 38

2.3.2 苗期集团鉴定检测抗灰飞虱 QTL 40

2.3.3 BC1群体趋避性相关QTL 检测 42

2.3.4 BC1群体灰飞虱抗生性相关QTLs 的检测 43

3 讨论 43

3.1 水稻第 12 染色体存在一个抗灰飞虱主效 QTL 43

3.2 水稻第 12 染色体 RM519-RM3331 之间存在稻飞虱基因簇该区间与吸汁类 害虫抗性密切相关 45

第三章 利用昌恢 891/02428 F 群体检测灰飞虱抗性QTL 47

目 录

1 材料与方法 48

1.1 植物材料 48

1.2 灰飞虱的饲养与繁殖 48

1.3 试验方法 48

2 结果与分析 49

2.1 苗期集团鉴定法检测抗灰飞虱 QTLs 49

2.1.1 亲本昌恢 891 和 02428 抗性表现 49

2.1.2 149 个 02428/昌恢 891 F2：3家系对灰飞虱抗性表现 49

2.1.3 抗灰飞虱 QTL 定位 50

2.2 抗生性测验及 QTL 定位 51

2.3 趋避性抗性相关 QTL 的检测 52

3 讨论 53

第四章 全文结论 55

参考文献 57

在读期间发表论文 73

附 录 75

致 谢 77

1几几几几几几 Rathu Heenati 几几几几几几几几 02428 几几几几几几几几几 162 几几几几02428/Rathu Heenati F2几 150 几几几几 02428/Rathu Heenati//02428 BC1几几几几几几几 162

F2几3几几几 150 几 BC1F2几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几 Windows QTL Cartographer 2.5 几几几几几几几几 F2几几几几几几 3 几几几几 QTLs几qSBPH2-b1, qSBPH5-

qSBPH12-a1 几 qSBPH4-a 几 BC1几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几 QTLs几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几

2几几几几几几几几几几几 891 几几几几几 02428 几几几几几几 149 几几几几 F2几几几几几几几

关键词:几几(Oryza sativa L.)几几几几几QTL几几几几几几几几几几几几

Genetic analysis for the resistance to small brown planthopper

(Laodelphax striatellus Fallén) in two rice varieties

ABSTRACT

Rice (Oryza sativa L.) is the staple food for more than 50% of the world’s

population，although insect pests are the major biotic constraints to production of this

crop The Small brown planthoper，Laodelphax striatellus Fallén (Homoptera:

Delphacide)， is one of the most destructive and wide spread insect pests found throughout the temperate rice-growing regions such as China，Japan and Korea The

population of Laodelphax striatellus Fallén has increased steadily due to alteration of the cropping system and infested South East China The dults and nymphs of Laodelphax

striatellus Fallén suck rice sap causing yellowing of leaves，wilting and eventually death

resulting in yield loss.The pest also transmits viral diseases such as Rice stripe virus，and

rice black streaked dwarf virus causing further yield loss Chemicals have mostly been used

to control Laodelphax striatellus Fallén，although it has developed resistance to most of

them Use of these chemicals has also resulted into death of natural enemies and pollution

of the environment leading to the resurgence of the pest Development of resistant varieties

is the most effective and economical way in controlling this pest The feeding behavoiur of the pest was evaluated on two rice varieties bearing resistance genes derived from three basic resistance mechanisms : antibiosis，antixenosis and tolerance by identifying the resistance genes in rice varieties with the help of the QTL

1 A set of F2 and BC1 population derived from the cross between 02428 and Rathu Heenati were used to investigate the small brown planthopper resistance loci Using the F2

population，three QTLs for antixenosis resistance were located on chromosome 2，5 and 6，respectively accounting for 30.75% of the phenotypic variance The QTL on chromosome 2 was also identified in BC1 population Three QTLs for antibiosis against the pest were detected on chromosome 8，9 and 12，respectively in F2 population qSBPH5-c

explaining 7.21% of phenotypic variance for antibiosis against the insect was identified on chromosome 5 using BC1 population A major QTL qSBPH12-a1 explained about 40% of phenotypic variance and a minor QTL (qSBPH4-a) were detected by SSST method using

both the F2 and BC1 population The QTLs identified in present study will be useful for

mark assisted selection for SBPH resistance in rice

2 The Japonica rice 02428 and the indica rice Changhui891，was used to detect

quantitative trait loci (QTLs) for the resistance to SBPH Modified seedling screening test (MSST)，along with antixenosis test and antibiosis test were applied to evaluate the resistance response of the two parents and 149 plant F2 to the insect and composite interval mapping (CIM) was used for QTL analysis When the resistance was measured by MSST method，two QTLs conferring resistance to Small brown planthopper were mapped on

chromosome 6 and chromosome 7 namely qSBPH6-a and qSBPH7-a，with log of odds

(LOD) scores 2.61 and 2.91，respectively; and two QTLs explained 8.75% and 13.1% of

the phenotypic variance in this population，respectively Two QTLs，namely qSBPH1-c and qSBPH2-c, expressing antibiosis to SBPH were mapped on chromosomes 1 and 2，

respectively，explaining 30.16% of the total phenotypic variance

Keywords: Rice; SBPH ( Laodelphax striatellus Fallén); Resistance; Quantitative trait

loci(QTL)

CIM composite interval mapping 复合区间作图

DH doubled haploid 双单倍体

DIBA dot-immunobinding assay 斑点免疫法

EST expressed sequence tags 表达序列标签

RSV rice stripe virus 水稻条纹病毒

SBPH small brown planthopper 灰飞虱

SSR simple sequence repeat 简单序列重复

SSST standard seedbox screening test 标准苗期筛选法 STS sequence-tagged site 标记序列位点

WBPH whitebacked planthopper 白背飞虱

第一章 文献综述

第一章 文献综述

第一节 稻飞虱的生物学特性及其危害

水稻(Oryza sativa L.)是世界主要粮食作物之一。水稻病虫害是制约水稻高产、稳产的主要因素。稻飞虱(图1-1)属同翅目（Homoptera）、飞虱科（Delphacide）、是一种世界著名的迁飞性害虫、是水稻的主要害虫之一、严重影响水稻的产量及其品质。稻飞虱俗名火蠓、响虫、火旋、稻虱子等、常见的有三种：褐飞虱、白背飞虱和灰飞虱。三种飞虱以褐飞虱 (Nilaparvata lugens Stål)为主、白背飞虱（Sogatella

furcifera Horvath）次之、灰飞虱（Laodelphax striatellus Fallén）更次之。

灰飞虱 (Laodelphax striatellus)

Small brown planthopper

褐飞虱 (Nilaparvata lugens ) Brown planthopper

白背飞虱（Sogatella furcifera ）

Whitebacked planthopper

图 1-1： 稻飞虱 Figure 1-1: Rice planthopper一般年份、这类害虫的危害、可使水稻减产1 成以上、大发生年可减产 2-3 成。稻飞虱以刺吸式口器刺入稻株组织吸取汁液、造成各种不规则的白色或褐色条斑、并以产卵器刺伤叶鞘、嫩茎和叶中脉等组织、产卵于其中、使稻株枯黄或倒伏、严重为害时、可在短期内导致全田叶片焦枯、状似火烧、稻丛基部变黑发臭、常引起烂杆倒伏。秕谷粒增加、千粒重显著下降、农民比喻为：“远看似火烧、近看禾杆

倒、镰刀割不起、吊吊轻飘飘”。另外、稻飞虱还能传播病毒或诱发水稻病害、例如、水稻病毒病—草状丛矮病（Grass Stunt）和齿叶矮缩病（Ragged Stunt）等（程遐年等、2003）。褐飞虱只为害水稻。而灰飞虱和白背飞虱除为害水稻外、尚可为害麦类、甘蔗、玉米、茭白、紫云英、稗草、看麦娘和游草等（朱绍先等、1984）。灰飞虱能传播水稻黑条矮缩病（Rice black streaked dwarf virus, RBSDV）和条纹叶枯病(Rice stripe virus、 RSV)等水稻病毒病(Heinrichs 等、1985；Ramirez 等、1994；林奇英等、1990；汪恩国等、2000；顾伯良等、2005；丁锦华等、2002；刘向东等、2006；王华第等、2007)、以及小麦丛矮病和玉米矮缩病等。

1 灰飞虱 Laodelphax striatellus (Fallén)

1.1 灰飞虱的形态特征

长翅型雌虫体长4-4.2mm、短翅型 2.4-2.8mm。全体淡黄褐或灰褐色、小盾片中央黄白色、土黄色或黄褐色、两侧各有１个半月形褐色斑纹。短翅型雌虫翅伸达腹末。长翅型雄虫体长3.5-3.8mm、短翅型 2.1-2.3mm、色较雌虫深、小盾片黑色。头、胸部背面：头顶方形、略突出于复眼前方。前胸背板比头顶稍短、两侧脊略弯曲、不伸达后缘。头顶基半部与前胸背板淡黄色、头顶端半部侧脊与中脊间黑褐色。雄虫中胸背板黑色、后缘淡黄色（程遐年等、2003）。

卵前期为香蕉形、中后期为长茄子形、通常3－5 粒到 20 余粒排列成串、成簇、前部单行、后部挤成双行。

若虫近椭圆形、1－2 龄时乳白或黄白色、3 龄后灰褐相嵌、落于水面后足向后斜伸成“八”定形。

1.2 灰飞虱的生活习惯特性

灰飞虱属于温带地区的害虫、耐低温能力较强、对高温适应性较差、其生长发育的适宜温度为15℃-28℃左右、最适生长、繁殖温度为 25℃-28℃、卵和若虫在 15℃-25℃下发育速率直线加快、但在 30℃或 32.5℃时直线关系不复存在（Hachiya,

1990）。灰飞虱能越冬、冬季低温对其越冬若虫影响不大、灰飞虱在 10℃以下开始越冬（高东明等、1994）及其有较强的抗寒能力、其越冬温度在-7℃左右（孔兴全等、2000）。在中国的北方稻区灰飞虱以 2-5 龄若虫在杂草丛中越冬（林志伟等、2004）。在日本的大部分地区、灰飞虱主要以4 龄若虫及少量 3 龄若虫滞育越冬（Mishiro 等、1994）。在韩国、灰飞虱以 2-5 龄若虫越冬(Bae 等、1995)。

水稻是灰飞虱的主要寄主植物之一。在水稻田中、灰飞虱的成虫和若虫一般聚

第一章 文献综述

集在稻丛下部的叶鞘上取食、离水面3-6cm 处若虫较多、而成虫多聚集在离水面 12cm 处。水稻抽穗后、许多灰飞虱的成虫和若虫转移到水稻上中部和穗部进行取食。灰飞虱的成虫有着明显的趋绿性、对嫩绿、高大、多分蘖、茂密的稻苗尤喜、在生长嫩绿、营养丰富的稻苗上取食后、灰飞虱的繁殖力和存活率特别高、因此、早播、早栽、氮肥多、生长嫩绿茂盛的稻田虫口密度大。此外、成虫和若虫也具有一定的趋光性（王德民等、1992）。

1.3 灰飞虱的分布、发生及危害

1.3.1 灰飞虱对水稻直接取食造成损失

在稻田中、灰飞虱直接刺吸危害、成虫及若虫群集于稻丛基部、刺吸茎叶组织汁液、消耗稻株养分、严重影响光合作用、使谷粒不饱满、千粒重减轻、瘪谷率增加、稻米品质降低、未治的严重田块可减产达30％以上（张景飞等、2005）。虫量多时、受害重时引起稻株下部变黑、腐烂发臭、瘫痪倒伏、导致严重减产或失收。产卵的时候也危害、产卵时刺伤稻株茎叶组织、形成大量伤口、促使水分由刺伤点向外散失、同时输导组织破坏、同化作用减弱、加速稻株倒瘫。

在中国、灰飞虱分布极广、北至黑龙江漠河、东至沿海各省和台湾、南到广东、西达新疆吉昌、所有水稻种植区都有灰飞虱的分布。中国北方地区1 年发生 4－5 代。华北地区越冬若虫于4 月中旬至 5 月中旬羽化、迁向杂草地产卵繁殖、第 1 代若虫

于5 月中旬至 6 月大量孵化、5 月下旬至 6 月中旬羽化、第 2 代若虫于 6 月中旬至

7 月中旬孵化、并于 6 月下旬至 7 月下旬羽化为成虫、第 3 代于 7 月至 8 月上、 中旬羽化、第4 代若虫在 8 月中旬至 11 月孵化、9 月上旬至 10 月上旬羽化、有部分则

以3-4 龄若虫进入越冬状态、第 5 代若虫在 10 月上旬至 11 月下旬孵化、并进入越冬期、全年以9 月初的第 4 代若虫密度最大、大部分地区多以第 3-4 龄和少量第 5 龄若

虫在田边、 沟边杂草中越冬。特别、长江中下游及华北稻区发生较多、为害较重。据江苏省农科院1955 年测定、严重被害株的千粒重比健株轻 8.92g、株高降低

33cm、穗长和每穗粒数分别降低 5.49cm 和 28.5 粒、而半实粒和不实粒则分别增加36.3％和 3.20％、减产率达 41.5％。1958 年河北、天津大发生、占稻田总面积的

64.4％、减产程度一般为 20-30％、重达 50％以上。武清县因被害而造成大面积颗粒无收（浦茂华、1963；朱绍先等、1984）。2004 年浙江省灰飞虱发生面积达

24.08 万公顷(乔慧等、2009）。

另外、灰飞虱还广泛分布于朝鲜、日本、印度尼西亚、原苏联、蒙古、保加利亚、匈牙利、英国、德国、土耳其和太平洋岛屿等。在热带国家如菲律宾、越南、北苏门答腊和印度支那的高原水稻上也发现灰飞虱(Kisimoto, 1989；Wilson 和 Claridge, 1991)已给这些国家的农业生产造成严重损失。

1.3.2 灰飞虱对水稻条纹病毒病的传毒机制及其危害

水稻条纹病毒(Rice stripe virus、 RSV)是一种负单链 RNA(-ssRNA)病毒、是纤细病毒科(Tenuiviridae)、纤细病毒属(Tenuivirus)的代表种(Murphy 等、1995)。由

RSV 引起的水稻条纹叶枯病是一种非常重要的水稻病毒病、在日本、朝鲜、韩国、乌克兰和中国均有发生(Toriyama, 1982)。灰飞虱是水稻条纹病毒（RSV）的传播媒介、以持久方式经卵传播、能连续传毒或间歇传毒、灰飞虱的雌雄个体成虫及若虫均可传毒、但雌虫传毒效率比雄虫要高(shinkai, 1966；Toriyama, 1983；Gingery, 1988)。灰飞虱最短获毒时间为 10-15 分钟、病毒在介体内的循回期为 3-30 天(刘玉彬、1989；刘玉彬等、1990；林莉等、1990；林奇英等、1991)。

带毒灰飞虱刺吸植物、植株染病后终身带毒、并可经卵传给下一代（Hibino,

1989；Wu 等、2001）、且能在体内增殖。带毒的灰飞虱通过刺吸健康的寄主植物、将病毒传播给健康植物、一般地说、传播能力不断下降、但那些不能将病毒传到植株上的昆虫仍可以75%一 100%的比例经卵传毒至后代(Shinkai、1962)。带毒灰飞虱可将病毒传递23 代、经卵传递率为 90%(Kisimoto, 1967；Washio, 1968a, 1968b)。灰飞虱传播水稻条纹病毒的过程如下：

灰飞虱经卵传毒示意图：

无毒♀X 带毒 or 无毒♂ 卵（后代）无毒

第一章 文献综述

图 1-2 灰飞虱繁殖及传播 RSV 危害的世代示意图(张迎信、2010) Fig 1-2 The life circle and transmitting stripe virus of small brown planthopper

不同来源的介体与病毒的亲和力有所差异、研究认为、这种差异是遗传控制的、因为在选择育种过程中、高低亲和力的个体数量比例发生了变化、如

Kisimoto(1967)通过选择育种、得到一个亲和力高达 50%-60%的种群和一个只有10%亲和力的种群。曲志才等(2002)通过杂交和选育、也获得活跃传毒的介体品系、其传毒率从F0群体的5.31%上升到 25%、并且人工选择压力对介体传毒力这一性状起着重要的作用、但对介体获毒没有影响。

利用荧光抗体染色技术发现、带毒昆虫的唾液腺、内肠、脂肪体和卵巢中都有强烈的荧光标记、护胞、卵细胞、小囊卵泡和粘菌胞中的特异性荧光标记暗示着RSV 经卵传播的机制是通过粘菌胞捕获病毒颗粒而进行的(Kitani 等、1968)。另有研究发现、在靠近上皮细胞基膜和主要唾液腺基层的胞质、中肠细胞内有不定形体被金颗粒标记、但在附生唾液腺细胞质内未发现不定形体。在卵巢小囊卵泡的细胞质内也发现金标记、这证实了病毒经卵传播的特性。在脂肪体细胞质内发现有丝状体正在形成、并有大量的金标记(Suzuki 等、1992)。此外、用免疫胶体金标记技术对病

害特异性蛋白(disease-specific protein, SP)在灰飞虱体内进行亚细胞定位、在灰飞虱的唾液腺、中肠和卵巢内均能够观察到胶体金颗粒、而在精巢中则未观察到(吴爱忠等、2001)。

灰飞虱为介体传播的水稻条纹叶枯病、已成为中国乃至亚洲水稻上最为严重的病害、给水稻生产带来了巨大的威胁。感染水稻条纹叶枯病毒的稻株矮化褪绿、分蘖

甚至颗粒无收（林奇英等、1990）。灰飞虱刺吸时间短、传毒持久、使治虫防病十分困难、中国水稻条纹叶枯病的发生逐年加重(魏太云等、2003)。1963 年、条纹叶枯病在中国江苏、浙江、上海一带首次爆发成灭(朱凤美等、1964)、已扩及 16 个省市(林奇英等、1990)、2000 年该病害在江苏、河南等地再次暴发成灾、2001 年发病田率达50%以上、部分病重田的病穴率达 80%、给农业生产造成巨大损失(马学文等、2001；杨荣明等、2002；史明武等、2003；魏太云、2003；李洪山等、2004)。自

2004 在中国东部稻区、特别江苏、浙江、灰飞虱大爆发以来（Sogawa, 2005；Wang 等、2008；Wei 等、2009）、2004-2005 年江苏省水稻条纹叶枯病连年大发生、发生面积达140 万公顷、超过该省水稻播种面积的 70%（乔慧等、2009）。灰飞虱及其传播的病毒病潜在威胁逐年加重、 成为当前水稻生产的一大难题。现已扩展蔓

川、广西、广东、云南、山东、河北、天津、河南、北京、辽宁（杨杰等、2008）。全中国近年该病的发病面积已达4000 万亩以上、病区发病率一般在 10%-20%、重病区发病率达50%-80%(潘学彪等、2005；邰德良、2005；张恒木、2007；王华弟、2007a)、给中国农民带来重大经济损失。

1963-1968 年之间、灰飞虱带毒诱导水稻条纹叶枯病发生面积已达日本全国水稻种植面积的13%-19%、每年减产 40 万吨、给日本的水稻生产造成了严重的损失

（Yamaguchi T 等、1965；Washio O 等、1968a, 1968b)。到 1980 年、该病已遍布整个日本（Shinkai, 1985；Hibino, 1989, 1996）。

1963-1967 年、该病在韩国曾经发生流行过(Lee 等、2002；Hibino 等、1985)、2000-2002 年、该病在其中部和南部爆发(Lee 等、2002)。

1.3.3 灰飞虱对水稻黑条矮缩病病毒的传毒特性及其危害

水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwafvirus, RBSDV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus) (Van 等、2000)、是由灰飞虱传毒发生的又一水稻病毒病（Milne R G 等、1977；Azuhata F 等、1993；阮义理等、1981）。水稻黑条

第一章 文献综述

矮缩病毒病的病株症状为浓绿矮缩、叶片僵直、不抽穗或穗小、叶背面的叶脉和茎杆上有短条瘤状突起、该突起在发病初期呈腊白色、后变为黑褐色。病叶基部叶脉常弯曲、使叶片表现纵皱状、病株分蘖增多、根系发育不良、感病早的不能抽穗、发病迟的虽能抽穗、但穗小、形成“包颈穗”或“半包穗”、故结实不良、发病田块一般减产10%-40%、重病田甚至颗粒无收（阮义理等、1984；朱绍先等、1984；陈声样等、1993, 2004, 2005）。

该病毒只能由特定的昆虫(以灰飞虱为主)带毒传播。已有研究表明、RBSDV 必须由灰飞虱在带毒的寄主植物食毒后才能带毒和传播病毒(阮义理、1984)。灰飞虱各个体对黑条矮缩病几乎都有亲和性、但因吸毒条件有限、不能使全部昆虫获毒、获毒率在40.0%-83.3%、平均 56.0%。吸毒时间短的一个小时或更短(5-10 分钟)、一般1-2 天就能充分吸毒、吸毒个体达 60%-70%、3 天以上吸毒个体达 90.0%。

病毒在虫体内有一个循回期（传毒虫从吸毒时起到开始传毒的一段时间）。据浙江农科院测定、在平均气温22.1-25℃时、多数为 15-24 天、最短 8 天、最长 35 天；

在28℃时为 10-13 天。其传毒时间在平均气温 24.6℃时、2 个小时即可传毒、48 个小时可充分传毒、4-5℃时不传毒、12℃以上时传毒较盛。带毒灰飞虱在零下 7-0℃下持续 15 天、对传毒率无明显影响。带毒灰飞虱能终生传毒、多数情况下、是短期间歇传毒；越冬后的个体传毒率高、病毒不能经卵传到下一代（王德全等、2000）

水稻黑条矮缩病毒病曾于20 世纪 60 年代中期在中国华东诸省市不少地区广泛发生。近年来、随着灰飞虱的大爆发、该病又迅速回升流行(王华弟等、2007b)。由于江淮流域近几年灰飞虱虫量基数大、而且田间杂草和禾本科作物是RBSDV 的寄主(Fang 等、2001；Zhang 等、2001；Azuhata 等、1993)、通过灰飞虱的食毒和传毒、该病有可能在江淮流域大发生、对水稻生产构成新的威胁。1999 年、台州地区发病面积已达到1 万多公顷、其中以连作晚稻发病最重、一般发病田块丛病率为 10%-30%、严重的达 30%-80%、最重的田丛病率达 95%以上（林凌伟等、2001）；

2002 年、浙江省发病发病面积 37713.3 公顷、一般田发病率在 10%-30%、严重田稻株发病率30%-80%、致使水稻严重减产（汪恩国等、2005）；2003 年、台州地区出现大流行、发病面积4.67 万公顷、2004 年再次暴发流行发病面积达 9.63 万公顷、占水稻种植面积的91.7%、重病田减产 7-8 成、甚至绝收、成为该地区水稻生产的灾发性病害（何国民等、2005）。

水稻在越南是第一大粮食作物、在其全国范围内都可种植。近年来、由灰飞虱传

飞虱存在着地理差异(Hoshizaki、1997)。利用 RAPD 技术对楚雄、沈阳、东京三个地区的灰飞虱种群进行多态性分析、结果表明不同地区的灰飞虱存在一定的差别、但群体间和群体内的差异都未达到显著水平(许骏等、2001)。同样利用 RAPD 技术对

群灰飞虱进行多态性分析、也发现不同地理种群的灰飞虱存在差异、但是不同地区灰飞虱种群的遗传距离与其地理距离不呈相关性(万由衷等、2001)、说明了灰飞虱种群间由于地理隔离等原因出现了多样性、但是并没有明显的地理种群分化现象产生。

2 褐飞虱 Nilaparvata lugens (Stål)

2.1 褐飞虱的生物学特性

褐飞虱分长翅型和短翅型。长翅型：雄虫体长2.5 mm、连翅长 4.2 mm；雌虫体

长3.5 mm、连翅长 4.0 mm。深色型体褐色至黑褐色；浅色型体黄褐色。短翅型：雄虫体长2.6mm；雌虫体长 3.2mm。深色型体暗褐色或黑褐色；浅色型体黄褐色或褐色。前翅一般伸达背部第5 至第 6 节。

头、胸部背面特征头顶略呈长方形、中长微大于基部宽。前胸背板与头顶近于等长、两侧脊背端部向侧方向弯曲、不伸达后缘。深色型的头顶及前胸背板褐色、中胸背板暗褐色、侧脊外方侧区黑褐色。浅色型全部黄褐色。卵前期丝瓜形、后期弯弓形、10－20 粒成行排列、前部单行、后部挤成双行、卵帽稍露出产卵痕。若虫初孵时淡黄白色、后变褐色、近椭圆形、5 龄若虫腹部第三、第四腹节背面各有１个白色“山”字形纹。若虫落于水面后足伸展成一直线。（程遐年等、2003）。

2.2 褐飞虱在世界的分布和危害

第一章 文献综述

褐飞虱广泛分布于南亚、东南亚、东亚、南太平洋岛屿和澳大利亚(Dyck等、1979；Kenmore等、1984；Ooi等、1988)。是亚洲水稻生产的头号害虫、对亚洲各国的水稻生产造成了严重为害。根据其对水稻产生的为害情况、一般划分为4种生物型、即东亚和东南亚种群的生物型1、生物型2、生物型3和生物型4。（表1-1）

在中国、20 世纪 80 年代、我褐飞虱主要以生物型 1 为主、进入 90 年代、地的

为两种以上生物型的混合群体、中生物型1 占 12.9%、生物型 2 占 60.1%(李容柏、2002)。程遐年等（2003）分析认为近 30 年中国褐飞虱发生和为害具有以下 3 个特点：第一、发生面积和范围扩大：20 世纪 30 年代稻飞虱发生面积为 200 万～300 万

2005 年以来更是连年大发生。2005-2007 年褐飞虱在我国南方 10 省稻区大面积爆发、

仅2005 年在华东 4 省市就损失粮食近 25 亿 kg、当年中国稻飞虱危害面积达 3.86 亿亩(朱述钧、2006)。

来源 Originations 生物型 1

biotype 1

东亚和东南亚 East and Southeast Asia

在日本和菲律宾的实验室中产生 Produced in laboratories in both Japan and the Philippines

均发生面积50 万-80 万公顷。

越南九龙江三角洲稻区、全年均可以种植水稻、褐飞虱是以本地繁殖为害为主、迁飞现象不明显。据Ngoan(1971)报告、在越南自 1967 年以来、飞虱危害日益严重。飞虱似乎成为限制水稻生产的主要因素。褐飞虱发生逐年增多、并发展成爆发态势。

“虱烧”大多数是由褐飞虱造成、不是由白背飞虱造成。每年被毁稻田面积达几千公顷、价值约300 万美元。自 1970 年以后、褐飞虱成为水稻最严重的害虫、1975 年在越南九龙江三角洲稻区有几个地区发生“虫烧”（Huynh, 1975）。特别在 1978 年、越南南部大暴发、损失稻谷100 多万吨(Bui Van Ich, 1991)。1991 年和 1992 年连续两年在越南南部特大暴发、1992 年在湄公河三角洲褐飞虱发生为害面积超过 150 万公顷（Ho, 1999）。在 1993-1998 年间、褐飞虱的为害面积每年在 50 万-80 万公顷、占全国水稻面积的7.5%-12%（Khuong, 1999）。2005 年、褐飞虱传播水稻病毒病—草状丛矮病几Grass Stunt几和齿叶矮缩病几Ragged Stunt几、为害损失 40 万吨粮食（占1.1%总产量几(Heong 几几2009)几从 2005 到 2006 年、在南方有 48.5 公顷被褐飞虱为害、损失82.8 吨粮食（Du 等、2007）。2010 年、在越南九江三角洲褐飞虱发生为害面积超过6000 公顷。

印度、印度的喀拉拉邦在1958 年和 1962 年曾偶然发生褐飞虱为害、但在

1973-第一章 文献综述

1974 年和 1975-1976 年两次大暴发、损失近 1200 万美元（Thomas, 1979）。印度的

主要害虫、但到20 世纪 70 年代已成为主要害虫；1975 年西孟加拉邦和喜马偕尔邦的两个县同时发生褐飞虱大暴发；泰米尔纳德邦褐飞虱每隔几年流行一次、为害广泛（Chatterjee, 1978；Chelliah 等、1974, 1979；Das 等、1972, 1977）。

此外、褐飞虱还在日本、菲律宾、韩国、印度尼西亚、马来西亚、孟加拉国、所罗门岛、巴布亚新几内亚、文莱、尼泊尔、泰国、斐济和柬埔寨等国家暴发。

3 白背飞虱 Sogatalla furcifera (Horváth)

3.1 白背飞虱的生物学特性

长翅型成虫体长3.8-4.6mm。淡黄色具褐斑、前胸背板黄白色、小盾片中间淡黄色、雄虫两侧黑色、雌虫两侧深褐色。短翅型雌虫体肥大、灰黄色或淡黄色、体长3.5mm 左右、短翅仅及腹部的一半。卵前期新月形、中后期长辣椒形、3-10 余粒单行排列、卵帽不露出产卵痕。若虫橄榄形、初孵时乳白色有灰斑、2 龄后灰白色或灰褐色、落于水面后足平伸成“一”字形。

3.2 白背飞虱的分布及其危害

在中国、白背飞虱分布较褐飞虱广大、长江流域及以南地区受害尤重。主要危害早稻、中稻和一季晚稻。近年来长江中下游及华南稻区其发生程度上升、对晚稻亦有严重危害、发生面积已越过褐飞虱而成为稻飞虱类首要害虫。

初次虫源由南方热带稻区随气流逐代逐区迁入、其迁入时间一般早于褐飞虱、一

趋光性、趋嫩绿性、生长嫩绿稻田、易诱发成虫产卵为害；卵多产于水稻叶鞘肥厚部分组织中、也有产于叶片基部中脉内和茎秆中、有5-28 粒、多为 5～6 粒。长翅雌虫可产卵300～400 粒、短翅型比长翅型产卵量约多 20％。若虫一般都生活在稻丛下部、位置比褐飞虱高。3 龄以前食量小、为害性不大、4～5 龄若虫食量大、为害重。

湿度要求较高、以相对湿度80-90％为适宜。

一般初夏多雨、盛夏干旱的年份、易导致大发生。在水稻各个生育期、成、若虫均能取食、但以分蘖盛期、孕穗、抽穗期最为适宜、此时增殖快、受害重。以成虫和若虫群栖稻株基部刺吸汁液、造成稻叶叶尖褪绿变黄、严重时全株枯死、穗期受害还可造成抽穗困难、枯孕穗或穗变褐色；秕谷多等为害状。每年均与褐飞虱混合发生为害、两种飞虱不同年份在不同省份和地区发生程度不同、年发生为害面积均

在2 亿亩次以上。

第二节 水稻抗稻飞虱遗传基础研究

抗性遗传研究是进行作物抗虫育种的基础、明确水稻品种对稻飞虱的抗性遗传规律、发掘抗性资源和抗性基因、可为作物抗虫育种实践提供理论依据。目前、3 种稻飞虱中、有关褐飞虱的抗性研究最为深入详尽、在抗性资源筛选、基因发掘与定位等方面进行了大量的工作、取得了卓有成效的进展；对于白背飞虱、许多研究者也进行了比较系统的研究、然而迄今有关水稻抗灰飞虱研究的报道却甚少。

1 水稻抗褐飞虱遗传基础研究

迄今、已先后发现和鉴定出21 个抗稻褐飞虱的主效基因、10 个来自于栽培稻；

9 个源自于野生稻、其中 3 个来源于澳洲野生稻 O.australiensis（Ishii 等、1994； Jena, 2003）、4 个来源于药用野生稻 O.officinalis（Hirabayashi 等、1997；Huang 等、 2001；Reganayaki, 2002）、1 个来自于紧穗野生稻 O.eichingeri (刘国庆等、2001)、

1 个来自于阔叶野生稻 O.latifolia（Yang 等、2002）。其中、显性基因 13 个、即

Bph1（Athwal 等、1971）、Bph3（Lakshiminarayana 等、1977）、Bph6（Kabir 等、

1988）、Bph9(Ikeda 等、1985；Nemoto 等、1989)、Bph10(t)(Multani 等、1994； Ishii 等、1994)、Bph12(t)（Yang 等、2002）、Bph13(t) (刘国庆等、2001)、

Bph14（Huang 等、2001）、Bph15（Huang 等、2001；Yang 等、2002）、

Bph17（Sun 等、2005）、Bph18（Jena 等、2003）、 Bph20 和 Bph21（Rahman 等、

2010）。隐性基因 8 个、即 bph2（Athwal 等、1971）、bph4（Lakshiminarayana 等、 1977）、bph5、bph7（Kabir 等、1988）、bph8 (Ikeda, 1985；Nemoto 等、1989)、

标记RG463 和 Sdh-1 染色体区段间。Jeon 等(1999)将源于 Gayabyeo 的 Bph1 定位在

第一章 文献综述

RG634 和 RG457 之间、与之分别相距 2.9cM。Sharma 等（2003）构建了 Bph1 的近

乎饱和的遗传图谱、进一步将Bph1 定位到水稻第 12 染色体的长臂上、并获得了与 Bph1 紧密连锁的 AFLP 标记 em5814N 和 em2802N、遗传距离均为 2.7cM、结合 bph2 基因的高分辨率遗传连锁图谱（Murai, 2001）、使 Bph1 和 bph2 的遗传距离在

记之间、遗传距离分别位3.6cM 和 3.2cM（孙立宏、2005）。Murata 等(1998b,

2001)利用 Pokkali/Norin-PL9 的 F3 群体、首次将 Pokkali 中的 Bph9 基因定位在第

12 染色体的长臂上、位于标记 S2545 和 G2140 之间。Su 等（2006）利用 SSR 标记将来自于印度栽培稻Kaharamana 的 Bph9 基因定位于 12 染色体上、位于标记

RM463 和 RM5341 之间、遗传距离分别为 6.8cM 和 9.7cM。Ishii 等（1994）利用RFLP 标记将来源于澳洲野生稻的抗褐飞虱基因定位在第 12 染色体上、与 RG457 的遗传距离位为3.68cM、并将该基因命名名为 Bph10 （ t ）。来源于药用野生稻的抗褐飞虱基因Bph11 （ t ）被定位于位于第3 染色体的长臂上、与 G1318 的遗传距离为

12.3cM；Bph12 （ t ）被定位于第4 染色体的 G271 和 R93 之间、遗传距离分别为2.4cM 和 4.0cM(Hirabayashi 等、1999)。刘国庆等（2001）将来源于紧密野生稻的显性抗褐飞虱基因Bph-13(t)定位于第 2 染色体、位于两个微卫星标记 RM240 和

RM250 之间、遗传距离分别为 6.1cM 和 5.5cM。Yang 等（2002）利用 RFLP 和

SSR 标记将 Bph12(t)基因定位到第 4 染色体的短臂上、位于标记 RM261 和 C946 之

间、与两者的遗传距离分别为1.8 cM 和 11.6 cM。Jena 等（2003）在对栽培稻IR54741-3-21-22 的药用野生稻抗褐飞虱基因的分子作图时发现、该基因与

Swarnalata 中携带的 Bph6 等位、研究中筛选到 19 个共显性的 RAPD 标记、其中

OPA93 与抗性基因的遗传距离为 0.52cM、该标记对于水稻辅助选择抗虫育种极具价值。

在第4 染色体短臂和第 12 染色体长臂。

来自药用野生稻的抗褐飞虱基因Bph14是目前唯一克隆的水稻抗褐飞虱基因、也

是第一个被克隆的水稻抗虫基因(Du, 2009)。该基因主要在褐飞虱的取食部位水稻维管束中表达、对褐飞虱并不具有趋避性、但对褐飞虱的取食量、生长速率和存活率

胞胼胝质的积累和蛋白酶抑制剂的产生、从而抑制了褐飞虱的取食、生长速率和寿命。Bph14编码的为NBS_LRR抗病相关蛋白、与之前克隆的蕃茄抗蚜虫基因

Mi1.2（Rossi, 1998）属同一蛋白家族。现有的研究表明、与咀嚼式害虫不同、刺吸

式害虫与植物之间的互作和植物的抗病反应存在着部分重叠。已克隆的植物R基因、大多都具有一些保守的结构域、如：核苷酸结合位点(nucleotide binding site, NBS)、富亮氨酸重复序列(lecine rich repeats, LRR)、丝氨酸/苏氨酸激酶(Serine-threonine

kinase, STK)域等。Bph14和Mi1.2两个刺吸式害虫抗性基因、也均为NBS_LRR抗性蛋

白、进一步证实了植物对刺吸类害虫的抗性与植物的抗病性存在某些联系。

2 水稻品种对白背飞虱抗性的遗传分析

目前、已鉴定并命名了8 个抗水稻白背飞虱的主效基因、即 Wbph1(Sidhu 等、 1979)、Wbph2(Angeles 等、1981)、Wbph3 、 wbph4(Hernandez, 1985)、Wbph5(Wu 等、

1985)、Wbph6 (李西明等、2003)、Wbph7 （ t ）和Wbph8 （ t ）（Tan 等、2004）。其

中N22 带有显性抗白背飞虱基因 Wbphl；ARC10239 带有显性抗白背飞虱基因

Wbph2；ADR52 带有显性抗白背飞虱基因 Wbph3；Podiwi-A8D 携带隐性抗白背飞虱

基因wbph4；N Diang Marie 带有显性抗白背飞虱基因 Wbph5；鬼衣谷携带显性基因 Wbph6；抗源来自药用野生稻的抗性品系 B5 携带 Wbph7 （ t ）、Wbph8 （ t ）。

第一章 文献综述

IET5741、Ptb33、Ptb19 和石崖釉等 15 份抗源材料受显性单基因控制(IRRI, 1983；Krishna 等、1984；李西明等、2001)、Nebeshi 和白秆糯等 28 个品种受隐性单基因控

制 (李西明等、2001)；Chaia Anaser 等 3 个品种受双显性基因 Wbph1 和 Wbph3 控制(Wu 等、 1985)、Colombo 和 We1240 携带 Wbph2 和一个隐性基因、Pundia 和 Mahia Bankoi 携带一个未知显性基因和一隐性基因（Angeles 等、1981）；Landi

Sarakanti 受隐性双基因控制。此外、Sidhu 等（1979）还明确了 Wbph1 与抗白叶枯

病的Xa4 和抗褐飞虱基因 Bphl 是独立分离的。白背飞虱抗性除受主基因控制外、在

某些水稻品种中还含有微效基因控制的抗性（IRRI, 1983）。一些具有微效基因的品种通过其对主基因的修饰、在抗虫性中起着重要作用。

3 水稻抗灰飞虱遗传基础研究

迄今、有关水稻抗灰飞虱的研究相对较少、缺乏对水稻抗灰飞虱的系统研究。Sun 等（2006）利用 Nipponbare/Kasalath//Nipponbare 回交重组自交系群体进行水稻抗条纹叶枯病基因定位时、发现亲本Kasalath 对灰飞虱表现出强的排驱性、对灰飞虱进行排驱性测验表明、Kasalath 对灰飞虱的抗性由微效基因控制、通过 QTL

与分子定位等研究提供了基础材料和理论依据、对于加快抗虫品种的选育和利用具有十分重要的意义。

第一章 文献综述

第三节 植物抗虫的三种类型

在自然界上、植物总是遭受各种病虫害的危害。植物不同与动物、植物是静止不动的、不能够通过移动来避开植食者的进攻。在长期进化中、植物形成了多种植物特有的自身防御体系、得以在恶劣的环境中生存。植物抗虫性机制可分为3类：即耐虫性（tolerance）、抗生性（antibiosis）和非选择性(Nonpreference）(Painter, 1951)

、 因为非选择性描述的是昆虫对寄主的反应、而不是寄主本身的抗虫性特征、因此、Kogan (1978) 提出用 趋避性（antixenosis）、来替代非选择性。

1 植物对害虫的抗生性机制

抗生性则指寄主植物具有不利于害虫生存、发育和繁殖的因素、从而导致害虫发育迟缓、体重减轻、寿命缩短、死亡率增高和繁殖力下降的特性。比如、

Yamasaki 等(2003)发现、有一些粳稻品种在白背飞虱的产卵部位释放出具有杀卵功能的苯甲酸苄酯；张富铁等(2004)利用 Northern 杂交研究了蛋白酶抑制剂基因

E61932 在水稻抗褐飞虱品系 B5 中的表达情况、发现该基因受褐飞虱若虫取食诱导表达上升。Wang 等(2008a)通过基因芯片分析抗褐飞虱品系 B5 与感虫品种 MH63 之间的表达谱差异、同样也发现抗虫品种中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂显著受到褐飞虱取食的诱导。

2 植物对害虫的趋避性机制

趋避性（antixenosis）是指寄主植物因具有化学的或形态的某些特征、致使昆虫不选它作为食料、产卵或栖息地的特性。趋避性大体可分为两种类型、物理性的与化学性的防御。物理性的防御主要指植物的形态防御机制、例如、植物体表的毛状物或刚毛可以有效的限制叶蝉口针到达植物组织、干扰它们对植物的接近；植物叶片表面的一层蜡质、可以保护其免受脱水、昆虫和疾病的侵害、抗褐飞虱水稻品种的蜡质中的羰基和烃基可以有效的影响灰飞虱的取食。在中国、栽培面积较大的毛粉

802 番茄就是利用了体表被覆浓密茸毛的特性而达到避蚜的目的（郑贵彬等、1986）。对番茄腺毛类型及分泌物的研究证实鳞翅目、双翅目和鞘翅目昆虫在野生番茄上的产卵量低于普通番茄。Snyder 等（1998）认为银叶飞虱在多毛番茄上产卵量降低的主要原因是由于Ⅳ型腺毛所建立的天然屏障不利于害虫产卵。所谓化学性的趋避性防御、主要是指当植物受到昆虫的侵袭时、植物可以通过次生代谢产物的排放、如糖苷、酚类化合物和萜烯化合物等、驱赶昆虫、免受其危害 (Painter 等、1951；Levin 等、 1973；Webster, 1975)。利用 52 个中抗白背飞虱品种进行了趋避性试验、结果表明、接虫一天后、白背飞虱的成、若虫均明显的趋向并定居于感虫稻株上

（胡国文等、1988)。

抗生性和趋避性两者之间常常有一些重叠、都能够导致害虫的发育延缓、甚至死亡、所以通过一些简单的试验很难将二者完全区分开来、往往需要做一系列的精细试验。

3 植物的耐虫性机制

植物耐虫性(tolerance)是指寄主植物具有忍耐害虫危害或受害后再生能力较强的生理特性、 是植物的一种防御策略(Strauss等、1999)。与抗生性和趋避性不同、耐虫性并不影响昆虫的取食行为和生长发育。与趋避性和抗生性显著不同、耐虫性的品种存在以下优点：第一是、在受到害虫危害后仍然保持较高的生产力、可以减少农药用量；第二是、对害虫不存在选择压力、可以防止害虫新生物型的产生；第三是、当某品种同时存在三种抗虫机制、而使植物具有抗异性和抗生性以保持高抗水平的主基因由于新生物型的产生而无效时、耐害性还保持中等水平抗性、并使品种保持一定生产能力（Mackenzie, 1980）、因而、选育具有耐害性的品种在害虫防治上具有极其重要的地位。

株少5.15%。而感虫品种 TN1 的标记部位叶片光合产物滞留量增加了 13.31%、这说明耐虫性强的品种受害后叶片光合产物向叶鞘、茎、分蘖和根等部位的转移量明显多于感虫品种（陈建明等、2003）。对白背飞虱取食稻株后分泌的蜜露量比较发现、在抗虫品种上分泌的蜜露量明显地少于感虫品种、而食痕数明显高于感虫品种上的食痕数（Liu 等、1990；刘芳等、1998）、这就表明抗虫稻株有显著的拒食作用、白背飞虱是受到某种或某些昆虫拒食剂作用而导致取食明显下降。而且在取食抗性品种后、白背飞虱若虫发育历期延长、存活率降低、成虫产卵量减少、种群数量降低

（刘光杰等、1993；丁可军、1993）。从氨基酸分析的结果来看、在感虫品种

TN1 上分泌的蜜露中、游离氨基酸总量高于抗虫品种几乎两倍、谷氨酸、天冬氨酸、撷氨酸在稻飞虱蜜露中含量较高、而稻株中亮氨酸和丙氨酸与品种的抗性显著相关

（Liu, 1990；谭荫初、1993）。

对于主茎粗大和有储存器官的多年生植物来说、储存器官的利用可能是其耐虫性的重要机理之一。利用储存器官的重要性可能取决于害虫危害的方式、例如有大量储存物质的种子在去掉部分子叶后比小种子更加忍受害虫危害。Van der Heyden等

（1996）发现、植物在害虫取食危害后体内碳源流动的证据。进化生态学家们也认为储存器官的利用与耐虫性有关、植株根茎比的大小与其受害后再生长能力显著正

第一章 文献综述

相关、然而有些研究者没有发现植物储存器官的利用与其耐虫性有关系（Tiffin等、2000）、这是因为储存物质主要以碳水化合物为主、而害虫摄取的可能是含氮物质。有一些植物往往在营养器官和生殖器官间出现营养供需差、当营养器官的光合产物超过生殖器官所需、那么营养器官部分受害不会影响产量、比如油松针叶遭受松毛虫适度危害后、在材积和营养物质储存方面表现出补偿和超补偿现象（李凯等、1997）。

由于植物的耐虫性机制复杂多样、所以为了正确评价植物的耐虫性、昆虫学家发展了多种评价方法、包括植物功能损失指数(耐虫指数)、产量损失率、植株被害率、存活率、根系体积(受害程度)、植株和害虫干重、叶片叶绿素荧光特性、保护酶活性和主茎伤流液量等生理生化指标以及害虫的种群发展和取食行为等方法。

第四节 本研究的目的及意义

灰飞虱及其传播的病毒病危害日益加剧、给水稻生产带来严重影响。长期以来、主要依赖于化学农药的防治措施、不但破坏生态平衡、导致灰飞虱抗药性的产生、而且还对自然环境造成污染和破坏。抗性品种的应用被认为是防治灰飞虱危害最为经济有效的方法。

研究发现、具有中等抗性的抗虫品种或由多基因控制的抗虫品种比由单个主基因控制的抗虫品种表现出更持久的抗虫性。但目前、关于水稻抗灰飞虱基因的研究相对较少。因此、不断挖掘和利用新的抗灰飞虱基因、选育具有持久抗虫性的水稻品种、已成为防治灰飞虱危害的首要任务。此外、稻飞虱生物型的变异性和抗虫性鉴定的复杂性也导致常规育种手段效率较低、抗虫育种进展缓慢。鉴定并利用与目标基因紧密连锁的分子标记、结合常规育种手段、转育或聚合抗虫基因、选育持久抗性品种将成为抗灰飞虱育种的趋势。

为此、本研究的目的旨在从现有的种质库中寻找新的抗源、为水稻抗灰飞虱育种提供基础材料；分析现有品种抗灰飞虱的遗传基础、为抗性基因的精细定位、图位克隆及育种利用奠定基础。

第二章 水稻品种 Rathu Heenati 抗灰飞虱基因的分子定位

第二章 水稻品种 Rathu Heenati 抗灰飞虱基因的

分子定位 摘要:几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几

Laodelphax striatellus Fallén 几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几

几几几几几几几几几几几几几几几几 Rathu Heenati 几几几几几几几几 02428 几几几几几几几几几 162 几几几几 02428/Rathu Heenati F2几 150 几几几几 02428/Rathu Heenati//02428 BC1几几几几几

几几 162 F2几3几几几 150 几 BC1F2几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几几Windows QTL Cartographer 2.5 几几几几几几几几几几 F2几几几几几几 3 几几几几

关键词: 几几 (Oryza sativa L.)几几几几几QTL

灰飞虱(Small brown planthopper、SBPH) Laodelphax striatellus Fallén 是水稻生产上的主要害虫之一、广泛分布于东亚、东南亚、欧洲和北非等地。在水稻生产中、灰飞虱直接刺吸稻株汁液危害水稻、同时传播水稻条纹叶枯病(梁小波等、2001；吴爱忠等、2001；Hibino, 1996；胡淑霞、1997)及水稻黑条矮缩病(Milne 等、1977；Azuhata F 等、1993；Ramirez 等、1994；阮义理等、1981)等病毒病、给水稻生产造成巨大损失。

至今、喷施化学农药仍是防治灰飞虱的主要手段、但化学防治不仅严重杀伤害虫

天敌、加剧环境污染、而且增强灰飞虱种群抗药性(Sono 等、1995；Endo 等、

2000；Endo 等、 2002)。另外、农药使用不当可导致害虫的再生猖獗(Chelliah 等、 1980；Heinrich 等、1982；余月书等、2008)。此外、灰飞虱传播的两类病害、均为病毒病、目前防治均无特效农药、特别是水稻黑条矮缩病尚未发现有效抗源。因此、发掘灰飞虱抗性基因、培育抗灰飞虱水稻品种、不仅是防治灰飞虱最为经济有效的途径、也将是控制黑条矮缩病的一种有效途径。

目前、水稻对吸汁类害虫的抗性可以分为耐害性、趋避性和抗生性、近年来对吸汁类害虫的寄主抗性研究取得了很多的进展、主要集中在对抗褐飞虱和白背飞虱的抗性基因（QTL）的定位（Jairin 等、2007；Geethanjali 等、2009）。目前、只有一些中国学者开展了抗灰飞虱基因定位研究。Duan 等利用 Nipponbare

(japonica)/Kasalath(indica)//Nipponbare 回交重组自交系群体、通过三种不同的表型鉴

定方法分别检测到的Qsbph11e、Qsbph11f 和 Qsbph11g、均位于第 11 染色体上标记

S2260-G257 之区间、表明该位点对 Kasalath 的抗性表现起着重要作用(Duan 等、 2010)。利用 Mudgo/武育粳 3 号 F2 群体在第 2、3 和 12 染色体上各检测到 1 个抗灰

飞虱QTL 位点 Qsbph2b、Qsbph3d 和 Qsbph12a、各 QTL 增强抗性的等位基因均来

于Mudgo(段灿星等、2009)。除此之外、关于水稻抗灰飞虱基因（QTL）的定位少见报道。所以要培育持续高抗灰飞虱的水稻品种、迫切需要发掘一批抗灰飞虱新基因。

本研究利用抗灰飞虱水稻籼稻品种Rathu Heenati 和感虫粳稻品种 02428、构建了02428/Rathu Heenati F2分离群体和02428/Rathu Heenati//02428 回交 BC1分离群体及两个群体的分子连锁图谱、并利用这两个群体分析了Rathu Heenati 抗灰飞虱的遗传基础、为进一步分子标记辅助选择育种和基因克隆奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

以高感粳稻品种02428 为母本、高抗籼稻品种 Rathu Heenati 为父本、构建了02428/Rathu Heenati F2 分离群体、共162 个 F2单株、162 个 F2单株自交获得相应的

F2:3家系。另外、利用02428/Rathu Heenati F1与02428 回交、获得 150 个 BC1单株、

每个BC1单株通过自交获得的相应的BC1F2家系。Mudgo 和武育粳 3 号分别作为抗虫和感虫对照。

1.2 灰飞虱的饲养与繁殖

第二章 水稻品种 Rathu Heenati 抗灰飞虱基因的分子定位

3 号的培养皿和塑料盒中饲养、每个培养皿或塑料盒转移一头待产灰飞虱繁殖后代。采用斑点免疫法(dot- immunobinding assay、 DIBA) 和 PCR 扩增法对每个培养皿或塑

农业大学温室内。

图 2-1 灰飞虱室内繁殖体系 Fig 2- 1 The propagation of small brown planthopper in house

1.3 抗灰飞虱鉴定

1.3.1 苗期集团接种法 （Standard Seedling-box Screening Test）

采用标准苗期集团接种法 (Heinrichs 等、1985)对两个亲本 02428 和Rathu Heenati、 162 个 02428/Rathu Heenati F2：3家系及150 个 02428/Rathu Heenati BC1F2

家系进行了抗灰飞虱鉴定。 Mudgo 和武育粳 3 号作为抗、感对照。每个家系（品种）分别播种于一个直径8.0 cm、 高 9.0cm、盛满营养的圆形塑料钵中(钵底部有一小孔、 便于渗透吸水)、每 28 钵置于 65cm×44 cm×14cm 的塑料箱内、 随机排列、箱内保持水层 2 cm 左右（图 2-2）、 外加亲本和感虫对照各两钵。每钵播种 30 粒发芽种子。每个材料两钵。自然光照、室温25～27 ℃、通风。在水稻幼苗 1.5～2.0 叶期接虫、

接 15 头/苗的比例接 2~3 龄灰飞虱若虫。

小麦繁殖 水稻繁殖

图 2-2 苗期集团接种示意图

Fig 2-2 The pattern of standard seedling-box screening test

表 2-1 灰飞虱对水稻苗期的致害性及其评价标准 Table 2-1 Evaluation criteria for resistance to SBPH at rice seedling stage.

危害症状（Damage symptom） 抗性级别

Resistance scale

抗性水平 Resistance level 未受害 (No visible damage) 0 免疫 (I) 受害级轻微 (Very slightly damage) 1 高抗 (HR) 第一、二片叶都分发黄 (Partial yellowing of the first and

叶片明显发黄、部分苗矮化 (Pronounced yellowing, and some

seedlings slight stunning) 5 中抗 (MR)稻苗严重矮化或枯死 (Seedlings showing signs of severe

stunning or wilting) 7 感虫 (S)90% 稻苗枯死 (90% seedling dead) 9 高感 (HS) Note: I- immune; HR- highly resistant; R- resistant; MR- moderately resistant; S- susceptible; HR- highly susceptible

当感虫对照武育粳3 号死苗率达 90%时、参照 IRRI (1996)和 Duan 等 (2008、 2009) 制定的抗虫性评价标准（Standard Seedling-box Screening Test, SSST）、 对亲

数。按如下方式进行抗虫性评价：0、免疫；0.1~2.0、高抗、2.1~3.0、 抗虫；3.1~6.0、 中抗；6.1~7.0 感虫；7.1~9.0、高感。

1.3.2 趋避性检测

第二章 水稻品种 Rathu Heenati 抗灰飞虱基因的分子定位

将催芽后的水稻种子播于65cm × 44cm × 14cm 的塑料周转箱内、每个家系（或品种）2 行、每行 15 株 (图 2-3)。待幼苗长至 1.5-2.0 叶、按每株 5 头接入 2～3 龄的灰飞虱若虫、自然光照、室温25±20C.、24 小时后开始调查每个单株上的虫数、每天一次、调查后驱虫、使其尽量均匀分布。5 天后计算每个品种(家系)单株上的平均虫数、作为趋避性测验值 (Nemoto 等、1994)。

图 2-3 趋避性实验示意图 Fig 2-3 The pattern of antixenosis test

1.3.3 抗生性检测

500mL 1% agar 在微波炉中加热煮沸、待温度降至 40℃、加入 10mL MS salt Stock（详见附录 1）摇匀、然后取 30mL 倒入杯底直径 6 cm、高 14 cm 的无色透明塑料杯中、冷却至室温。然后将浸种催芽后的水稻种子播于上述盛有1% agar 的塑料杯中、每杯5 粒、重复 2 次、待秧苗长至 1.5～2.0 叶期、每杯接入 2～3 龄的灰飞虱若虫约30 头、纱布封口、10 天后统计每个杯子剩余的虫数、计算灰飞虱若虫的残存率、作为抗生性测验值（图2-4）。

图 2-4 抗生性检测示意图 Fig 2-4 The pattern of antibiosis test

1.4 DNA 样品制备

在水稻分蘖中期、取F2群体及BC1群体单株叶片1-2 张。DNA 的提取参照 Dellapporta S L 等 (1983) 的方法（表 2-2）。

表 2-2 DNA 微量提取步骤

1 取新鲜叶片 200mg-300mg、液氮研磨成细粉、置于 1.5ml 离心管中

2 向装有样品 1.5ml 离心管中加入 600μl 提取液（100mM Tris-HCl pH8.0, 50ml EDTANa2,500mM NaCl, 1.25% SDS）、摇匀、65℃温浴 30min、 间或振荡 3-4 次、至样品成黑绿 色

3 再向离心管中加入 150μl 醋酸钾（KAC） 浓液（5mol/L）、摇匀后、置于冰相里 30 分 钟

第二章 水稻品种 Rathu Heenati 抗灰飞虱基因的分子定位

1.5.1 试剂

SSR 引物在上海英俊生物技术有限公司合成、母液浓度 100pmol/L、-200C 保存；工作液浓度 2pmol/L、40C 保存。Taq 酶购于 Takara 公司。DNA Ladder (50bp): 北京Tiangen 公司。

1.5.4 SSR 标记的 PCR 产物检测

扩增产物用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶分离、然后利用 Sanguinetti 等(1994)的方法银染显色(表 2-3)。PCR 产物的观测利用垩白观测仪进行观察

744 对 SSR 标记进行亲本间多态性检测、选取 161 个具有多态的标记用于各群体

（F2 和BC1）基因型的分析。与母本02428 相同的带型赋值为“A”、与父本 Rathu Heenati 相同的带型赋值为“B”、杂合型的带型赋值为“H”、特殊的或缺失的带型赋值为“-”、利用 MAPMAKER/EXP 3.0 软件（Lincoln, 1993）进行连锁分析。

用MAPMAKER/EXP3.0 软件将所得到的 SSR 标记数据进行连锁分析。首先用

‘photo’ 命令为了收入数据、然后‘pd’、 ‘trans all’、‘s all’根据各标记之间的连锁关系、用“group”命令在 LOD 值大于 3.0 时、将所有标记进行分组。然后对每个“group”中的标记作多点分析、并采用Kosambi 函数将重组率转换成遗传距离（Centimorgan、 cM）。对于小的连锁群、直接采用 “compare” 命令、选择具有最大似然值的排列顺序构建连锁框架图；对于较大的连锁群、先用两点测验的方法、计算任意两标记间

的LOD 值、选择具有较大 LOD 值的 4-6 个标记、采用“compare”命令、推测其最佳排列顺序、建立基本框架图、然后采用“try”命令、依次将其它的标记放入到框架中的每个空间、寻找出每个标记的最佳位置、具有最大似然值的排列即是该标记的最佳位置。同时用 “ripple” 验证标记排列顺序。计算出每组内标记的最佳位置。最后、

用 “map” 命令确定标记间的相对位置。

1.7 QTLs 定位

采用基于多元回归模型(composite interval mapping, CIM) Windows QTL Cartographer 2.5 的复合区间作图法（Wang 等、2007）检测抗灰飞虱QTL。将LOD值的阈值定为2.2。取概率值P=0.005来确定性状QTL数目及其在染色体上的位置、贡献率和加性效应值也由此软件评估。QTL命名遵循 McCouch 等（1997）的原则。1.8 数据分析

采用 Excel 2003 软件和 SPSS 17.0 软件统计频率分布和进行卡方检测。