Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên trong quá trình sản xuất bánh men rượu

Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên trong quá trình sản xuất bánh men rượu

PHẦN 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong thế giới vi sinh vật, bên cạnh vi khuẩn, nấm mốc thì nấm menchiếm một tỉ lệ rất lớn, bao gồm cả những chủng có lợi và có hại Đặc biệtmột số chủng nấm men có khả năng lên men một số loại thực phẩm, có thể sửdụng để sản xuất các thực phẩm truyền thống

Việc sử dụng nấm men với mục đích phục vụ cho con người đã được

nhà bác học người Pháp Louis Pasteur và nhà bác học người Đan Mạch E.CHansen tiên phong nghiên cứu từ giữa những năm 1800 và cũng từ thời điểmnày, những công trình nghiên cứu về tính đa dạng của những sản phẩm thựcphẩm được sản xuất hoặc có tác động của nấm men đã cho thấy được vai trò

to lớn của nó

Ban đầu, để sản xuất cồn từ tinh bột, ở Châu Á, người ta thường dùngcác loại bánh men truyền thống; ở Châu Âu và Châu Mỹ, người ta dùng chếphẩm enzyme thu nhận được từ malt để đường hóa Theo thời gian, công nghệsản xuất cồn rượu ngày càng được hoàn thiện Từ bánh men thuốc bắc, thuốcnam của người Châu Á, các nhà khoa học đã phân lập được các giống vi sinhvật thuần khiết có khả năng đường hóa cao và ứng dụng thành công trong

công nghiệp như: nấm Rhizopus và Mucor (trong phương pháp amylose) hay loài nấm sợi Aspergillus trong phương pháp mycomalt Ngày nay, thay vì

công đoạn nuôi cấy mốc, người ta sử dụng trực tiếp chế phẩm enzyme côngnghiệp trong công đoạn đường hóa, làm tăng hiệu suất đường hóa cũng nhưhiệu suất lên men rất nhiều

Các phương pháp sản xuất rượu theo quy mô công nghiệp có mộtnhược điểm là yêu cầu điểu kiện vô trùng nghiêm ngặt Trong khi đó, việc sảnxuất rượu gạo theo phương pháp truyền thống bằng chế phẩm bánh men rượukhông đòi hỏi điều kiện nghiêm ngặt về vi sinh, lại thu được rượu có hương vịthơm ngon Do đó, những nghiên cứu gần đây có xu hướng quay lại côngnghệ lên men rượu truyền thống Hầu hết các nghiên cứu đều nhằm nâng cao

và ổn định hiệu suất của lên men truyền thống: nghiên cứu phân lập, ứngdụng những chủng giống đặc biệt vào lên men rượu truyền thống ở Nhật Bản,

Philipines, Trung Quốc… Trong nước, hiện đã có nhiều nghiên cứu về nhữngđặc tính của những chủng giống nấm men, nấm mốc phân lập từ bánh menrượu; nghiên cứu ứng dụng loại bánh men có bổ sung hỗn hợp nấm men vànấm mốc trong lên men rượu gạo có kiểm soát: nghiên cứu ảnh hưởng của các

vị thuốc lên hệ vi sinh vật trong bánh men [16]

Do đó cần phân lập và nghiên cứu đặc điểm sinh học các chủng nấmmen phân lập từ các nguồn tự nhiên để tìm cách tối ưu hóa, ứng dụng vàoviệc sản xuất bánh men rượu là rất cần thiết Xuất phát từ những yêu cầu đó,

chúng tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu ứng dụng chủng nấm men phân lập từ các nguồn tự nhiên trong quá trình sản xuất bánh men rượu”.

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tổng quan về nấm men

2.1.1 Định nghĩa, hình thái và cấu tạo của nấm men

2.1.1.1 Định nghĩa [3], [12], [17]

Nấm men (Yeast, levure) là loại nấm đơn bào sinh sản bằng hình thức

nẩy chồi hoặc phân đôi tế bào, có cấu tạo khá hoàn chỉnh gần giống tế bào cơthể bậc cao Chúng cư trú ở nhiều nơi, đặc biệt là trên lá, hoa quả và trong đất,nước, trên lương thực, thực phẩm có hàm lượng đường cao

Nấm men là vi sinh vật có khả năng sử dụng nhiều loại hydratcacbon

và đường khác nhau Loài nấm men Saccharomyces cerevisae có khả năng

hấp thụ rất nhiều loại đường như: glucoza, fructoza, mannoza, galactoza,sacaroza, maltoza, maltotrioza và một phần rafinoza Ngoài ra 2 loài có ích

nhất là: Saccharomyces cerevisae và Saccharomyces uvarum (carlsbergensis)

có khả năng sử dụng các dextrin và melibioza tương ứng Tuy nhiên, loài

Saccharomyces và các loài có quan hệ gần gũi với nó không có khả năng

chuyển hóa tất cả các loại đường như pentoza (riboza, xyloza, và arabinoza),xenlobioza (sản phẩm thủy phân của hemixenluloza, xenluloza), lactoza,insulin và xenluloza [2], [10]

2.1.1.2 Hình thái của tế bào nấm men [3], [11], [12]

Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật Tùy loài nấmmen mà tế bào có hình dạng khác nhau như hình cầu, hình trứng, hình ovan,hình elip và thường không ổn định, nó phụ thuộc vào tuổi, loài và điều kiệnnuôi cấy So với các vi sinh vật khác tế bào nấm men có kích thước tương đốilớn: đường kính khoảng 1µm; chiều dài 8µm.Và kích thước này thay đổi tùytheo loài, lứa tuổi, và điều kiện nuôi cấy

2.1.1.3 Cấu tạo của tế bào nấm men [4], [11]

Nấm men có cấu tạo tế bào khá phức tạp gần giống như tế bào thựcvật Có đầy đủ cấu tạo thành tế bào, màng, tế bào chất, ty thể, riboxom, nhân,không bào và các hạt dự trữ

Thành tế bào được cấu tạo bởi hai lớp phân tử bao gồm 90% là hợp chấtglucan và mannan, phần còn lại là protein, lipit và glucozamin Glucan là hợp chấtcao phân tử của D- Glucozamin, mannan là hợp chất cao phân tử của D -Mannoza Trên thành tế bào có nhiều lỗ, qua đó các chất dinh dưỡng được hấp thu

và các sản phẩm của quá trình trao đổi chất được thải ra Màng tế bào có chiềudày không quá 1nm và dính chặt vào tế bào chất Tế bào chất có cấu trúc khôngđồng nhất và ở thể keo Độ nhớt của tế bào chất cao hơn của nước 800 lần

Nhân tế bào nấm men là nhân điển hình, có màng nhân, bên trong làchất dịch nhân có chứa hạch nhân Nhân của tế bào nấm men ngoài ADN còn

có protein và nhiều loại men

Ty thể là cơ quan năng lượng của tế bào Ty thể nấm men có hình bầudục, được bao bọc bởi 2 lớp màng, màng trong gấp khúc thành nhiều tấm rănglược hoặc nhiều ống nhỏ làm cho diện tích bề mặt của màng trong tăng lên.Cấu trúc của 2 lớp màng ty thể giống cấu trúc của màng nguyên sinh chất.Trên bề mặt của màng trong có dính vô số các hạt nhỏ hình cầu Các hạt này

có chức năng sinh năng lượng và giải phóng năng lượng của ty thể Trong tythể còn có các thành phần cần cho quá trình tổng hợp protein như riboxom,các loại ARN và các loại enzym cần thiết cho sự tổng hợp protein

Riboxom của tế bào nấm men có 2 loại: loại 80S ( gồm 2 tiểu thể 60S

và 40S) nằm trong tế bào chất, một số khác gắn với tế bào chất; loại 70S( gồm

2 tiểu thể 40S và 30S) Ngoài các cơ quan trên, nấm men còn có không bào vàcác hạt dự trữ như hạt volutin, hạt glycogen và hạt lipit

2.1.2 Các quá trình sinh lý, sinh hóa của tế bào nấm men

2.1.2.1 Dinh dưỡng nấm men [4], [12].

Chất dinh dưỡng được thấm qua màng vào tế bào từ các chất của môitrường nuôi cấy bên ngoài Khi tế bào ở trạng thái môi trường nghèo hoặc cạncác chất dinh dưỡng thì những chất dự trữ nội bào như glycogen, tregaloza,lipit, các hợp chất chứa nitơ sẽ được sử dụng: dinh dưỡng nội bào

Các chất dinh dưỡng khi được sử dụng hoặc là đi vào thành phần tế bào

để phục vụ cho sinh trưởng hoặc là cung cấp năng lượng cần thiết cho đờisống của tế bào

* Dinh dưỡng cacbon

Các hợp chất hữu cơ khác nhau như các loại đường và dẫn xuất, cácrượu, axit hữu cơ, axit amin có thể là nguồn dinh dưỡng cacbon của nấmmen Hầu hết các loại nấm men đều không có enzym polyhdrolaza trong đó

có amylaza và xenlulaza Vì vậy nấm men không sử dụng trực tiếp được tinhbột cũng như xenluloza và hemixenluloza

Hầu hết các loài nấm men đều sử dụng được đường glucoza Tỷ số cácđường được nấm men sử dụng là đặc điểm riêng của từng loài Các loài

sacharomyces lên men rượu vang sử dụng glucoza, fructoza, maltoza,

saccaroza, galactoza, với rafinoza chỉ sử dụng được một phần, còn lactoza,melibioza, dextrin, pentoza và tinh bột lại hoàn toàn không sử dụng được

Các axit hữu cơ chiếm một vị trí quan trọng trong trao đổi chất của nấmmen Chúng có khả năng kích thích hoặc ức chế sinh trưởng của nấm men.Chúng cũng có thể là nguồn dinh dưỡng cacbon và năng lượng duy nhất Cácaxit béo được làm nguồn cacbon dinh dưỡng phụ thuộc vào từng chủng loàinấm men, vào nồng độ axit, vào chiều dài của mạch cacbon trong phân tử axit

và mức độ điện ly

* Dinh dưỡng Nitơ [4], [12]

Nguồn N cần thiết cho tổng hợp các cấu tử chứa nitơ có thể là các hợpchất hữu cơ hoặc vô cơ có sẵn trong môi trường Các hợp chất hữu cơ chứanitơ của tế bào là các axit amin, các nucleotit burin, pyrimidin, protein và một

số vitamin

Đa số nấm men không đồng hóa được nitrat Nguồn nitơ vô cơ đượcnấm men sử dụng tốt là các muối amoni của axit vô cơ cũng như hữu cơ Đó

là amoni sunphat, phosphat rồi đến các muối axetat, lactat, malat và sucxinat

Các nguồn nitơ hữu cơ thường là hỗn hợp các axit amin, các peptit, cácnucleotic Trong thực tế người ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủyphân protein tự nhiên ( đậu tương, khô lạc ) làm nguồn nitơ hữu cơ

Nấm men tiêu hóa rất tốt các axit amin, còn pepton kém hơn và hoàn toànkhông sử dụng được protein Nấm men chỉ sử dụng được các axit amin ởdạng tự nhiên (L - axit amin) Trong quá trình nuôi cấy nấm men các axitamin vừa là nguồn nitơ vừa là nguồn cacbon dinh dưỡng

* Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ khác [4], [12]

Các nguyên tố vô cơ trong nuôi cấy vi sinh vật nói chung, trong đó có nấmmen thì phospho được quan tâm trước hết, sau đó là kali, magiê và lưu huỳnh

+ Phospho tham gia vào các thành phần quan trọng của tế bào như cácnucleoproteit, axit nucleic, polyphosphat, phospholipit các hợp chất phosphođóng vai trò xác định trong các biến đổi hóa sinh khác nhau, đặc biệt là trongtrao đổi chất hydratcacbon và vận chuyển năng lượng Trong điều kiện kỵ khínấm men tiêu hóa phospho chủ yếu ở giai đoạn đầu, có thể dùng tới 80 - 90%tổng nhu cầu nguyên tố này

+ Lưu huỳnh: là thành phần của một số axit amin trong phân tử protein

và là nhóm phụ (- SH) của một số enzym Trong môi trường với hàm lượngnhỏ làm tăng sự nảy chồi của nấm men nhưng ở nồng độ 1mg/l thì lưu huỳnh

đã kìm hãm quá trình này

+ Các ion kali, canxi cũng cần có trong môi trường nuôi cấy hoặc lênmen Thông thường ion kali được bổ sung cùng với các muối phosphat hoặcsunfat, còn Ca2+ và Mg2+ thường có đủ trong nước sinh hoạt

+ Các nguyên tố vi lượng cũng rất cần thiết để quá trình sinh lý trong tếbào nấm men được xảy ra bình thường

+ Các nguyên tố vi lượng là mangan, đồng, sắt, kẽm, molipden, bo, liti,rubidi, coban Các nguyên tố này chỉ cần một lượng rất nhỏ

2.1.2.2 Quá trình trao đổi chất cuả nấm men [12]

 Dị hóa và đồng hóa ở tế bào nấm men

sản phẩm của quá trình dị hóa là vật liệu tế bào dùng cho sinh tổng hợp cáchợp chất cấu trúc tế bào mới, còn một số sản phẩm tế bào không sử dụng thải

ra ngoài môi trường như: rượu etylic, CO2, glycerin

Các cơ chất dinh dưỡng của nấm men thường dùng là các loại đườngnhư: các monosaccharit (glucoza, fructoza, galactoza ), các disaccharit( lactoza, maltoza, sacchroza ) các trisaccharit (xenlobioza )

* Sự đồng hóa

Đồng hóa là sử dụng các hợp chất trao đổi trung gian do quá trình dịhóa tạo thành hoặc có sẵn trong môi trường để thực hiện các quá trình sinhtổng hợp ra các cấu trúc tế bào, như các hợp chất cao phân tử polysaccharit,protein, axit nucleic, lipit tạo ra các tế bào mới từ các tiền chất đơn giản(axit amin, các bazơ purin và pyrimidin, axit hữu cơ)

Các quá trình đồng hóa và dị hóa thường xảy ra ở các vùng khác nhautrong tế bào, song chúng lại xảy ra đồng thời do các enzym đặc hiệu Các quátrình lên men và hô hấp hoặc là phản ứng hiếu khí hay kị khí đóng vai trò cơbản trong trao đổi chất của tế bào nấm men Các phản ứng trao đổi chất trong

tế bào nhờ chất xúc tác sinh học là các enzym Trong tế bào vi sinh vật cóhàng ngàn enzym được chuyển hóa xúc tác những phản ứng đặc trưng Nhữngenzym và hệ enzym khác nhau được khu trú trong các cơ quan của tế bàohoặc đơn giản là chúng được hòa tan trong tế bào chất Các enzym invertaza,permeaza đảm nhận việc đồng hóa các loại đường và vận chuyển các chất quamàng tế bào

 Trao đổi năng lượng

Nấm men cần nguồn năng lượng trong quá trình phân giải (hay oxy hóahoặc đốt cháy) các hợp chất dinh dưỡng từ ngoài vào tế bào Nguồn cung cấpnăng lượng chủ yếu cho nấm men là gluxit, thực chất là một số loại đườngđơn và đường đôi Các loại đường trước hết được biến thành glucoza vàfructoza Hai loại đường bị biến đổi qua một số phản ứng tới axit pyruvic vàgiải phóng ra hợp chất năng lượng giàu ATP Tiếp theo giai đoạn đường phân

là sự phân giải triệt để các hợp chất trung gian thành sản phẩm cuối cùng là

CO2 và H2O

 Hô hấp

Nấm men là cơ thể sống kỵ khí tùy tiện Chúng có thể sống ở điều kiệnhiếu khí cũng như kỵ khí Chính vì vậy chúng có 2 kiểu hô hấp khác nhau, tùythuộc vào lượng oxy cung cấp cho quá trình trao đổi chất

Hô hấp hiếu khí:

C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H20 + 674 cal

Hô hấp kỵ khí:

C6H12O6 2 CH3CH2OH + 2CO2 + 33 cal

2.1.2.3 Sinh trưởng của nấm men [12]

Khi cấy nấm men hay vi sinh vật nói chung vào môi trường dinhdưỡng, chúng sẽ sinh sản cho đến khi cơ chất dinh dưỡng cần thiết trong môitrường giảm tới mức thấp nhất Khi đó sinh trưởng phát triển của chậm dần vàngừng hẳn, cũng có thể tế bào còn vài lần phân chia tiếp, nhưng sự phân tăngsinh khối không đáng kể Nếu trong cả quá trình nuôi cấy này ta không bổsung và loại bỏ các sản phẩm trao đổi chất thì ta có quần thể tế bào trongkhông gian sống có giới hạn

Quá trình sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật nói chung, trong đó

có nấm men được chia làm 4 pha:

- Pha lag (pha tiềm phát hay pha làm quen):

Đây là giai đoạn nấm men mới được cấy vào môi trường còn chưa sinhsản Vận tốc sinh trưởng xem như bằng không Đây là pha tiềm phát, nấmmen còn thích nghi với môi trường mới, trong đó một tế bào bị ức chế, thậmchí có thể chết Số lượng tế bào nấm men lúc này là không tăng hoặc tăngkhông đáng kể, nhưng sự trao đổi chất của chúng xảy ra mạnh mẽ Tế bào cókích thước tăng lên đáng kể, hàm lượng các chất đều tăng lên Trong môitrường càng đầy đủ dinh dưỡng, giống nấm men cấy vào càng non, khỏe thìpha lag càng ngắn

- Pha logarit (pha phát triển chỉ số hay pha phát triển theo cấp số nhân).Trong pha này nấm men sẽ phát triển số lượng tế bào theo cấp số nhânvới tốc độ sinh trưởng là cực đại Trong pha này, nấm men có hoạt tính sinh

lý sinh hóa rất đặc trưng và chúng rất nhạy cảm với các nhân tố không thuậnlợi hơn các tế bào đã trưởng thành và ở trạng thái ổn định

Trong pha chỉ số tế bào phát triển ồ ạt, trong khi đó các chất dinhdưỡng trong môi trường không phải là vô tận mà ngược lại ngày một giảm đi,hơn nữa trong môi trường xuất hiện và tích tụ những sản phẩm trao đổi chấtkhông cần thiết đối với giống nuôi cấy Như vậy trong quá trình chất dinh

dưỡng cạn dần, các sản phẩm sinh ra làm cho các điều kiện mất đi sự thuậnlợi cho sinh trưởng và quá trình chuyển sang pha ổn định.

- Pha ổn định: Trong pha này tế bào sống là ổn định và mật thể quầnthể là tối đa

- Pha suy vong: Trong pha này tế bào sống giảm dần và tế bào chấttăng dần, một số tế bào chất bị tự phân do các enzym proteaza nội bào Các tếbào sống trở nên già đi, kích thước nhỏ lại, biến dạng và tế bào chất xuất hiệndạng hạt Tế bào chất bị tự phân trở nên trống rỗng và bên trong còn các hạtchất béo nhỏ

2.1.2.4 Sinh sản của nấm men [3], [4], [12], [13]

Nấm men có 3 hình thức sinh sản: sinh dưỡng (bằng nảy chồi hoặcphân cắt tế bào), hữu tính ( bằng bào tử) và vô tính (bằng bào tử) Tùy thuộcvào điều kiện nuôi cấy tế bào nấm men sẽ sinh sản theo cách sinh sản vô tínhhay cách sinh sản hữu tính

* Sinh sản sinh dưỡng

Là hình thức sinh sản đơn giản nhất của nấm men Có 2 hình thức sinhsản sinh dưỡng: nảy chồi và hình thức phân đôi tế bào Ở hình thức nảy chồi,

từ một cực của tế bào mẹ nảy chồi thành một tế bào con, sau đó hình thànhvách ngăn ngang giữa 2 tế bào Tế bào con có thể tách khỏi tế bào mẹ hoặc cóthể dính với tế bào mẹ và lại tiếp tục nảy chồi làm cho nấm men giống nhưhình dạng cây xương rồng tai nhỏ

* Sinh sản vô tính: bằng 2 hình thức bào tử túi và bào tử bắn.

Bào tử túi là những bào tử đã được hình thành trong một túi nhỏ gọi lànang Trong nang thường chứa từ 1 đến 8 bào tử, đôi khi đến 12 bào tử

Bào tử bắn là những bào tử sau khi hình thành nhờ năng lượng của tếbào bắn mạnh về phía đối diện Đó là một hình thức phát tán của tế bào

* Sinh sản hữu tính: do 2 tế bào nấm men kết hợp với nhau hình thành

hợp tử Hợp tử phân chia thành các bào tử nằm trong nang, nang chín bào tửđược phát tán ra ngoài Nếu 2 tế bào nấm men có hình thái kích thước giốngnhau tiếp hợp với nhau thì được gọi là tiếp hợp đẳng giao Nếu 2 tế bào nấmmen khác nhau thì được gọi là tiếp hợp dị giao

Nấm men là nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, nótham gia vào các quá trình chuyển hóa vật chất, phân hủy chất hữu cơ trongđất Hoạt tính sinh lý của nhiều loại nấm men được ứng dụng trong côngnghiệp thực phẩm, nông nghiệp và các ngành khác Đặc biệt trong quá trìnhsản xuất các lọai rượu, cồn, nước giải khát lên men, làm thức ăn gia súc; trong

y học như sản xuất chất kháng sinh penixilin, trong việc tổng hợp các loại axithữu cơ, các loại enzym, các nhân tố sinh trưởng, trong công nghệ enzym nấmmen là nhân tố tích cực nhất

Ngoài hoạt tính sinh lý, bản thân tế bào nấm men có rất nhiều loạivitamin và các axit amin, đặc biệt là các axit amin không thay thế Đặc tínhnày được dùng để chế tạo thức ăn gia súc từ nấm men

2.1.3.2 Ứng dụng của nấm men trong sản xuất rượu [12], [14]

 Bản chất của quá trình lên men

Về bản chất, lên men là quá trình oxy hóa khử sinh học được thực hiện

do hoạt động sống của vi sinh vật dưới xúc tác của enzym nhằm cung cấpnăng lượng và các hợp chất trung gian cần thiết cho chúng

Cũng như quá trình oxy hóa khử sinh học ở mọi cơ thể khác, các mạchphản ứng của sự đường phân, chu trình Krebs, chu trình pentosophosphat lànhững phanr ứng hóa sinh cơ bản nhất của quá trình lên men ở tế bào vi sinhvật Khác với cả quá trình hô hấp, trong quá trình lên men, hydro (gồm e- và

H+) tách khỏi cơ chất được chuyển tới chất nhận cuối cùng là các chất hữu cơ

khác nhau tạo thành các sản phẩm tích tụ trong môi trường Đó là các sảnphẩm mà người ta nhận được trong sản xuất lên men.

Năng lượng giải phóng ra từ sự phân giải các hợp chất hữu cơ trongquá trình sản xuất lên men tuy không nhiều, song do chính là nguồn cung cấpnăng lượng đáp ứng nhu cầu về năng lượng cần cho hoạt động sống của visinh vật trong các quá trình lên men tương ứng

*Điều kiện của quá trình lên men

Thành phần của môi trường

- Glucid : Glucid là nguồn dinh dưỡng quan trọng của vi sinh vật, đóngvai trò chủ chốt trong sự tạo năng lượng cho tế bào vi sinh vật Ngoài ra nócòn là nguồn cung cấp vật liệu tạo nên các thành viên của tế bào Trong môitrường lên men, glucid thường được sử dụng dưới dạng chiết có đường, mật rỉhoặc các nguyên liệu và bã thải chứa đường, tinh bột Các vật liệu chứa tinhbột thường cũng được thủy phân thành đường trước khi lên men

- Phosphat vô cơ :

Phosphat vô cơ đóng vai trò quan trọng trong sự trao đổi năng lượng.Trong lên men các muối phosphat vô cơ được dùng phổ biến là phosphatamon, phosphat kali

- Nitơ :

Nitơ tham gia quá trình tạo protein và nhiều chất có đặc tính sinh họckhác của tế bào vi sinh vật Trong môi trường lên men, nitơ thường được sửdụng dưới dạng muối nitrat và các hợp chất amon hoặc một số chất có nguồngốc vi sinh vật

- Vitamin và nguyên tố vi lượng :

Vitamin là nguyên tố vi lượng là các chất sinh trưởng cần thiết cho hoạtđộng sống của vi sinh vật Chúng thường được sử dụng với lượng rất ít nhưng tácdụng của chúng rất lớn và đa dạng đối với sự sống bình thường của vi sinh vật

Tác nhân gây lên men

Điển hình của tác nhân gây lên men là nấm men Trong số các giống

nấm men, Saccharomyces là giống được sử dụng rộng rãi Nấm men đặc điểm

là trong môi trường yếm khí, chúng có khả năng chuyển đường thành rượuetylic và CO2 và không có khả năng chuyển hóa tiếp etanol tạo thành, có

nghĩa là sự lên men sẽ dừng lại ở giai đoạn hình thành và tích lũy rượu etylic.

Tế bào nấm men còn có đặc điểm là khả năng tạo ra các nội enzym, nghĩa lànhững enzym xúc tác ở bên trong tế bào Như vậy sự phân ly đường sẽ xãy ra

ở bên trong tế bào nấm men, còn rượu etylic và CO2 được tạo thành thì đi rakhỏi tế bào và tích tụ ở trong môi trường

Các chủng nấm men có ứng dụng nhiều trong công nghiệp bia, rượu,

nước uống thuộc họ Saccharomyceteae bao gồm các giống Pichia,

Saccharomyces, Torulaspora, Debaryomyces, Schizosaccharomyces.

 Nguyên liệu và các điều kiện lên men

Nguyên liệu chủ yếu để sản xuất rượu là tinh bột Trước khi thực hiệnquá trình lên men, tinh bột cần được thủy phân thành đường Sự thủy phân cóthể thực hiện nhờ enzym amylaza từ nguồn khác như enzym vi sinh vật hoặcmalt Trong các nguồn cung cấp enzym này, ngoài amylaza còn chứa cácenzym khác Vì vậy, cùng với sự thủy phân tinh bột cũng đồng thời xảy ra sựthủy phân các chất khác chứa trong nguyên liệu lên men như: protein, hợpchất phospho, chất béo Nhiều sản phẩm thủy phân của các chất này chấtdinh dưỡng cần thiết cho nấm men và cũng là những chất tạo hương vị chosản phẩm cho quá trình lên men rượu, hoa quả, bánh mỳ

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men như nồng độ đường,

độ axit của môi trường, nhiệt độ Nồng độ đường thích hợp cho đa số nấmmen là 12 - 16% Khi nồng độ đường quá cao hoặc quá thấp thì hiệu lực lênmen đều bị giảm thấp Độ axit của môi trường cũng giữ vai trò quan trọng.Quá trình lên men xảy ra bình thường khi pH = 4 - 4.5 Trong môi trườngkiềm, sự lên men tiến triển theo đường hướng đặc biệt tạo thành sản phẩmchính là glycerin Nhiệt độ có ảnh hưởng tới vận tốc lên men Thường vận tốclên men lớn nhất vào khoảng 29 - 320C Trong thực tế tùy yêu cầu quá trìnhlên men tiến hành trong khoảng nhiệt độ từ 24 - 280C Sự tích tụ rượu trongmôi trường có tác dụng độc hại đối với nấm men Đa số trường hợp sự lênmen đường bị đình chỉ khi nồng độ rượu trong môi trường đạt từ 12 - 14% thểtích Khí CO2 ức chế sự lên men, nhưng sự thoát khí CO2 có tác dụng khuấyđộng dịch lên men do đó làm tăng tốc độ lên men

 Diễn biến sinh lý quá trình lên men rượu

Đường và các chất dinh dưỡng khác của quá trình lên men trước tiênđược hấp phụ trên bề mặt của tế bào nấm men, sau đó khuyếch tán qua bề mặtbán thấm vào bên trong tế bào Trong tế bào, đường bị chuyển hóa qua chuỗiphản ứng enzym để tạo thành sản phẩm cuối cùng của sự lên men là rượu và

CO2 Rượu etylic và CO2 được tạo thành thoát ra khỏi tế bào và khuyếch tánvào môi trường xung quanh Vì rượu hòa tan được với nước theo bất kỳ tỷ lệnào nên nó có thể khuyếch tán vào môi trường một cách nhanh chóng và tạo

ra một đậm độ lớn ở xung quanh tế bào nấm men Khí CO2 cũng hào tan đượctrong dịch thể, song độ hòa tan của nó trong nước không lớn lắm Do vậy màmôi trường lên men nhanh chóng bão hòa bởi khí CO2 CO2 bám vào tế bàonấm men thành những cái bột Khi các bọt đạt đến độ lớn nào đó thì lực nângcủa nó vượt quá trọng lượng của tế bào và cả tế bào bọt được nâng lên nổitrên bề mặt, bọt vỡ, tế bào nấm men bị chìm xuống Như vậy tế bào nấm menvốn dĩ không di động trở thành di động ở trong môi trường lên men khiến cho

sự trao đổi chất trong tế bào trở nên mạnh mẽ hơn sự lên men cũng được tănglên một cách tương tự

 Cơ chế sinh hóa xảy ra trong quá trình lên men rượu

Lên men rượu là phân giải yếm khí đường dưới tác dụng của enzym visinh vật đặc hiệu Trong sự lên men rượu, axit pyruvic được tạo thành và bịdecacboxyl hóa tạo thành acetaldehyl và CO2 nhờ sự xúc tác của pyruvatdecacboxylaza

CH3 - C - COOH CH3CHO +CO2 (1) Pyruvat decacbonxylaza

O

Axit pyruvic Acetaldehyd

Sau đó, acetaldehyde bị khử thành rượu etylic dưới tác dụng xúc táccủa ancoldehydrogenaza của nấm men

CH3CHO + NADH+ + H+ CH3CH2OH +NAD+ (2) Acoldehydrogenaza

Ở đây NADH2 tạo thành trong phản ứng oxy hóa glyceradehyd 3P củaquá trình đường phân đóng vai trò chất cho hydro, còn acetaldehyd là chấtnhận Trong điều kiện thoáng khí quá trình lên men bị ức chế, khi đó hydro

tách ra được chuyển qua chuỗi hô hấp tới oxy và axit pyruvic, sản phẩm củaquá trình đường phân sẽ tiếp tục bị oxy hóa qua nhiều bước trong chu trìnhKrebs Các cặp hydro tách ra được chuyển tới oxy Quá trình này liên hợp vớiquá trình tạo ATP.

Sự lên men rượu trong điều kiện bình thường: Xảy ra khi pH = 4 –

5 và có thể chia làm hai thời kỳ:

Thời kỳ cảm ứng

Trong thời kỳ nay lượng acetaldehyd tạo thành theo phản ứng (1) còn ít,khi đó hydro được chuyển từ NADH2 tới glyceradehyd 3P tạo thành glycerin3P Chất này bị khử gốc P nhờ enzyme photphataza tạo thành glycerin

CH2OP NADH2 NAD CH2OP CH2OH

C6H12O6… CHO CHOH CHOH

P

CHO CH2OH CH2OH Glyceradehyd 3P glycerin 3P glycerin

Vậy glycerin là sản phẩm phụ của lên men rượu trong môi trường axit

Thời kỳ tĩnh

Khi lượng acetadehyd đã đạt tới mức nào đó thì chất tiếp tục nhậnhydro từ để chuyển thành rượu etylic theo phản ứng (2)

C6H12O6 CH3CHO + NADH2 + CH3CH2OH + NADH+

 Sự ức chế lên men rượu khi có mặt oxy

Sự lên men rượu xảy ra mạnh mẽ trong điều kiện yếm khí, hiệu suất

dự trữ năng lượng cho tế bào vi sinh vật trong trường hợp này rất thấp Dovậy để duy trì sự sống vi sinh vật phải sử dụng một lượng lớn glucoza nhờquá trình lên men

Khi có oxy, quá trình lên men bị ức chế và chuyển sang cơ chế hô hấp

Sự ức chế lên men khi có mặt oxy gọi là hiệu ứng Pasteur Trong quá trìnhnày ATP được tổng hợp mạnh mẽ nhờ quá trình phosphoryl hóa oxy hóa liênhợp với quá trình vận chuyển proton và electron qua dãy hô hấp tới oxy Kếtquả là trạng thái tích lũy năng lượng glucoza không nhiều cũng đủ duy trì sựsống và phát triển của chúng Bởi vậy khi có hiệu ứng Pasteur thì khôngnhững tạo thành etanol và CO2 giảm mà cả tiêu thụ đường cũng giảm

2.2 Tổng quan về bánh men

Ở các nước Châu Á, theo truyền thống người ta hay dùng các loại bánh

men để sản xuất rượu, cồn từ tinh bột Lúc đầu, bánh men cũng được tạo ra từ

những mẻ ủ tốt nhất bằng cách tạo hình, đem sấy khô, rồi bảo quản để dùngdần Bằng cách này, người ta hoàn toàn chủ động được quá trình sản xuất vàđảm bảo cả chất lượng sản phẩm Từ đó phương pháp sản xuất bánh men pháttriển khá hoàn thiện và tạo ra được nhiều loại bánh men khác nhau, tùy từngdân tộc và thị hiếu người tiêu dùng Các loại bánh men đươc sản xuất theophương pháp truyền thống về nguyên tắc là giống nhau Nhưng tùy theo đặcđiểm khí hậu, nguyên liệu và sở thích từng địa phương mà người ta bổ sungvào nấm men một số thành phần khác

2.2.2 Bánh men rượu lá

Bánh men lá thường được người dân tộc thiểu số sản xuất và tiêu thụ Đồng bào thiểu dân tộc thiểu số sử dụng bánh men lá để sản xuất rượu cần Ở đây thay cho các vị thuốc bắc là các loại lá khác nhau Chất lượng rượu phụ thuộc rất lớn vào số lượng và thành phần các loại lá Bánh men lá có 3 loại: loại một lá, loại hai lá, loại ba lá

2.2.3 Bánh men thuốc bắc

Ngoài thành phần bột gạo, vi sinh vật còn có các vị thuốc bắc Trongbánh men thuốc bắc ở Mai Đông - Vân Hà (Hà Bắc) có 10 đến vị thuốc bắcnhư bạch truật, nhục đậy khấu, nhục quấy

Việc cho thuốc bắc vào có thể là để kích thích sinh trưởng cho hệ visinh vật trong bánh men, để sát trùng hoặc có thể tạo mùi thơm đặc trưng củasản phẩm

2.3 Quy trình sản xuất bánh men theo phương pháp truyền thống

Giới thiệu bánh men và quy trình sản xuất bánh men theo phương pháp

truyền thống [16].

Bánh men là một loại men rượu được sản xuất thủ công tại Việt Nam.Mỗi địa phương và mỗi dân tộc có một phương pháp sản xuất riêng Trongchế phẩm bánh men thuốc bắc chứa nhiều giống vi sinh vật thuộc vi khuẩn,nấm men và nấm mốc (nấm sợi) Thực chất, men thuốc bắc là canh trườngkhông thuần khiết của hệ vi sinh vật có khả năng sinh trưởng tổng hợp hệenzyme đường hóa và lên men rượu

Nguyên liệu chính để sản xuất bánh men là: bột gạo, men giống Quytrình sản xuất theo phương pháp truyền thống như sau:

Quy trình sản xuất bánh men rượu theo phương pháp truyền thống

Nước

Tạo hình

Gạo Làm sạch

Men mốc giống Nước

Ủ

Bánh men rượu Hong khô

Thuyết minh quy trình:

Nguyên liệu làm bánh men: Bánh men sử dụng trong sản xuất rượu

truyền thống là bột gạo ẩm trộn lẫn với bánh men giống giả nhỏ

Làm bánh men

Gạo sau khi xay thành bột được nhào trộn đều với men giống đã đượcnghiền nhuyễn theo tỉ lệ nhất định Sau đó định hình thành dạng viên, đặt vàocác khay có lót trấu và ủ trong thời gian thích hợp để hệ vi sinh vật trong bánhmen phát triển và nở xốp Khi bánh men nở xốp, nấm mốc mọc đều và có mùirượu thì tiến hành hong khô Bánh men thành phẩm được bảo quản để sửdụng dần

Lưu ý có hỗn hợp bột trước khi tạo hình nên có độ ẩm vừa phải, khôngkhô quá cũng không nhão quá, thích hợp nhất là khoảng 50 - 55% Nhiệt độ ủkhoảng 30 - 350C là tốt, nhiệt độ hong không quá 350C

Việc sản xuất bánh men theo phương pháp cổ truyền có những ưu vànhược điểm nhất định Ưu điểm là không cần giống vi sinh vật thuần khiết,không đòi hỏi kỹ thuật cao và không cần nhiều vốn đầu tư Tuy nhiên chấtlượng bánh men kém vì có nhiều tạp khuẩn dẫn đến chất lượng bánh mencũng không ổn định và hiệu suất lên men không cao

Ngày nay cùng với những tiến bộ trong phân lập, nhân giống, kỹ thuậtsản xuất bánh men rượu có thay đổi : thay vì sử dụng bánh men gốc để sản xuấtbánh men, người ta dùng trực tiếp chủng vi sinh vật thuần khiết để sản xuấtbánh men, hoặc vẫn dùng bánh men gốc nhưng bổ sung thêm những giốngthuần khiết, có hoạt lực cao để tăng chất lượng của bánh men thành phẩm

PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu

- Nấm men được phân lập từ các nguồn : dứa, nho có trong tự nhiên.

- Gạo tẻ được mua tại các chợ ở thành phố Huế

- Nấm mốc Aspergillus oryzae thuần chủng từ Nhật Bản.

Môi trường nuôi cấy

Các môi trường và thành phần môi trường sử dụng trong nghiên cứu(phụ lục):

- Phân lập và nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của nấm men: môitrường Hansen (MT1)

- Môi trường nhân giống nấm men: môi trường Hansen – Cao nấmmen (MT2)

- Nghiên cứu khả năng lên men của các loại đường: môi trường nướcchiết giá đậu có bổ sung 2% các loại đường (MT3)

- Môi trường nghiên cứu khả năng lên men: môi trường Hansen bổsung 20% glucose (MT4)

3.2 Nội dung nghiên cứu [1], [6], [7], [9]

- Phân lập các chủng nấm men thuần chủng từ các nguồn nho và dứa

- Xác định được một số đặc điểm sinh học của các chủng nấm menphân lập được:

+ Đặc điểm hình thái của khuẩn lạc và của tế bào nấm men

+ Khả năng lên men của một số loại đường: glucoza, sacchroza,maltoza, lactoza của nấm men

+ Khảo sát khả năng lên men rượu của các chủng nấm men phân lập được.+ Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của cácchủng nấm men như: thời gian, nhiệt độ

+ Khảo sát khả năng thủy phân tinh bột của các chủng nấm men

- Phương pháp sản xuất bánh men rượu

+ Sản xuất bánh men rượu từ chủng nấm men phân lập được

+ Ảnh hưởng của độ ẩm đến chất lượng bánh men và khả năng lênmen rượu của bánh men

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Nấm men

3.3.1.1 Phân lập nấm men [6[, [7]

Chuẩn bị một dãy ống nghiệm chứa 9ml nước muối sinh lý đã đượckhử trùng Đồng nhất và lấy 1g mẫu cho vào ống nghiệm, tiến hành pha loãngthành các nồng độ liên tiếp Lấy 1ml dung dịch ở một độ pha loãng được chọncho vào hộp peptri đã được khử trùng, đổ môi trường Hansen đã được khửtrùng và làm nguội đến 50oC vào, xoay nhẹ và đều tay hộp peptri để môitrường phân bố đều trong đĩa Đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 35oC ± 2oC Sau 24 -36h lấy ra quan sát khuẩn lạc.

Chọn những khuẩn lạc riêng biệt, dùng que cấy phân lập tiếp trên môitrường đặc Tiếp tục phân lập đến khi nào được các khuẩn lạc thuần chủng

3.3.1.2 Cấy chuyền và giữ giống [2], [8]

Dùng que cấy lấy một ít khuẩn lạc từ ống thạch nghiêng cho vào ốngnghiệm chứa dung dịch Hansen Nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ 35oC ± 2oC Sau24h lấy que cấy nhúng vào dịch rồi cấy vạch lên đĩa thạch chứa môi trườngHansen Nuôi trong tủ ấm cho khuẩn lạc phát triển Chọn khuẩn lạc riêng rẽcấy vào ống thạch nghiêng Giống được bảo quản trong ống thạch nghiêng ở

3 - 4oC trong vòng 1 tháng

3.3.1.3 Nhân giống [9]

Môi trường nhân giống là môi trường lỏng được chuẩn bị và thanhtrùng trong ống nghiệm và bình tam giác Chủng nấm men được lấy trong ốnggiống Sau 24h phát triển thì cấy tiếp sang bình tam giác (tỉ lệ 1% về thể tích).Tùy thuộc quy mô phòng thí nghiệm mà các cấp nhân giống thích hợp

3.3.1.4 Nhuộm, soi tế bào nấm men [1], [2], [6].

Nguyên tắc: vi sinh vật bắt màu thuốc nhuộm là một quá trình hấp

phụ Trong đa số trường hợp thuốc nhuộm kết hợp với vi sinh vật rất bềnvững khó bị phá hủy hoặc bị nước làm phai đi

Cách tiến hành: cho vài giọt canh trường nấm men và một giọt thuốc

nhuộm lên phiến kính, trộn đều, đậy lá kính lại để yên 2 - 3 phút rồi đem quan sát

3.3.1.5 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng nấm men phân lập được

 Khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng nấm men theo

thời gian nuôi cấy

Theo một số tài liệu thì đa số nấm men phát triển bình thường trongkhoảng nhiệt độ 280C - 320C [6], [12] Do đó chúng tôi chọn nhiệt độ là 300C

để khảo sát khả năng sinh trưởng của các chủng nấm men theo thời gian là12h, 24h, 36h, 48h và 72h

Nấm men được lấy từ ống giống sau khi đã nhân giống được bổ sungvào các ống nghiệm chứa môi trường Hansen lỏng.Tiến hành nuôi cấy ở nhiệ

độ 300C theo các khoảng thời gian trên Định kỳ lấy ra và đo mật độ tế bàobước sóng 620nm

 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng của

các chủng nấm men

Để khảo sát ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ đến khả năng phát triển củacác chủng nấm men phân lập được, chúng tôi chọn các mốc nhiệt độ 250C,

300C, 350C, 400C để khảo sát nhiệt độ tối thích cho từng chủng nấm men

Nấm men được lấy từ ống giống, sau khi đã nhân giống được bổ sung vàocác ống nghiệm chứa môi trường Hansen lỏng Sau khoảng thời gian tối thíchnhất cho từng chủng nấm men thì lấy ra đo mật độ tế bào ở bước sóng 620nm

 Khảo sát khả năng lên men các nguồn đường của các chủng

Quan sát việc tạo thành CO2 và đẩy ống Durham để biết nấm men cóhay không có khả năng lên men từng nguồn đường

 Khảo sát khả năng thủy phân tinh bột của các chủng nấm men

phân lập được [1]