NGHIÊN cứu điều KIỆN NUÔI, KHẢ NĂNG KHỬ SULFIDEM, QUY TRÌNH ĐÔNG KHÔ VI KHUẨN tía (RHODOBACTER SP NTU) NHẰM sản XUẤT CHẾ hẩm PROBIOTIC

Ngoài ra,probiotic còn có tác dụng làm sạch đường ruột, cân bằng hệ sinh thái, điều chỉnhmôi trường, ức chế các vi sinh vật gây bệnh, loại bỏ các quá trình lên men bất lợi docác vi sinh

Trước tiên tôi xin chân thành gửi lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn VănDuy, người đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành đề tài

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới quý thầy, cô trong Viện Công nghệ sinh học &môi trường, trường Đại học Nha Trang đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quýbáu trong suốt quá trình học

Con xin gửi lòng biết ơn đến bố mẹ cùng gia đình đã tạo mọi điều kiện vềmặt tinh thần cũng như về vật chất trong suốt quá trình của khóa học

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến chị Nguyễn Minh Nhật, cán bộ quản lý phòng thínghiệm Công nghệ sinh học, đã tạo mọi điều kiện về thời gian để tôi hoàn thành đềtài

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thể Lớp 48 CNSH, những bạn đồng hànhcùng tôi trong bốn năm qua, cùng chia sẻ và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đềtài này

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả!

Nha Trang, tháng 06 năm 2010

Sinh viên thực hiện

Vũ Thị Nhung

MỤC LỤC

DANH MỤC BẢNG

DANH MỤC HÌNH

LỜI NÓI ĐẦU

Sự phát triển không ngừng của khoa học công nghệ nhằm đáp ứng nhu cầungày càng cao của con nguời Trên tiến trình vận động này con người ngày càng đòihỏi khắt khe hơn về chất lượng của mọi loại sản phẩm tiêu dùng đặc biệt là vấn đề

an toàn sức khoẻ của chính bản thân mình Chính những nhu cầu này là nhân tốkích thích trực tiếp thúc đẩy sự phát triển của khoa học công nghệ “ Probiotic” làmột phần của sự phát triển ấy

Probiotic là một thành quả khoa học, một thành quả của công nghệ sinh học

Nó đang được ứng dụng rộng rãi vào đời sống con người bởi vì tính hợp lý và hiệuquả mà nó thể hiện Probiotic bao gồm các chủng vi sinh vật hữu hiệu được bổ sungvào thành phần thức ăn của vật nuôi (gia súc, gia cầm, thủy sản…) nhằm làm tănghiệu quả sử dụng thức ăn, tăng và đảm bảo tính an toàn về sức khoẻ Ngoài ra,probiotic còn có tác dụng làm sạch đường ruột, cân bằng hệ sinh thái, điều chỉnhmôi trường, ức chế các vi sinh vật gây bệnh, loại bỏ các quá trình lên men bất lợi docác vi sinh vật có hại này gây nên, làm cho các chức năng của đường ruột được hoạtđộng tốt hơn …

Một trong những vi sinh vật hữu hiệu trong chế phẩm probiotic là các vikhuẩn quang hợp tía Chúng có tác dụng khử một chất làm hôi môi trường, H2S, vàđóng góp vật chất hữu cơ trong các môi trường thiếu ôxy do năng lực tự dưỡng củachúng

Ở nước ta, những nghiên cứu về vi khuẩn tía còn hạn chế, chủ yếu hướngvào mục đích sản xuất chế phẩm probiotic để xử lý môi trường, một số phục vụ chonuôi trồng thủy sản

Xuất phát từ thực tế trên đây, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

“Nghiên cứu điều kiện nuôi, khả năng khử sulfide và quy trình đông

khô vi khuẩn tía (Rhodobacter sp NTU) nhằm sản xuất chế hẩm probiotic” với

mục đích như sau:

• Nghiên cứu điều kiện nuôi, khả năng sinh trưởng của vi khuẩn

tía (Rhodobacter sp NTU) nhằm thu hoạch sinh khối tối ưu.

• Xác định khả năng khử sulfide của chủng vi khuẩn trên

• Xây dựng được quy trình đông khô phù hợp để sản xuất chếphẩm probiotic

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Chế phẩm probiotic

1.1.1 Khái niệm và thành phần chế phẩm probiotic

Thuật ngữ “probiotic” được Lilly và Stiwell đề xuất năm 1965 để mô tảnhững chất sản sinh bởi vi sinh vật làm tăng trưởng một vi sinh vật (hoặc sinh vật)

khác Năm 1989, Parker lại định nghĩa thêm cho rõ:”Probiotic là những vi sinh vật (chủ yếu là vi khuẩn) có khả năng cộng sinh (hoặc hợp sinh) trong đường ruột có tác dụng cân bằng hệ vi sinh vật trong đó có một số tác dụng hữu ích cho vật chủ”

(Parker, 1989) Do vậy, probiotic có nghĩa là phòng ngừa hay dự phòng sinh học(có lẽ là do ghép 2 chữ tiếng Anh: Prophylxia – phòng bệnh, dự phòng và biotics –

sự sống)

Nghiên cứu ứng dụng probiotic mới được chú ý trong 20 năm trở lại đây,nhưng tác dụng của nó đã được nhận thấy từ lâu Elie Metnhicoff là người đầu tiênđặt nền móng cho việc sử dụng probiotic (Metnhicoff, 1908) Năm 1908, ông đề

nghị sử dụng vi khuẩn lactic (Lactobacterium delbruekii spp bulgaricus) để kéo dài

tuổi thọ con người Ngày nay chế phẩm probiotic được sử dụng khá hiệu quả trongchăn nuôi đặc biệt là trong nuôi tôm, trồng trọt, trong bảo vệ sức khỏe con người vàbảo vệ môi trường Tuy nhiên việc dùng chế phẩm này vào nuôi trồng thủy sản(tôm, cua, cá, nhuyễn thể…) mới bắt đầu trong hơn thập kỷ gần đây

Tại Nhật Bản, chế phẩm probiotic có tên gọi là E.M (các vi sinh vật hữuhiệu) do giáo sư, tiến sỹ Teruo Higa, Trường đại học Ryukyus, Okinawa, Nhật Bản

đề xuất năm 1980 đã được sử dụng nhiều trong chăn nuôi, trồng trọt cũng như bảo

vệ môi trường đều cho kết quả khả quan (Higa, 1980) Đến nay chế phẩm này đượchơn 80 nước và vùng lãnh thổ sử dụng, đặc biệt là khu vực Châu Á và Thái BìnhDương trong đó có Trung Quốc, Hàn Quốc, Thái Lan và Việt Nam

Thành phần chế phẩm probiotic thường có những nhóm vi sinh vật sau

(Lương Đức Phẩm, 1998):

- Các nhóm vi sinh vật cơ bản:

1 Vi khuẩn lactic,

2 Vi khuẩn Bacillus,

3 Vi khuẩn quang dưỡng khử H2S – vi khuẩn tía lưu huỳnh,

4 Nấm men (men rượu Saccharomyses).

a Trong chăn nuôi và nuôi trồng thủy sản

Probiotic có tác dụng đối với tất cả vật nuôi, gồm các loại gia súc, gia cầm,thủy cầm, thủy sản Đối với vật nuôi, probiotic giúp phát triển hệ vi sinh vật đườngruột bình thường, tăng cường khả năng tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng từ các loạithức ăn Đối với gia súc dạ cỏ chế phẩm này còn giúp cho hệ vi sinh vật dạ cỏ pháttriển và hoạt động tốt hơn Hơn nữa, probiotic có tác dụng làm tăng sức khỏe vậtnuôi, tăng sức đề kháng và khả năng chống chịu với các điều kiện bất lợi cho vật

nuôi, phòng chống các dịch bệnh thường gặp, nhất là bệnh ỉa phân trắng (Huang và

cs, 2004) Một số nghiên cứu khác cho thấy, probiotic làm cho gia súc gia cầm cái

mắn đẻ hơn, tăng chất lượng thịt, tăng năng suất chăn nuôi (Fuller, 1998) Cuốicùng, chế phẩm này làm ức chế và có thể tiêu diệt được các vi sinh vật có hại, làm

giảm hoặc làm mất mùi hôi thối ô nhiễm chuồng trại chăn nuôi (Võ Thị Hạnh và cs,

2005)

Vì vậy, dùng chế phẩm probiotic hòa vào thức ăn hay nước uống cho vậtnuôi đều có tác dụng dương tính Dùng dạng dịch pha loãng phun trực tiếp lên cơthể con vật như chó, lợn… sẽ mất mùi thối, phun trực tiếp vào bầu vú con cái thìkhi cho con bú sẽ tránh bị nhiễm khuẩn có hại (Lương Đức Phẩm, 1998)

Ngoài ra, sử dụng probiotic trong nuôi trồng thủy sản giúp phân hủy các chấthữu cơ trong nước (chất hữu cơ là một trong nhiều nguyên nhân làm môi trườngnước bị ô nhiễm), hấp thu xác tảo chết và làm giảm sự gia tăng của lớp bùn đáy,giảm các độc tố trong môi trường nước (do các chất khí: NH3, H2S… phát sinh), do

đó sẽ làm giảm mùi hôi trong nước, giúp tôm cá phát triển tốt, nâng cao khả năngmiễn dịch của tôm cá (do kích thích tôm, cá sản sinh ra kháng thể) Hơn nữa chếphẩm probiotic sẽ ức chế sự hoạt động và phát triển của vi sinh vật có hại (do cácloài vi sinh vật có lợi sẽ cạnh tranh thức ăn và tranh giành vị trí bám với vi sinh vật

có hại) Trong môi trường nước, nếu vi sinh vật có lợi phát triển nhiều sẽ kìm hãm,

ức chế, lấn át sự phát triển của vi sinh vật có hại, do đó sẽ hạn chế được mầm bệnhphát triển để gây bệnh cho tôm cá Đồng thời chế phẩm probiotic giúp ổn định độ

pH của nước, ổn định màu nước do probiotic hấp thu chất dinh dưỡng hòa tan trongnước nên hạn chế tảo phát triển nhiều, do đó sẽ giảm chi phí thay nước Cuối cùng,chế phẩm probiotic còn có tác dụng gián tiếp làm tăng oxy hòa tan trong nước, giúptôm cá đủ oxy để thở, do đó tôm cá sẽ khỏe mạnh, ít bệnh, ăn nhiều, mau lớn (Phạm

Văn Ty và cs, 2007).

b Trong bảo vệ môi trường

Các vi sinh vật của chế phẩm probiotic, đặc biệt là nhóm vi khuẩn lactic và

nhóm vi khuẩn Bacillus có tác dụng ức chế các vi sinh vật gây bệnh đường ruột, như Samonella, Vibrio, Shigella Ngoài ra, axit lactic tạo thành có tác dụng làm

sạch ruột, làm cơ chất dinh dưỡng rất tốt cho động vật tiêu hóa Các hoạt chất khángsinh do các vi khuẩn này sinh ra đều có khả năng ức chế sinh trưởng của các vi sinhvật gây hại

Nhóm vi khuẩn Bacillus là các vi khuẩn sống hiếu khí tùy tiện và có khả

năng sinh ra các enzyme thủy phân ngoại bào Vì vậy, khi vào môi trường nuôi thủysản chúng có thể sinh sản rất mạnh, ngoài khả năng ngăn chặn các vi sinh vật gâybệnh phát triển, chúng còn phân hủy các chất hữu cơ do thức ăn thừa và phân củavật nuôi bài tiết … để làm giảm thiểu ô nhiễm (Lương Đức Phẩm, 1998)

Trong quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ ta thấy xuất hiện khí H2S vàcác khí thối khác là dẫn xuất của khí này Trong probiotic có vi khuẩn tía có khảnăng sử dụng khí H2S làm thức ăn, mùi hôi thối giảm đi rõ rệt Đồng thời các nấmmen có trong chế phẩm có khả năng lên men rượu từ đường có trong môi trường,tạo mùi thơm, cải thiện mùi cho môi trường và nâng cao hệ số tiêu hóa của thức ăncho vật nuôi.

Tác dụng của chế phẩm trong bảo vệ môi trường được thể hiện rất đa dạng:

- Khi phun chế phẩm vào những chỗ có mùi hôi thối như cống, rãnh, hố xí,đống rác thải, chuồng trại chăn nuôi, cũng như vật nuôi đều có tác dụng làm mấtmùi hoặc giảm mùi rõ rệt, giảm số lượng ruồi nhặng và các loại côn trùng so vớitrước khi sử dụng chế phẩm

- Đối với các đống rác ngoài tác dụng làm giảm hoặc mất mùi hôi thối còn cóhiện tượng thể tích giảm nhanh là do các vi sinh vật trong chế phẩm tiết ra hệenzyme thủy phân các chất hữu cơ Đó là các nhóm enzyme amylase, protease,cellulase và đặc biệt là cellulase, hemicellulase làm tạo mùn nhanh chóng hơn

- Phun chế phẩm vào kho bảo quản nông sản có tác dụng ngăn chặn đượcquá trình thối rữa

- Cho vật nuôi uống chế phẩm đều tốt, giảm mùi hôi thối của phân

- Với môi trường nước nuôi tôm, cá khi dùng chế phẩm nước ao đầm có pHthay đổi từ từ hoặc thay đổi không quá đột ngột Các chỉ số BOD, COD cũng vậy,hàm lượng NH3 và H2S thường không quá giới hạn cho phép thì thời gian thay nước

sẽ kéo dài hơn Điều quan trọng hơn cả là vật nuôi khỏe hơn, tăng trọng nhanh hơn

và chi phí thức ăn cho 1 đơn vị tăng trọng giảm (Lương Đức Phẩm, 1998)

c Trong trồng trọt

Chế phẩm probiotic có tác dụng với nhiều loại cây trồng (bao gồm cây lươngthực, cây ăn quả, cây hoa màu…) và ở mọi giai đoạn sinh trưởng phát triển khác

nhau (Võ Thị Hạnh và cs, 2004) Những nghiên cứu về tác dụng của probiotic với

cây trồng cho thấy chúng có thể:

i) kích thích sự nảy mầm, ra hoa, kết quả và quá trình chín của quả,

ii) cải thiện hệ vi sinh vật đất, ngăn chặn các mầm bệnh,

iii) tăng cường khả năng hấp thụ dinh dưỡng của cây trồng và

iv) kéo dài được thời gian bảo quản, tăng chất lượng các sản phẩm tươi sống,làm cho hoa trái tươi lâu

Dùng chế phẩm probiotic trong đất có thể tái lập quần thể hệ vi sinh vật mới

có lợi cho cây trồng, đặc biệt là hệ vi sinh vật vùng rễ Cây trồng sẽ phát triển tốt ởđất, nơi mà các vi sinh vật có ích chiếm vai trò chủ yếu, giúp cho cây trồng nângcao được hiệu suất quang hợp và sử dụng phân bón, đặc biệt là phân bón hữu cơ

(Võ Thị Hạnh và cs, 2005).

d Trong y học

Khi probiotic được đưa vào đường ruột, các vi sinh vật hữu ích trong chếphẩm làm sạch đường ruột, cân bằng hệ sinh thái của các vi sinh vật trong đườngruột, ức chế các vi sinh vật gây bệnh, loại bỏ các quá trình lên men bất lợi do các visinh vật có hại này gây nên, làm cho các chức năng của đường ruột được hoạt độngtốt hơn Chế phẩm probiotic còn liên quan đến việc làm sạch đường ruột có tácdụng thúc đẩy quá trình lọc máu và lọc các chất độc cần bài tiết, tăng cường hệ sốtiêu hóa của thức ăn: tăng hệ số hấp thu và sử dụng các chất dinh dưỡng trong thức

ăn Ngoài ra, chế phẩm probiotic làm bình thường chức năng miễn dịch của cơ thể,làm lành mạnh và hoạt hóa khả năng tự nhiên của tế bào

Tác dụng cuối liên quan đến dịch chiết từ chế phẩm probiotic có hoạt chấtsinh học, như axit amin, các enzyme, các nucleotit, các axit nucleic, các vitamin,đặc biệt là biotin Các hoạt chất này có liên quan đến khả năng đổi mới tế bào cơthể, làm tăng kháng thể và khả năng miễn dịch… cũng có thể làm chậm quá trìnhlão hóa, làm tăng sức đề kháng chống lại sự xâm nhập của vi sinh vật gây bệnh

1.2.Vi khuẩn tía

1.2.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn tía

Vi khuẩn tía là một nhóm chính của vi sinh vật quang dưỡng phân phối rộng

rãi trong tự nhiên Trong thành phần vi sinh vật của nhiều chế phẩm sinh học

probiotic trong nước và nhập ngoại như VEM (Võ Thị Hạnh và cs, 2004),

PRO-BEST (Công ty Cổ phần Thủy sản Bình Minh – thành phố Hồ Chí Minh), CTA –serri (Công ty Biển Cờ), SUPERKING (Trung Quốc), BACTA (Thailand), EM(Nhật Bản)…đều có nhóm vi khuẩn quang hợp tía với chức năng đặc trưng là khửsulfide (H2S)

Nói chung, vi khuẩn tía được coi là nhóm quang dưỡng quan trọng bởi vìchúng có thể khử một chất làm hôi môi trường, H2S, và đóng góp vật chất hữu cơtrong các môi trường thiếu ôxy do năng lực tự dưỡng của chúng Hơn nữa chúngcòn có khả năng tiêu thụ các hợp chất hữu cơ, trong đó vai trò của chúng là vi sinhvật quang dị dưỡng Ngoài ra, chúng còn là vi sinh vật mô hình cho các nhà khoa

học nghiên cứu sự đa dạng phân tử của quá trình quang hợp (Hunter và cs, 2009).

Sinh khối của chúng còn được sử dụng để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học cógiá trị như ubiquinine, các chất kháng sinh, enzyme và làm thức ăn trong chăn nuôigia cầm và nuôi trồng thủy sản (Sasikala và Ramana, 1995)

Ngoài ra, sinh khối của vi khuẩn tía rất giàu protein và vitamin, đặc biệt làvitamin B12 Tại Ấn Độ có công nghệ sản xuất sinh khối của vi khuẩn tía ở dịch lytâm từ phân gia súc dùng để làm thức ăn (cùng vi tảo) cho tôm hoặc cho ngao đạthiệu quả rất khả quan Có lẽ đây là thức ăn rất thích hợp cho thủy sản thân mềm vàđang được ưa chuộng trên thị trường thế giới (Lương Đức Phẩm, 1998)

Ở Việt Nam, nhóm vi khuẩn này đã và đang được chú trọng phân lập vàtuyển chọn để ứng dụng vào các lĩnh vực khác nhau như xử lý nước thải đậm đặc

hữu cơ (Đỗ Thị Tố Uyên và cs, 2003), phân hủy các hydrocacbon mạch vòng (Đinh Thị Thu Hằng và cs, 2003), thu nhận các hoạt chất sinh học có giá trị như ubiquinine (Đỗ Thị Tố Uyên và cs, 2005).

1.2.2 Phân loại vi khuẩn tía

Dựa trên các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, sinh thái và căn cứ vào tỷ

lệ G + C trong DNA, người ta phân loại vi khuẩn tía thành 2 nhóm là vi khuẩn lưuhuỳnh màu tía và vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía (Nguyễn Lân Dũng, 2005)

a Vi khuẩn lưu huỳnh màu tía (Purple sulfur bacteria)

Vi khuẩn lưu huỳnh màu tía là sinh vật quang tự dưỡng mạnh mẽ nhưng khảnăng quang dị dưỡng cũng như trao đổi chất và tăng trưởng trong bóng tối là hạnchế Một số loài có thể sống trong điều kiện khắc nghiệt như nhiệt độ, pH hoặc có

độ mặn cao (Hunter và cs, 2009).

Vi khuẩn tía lưu huỳnh rất đa dạng về hình thái và kiểu di động Trong quátrình oxy hóa H2S, lưu huỳnh được tích tụ thành giọt trong tế bào, nhưng cũng cóloài không tích tụ ở trong mà ở ngoài tế bào Một số loài có khí khổng trong tế bào

Vi khuẩn lưu huỳnh màu tía bao gồm các vi khuẩn kị khí bắt buộc, có khả năngquang tự dưỡng vô cơ (photolithoautotroph), tế bào có chứa chlorophyll a hoặc b,

hệ thống quang hợp chứa các màng hình cầu hay hình phiến gắn với màng sinhchất Chất nhận điện tử (electron donors) trong quang hợp thường sử dụng là H2,H2S hay S Chúng có khả năng di động với tiên mao mọc ở cực, có loài chu mao, tỷ

lệ G+C là 45-70% (Nguyễn Lân Dũng, 2005)

Hơn 25 chi của vi khuẩn lưu huỳnh màu tía ngày nay được công nhận (bảng

1.1), (Hunter và cs 2009) Vi khuẩn lưu huỳnh màu tía thuộc Lớp Gammaproteobacteria, có 2 họ: Họ Chromatiaceae: dự trữ S0 bên trong tế bào (hình

1.1a) và họ Ectothiorhodospiraceae: sản xuất S0 ngoại bào (hình 1.1b)

Bảng 1.1: Bảng phân loại vi khuẩn lưu huỳnh màu tía (Hunter và cs, 2009)

Thiococcus Hình cầu

Chromatium Thiocapsa

Hình 1.1: Hình ảnh tế bào của một số vi khuẩn lưu huỳnh màu tía

(a.Vi khuẩn tía chứa S0 bên trong tế bào, b.Vi khuẩn tía sản xuất S0 ngoại bào)Sinh lý học của vi khuẩn lưu huỳnh màu tía có liên quan mật thiết đến quátrình trao đổi chất sulfide Hầu hết chúng được tìm thấy trong môi trường tự nhiên

có ánh sáng và có sulfide Điều này cho thấy sự tăng trưởng của chúng trong tựnhiên là quang dưỡng Nếu tăng trưởng là quang tự dưỡng thì sunfua, H2,thiosulfate được sử dụng làm nguồn cho điện tử trong quang hợp (Truper vàFischer, 1982; Madigan, 1988; Brune, 1995) Một số loài có thể sử dụng ion Fe2+

làm nguồn cho điện tử trong quang hợp, oxi hóa nó thành ion Fe3+ (Ehrenreich và

Widdel, 1994) Đặc biệt, ít nhất một loài, Thiocapsa sp, có thể sử dụng nitrit (NO2-)làm nguồn cho điện tử trong quang hợp, ôxi hóa nó thành nitrat (NO3-)

b Vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía (Nonsulfure purple bacteria)

Vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía là nhóm vi khuẩn quang dị dưỡng hữu cơ(photoorganoheterotrophs) thường kỵ khí bắt buộc, một số loài là quang tự dưỡng

vô cơ không bắt buộc (trong tối là hoá dị dưỡng hữu cơ

- chemoorganoheterotrophs) Tế bào chứa chlorophyl a hoặc b, hệ thống quang hợpchứa các màng hình cầu hay hình phiến gắn với màng sinh chất Chất nhận điện tửtrong quang hợp thường sử dụng là chất hữu cơ, đôi khi là hợp chất lưu huỳnh dạngkhử hoặc H2 Vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía có khả năng di động với tiên maomọc ở cực, hoặc không di động, một số loài có túi khí, tỷ lệ G+C là 61-72%(Nguyễn Lân Dũng, 2005) Vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía thuộc lớpGrammproteobacteria

Dưới đây là bảng phân loại vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía:

Bảng 1.2: Bảng phân loại vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía (Hunter và cs, 2009)

Alphaproteobacteria Rhodobaca c Hình cầu,

nảy chồi

Betaproteobacteria Rhodocyclus Phẩy khuẩn

phẩy khuẩn

Rhodobacter Rhodopila

Hình 1.2: Hình ảnh tế bào của một số vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía

Vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía là nhóm vi sinh vật có sinh lý linh hoạt,

có thể phát triển quang dưỡng và trong bóng tối Chúng có thể sử dụng nguồncarbon vô cơ hoặc hữu cơ Nếu tăng trưởng là quang tự dưỡng thì H2, sunfua ở nồng

độ thấp được sử dụng làm nguồn cho điện tử trong quang hợp Một vài loài có thể

sử dụng thiosulfate hoặc Fe2+ là nguồn cho điện tử (Ehrenreich và cs, 1994; Brune,

1995)

Tuy nhiên, hầu hết vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía phát triển tốt nhấttrong môi trường dị dưỡng Đó là môi trường có chứa một số hợp chất hữu cơ dễ sửdụng, chẳng hạn như malate hoặc pyruvat và ammoniac là nguồn nitơ (Sojka,1978) Ngoài ra, một số vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía có thể phát triển trongđiều kiện thiếu oxy, trong bóng tối bằng cách lên men hoặc hô hấp kị khí (Hunter

và cs, 2009).

1.2.3 Ảnh hưởng của các nhân tố lý hóa đến sinh trưởng của vi khuẩn tía

a pH

Quang hợp của vi khuẩn tía có thể xảy ra trong môi trường có pH 3 – 11

(Hunter và cs, 2009) Vi khuẩn tía sinh trưởng và phát triển ở pH tối ưu khoảng 6 – 7.

b Cường độ ánh sáng

Vi khuẩn lưu huỳnh màu tía sử dụng ánh sáng để quang hợp, phát triển mạnh

ở môi trường có ánh sáng đỏ Vi khuẩn không lưu huỳnh màu tía có thể phát triển

quang dưỡng và trong bóng tối (Hunter và cs, 2009).

c Nhiệt độ

Quang hợp của vi khuẩn tía có thể xảy ra ở nhiệt độ lên tới 570C và xuống tới

00C (Castenholz và Pierson, 1995) Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triểncủa vi khuẩn tía ở 300C

d Các yếu tố khác

Nhiều loài vi khuẩn tía có thể sinh trưởng quang dưỡng với sulfide như làchất cho điện tử với nồng độ nhỏ hơn 2 mM Nếu trong môi trường sống có nồng độ

sulfide quá cao sẽ ức chế sự sinh trưởng của chúng (Hunter và cs, 2009) Ngoài ra,

nồng độ NaCl trong môi trường cũng ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của vi khuẩn tía

Có loài sống được trong môi trường nước biển có độ mặn từ 8 – 11%NaCl (Mack

và cs, 1993).

1.2.4 Vai trò của vi khuẩn tía trong chế phẩm probiotic

Trong môi trường nước, trong các loại phân động vật, trong các đống rácthường xuất hiện khí hydro sunfua (H2S) Đây là chất khí không màu, có mùi trứngthối, rất độc Khí H2S tan trong nước thành axít sunfuhydric (H2SO4) Khí H2S hìnhthành từ các con đường: khử sunfat, phân hủy các axit amin có chứa lưu huỳnh trongquá trình amon hóa Sự có mặt của khí này làm cho môi trường bị nhiễm độc, thường

có mùi khó chịu và làm chết đối với các động thực vật thủy sinh như tôm, cá…

Chính vì vậy, sử dụng chế phẩm probiotic có chứa vi khuẩn tía có khả năng

sử dụng H2S thay nước trong quá trình quang hợp:

CO2 + H2S => Chất hữu cơ + S

So sánh với phương trình quang hợp của cây xanh ta thấy trong phương trìnhnày H2S được thay thế cho H2O và sản phẩm là chất hữu cơ và lưu huỳnh chứkhông sinh ra oxy Như vậy H2S sẽ được xử lý, làm giảm mùi hôi thối trong môitrường (Lương Đức Phẩm, 1998)

1.3 Nguyên lý đông khô trong sản xuất chể phẩm probiotic

1.3.1 Khái niệm đông khô

Đông khô (= sự thăng hoa) có nghĩa là làm khô sản phẩm đã bị đông lạnh(chủ yếu là chất có nước) dưới áp suất chân không mà không qua giai đoạn lỏng củachất cần đông khô Ví dụ, CO2 hóa lỏng thăng hoa ngay tại điều kiện áp suất khíquyển (không qua giai đoạn lỏng) Nhưng nước và các chất khác thì cần phải cóđiều kiện áp suất chân không để thăng hoa được như vậy (TELSTAR, 2008)

Các ứng dụng điển hình của đông khô như trong sản xuất dược phẩm,vaccine kháng sinh, các kít chẩn đoán, kiểm tra, sản phẩm máu hay thu được từ máu

và một số sản phẩm thực phẩm như thảo mộc, hoa quả, nấm, cà phê …Ngoài rađông khô còn được ứng dụng trong bảo quản sản phẩm khảo cổ học như các phầnbằng gỗ của con thuyền, gốm sứ, da, quần áo, vải, sách, tài liệu…(TELSTAR, 2008)

1.3.2 Nguyên lý đông khô

Trong quá trình khô thì sản phẩm ở trong môi trường áp suất chân không(nhỏ hơn 6,11 mbar) và hơi nước bay ra từ sản phẩm sẽ được ngưng tụ tại bề mặt

(rất lạnh) của bộ ngưng tụ (ice condenser) Bộ ngưng tụ hoạt động như một máybơm hơi nước, máy bơm chân không để giữ áp suất chân không trong khoang.

Nhưng để thăng hoa được thì sản phẩm phải được cung cấp nhiệt (theonguyên lý nhiệt học thì bay hơi là thu nhiệt) Khi đông khô ví dụ như các bình tođáy tròn thì nhiệt độ phòng chính là nguồn nhiệt cung cấp cho sản phẩm Nếu đôngkhô các lọ nhỏ trong khay thì nhiệt độ cấp cho sản phẩm là từ các giá để sản phẩm(giá sản phẩm điều khiển được nhiệt độ)

Khoảng 90-99% lượng nước được lấy ra từ sản phẩm trong quá trình đôngkhô chính (main drying) Lượng nước bám dính còn lại sẽ được lấy ra trong quátrình đông khô cuối cùng (final drying) dưới áp suất chân không rất thấp(TELSTAR, 2008)

Nếu áp suất khí quyển lớn hơn 6,11mbar và cố định thì nước sẽ tồn tại ở 3trạng thái: lỏng, rắn và khí Tại áp suất chính xác 6,11 mbar và nhiệt độ 00C thìnước sẽ tồn tại cả ở 3 trạng thái rắn, lỏng, khí (điểm cắt của 3 trạng thái) Nếu ápsuất nhỏ hơn 6,11 mbar thì nước sẽ chuyển trực tiếp từ rắn sang khí và ngược lạibằng việc thay đổi nhiệt độ (quá trình chuyển trực tiếp từ rắn sang khí được gọi làquá trình thăng hoa)

1.3.3 Các bước của quá trình đông khô

a Phase 1: Tiền đông

Điểm đông có thể được xác định bằng các giá trị lý thuyết nhiệt động họccủa các chất hay sản phẩm hoặc bằng phương pháp DSC (đo quét nhiệt lượng vi sai(Differential Scanning Calorimetry)) (rất đắt) hoặc bằng phương pháp đo nhiệt độ

và điện trở trong phase làm đông tại điều kiện áp suất khí quyển (rất dễ)

Xác định điểm đông:

Điện trở của sản phẩm thay đổi khi chuyển từ trạng thái lỏng sang trạngthái rắn và khoảng đông có thể biết được bằng việc ghi cả nhiệt độ và điện trở sảnphẩm Điểm cắt giữa nhiệt độ và điện trở là điểm đông của sản phẩm

- Độ dày sản phẩm

- Tiền đông trong các bình cố định (tiền đông tĩnh), độ dày lớp sản phẩmkhông vượt quá 10 mm.

- Tiền đông trong các bình quay (tiền đông động), khi lượng sản phẩm nhỏ

so với dung tích bình thì lớp mỏng của sản phẩm có thể đạt được Chất lỏng đượclàm đông trên thành của bình với vận tốc quay cố định

- Ví dụ, 250 ml huyết thanh máu được đổ vào chai 500 ml, thì lớp sản phẩm

sẽ dày khoảng 70 mm Nếu quay chai với tốc độ 1000 rpm thì lớp chất lỏng sẽ dânglên thành bình nhờ lực ly tâm và độ dày lớp chất lỏng chỉ còn khoảng 9 mm

b Phase 2: Chuẩn bị

Nếu sản phẩm đạt nhiệt độ khô và toàn bộ sản phẩm đã bị đông thì phasechuẩn bị (preparation phase) bắt đầu Trong phase này bơm chân không chạy khởiđộng và nhiệt độ dàn ngưng giảm xuống đến mức thấp nhất (thời gian chuẩn bị từ20-30 phút)

Giá không được cấp nhiệt và khoang không có áp suất chân không, vì vậyvan giữa bơm chân không và khoang phải được đóng

c Phase 3: Khô chính

Tại lúc bắt đầu giai đoạn khô chính, áp suất sẽ giảm xuống tới áp suất chânkhông, van điều khiển áp suất giữa khoang và bơm chân không mở ra Trong quátrình đông khô chính phải quan sát áp suất chân không và nhiệt độ dàn ngưng Nhiệt

độ dàn ngưng phải thấp hơn nhiệt độ khô (tại sản phẩm) khoảng 5-150C trong toàn

bộ quá trình Áp suất chân không phải thấp hơn áp suất chân không an toàn Đểthăng hoa thì cần thiết phải cấp năng lượng nhiệt cho sản phẩm qua giá (điều khiểnđược nhiệt độ), nhiệt độ của giá phải được tăng chậm từng bước và lớn nhất tớinhiệt độ phòng Nếu dùng các chai đáy tròn thì năng lượng nhiệt được cấp từ môitrường

Nhiệt độ đông của sản phẩm là rất quan trọng để xác định độ chân không vànhiệt độ khô Trong quá trình khô, nhiệt độ sản phẩm được điều chỉnh chủ yếu bởi

áp suất chân không (mà không bởi nhiệt độ giá) - theo áp suất bay hơi của nước

Nhiệt độ bề mặt sản phẩm gần như độc lập với nhiệt độ giá Trong quá trìnhkhô thì phải đảm bảo sản phẩm không bị tan chảy, bởi vậy nhiệt độ khô nên thấphơn ít nhất nhiệt độ đông 100C Căn cứ vào nhiệt độ này ta dễ dàng tra được áp suấtchân không khô theo bảng đường cong áp suất bay hơi Ví dụ: Nhiệt độ đông teu =-100C, nhiệt độ khô tdry = -200C thì áp suất chân không pdry = 1,030 mbar.

Áp suất an toàn: Để sản phẩm có độ an toàn cao nhất thì nhất thiết phảiđặt áp suất an toàn Nếu áp suất trong buồng khô tăng quá cao (quá giới hạn áp suất

an toàn) thì nhiệt độ của giá cấp cho sản phẩm phải được dừng và quá trình thănghoa chậm lại, tránh được sự tan chảy của sản phẩm Nhiệt độ an toàn nên thấp hơn

50C so với điểm tan chảy (hay điểm đông) Theo đường cong áp suất bay hơi dễdàng tìm được psafe Ví dụ: Nhiệt độ đông teu = -100C, nhiệt độ khô tdry = -200C thì

áp suất chân không pdry = 1,030 mbar, nhiệt độ an toàn tsaf = -15 0C thì áp suất chânkhông an toàn psaf = 1,650 mbar

Áp suất báo động: Các máy lớn có máy điều nhiệt bằng chất lỏng thì cóthể có hệ thống cảnh báo áp suất báo động Nếu áp suất trong buồng khô tăng tớigiá trị đặt áp suất báo động thì máy sẽ cắt cấp nhiệt cho sản phẩm Bộ điều khiển sẽcho ra âm thanh báo động và nhiệt độ giá được làm lạnh xuống nhiệt độ tiền đôngcàng nhanh càng tốt Nhiệt độ báo động nên thấp hơn nhiệt độ đông từ 3-50C Ví dụ:Nhiệt độ đông teu = -100C, nhiệt độ khô tdry = -200C thì áp suất chân không pdry =1,030 mbar, nhiệt độ an toàn tsaf = -150C thì áp suất an toàn psaf = 1,650 mbar, nhiệt

độ báo động talarm = -130C thì áp suất báo động palarm = 1,980 mbar

d Phase 4: Đông khô cuối

Nhiệt độ giá sẽ tăng lên và áp suất chân không sẽ giảm xuống thấp nhất cóthể khoảng 0,001 mbar Thời gian cho đông khô cuối phụ thuộc vào từng loại sảnphẩm (thông thường 2 giờ) Khi kết thúc quá trình khô thì khoang đông khô phảiđược thông khí, thông thường thông khí bằng không khí hay một loại khí trơ nhưnitơ Trước khi bắt đầu quá trình đông khô mới thì dàn ngưng phải được xả đá vàkhoang đông khô phải được làm sạch và tiệt trùng