Ứng dụng chỉ thị phân tử PCR và dòng BAC để xác định gen GEN mùi thơm trên cây lúa (oryza sativa l)

AP-PCR Arbitrary M i-PCRBAC Bacterial Artificial Chromosome BC Lai h i giao Backcross DNA Deoxyribo Nucleic Acid E.coli Escherichia coli EAP External Antisense Primer EDTA Ethylene diami

-CHÂU T N PHÁT

NG D NG CH TH PHÂN T PCR VÀ

TH M TRÊN CÂY LÚA

ng Hòa Xã H i Ch Ngh a Vi t Nam

c l p – T Do – H nh Phúc

-I CAM OAN

Tôi xin cam oan công trình nghiên c u:” ng d ng ch th phân t PCR

a riêng tôi Các s li u, k t qu nêu trong lu n án là trung th c và ch a t ng c

ai công b trong b t k công trình nào khác

Châu T n Phát

I C M T

- GS.TS Nguy n Th Lang, ã h t lòng ch d n nh ng n i dung c n thi t

th c hi n các môn h c, các thí nghi m và n i dung nghiên c u hoànthành lu n án

- GS.TS Bùi Chí B u, ã t n tình ch b o và h ng d n các n i dung,

ph ng pháp và k ho ch tri n khai thành công các môn h c, th c hi ncác thí nghi m

- Các th y cô tham gia gi ng y l p nghiên c u sinh khóa 1 a c s ào

o Vi n Lúa ng b ng sông C u Long

Không th hoàn thành lu n án n u không có s giúp h ng d n khoa h c

và ng viên c a Cô và Th y

th i gian c và óng góp nhi u ý ki n qúi báu cho lu n án c hoàn thi n

Xin chân thành c m n:

- Vi n Khoa h c Nông nghi p Vi t Nam

- Ban giám c Vi n Lúa ng b ng sông C u Long, ã giúp t o u

ki n cho tôi trong h c t p và th c hi n tài

- Ban giám hi u Tr ng i H c C n Th

- Ban giám hi u và t p th th y cô giáo tr ng i h c N ng Nghi p I Trâu Qu - Gia Lâm - Hà N i ã t o u ki n và giúp tôi r t nhi utrong su t th i gian tôi theo h c ch ng trình cao h c t i ây

Phòng Khoa h c và H p tác qu c t - Vi n Lúa ng b ng sông C uLong, ã theo dõi, ng viên tôi trong su t quá trình h c t p c ng nh

- môn Công Ngh H t Gi ng - Vi n Lúa ng b ng sông C u Long, ã

ng viên và t o u ki n v th i gian giúp tôi có th hoàn thành lu n ántrong th i gian qui nh

- TS Bùi Th Thanh Tâm, TS Ph m Trung Ngh a ã óng góp nhi u ý

ki n quí báu hoàn thi n cho các môn h c chuyên và lu n án

- Sau cùng, xin c m thông s hy sinh, chia s và ng viên c a cha m và

ng i thân trong gia ình, b n bè, ng nghi p góp ph n không nh vào thành công c a lu n án

Tác gi lu n án

Châu T n Phát

1.1.1 H p ch t t o mùi th m, gen th m và m t s y u t môi tr ng

nh h ng n vi c hình thành mùi th m trên lúa

1.2.3 M t s nghiên c u trong và ngoài n c v ng ng BAC

DNA trong ch n gi ng lúa

3.2 ánh giá ki u hình và ki u gen mùi th m trên các gi ng s d ng làm

t li u lai và qu n th con lai sau khi c lai t o

77

3.2.1 ánh giá mùi th m trên các gi ng lúa b m 77 3.2.2 Phát tri n qu n th c a 20 t h p lai 79

3.2.3 Phân tích a d ng di truy n d a vào ki u hình c a các gi ng

ng 3.4 M t s gi ng lúa mùa ch th hi n mùi th m trên lá và h t 54

ng 3.5 M t s gi ng lúa mùa ch th hi n mùi th m trên thân và

ng 3.8 ánh giá ki u hình mùi th m trên lá, thân và h t a 30

gi ng lúa cao s n thu c b cao s n

70

ng 3.9 So sánh ki u hình và ki u gen trên 30 gi ng thu c b lúa

cao s n

76

ng 3.10 C p mùi th m trên lá, thân và h t a các gi ng lúa b 78

ng 3.11 C p mùi th m trên lá và thân a các t h p lai th h

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1a S phát tri n qu n th lai n và lai h i giao

thông qua MAS

Hình 2.8 Dòng BAC c chuy n vào môi tr ng LB l ng và

qua êm trên máy l c

40

Hình 3.1 l các gi ng có mùi th m trên lá, thân và h t

Hình 3.5 Bi u phân nhóm di truy n d a vào ki u hình mùi

Hình 3.9 Ki m tra ch t l ng DNA c a các gi ng lúa mùa

trên gel agarose 0.9%

thu c b cao s n c khu ch i gen mùi th m

n di trên agarose gel 1,2%

Hình 3.17 Bi u phân nhóm di truy n d a vào ki u hình mùi

th m trên 9 gi ng lúa b m và 20 t h p lai

82

Hình 3.29 Xác nh nh ng dòng BAC d tuy n locus mùi

th m b ng n di phân tích PFGE trên các dòngBAC c phân c t b i enzyme gi i h n HindIII

102

Hình 3.30a K t qu i n di ki m tra s n ph m PCR c a 2 dòng

BAC ch ng l p s d ng ch th RG28FL-RB

106

Hình 3.30b Lai Southern Blot c a 2 dòng BAC ch ng l p c

phân c t v i HindIII s d ng RG28FL-RB làm con

AP-PCR Arbitrary M i-PCR

BAC Bacterial Artificial Chromosome

BC Lai h i giao (Backcross)

DNA Deoxyribo Nucleic Acid

E.coli Escherichia coli

EAP External Antisense Primer

EDTA Ethylene diamine tetra acetate

ESP External Sense Primer

IFAP Internal Fragrant Antisense Primer

INSP Internal Non-fragrant Sense Primer

IPTG Isopropyl thiogalactoside

IRRI International Rice Research Institute

KDM 105 Khao Dawk Mali 105

MAS Marker-Assisted Selection

MRDHV-DNA

Moderately Repeat, Dispersed and Highly Variable DNA,minisatellite

mRNA messenger Ribonucleic Acid

NBS Nucleotide Binding Site

Ori Origin of replication

PAC P1-derivative Artificial Chromosome

pBR322 plasmid Bolivar & Rodrigues 322

PCR Polymerase Chain Reaction

PFGE Pulse Field Gel Electrophoresis – n di trong tr ng xungQTL Quantitative Trait Loci

RAPD Random Amplified Polymorphic DNA

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

RILs Recombinant inbred line

RT-PCR Reverse Transcriptase –PCR

SFP Single Functional Polymorphism

SNPs Single Nucleotide Polymorphism

SSCP Simple Strand Conformation PolymorphismSSR Simple Sequence Repeat (microsatellite)

TBE Tris base, Boric acid, EDTA

Lúa g o là th c n c n b n c a 39 n c và vùng a lý trên th gi i, lúa g ocung c p t 35 n 59% ngu n n ng l ng cho h n 3 t ng i [1b] Tr c ây, v i

u ki n v t ch t còn thi u th n, l ng th c không n ng i ta ch có nhu c u là

n no Nh ng ngày nay do m c s ng c a ng i dân ngày càng nâng cao thì nhu c u

n no ã thay i, vi c n ngon, có dinh d ng cao d n tr thành nhu c u quan

tr ng không th thi u i v i con ng i Do ó ch t l ng g o c xem nh là

t trong nh ng m c tiêu hàng u, trong ó mùi th m c ánh giá r t cao trên

th tr ng xu t kh u g o c a th gi i Tuy nhiên, s n l ng g o th m t các gi nglúa th m c truy n và các gi ng nh p n i nh : Tám Th m, Nàng Th m Ch ào,Séng Cù, N p Cái Hoa Vàng, Khao Dawk Mali, Basmati, thì có r t ít không

áp ng nhu c u th tr ng và khó m r ng di n tích gi i quy t v n này, cácnhà khoa h c ã lai t o và phóng thích nhi u gi ng lúa có ch t l ng th m ngon

nh ng ph ng pháp còn mang tính th công, ch n l c b ng c m quan là chính,

ch a n nh và m t nhi u th i gian M t khác, vi c ng d ng công ngh di truy nphân t , hi n t ng tái t h p gen, gi i mã chu i trình t gen ã thúc y hoàn thi n

gi ng lúa có nhi u tính tr ng quý hi m trong m t th i gian ng n [1a]; trong ónghiên c u ch n gi ng lúa có gen mùi th m là m t trong nh ng ng d ng hi u

qu công ngh trên ch n t o gi ng lúa có ch t l ng th m ngon, rút ng n th igian, hi u qu cao, áp ng nhu c u th tr ng ngày càng r ng thì vi c ng d ng kthu t trong sinh h c phân t nh m ch n t o ra lúa có ch t l ng g o th m là c pthi t

Vì v y, tài: ” ng d ng ch th phân t PCR và dòng BAC xác nh

gen ‘‘fgr’’ qui nh mùi th m b ng ph ng pháp s d ng ch th phân t DNA

- Xác nh c các ch th DNA liên k t v i gen ‘‘fgr’’ quy nh mùi th m

cây lúa trên c s khai thác th vi n BAC

- Xác nh nh ng d u chu n phân t riêng bi t liên k t v i gen “fgr” trên cây

lúa giúp cho vi c ch n dòng con lai hi u qu n

nh mùi th m khai thác t ngu n dòng BAC hi u rõ n v k thu t dòng hóagen c tiêu, ph c nghiên c u sâu h n v ch c n ng gen này

- tài ã góp ph n b sung nh ng dòng lúa có tri n v ng bi u th mùi th m

thông qua ng d ng nh ng d u chu n phân t riêng bi t liên k t ch t v i gen “fgr”

ph c cho vi c phát tri n nh ng gi ng lúa th m cao n BSCL

- i nh ng k t qu t c t vi c khai thác th vi n BAC, tài ã tìm

và phân tích ch th m i t ó chuy n sang ch th ch a n gen mùi th m ph c vcho ch n gi ng lúa

n hi n ang c duy trì và nhân gi ng

th m

- Ph m vi nghiên c u:

+ C xác nh n i dung có liên quan n các ch th phân t liên k t

v i gen “fgr” trên nhi m s c th s 8 và ng ng k t qu trên ch n gi ng lúacao n có gen c tiêu

+ Phân l p c o n phân t mang gen c tiêu

CH NG 1

Kim [64] báo cáo r ng các h p ph n hydrocacbon không khác nhau có ýngh a gi a lúa th m và không th m, tuy nhiên lúa th m có m c cao h n valcohol, aldehyde, keton, acid; trong ó lúa th m có n ng 2-acetyl-1-pyrrolinecao g p 15 l n so v i lúa không th m

Lorieux và ctv [76] ã phân tích m u g o c a 2 gi ng lúa Azucena (th m) vàIR64 (không th m), k t qu không tìm th y ch t 2-acetyl-1-pyrroline IR64(không th m), trong khi ó gi ng lúa th m Azucena có hàm l ng cao v ch t này.Trong s 89 h p ch t phân tích, x lý th ng kê cho th y các ch t sau có s khác bi t

gi a gi ng lúa th m và không th m ó là: pentanol, 2-acetyl-1-pyrroline,benzaldehyde, octanol, pentadecan-2-1,6,10,14-imethylpentadecan-2-1 và hexanol

Buttery và ctv [39] ngh r ng s khác nhau gi a lúa th m và không th mkhông ch s hi n di n hay v ng m t c a ch t 2-acetyl-1-pyrroline mà còn trong khác nhau v s l ng c a ho t ch t có trong lúa g o Nhi u alen c a m t gen

th m có th t o ra s bi n i nh trong cùng m t enzyme k t qu là d n n tính

th m khác nhau

Buttery và ctv [40] ã phân tích và xác nh 2-acetyl-1-pyrroline (2-AP) nh

là m t thành ph n quan tr ng óng góp vào mùi th m c a các gi ng lúa th m Theoánh giá v ch t l ng mùi th m c a 2-acetyl-1-pyrroline c mô t gi ng nhmùi c a ngô n Xác nh n ng mùi th m c a 10 gi ng lúa, kho ng n ng t 6ppb n 90ppb v i lúa chà tr ng Lúa ch a chà tr ng n ng 2-acetyl-1-pyrroline

là 100-200ppb Vì th có th ngh r ng b m t l p aloron c a h t g o gi m t vaitrò quan tr ng trong vi c hình thành mùi th m c a c m khi n u M i c a ng i có

Bên c nh ó, Buttery và ctv [38] ã phân tích lá c a cây lá d a (Pandabases

amaryllifolius) nh n th y r ng thành ph n bay h i chính c ng là

2-acetyl-1-pyrroline (2AP) và có m t s liên h r t m t thi t gi a ch t 2-acetyl-1-2-acetyl-1-pyrrolinetrong lá c a cây lá d a và lúa th m N ng c a ch t 2-acetyl-1-pyrroline trong lá

a cây lá d a cao h n g p 10 l n trong lúa th m và cao h n g p 100 l n trong lúakhông th m

Tóm l i, hi n nay có hai quan m v thành ph n ch t th m c a lúa g o.Quan m th nh t cho r ng ch t th m c t o ra t các h p ch t aldehyde(CHO) và keton (C=O) và các h p ch t v i l u hùynh Quan m th hai cho r ng

ch t th m lúa g o, do vòng ryrrol ki m sóat tính th m c a ch t 2-acetyl-1-pyrroline[34] Kader và Delseny [59] cho r ng có s khác nhau trong vi c th hi n mùi th mtrên các b ph n c a cây lúa, h p ch t 2AP c th hi n m t cách t nhiên t giai

n m cho n khi chín và c bi t là trong giai n h t tr ng thành trên các b

ph n c a cây lúa ngo i tr r , mùi th m c tích l y nhi u nh t trên b ph n h tlúa Bên c nh ó, Chen và ctv [42], Vanavichit và ctv [102] c ng kh ng nh mùi

th m không th hi n ho c th hi n r t th p không áng k trên b ph n r lúa

1.1.1.2 Gen th m

Li và Gu [71] nghiên c u v s di truy n và v trí c a gen th m trên lúa,nhóm tác gi nh n th y r ng các gen c a chúng có alen v i nhau thông qua vi c laithu n ngh ch gi a các gi ng lúa th m

Bradbury và ctv [78] ã phân tích mùi th m c a lúa Basmati và Jasmine v i

th hi n c a 2-acetyl-1-pyrroline M t gen l n fgr trên NST s 8 c a lúa qui nh

s th hi n tính tr ng quan tr ng này và có m t gen t ng ng mã hóa protein cótên i là Betaine Aldehyde Dehydrogenase (BAD) th hi n s a hình có ý ngh a

trong vùng ch a gen th m Gen fgr có s t ng ng v i gen mã hóa BAD2 tronglúa Ng c i, gen mã hóa BAD1 nh trên nhi m s c th s 4 Gen mã hóaBAD liên k t v i gen kháng stress trong cây tr ng Quá trình t ng h p 2-AP (2-acetyl-1-pyrroline: h p ch t chính t o mùi th m trên lúa) ph thu c gián ti p vào

ho t tính c a enzyme Betaine Aldehyde Dehydrogenase (BAD2) Khi enzymeBAD2 ho t ng m nh s c nh tranh c ch t v i enzyme sinh t ng h p 2-AP d n

n hàm l ng 2-AP b gi m và lúa s không có mùi th m Ng c l i, n u gen sinhenzyme BAD2 b t bi n d n n xu t hi n mã k t thúc s m s làm enzyme BAD2

t ho t tính d n n enzyme t ng h p sinh ra 2-AP nhi u và cây lúa s có mùi

th m u này có th c xem là lúa có ch a gen th m l n fgr Do ó gi ng lúa

nào mang gen mã hóa BAD2 nguyên v n bình th ng s không th hi n mùi th m

2-AP hay không ch a gen th m l n fgr S t o mùi th m các gi ng lúa gi vai trò

quan tr ng trên cây lúa Th ng thì cây lúa tr ng trong môi tr ng khó kh n hay

ch u nh ng stress phi sinh h c nh là khô h n, l nh ho c m n thì m i th hi n mùi

th m ây c ng gi ng nh là m t c ch kháng c a cây i v i nh ng tác nhân phisinh h c mà s n ph m c a nó là t o ra h p ch t th m 2-AP (2-acetyl-1-pyrroline).Hay 2-AP là s n ph m cu i c a quá trình này

Shi và ctv [107] c ng k t lu n gen fgr là gen l n n m trên NST s 8 liên

quan n mùi th m c a lúa Gen này có t alen l n m t ch c n ng bad2 và alen

tr i BAD2 mã hóa protein BAD2 làm cho lúa không th m T ng s 34 gi ng lúa

th m và không th m ã c nghiên c u và gi i trình t n phân t BAD2/bad2.

Trong s 24 gi ng lúa th m có 12 gi ng ch a alen bad2-E7 (bad2-E7: m t i 8 c p

baz và 3 SNPs trên exon s 7), m i hai gi ng còn l i ch a alen bad2-E2

(bad2-E2: m t i 7 c p baz trên exon s 2) C hai alen u qui nh mùi th m c a lúa

a trên chu i trình t khác nhau gi a BAD2 và 2 alen l n bad2 ã phát tri n

nh ng ch th phân t giúp cho vi c xác nh dòng lúa th m, phân bi t rõ dòngkhông th m và th m xét v ki u gen Tuy nhiên, ki u hình bi u th ra bên ngoài vôcùng ph c p u này có th do i u ki n môi tr ng qui nh s c ch ho c kích

ho t promoter gen th hi n mùi th m

Bên c nh ó, Fitzgerald và ctv [80] c ng ã có nh n xét t ng t v i Shi vàctv [107]: 2-acetyl-1-pyrroline là h p ch t chính t o nên mùi th m trong lúa và

c tích l y do b i s m t i 8 c p baz trong m t alen locus “fgr” Trong

nghiên c u này, 2-acetyl-1-pyrroline c nh l ng S th hi n hay v ng m t

a alen fgr ã c xác nh trong 464 m u c a các gi ng lúa truy n th ng aTrung Tâm Ngân Hàng Gen IRRI mang tên T.T.Chang K t qu cho th y r ngnhi u gi ng lúa th m, c bi t t Nam và ông Nam Á, không bi u th m t i 8

p baz , nh ng n ph m 2-acetyl-1-pyrroline v n c xác nh trong c d ng

o và d ng c m c a nh ng gi ng này S m t i 8 c p baz trong locus fgr không

ch là nguyên nhân qui nh mùi th m mà còn có m t t bi n khác ã u khi n tích l y n ph m 2-acetyl-1-pyrroline Protein t ng s 2-acetyl-1-pyrroline c

mã hóa b i nh ng gen ng d ng fgr không bi u th khác bi t có ý ngh a so v i

ki u gen n-fgr M t vài ki u gen fgr, c bi t t Nam Á mã hóa protein này v i stích l y s l ng l n 2-acetyl-1-pyrroline nh Basmati S t bi n o ra 2-acetyl-

1-pyrroline trong các gi ng lúa th m n-fgr có th c o ra m t vài l n trong quá

trình thu n hóa và ti n hóa Gen fgr và các alen khác liên quan t i

2-acetyl-1-pyrroline ã qui i trong các gi ng lúa th m Nam Á o ra các gi ng lúa c

n c truy n có mùi th m cao S xác nh nhi u t bi n i v i pyrroline có th y ra trong các ch ng trình ch n gi ng lúa a ng ngu n ditruy n c a 2-acetyl-1-pyrroline nh m phát tri n gi ng lúa có mùi th m cao và ch t

2-acetyl-1-ng t t

1.1.1.3 M t s y u t môi tr ng nh h ng n vi c hình thành mùi

th m trên lúa

+ Nhi t

Theo Juliano [57b] vi c hình thành mùi th m trong h t t ng lên nhi t

th p trong su t giai n vào ch c c a h t Gi ng lúa Basmati yêu c u nhi t th p(25oC ban ngày, 21oC ban êm trong su t quá trình tr ng thành) thì t t cho vi chình thành mùi th m

Nhân t t c ng nh h ng n mùi th m và các tính tr ng ch t l ng khácthông qua dinh d ng cây tr ng và m i quan h t ng tác c a các ch t dinh d ngbay h i v i các thành ph n bay h i có liên quan n mùi th m Singh và ctv [94]

nh n th y có s khác nhau m t cách có ý ngh a v mùi th m c a lúa hai th a

ru ng li n k nhau m c dù là cùng m t gi ng u ki n t t i x p và t vùng cao

ng giúp hình thành mùi th m c t t h n

Bên c nh ó, Bocchi và ctv [36] ã ánh giá s nh h ng c a các c tính

t trên ch t l ng mùi th m c a lúa trên ru ng th nghi m Pavia, Italy và k t

lu n r ng hàm l ng cao nh t c a các ch t bay h i trong h t có liên quan n các

lo i t có hàm l ng sét th p và hàm l ng cát cao nh h ng c a t ng tác ki ugen và t trên ch t l ng h t lúa c a lúa Japonica thì c ng c báo cáo b i Lee

và ctv [68]

+ T p quán canh tác

Theo Singh và ctv [94] lúa s có mùi th m h n khi cây lúa c s tr c ti p

so v i khi c c y Bên c nh ó th i gian thu ho ch là m t nhân t khác có nh

ng n mùi th m và nh ng tính tr ng ch t l ng khác lúa Vi c trì ho n thu

ho ch sau khi chín có th làm gi m mùi th m C n ng su t và ph m ch t h t s

gi m i n u vi c thu ho ch v t quá th i gian này S tác ng c a vi c trì hoãn thuach trên ph m ch t lúa g o thông qua s gi m hay thay i trong các thành ph n

t do b i nhi t , m , côn trùng d ch h i và các vi sinh v t khác

+ thu n gi ng

Theo Singh và Singh [93] trong h u h t các vùng tr ng lúa th m b n a

n , ng i nông dân th ng s d ng h t c a các th h tr c Không có ch ngtrình c i thi n n ng su t cho các gi ng lúa này K t qu là h t không thu n d n n

vi c gi m i mùi th m

Tóm l i, các thành ph n di truy n, t p quán canh tác, môi tr ng và các nhân khác có nh h ng n s th hi n c a mùi th m và các tính tr ng ch t l ngtrên lúa th m Cùng m t gi ng c tr ng các n i khác nhau có th không s n

xu t h t có ch t l ng nh nhau Tính tr ng ch t l ng c a các gi ng này c th

hi n t t nh t trong các vùng b n a c a chúng khi c tr ng

1.1.2 Nguyên lý và yêu c u trong ch n gi ng b ng MAS

Ch n t o gi ng nh ch th phân t (MAS) là k thu t ch n t o gi ng k t h p

gi a ph ng pháp truy n th ng v i ph ng pháp công ngh sinh h c hi n i làm c vi c này c n xác nh c c p b m mang nh ng c tính mong mu n

và các gen qui nh các c tính ó ã c l p b n và có nh ng ch th phân tliên k t ch t v i các c tính ó Tiêu chu n quan tr ng nh t trong l a ch n b m

ph i có s t ng ph n r t l n v tính tr ng m c tiêu có trong b m và s di truy n

a tính tr ng này b m Xét v m c a hình gi a b m , tính ch t này càng

n k t qu càng t t [2] Bên c nh ó, nguyên lý c b n trong ch n gi ng b ngMAS là s d ng ph ng pháp lai truy n th ng và ph ng pháp lai h i giao(Backcross-BC) nhi u l n cho n khi t c th h BC mong mu n Trong qúatrình này s s d ng các ch th phân t ch n các cá th có ki u gen mong mu n

Cu i cùng n m t th h nào ó s ch n ra cá th cho t th t o dòng thu n cómang ki u gen mong mu n c n c i t o Ph ng pháp ch n t o gi ng này v a chínhxác v a có th rút ng n th i gian ch n l c, di n tích tri n khai do có th phân tích

và ch n c các gi ng mang gen ngay giai n s m, thí d nh cây gieo t h tsau 7-10 ngày mà không c n ch n khi thu h ach [20] M t s gi ng lúa m i ã

c t o ra thông qua ph ng pháp ch n gi ng nh ch th phân t nh là OM4495

(thích nghi vùng khó kh n), OM4498 (thích nghi vùng khó kh n), OM5992 (th m

nh ), OM5953 (th m nh ) [22]

1.1.3 Nhi m s c th nhân t o c a vi khu n BAC (Bacterial Artificial Chromosome)

1.1.3.1 Khái ni m BAC DNA và BAC contigs

BAC (Bacterial Artificial Chromosome)- nhi m s c th nhân t o vi khu n.BAC DNA là các vòng plasmid BAC ch a n DNA ngo i lai c chèn vào v trí

c tiêu trên nhi m s c th này Các plasmid BAC có kh n ng t nhân lên c l p

i s phân chia t bào vi khu n Plasmid BAC có th t n t i t m t n hàng tr mphiên b n trong m t t bào vi khu n

BAC contigs hay BAC “contiguous sequence” là m t n dài c a chu itrình t c xây d ng b i m t s các trình t ng n, chu i trình t này có các nphân t ch ng l p lên nhau [3]

1.1.3.2 Xây d ng BAC contig

Nh ng dòng BAC có tính ch ng l p lên nhau c g i v i thu t ng là

“contig”, có th c xây d ng thông qua:

+ Vi c thanh l c khu n l c (colony)

+ K thu t “chromosome walking”

+ K thu t “DNA fingerprinting”

+ Ch th STS (nh ng ch th c chuy n i t RFLP)[3]

Nguy n Th Lang và ctv [67] phân tích PCR v i ch th STS c s d ng thanh l c các dòng BAC có tính ch t ch ng l p và hình thành nh ng “contig” c akho l u tr BAC t DNA c a qu n th n b i kép gi ng lúa IR64/Azucena Kho

u tr này g m có 18.432 dòng Th c hi n thanh l c DNA c a th vi n BAC v i

120 m i STS T ng s dòng BAC ã c phân l p là 86 dòng trên 23 loci c a 38

i STS M t vài contig ã c “neo” gi trên nh ng nhi m s c th cây lúa trên

s b n d u chu n phân t STS c a qu n th n b i kép t c p lai

IR64/Azucena. t qu cho th y phân tích PCR v i m i STS là m t ph ng ti n r t

t tìm ra nh ng dòng BAC có tính ch t ch ng l p hình thành contig Ph ng

pháp này c ng ã xác nh c các dòng BAC mang nh ng n phân t chuyên

bi t nh v y

Theo Wang và ctv [105] trong nghiên c u xây d ng m t BAC contig ch a

Xa-4 locus trên nhi m s c th s 11 Gen kháng vi khu n b c lá XaXa-4 ã c s d ng

t cách r ng rãi khai thác gen kháng trong nhi u ch ng trình ch n gi ng lúa

a Châu Á và c ngh là có tính kháng n nh trong nhi u gi ng lúa th ng

i [81] M t ph n c a nhóm gen kháng bao g m Xa3, Pi-1 (t), Pik, và Pi-f trên nhi m s c th 11 [69]; [111] Tuy nhiên, các dòng lúa ch ng gen Xa4 v i các gen

kháng vi khu n b c lá khác cho k t qu m c kháng cao h n và th m chí là phkháng r ng h n so v i b nh này ch v i m t gen kháng n gen [54] Vì v y mà,

Xa4 ã c coi nh là m t m c tiêu cho tách dòng nh v Xa4 ã c xác nh

n u tiên b i Yoshimura và ctv [117] trên nhi m s c th 11 trên lúa g n v i ch

th G181 (ch th RFLP) G n ây, m t vài chu i trình t t ng ng gen kháng(RGAs) khu ch i t DNA b gen cây lúa v i các m i chuy n i ã c l p b n

trong vùng này [69] Thanh l c RGAs cùng v i locus Xa4, khai thác theo ki u

ti p c n d a trên PCR [83]; [118] M t trong s nh ng chu i t ng ng gen kháng

là RSI3 v i m c t ng ng cao v i gen c bi t là NBS-LRR ã c tìm th y

cùng v i Xa4 trong m t qu n th F2 có ngu n g c t gi ng IR24 và qu n th NIL

Xa4 (IRBB4); RSI3 n m gi a hai ch th RFLP là G181 và L1044 Chi n l c này

có tên g i là “Chromosome landing”, “Chromosome landing” có xu h ng ch n l cphong phú các ch th DNA trong ph m vi vùng cM ph chung quanh gen m c tiêu[99] Vì v y, RSI3 có th c s d ng ánh d u v trí Xa4. tách ly gen

Xa4, m t th vi n BAC bao g m 55.296 dòng c a IRBB56 ã c xây d ng Các

ch th RSI3, G181, và L1044 c s d ng thanh l c th vi n BAC K t qu ãthanh l c c 18, 13 và 106 dòng BAC theo th t các ch th nh trên Trong s

18 dòng BAC ã c nh n bi t b i RSI3 có b n dòng BAC (1F21, 26D24, 56M22

và 111E1) c ng ã c nh n bi t b i ch th G181 và sáu dòng BAC (1F21, 33M8,56M22, 61A13, 104B15 và 111E1) c nh n bi t b i ch th L1044 Trên c s c t

n ch c a enzyme HindIII, 12 trong s 18 dòng BAC ã c ch n l c và c t v i

enzyme c t gi i h n HindIII ph c v cho phân tích Southern S d ng G181 làm

n dò k t qu ã nh n bi t m t b ng sau khi phân tích Sounthern v i các dòngBAC: 56M22, 111E1 và 26D24 Vì v y, ch th G181 coi nh n m trên ph n trùng

p c a nh ng dòng BAC này S d ng L1044 làm n dò sau khi phân tíchSounthern k t qu ã nh n ra các b ng trên 2 v trí khác nhau: m t b ng cho cácdòng BAC 56M22 và 111E1, cái còn l i cho các dòng BAC 104B15, 33M8 và61A13 c tính kho ng cách di truy n gi a G181 và L1044 Ch th L1044 n mtrong ph n trùng l p c a 3 dòng BAC là 104B15, 33M8 và 61A13 S d ng RSI3làm n dò trong phân tích Southern k t qu ã nh n bi t t 2 t i 5 b ng trong m inhóm ít nh t là 2 dòng BAC M i quan h trùng l p gi a các dòng BAC ã cphân tích thêm thông qua phân tích Southern s d ng n dò c thi t k t cácdòng BAC trên v i TAIL-PCR [75] Kích th c n chèn c a m i dòng BAC

c xác nh thông qua n di CHEF sau khi c t v i enzyme c t gi i h n NotI.

t BAC contig dài kho ng 420kb ph trên v trí gen Xa4 ã c xây d ng.Trong s 339 cá th t qu n th F2 c a nh ng dòng ng gen Xa4, m i c thi t k trình t u cu i c a n chèn c a các dòng BAC: 56M22F ã nh n bi t 3 tái t

p, 26D24R nh n bi t 5 tái t h p và 104B15R nh n bi t 6 tái t h p Các tái t

p c nh n bi t b i 56M22F thì khác so v i các tái t h p c nh n bi t b i

26D24R và 104B15R, Xa4 có th coi là n m trong vùng gi a 56M22F và 26D24R

i chi u dài v t lý c tính kho ng 90kb Ch th RSI3 có m c t ng ng cao

i vùng NBS c a l p gen NBS-LRR và ng cách ly v i gen Xa4, có kh n ng ch

th RSI3 là m t ph n c a m t thành viên trong h gia ình gen Xa4 Ch th RSI3 có

th nh n bi t c 5 b ng HindIII Trong s nh ng dòng BAC c nh n bi t b i

ch th RSI3 thông qua phân tích Southern, dòng BAC 106P13 có th hi n th t t c

nh ng b ng lai và bao b c vùng gi a hai ch th 56M22F và 26D24R Vì v y, dòng

BAC 106P13 có l ch a alen Xa4 và ã c ch n l c cho nh ng ánh giá sau này

1.1.3.3 M t s thông tin v BAC DNA

BAC vect c phóng thích t “E.coli F factor plasmid”, bao g m các gen

u khi n s b n sao có tính gi i h n và s t tái b n DNA có tính ng h ng Chai tính ch t này u giúp cho plasmid c duy trì và n nh Kh n ng nhândòng c a BAC là 400kb C u trúc c n b n c a BAC vect c phát tri n tplasmid F n i sinh Plasmid F bao g m 4 vùng c n thi t có ch c n ng n nh

plasmid và quy t nh s b n sao ó là: ParA, ParB, OriS, RepE C hai ParA và

ParB u c n cho vi c phân n và n nh plasmid Bên nh ó, ParB còn c n cho vi c k t h p v i F factor khác OriS là ngu n t tái b n DNA, có tính ch t ng

ng RepE mang tính hi u c a protein E, c n trong quá trình t tái b n t OriS và

n trong quá trình ki m soát b n sao Ng i ta cho vào gen khángchloramphenicol, dùng ch n l c các th h có tính ch t kháng sinh [3]

Dòng E.coli c s d ng ph bi n nh t cho k thu t nhân dòng nhi m s c

th nhân t o trong vi khu n (BAC) là DH10B Hanahan [52] c m chính c adòng này là có nh ng t bi n ng n tr :

(1) Phân c t DNA l do h men n i sinh (hsd / RMS)

(2) Phân c t DNA có g c methyl (methylcytosine ho c methyladenine,

5’-hydromethylcytosine) (mcrA, mcrB, mcrC, mrr)

(3) tái t h p (recA1)

Vì h th ng BAC còn quá m i m , do v y ch có vài loài th c v t c thi t

p th vi n Thí d , th vi n trên lúa IR64 [115] Trên cao l ng có 13.750 dòngBAC [109] Th vi n này c kho ng 90% genome c a cao l ng và 14% b t p

i trình t c a th l p

Zhang và ctv [119] ã xây d ng th vi n BAC cho cây lúa thu c nhóm

japonica và indica K t qu ghi nh n t ng t nh trên cao l ng Nh ng k t qu

u tiên này cho th y BAC r t có tri n v ng trong ng d ng sinh h c phân tphân tích genome th c v t

Kho l u tr BAC trên lúa hi n nay có 18.432 dòng trên qu n th DH a t

h p lai IR64/Azucena [114]; [115] Kh n ng chèn vào l n nh t a BAC là 364kb

Có 75% dòng BAC có kh n ng mang 76-135kb, trung bình là 107kb

i dòng BAC c ký hi u theo s a (plate) (X), s hàng (Y) và s c t(Z) Thí d , BAC trong tr ng h p IR64/Azucena t i IRRI (Philippines) c theodõi có 48 a ánh s t P1 n P48 Có 16 hàng ánh th t t A n P và có 24

t ánh th t t C1 n C24

1.1.3.4 M t s th vi n BAC trên th gi i và Vi t Nam

Theo Khush và ctv [62] th vi n nhi m s c th nhân t o n m men (YAC)trên lúa ã c công b b i RGRP (Rice Genome Research Program) và th vi nnhi m s c th nhân t o vi khu n (BAC) b i Wang và ctv [104]

Wang và ctv [104] ã phát tri n l n u tiên th vi n BAC ph c v tích c ccho vi c xây d ng b n v t lý trên b genome cây lúa Th vi n BAC này ch akho ng 11.000 dòng v i kích th c n chèn trung bình là 125kb Trong ó có 12dòng ã c lai v i 3 DNA ch th liên k t g n v i locus Xa21.

Yang và ctv [115] ã phát tri n th vi n BAC n ng su t cao và phát tri n

ng rãi trên gi ng lúa indica IR64 Th vi n này có ch a 18.432 dòng v i kích

th c an chèn trung bình 107kb M t vài dòng BAC trùng l p ã c xác nhthông qua lai colony v i các ch th RFLP trên nhi m s c th s 4.

Zhang và ctv [120] ã xây d ng 2 th vi n BAC trên lúa ch a 22.000 dòng

i kích th c an chèn trung bình l n l t là 130 và 150kb

Hi n nay, Vi t Nam t i Vi n Lúa ng b ng sông C u Long ang ng

ng th vi n BAC (gi ng lúa IR64) trên gen r y nâu bao g m 18.432 dòng (clone)trong nh ng nghiên c u g n ây t i c s [66]

Trung Qu c ã xây d ng m t th vi n BAC c a dòng lúa hoang thông

th ng (YJCWR), thu th p t Yuanjiang, t nh Yunnan v i kích th c n chèntrung bình 50kb Th vi n bao g m 52.992 dòng (clone) [110]

M , hi n nay có 2 th vi n BAC ã c công b r ng rãi là Oryza sativa

TP164 (54 x 384 well plates) v i kích th c an chèn trung bình là 140kb Th

vi n BAC trên Oryza rufipogon (56 x 384 well plates) v i kích thu c an chèntrung bình 120kb [106]

1.2.1 Nghiên c u di truy n gen mùi th m trên cây lúa

1.2.1.1 Mùi th m trên lúa do m t gen l n ki m soát

Berner và ctv [35] t ng k t r ng tính th m c a gi ng Della c qui nh b i

t gen l n trong nhân Gen này n m trên nhi m s c th s 8 và ã c xác nhqua k thu t RFLP [31] Ghose và Butany [50], Reddy và Reddy [87], Sood vàSiddiq [96] ng ã ngh tính th m c qui nh b i m t gen l n m trongnhân t bào chi ph i

Reddy và Reddy [87] ã báo cáo mùi th m c ng c u khi n b i m tgen l n và nh n th y r ng có s v ng m t c a m t enzyme ng ng riêng bi tthu c lo i ester i kèm v i s hình thành tính th m trên lúa

Trong qu n th phân ly F2 th m và trong các dòng b m th m, Huang vàZou [53] nh n th y các cây F1 t t t c các c p lai thu n ngh ch u không th m

u này cho th y r ng có m t gen l n u khi n tính th m S ánh giá mùi th m

a cây F2 cho t l 3:1 (không th m: th m) s phân ly ã kh ng nh l i gen th m

là m t gen l n trong lúa

Katare và Jambhale [60] ã nghiên c u v s di truy n c a mùi th m trong 4

h p lai có liên quan trên các gi ng Kasturi, Ambemohar-197 (th m) và Jaya,Mahsuri (không th m) Trong t t c các c p lai c ng nh n th y s di truy n c

qu n lý b i m t gen l n

Song và ctv [95] ã lai 4 gi ng th m l ng b i v i ba gi ng không th m, vàhai t h p lai t ng t nhau c làm t t b i hóa T t c các cây F1 c a 4 c p laithu n ngh ch t t b i hóa và 5 con l ng b i u không th m v i t l không th m

và th m F2 là 35:1 và 3:1 K t qu này cho th y r ng s di truy n c a mùi th m

c u khi n b i m t gen l n

Berner và Hoff [35] ã báo cáo v s di truy n gen l n n c a tính th m và ngh r ng mùi th m có th c nh n bi t trong ph n h t không ch a phôi nh

a h t n b ng cách nhai ph n này nh m ti t ki m ph n h t ch a phôi nh

Trong nghiên c u c a Pinson [85] v s di truy n c a mùi th m trên 6 gi nglúa nh n th y s m t i mùi th m c a lá trong con lai F1 (th m x không th m) cho

th y tính l n c a mùi th m trong t t c các gi ng nghiên c u T l phân ly F2 t hai

gi ng, Jasmine 85 và PI457917, m i gi ng ch a m t gen n v mùi th m, và tính

th m c a các lá F1 t các t h p lai v i nhau và v i A-310, Delta-X cho th y r nggen th m trong 4 gi ng là có alen v i nhau Tuy nhiên, Amber và Dragon Eyeball-

100 m i gi ng u ch a hai gen th m và m t gen m i s thêm vào m t alen cho cácgen trong A-310, Delta-X, Jasmine 85 và P457917

Sadhukhan và ctv [90] báo cáo r ng mùi th m trên các gi ng th mGovindobhog và Kataribhog có alen v i nhau và c u khi n b i m t gen l n

a vào nghiên c u c a 50 dòng tái t h p lai F8 (single-seed descent) pháttri n t t h p lai BG1 x Koshihikari, s di truy n c a mùi th m và m t vài tính

tr ng nông h c khác i kèm v i nó ã c tìm ra b i Kato và Itani [61] Ki m tra

m quan v s phân ly mùi th m h t cho th y r ng s khác nhau v mùi th m gi a

BG1 và Koshihikari c u khi n b i m t gen l n, có ngu n g c t các gi ng

lúa indica th m c a Trung Qu c, Chang Hsian Tao, m t b m c a BG1.

Berner và Hoff [35] báo cáo r ng khi các h t c l p t cây F1 c nhai vàánh giá tính th m và không th m, k t qu cho th y h t c a cây F1 phân ly theo t l3:1 (không th m: th m) Mùi th m th hi n trong lá c ng gi ng nh trong h t, mùi

th m là l n, ch nh ng cây ng h p l n m i th m

Sood và Siddiq [96] nghiên c u di truy n tính th m c a 7 t h p lai gi a

gi ng th m và không th m K t qu , cây F1 không th m và s phân ly theo t l3(không th m) : 1 (th m) th h F2 cho th y tính th m c ki m sóat b i m tgen l n

IRRI [55] c ng nh c l i k t qu t ng t c a Benner và Hoff [36] v t h plai gi a gi ng Della (th m)/Dawn (không th m) v i t l 3(không th m): 1(th m)

1.2.1.2 Mùi th m trên cây lúa do m t gen tr i ki m soát

K t qu nghiên c u c a Kadam và Patankar [58] cho r ng gen th m là m tgen tr i Bên c nh ó, m t gen tr i c ng ã c báo cáo là u khi n mùi th mtrên lúa b i Jodon và ctv [57a]

1.2.1.3 Mùi th m trên cây lúa do a gen ki m soát

k t qu phân ly v i t l 13 (không th m) : 3 (th m) F2 gi a 2 gi ng

th m/không th m, Charkravaty [41] k t lu n có m t gen c ch liên quan n tính

th m c a lúa trong s 2 gen l n c phát hi n

t s nghiên c u khác thì cho r ng tính th m do: hai gen l n ho t ng l p

an (t l 1:15 F2) [44]; ba gen l n (t l 27:37 F2) [58], [82], [86]

Vivekanandan và Giridharan [103] ã báo cáo có hai gen l n u khi n mùi

th m ph thu c vào ki u gen s d ng trong vi c lai t o trong nghiên c u

Tripathi và Rao [100] cho r ng mùi th m c u khi n b i hai gen tr i b

sung (SK1và SK2), các gen này c l p v i các gen u khi n màu lá và màu vchín S d ng t h p lai Pankaj (lúa th ng)/Kalabhat (lúa th m), k t qu cho t lphân ly 9 (th m) : 7 (không th m) th h F2

Geetha [48] c ng báo cáo có hai gen l n thay cho m t gen u khi n mùi

th m trên lúa

Tsuzuki và Shimokawa [101] quan sát t l 13:3 (không th m: th m) trong F2cho th y r ng m t gen cho mùi th m và m t gen i kèm theo có kh n ng pháttri n mùi th m

IRRI [55] ã li t kê k t lu n c a nhi u tác gi cho r ng ba gen tr i b sung

ki m soát tính th m [82], [86] ng ý v i các quan m trên, Nagaraju và ctv [82]

ng nh n th y r ng mùi th m c u khi n b i s h at ng c a ba gen tr i bsung và ngh phân tích lá coi nh là ph ng pháp n gi n và t t nh t phântích mùi th m

Hai khoa h c gia n Kadam và Patankar [58] ã nghiên c u qu n th lai

gi a gi ng Kolamba (lúa th ng) và gi ng lúa Sukhadasi (lúa th m), s d ng

ph ng pháp un nóng g o l t trong ng nghi m v i n c l c K t qu cho th ycác cá th F1 u th m và t l phân ly th h F2 là 27(th m) : 37(không th m);

gi thuy t r ng có 3 gen tr i b sung ki m soát tính th m: Oa, Ob, Oc h at ng

Reddy và Sathyanarayanaiah k t lu n r ng mùi th m c qui nh b i 3gen l n b sung [86]

Tuy nhiên, Dhulappanavar [43] l i cho r ng mùi th m c qui nh b i 4gen l n b sung Dhulappanavar ã s d ng ph ng pháp c m quan nghiên c utính th m con lai c a gi ng T-141(không th m)/Kagisali 44-1(th m) Theo githuy t có 4 gen b sung t th h F2 v i 81(th m) : 175(không th m)

di truy n a gen c ng ã c ngh cho mùi th m trên lúa b iRichharia và ctv [88]

Siddiq [92] ã báo cáo có 3 gen l n, 2 trong s chúng r t quan tr ng cho vi c

bi u hi n mùi th m

Khush và Dela Cruz [63] ã ngh r ng mùi th m là m t tính tr ng s

ng khi các con phân ly th hi n m c khác nhau v mùi th m c quan sáttrong các t h p lai gi a lúa th m và không th m C ng có kh n ng m t gen chính mùi th m và m t vài gen b sung hay QTLs Tuy v y, c ng không lo i tr nh

ng c a t ng tác GxE trong s th hi n mùi th m

Bên c nh ó, Kader và Delseny [59] c ng k t lu n mùi th m là QTLs, mùi

th m c u khi n b i m t gen chính trên nhi m s c th s 8 và hai gen ph trênnhi m s c th s 4 và s 12

Pinson [85] cho r ng m t trong s nh ng lý do d n n s nh m l n v gen

th m ó là do s phân tích các gi ng lúa khác nhau, t p trung vào 6 gi ng ánhgiá ki u gen th m có liên quan và ã nh n th y r ng Jasmine 85, A-310, Della-X vàPI45917 m i gi ng u ch a m t gen n v mùi th m và có alen v i nhau Gi ngAmber và Dragon Eyeball 100 m i gi ng u ch a 2 gen th m, m t gen m i thêmvào m t alen cho gen trong A-310, Della-X, Jasmine 85 và PI457917

Tóm l i, ã có nhi u quan m khác nhau v s di truy n gen qui nh mùi

th m trên cây lúa u này có th do s phân tích các gi ng lúa khác nhau hay n n

ng v di truy n khác nhau c a các v t li u c s d ng trong nghiên c u [59], vì

th ph i có nh ng khu v c xác nh cho vi c canh tác các gi ng lúa có mùi th m

i các tính tr ng s l ng c a chúng c th hi n m t cách t t nh t

th i m hi n t i, m t dù các ki m tra c ng khá nh y i v i vi c có haykhông có mùi th m, nh ng nó v n không phân bi t c các m c khác nhau

a mùi th m Không có ph ng pháp v s l ng nào nh n bi t mùi th m Có

là do s nh h ng c a môi tr ng (tính th m có h s di truy n r t th p [18])trên s bi u hi n mùi th m và s thi u ph ng pháp ánh giá v s l ng cho các

c khác nhau c a mùi th m

1.2.2 M t s nghiên c u trong và ngoài n c ng d ng PCR trong ch n

c gen mùi th m

mùi th m

B n fine mapping v gen mùi th m trên nhi m s c th s 8 c Nguy n

Th Lang và ctv [3] thi t k thông qua ng d ng SSR (microsatellite) v i kho ng

cách di truy n gi a gen fgr v i ch th RM223 là 1,8cM và v i ch th RG28FL-RB

c thi t k l i t trình t c a ch th RG28) là 1,6cM, c xem là có liên k t

ch t v i gen fgr Hai ch th RG28FL-RB và RM223 có th s d ng trong ch ngtrình ch n gi ng nh ch th phân t [67]

(Ngu n: Nguy n Th Lang và Nguy n Thúy Li u [17])

Bên c nh ó, ch th RM223 có s liên k t v i gen ch ng ch u m n v ikho ng cách di truy n là 6,3cM trên nhi m s c th s 8 giai n m [11]

tài ng d ng ánh d u vi v tinh trong ch n gi ng lúa (Oryza sativa L.)

có mùi th m ã c Bùi Th D ng Khuy u th c hi n vào n m 2004 [7] trên b

gi ng lúa mùa a ph ng (193 gi ng) v i k t qu có 4 alen liên k t v i ch thRM223

Nguy n Th Lang và ctv [12]; [13] th c hi n tài nghiên c u v mùi th m

ng d ng d u chu n phân t thông qua các k thu t SSR và STS th nghi m trênnhi u ch th khác nhau K t qu ch có 12 ch th SSR n m trên nhi m s c th s 8

là RM134, RM118, OSR34, RM38, RM25, RM310, RM344, RM42, RM223,RM284, RM308 có bi u hi n a hình trong c p lai OM1490/Khao Dawk Mali 105

i v i ch th STS, a hình trong c p lai OM1490/Khao Dawk Mali 105 trên ch

th RG28 bi u th khá rõ

Theo Nguy n Th Lang [9] ánh giá mùi th m thông qua ki u gen, s n ph mPCR trên gel agarose 3% v i ch th RM223 cho th y có s a hình trên các gi ng:

Th m S m, N p S ng G ng, Nh Th m, N p Sáp, Tr ng Hòa Bình, Khao DawkMali 105, Nàng Th m Ch ào, Nàng Th m Mu n, Nàng Th m Thanh Trà, Bông

qu phân tích nhóm di truy n v mùi th m cho th y gi ng Hoa Lài (th m nh ) vàBông H ng (không th m) có m c dung h p nh h n 65% Hai gi ng c s

ng làm b m này có kho ng cách di truy n liên k t v i tính tr ng mùi th m trên35% [14]

i v i lúa mùa a ph ng, t p trung nghiên c u các m u lúa thu th p khácnhau t gi ng lúa Nàng Th m Ch ào Do v y nhi u m u trong cùng m t gi ng

c ch n l a và ánh giá v tính tr ng mùi th m Tuy nhiên, v mùi th m trên cácdòng này r t bi n ng [17]

Nghiên c u a d ng di truy n lúa Tám b ng ch th microsatellite ã c

Tr n Danh S u và ctv [19] th c hi n Hai m i hai (22) gi ng lúa th m thu c nhómlúa Tám ã c ánh giá thông qua vi c s d ng 48 ch th SSR trên 12 nhi m s c

th c a b gen cây lúa K t qu cho th y r ng s l ng alen trung bình cho m i ch

th SSR là 3,37 alen Các alen d h p t c coi nh có t n su t cao trong lúa

th m T t c 22 gi ng lúa th m trong nghiên c u này thu c nhóm japonica Hai

gi ng có tên g i là Tám Ngh a L c (acc No.5122) và Tám p B (acc No.5126)

c coi nh là cùng m t gi ng nh ng v i tên g i khác nhau

Nguy n Th Lang và ctv [16] th c hi n thông qua ng d ng ch th

RG28FL-RB phát hi n cá th có gen fgr i v i gi ng Nàng Nhen Th m c a t nh An

Giang ng d ng ch th này ánh giá 1000 cá th gi ng lúa Nàng Nhen Th mcho th y m c bi n ng c a nh ng cá th ch n l c r t l n Nhóm 1 (không

th m) chi m 60%, nhóm 2 (th m nh ) chi m 37%, nhóm 3 (th m trung bình)chi m 3% và nhóm 4 (r t th m) chi m 0,001%

Nguy n Th Lang và Bùi Chí B u [4] ánh giá v ki u hình và ki u gen chomùi th m trên lúa trong tài ch n gi ng ph m ch t cho BSCL i v i lúa cao

n, phân tích trên 46 gi ng lúa c i ti n, ng n ngày, n ng su t cao Dùng IR64 làm

gi ng i ch ng không th m và Jasmine 85 làm gi ng i ch ng th m Phân tíchmùi th m trên lá, thân, g o tr ng và g o l c K t qu ghi nh n các gi ng có m c mùi th m khác nhau Ch n l a m t s gi ng lúa mùa và lúa cao s n i di n, ti nhành ch y PCR b ng ph ng pháp microsatellite Dùng ch th RM223 ghi nh n skhu ch i trên các gi ng chi m 93,8% S n ph m a hình tách r t rõ hai alen: alen

A có s n ph m PCR dài 140 c p baz và alen B là 160 c p baz (bp) Theo ánhgiá các alen tr i c a IR64 có l n phân t 160 c p baz và alen l n u khi n gen

fgr c a DS-20 có l n phân t là 140 c p baz Các gi ng có alen v i l n phân

140 c p baz s mang gen th m

Phân tích STS i v i ch th RG28FL-RB, ghi nh n s khu ch i c a s n

ph m PCR trên các gi ng chi m 93,8% và có s a hình các gen trên các

gi ng/dòng lúa mùa và cao s n v i hai alen: alen A v i kích th c phân t là 1100

c p baz , alen B v i kích th c phân t là 1200 c p baz Theo k t qu nghiên c u

a Nguy n Th Lang và ctv [18] các gi ng có alen v i l n 1200 c p baz smang gen th m

Tóm l i, hai ch th phân t RM223 và RG28FL-RB có th c xem là liên

t ch t v i gen qui nh mùi th m trên cây lúa và c ng là hai ch th tiêu bi u ã

c s d ng r t hi u qu trong ch n l c gen mùi th m thông qua các nghiên c utrên

1.2.2.2 M t s nghiên c u ngoài n c ng d ng PCR trong ch n l c gen mùi th m

Theo Ahn và ctv [32], Li và ctv [73] báo cáo r ng ch th phân t RG28 trênnhi m s c th 8 có liên k t ch t v i gen th m fgr v i kho ng cách di truy n

4,5cM và ngh ch th phân t này có th c s d ng ch n l c dòng con lai

có th hi n hay v ng m t c a gen qui nh mùi th m

Theo Lorieux và ctv [76] có 4 lo i ch th phân t (RFLPs, RAPDs, STSs,isozymes) c s d ng l p b n ch th phân t cho gen th m K t qu xác nh

có nhi u ch th phân t trên nhi m s c th s 8 liên k t r t ch t v i gen u khi n

hi n di n c a 2-acetyl-1-pyrroline (2AP) m t h p ch t chính t o mùi th m c alúa Có m t gen chính và hai loci tính tr ng s l ng u khi n tính tr ng mùi

th m cây lúa Gen chính u khi n mùi th m c nh v và liên k t gi a hai ch

th RG1 và RG28 trên nhi m s c th s 8 Hai loci u khi n tính tr ng s l ngtác ng n m c th m c a các gi ng lúa

Jin và ctv [56] dùng 300 m i RAPD thanh l c xác nh tính tr ng th m c acon lai t gi ng b m Khao Dawk Mali 105 (th m) và CT9993 (không th m) S

ph n tr m m i th hi n a hình khá cao (64,1%) gi a hai gi ng Khao Dawk Mali

105 và CT9993 Tuy nhiên, ch có m t m i Jas1.5 (5’-GAACGGACTC-3’) cho

t b ng a hình gi a cá th th m và không th m, b ng 1,5kb ch tìm th y gi ngkhông th m K t qu cho th y n này có s k t n i v i alen tr i không th m

a vào s hi n di n c a alen tr i không th m lo i tr các cá th không có mùi

th m, ch th Jas1.5 liên k t v i gen th m trên nhi m s c th s 8 v i kho ng cách

di truy n 13,9cM

Ngoài ra, Yoshihashi [116] ã thành công khi dùng SSR ánh d u v i m iRM17 xác nh gi ng g o th m Khao Dawk Mali 105 v i các gi ng khác c ngmang cùng tên trên th tr ng thông qua DNA c ly trích t h t g o xay chà

Stephen Garland và Robert Henry [98] mô t s phát tri n và ng d ng 3 ch

th có ích cho gen fgr n m trong m t ch ng trình ch n gi ng lúa c a Úc Xu t phát

ý t ng c a các tác gi i tr c ã báo cáo v s a hình c a các n dò RFLP

lúa và STS là Fuknoka và ctv [46], Ghareyazie và ctv [49], Williams và ctv [108],

Xu và ctv [113] T ó ã chuy n các n dò RFLP và nh ng ch th khác thànhcác ch th phân t PCR Ph ng pháp c áp d ng trong nghiên c u này d a trêncác báo cáo v m c liên k t gi a RG28 trên NST s 8 v i gen qui nh mùi th m

i kho ng cách di truy n 4,5cM c a Ahn và ctv [32]

Bên c nh ó, Lorieux và ctv [76] ã báo cáo m c liên k t gi a RG28 và

gen fgr là 5,8cM Thanh l c v s a hình trong nh ng vùng khu ch i PCR t ng

ng v i các RFLP clone có liên k t v i fgr phát tri n nh ng ch th phân t Thêm vào ó, nh ng ch th SSR ã c l p b n tr c ây trong nh ng vùng

lân c n c a gen fgr c ng c ánh giá v thông tin a hình cung c p nh ng ch

th t t cho mùi th m Kh ang cách v di truy n gi a gen fgr và các ch th liên k t

c xác nh là ph n tr m trao i chéo Thông qua thí nghi m ã xác nh c 3

th m)/Kyeema (th m) kho ng 163 cá th Vi c l p b n trình k t qu mùi

th m t m t gen l n và ã phát hi n RSP04 có liên k t v i gen th m v i kh angcách di truy n là 2cM RSP04 ã c ánh giá trên nhi u gi ng T t c các gi ng

th m có “C“ v trí SNP trong khi các gi ng không th m có m t s tr n l n gi a

“C“ và “T“ v trí SNP

t s nghiên c u g n ây c a Giovanni và ctv [51] ã k t lu n thành ph nhóa h c 2-acetyl-1-pyrroline c coi nh là thành ph n quan tr ng nh t c a mùi

th m trong lúa th m ki u Jasmine và Basmati và xác nh m t an SSR – (AT)40

cho mùi th m và các alen không th m c a gen fgr.

Mandy Christopher và ctv [79] ã báo cáo v m t ch th SSR và m t ch thSNP m i cho mùi th m Xu t phát t SCU-Rice-SSR-1 d a trên s phân bi t khácnhau c p baz n trong m t l p l i (T)n gi a các gi ng th m và không th m Tuy