Đặc điểm tự nhiên của DNA: là một phân tử acid nucleic mang thông tin di truyền mã hóa cho hoạt động sinh trưởng và phát triển của các vật chất hữu cơ. Đặc biệt DNA có khả năng tự nhân đôi, sau khi nhân đôi 2 phân tử ADN mới (mỗi phân tử chứa một chuỗi cũ và một chuỗi mới) đều giống hệt trình tự nhau. Sự phân tách sản phẩm PCR khi điện di: sau khi kết thúc quá trình PCR thì vô số bản sao DNA được tạo thành, các sản phâm này sẽ được phân tích và đánh giá thông qua quá trình điện di nhờ vào đặc điểm và kích thước, độ cồng kềnh… của từng đoạn DNA.
Trang 1phương pháp cơ bản trong công nghệ sinh học
( điện di GEL , PCR, AFLP, RFLP )
Câu 1 trình bày hiểu biết về kĩ thuật điện di trên gel agarose.
Nguyên tắc của điện di trên gel agarose:
− Kĩ thuật điện di trên gel agarose hoạt động nhờ vào lực kéo của điện trường tác động vào các phân tử tích điện và kích thước lỗ của thể nền (gel).
− Gel cấu tạo bởi các chuỗi cao phân tử (polymer mạch thẳng không bị sulphate hóa chứa hai gốc xen kẽ nhau là D-galactose và 3,6-anhydro-L-galactose ) được liên kết chéo với nhau tạo thành một hệ thống mạng lưới với kích thước các mắc lưới tùy thuộc vào nồng độ chất cao phân tử và phản ứng tạo liên kết chéo.
− Các phân tử được phân tách khi di chuyển trong gel với vận tốc khác nhau nhờ vào sự khác nhau của lực của điện trường tác động lên chúng (nếu các phân tử tích điện khác nhau),kích thước của phân tử so với kích thước lỗ của gel và hình dạng, độ cồng kềnh của phân tử.
− Vị trí của DNA trong gel được xác định trực tiếp : các băng DNA trong gel được nhuộm ở nồng độ thấp của thuốc nhuộm huỳnh quang ethidium bromide (EtBr) và có thể phát hiện dưới ánh sáng tử ngoại.
Các yếu tố ảnh hưởng
− Kích thước của phân tử
+ Các phân tử DNA có kích thước càng lớn (khối lượng phân tử lớn) thì tốc độ dịch chuyển càng chậm Các phân tử DNA mạch thẳng sợi đôi đi qua bản gel
ở các tốc độ tỷ lệ nghịch với hàm log10 của khối lượng phân tử của chúng
− Nồng độ agarose
+ Đoạn DNA mang kích thước khác nhau di ̣ ch chuyển ở các tốc độ khác nhau qua các bản gel chứa các nồng độ agarose khác nhau
Trang 2
− Cấu hình của DNA
+ Các DNA dạng vòng đóng, vòng đứt và mạch thẳng có cùng một kh ối lượng phân tử sẽ dich chuyển trên agarose gel ở các tốc độ khác nhau DNA của các plasmid mạch vòng dịch chuyển nhanh hơn DNA của plasmid cùng loại nhưng có dạng mạch thẳng.
Thiết bị điện di và hóa chất điện di.
− Thiết bị điện di agarose gel gồm 3 bộ phận cơ bản: nắp, khay vận hành và buồng điện di
+ Nắp: trên nắp có đầu ra của dây cáp điện nối điện cực trên buồng điện di với nguồn điện
+ Khay vận hành bao gồm: khay đổ gel, khuôn đổ gel, lược.
+ Buồng điện di: là nơi đặt gel trong quá trình điện di Buồng có rãnh để cài lược, hai điện cực tạo ra điện trường trong dung dịch
− Hóa chất điện di
+ Đệm pH: đệm điện di DNA thích hợp là Tris-acetate-EDTA (TAE).Đệm giúp thiết lập một giá trị pH, cung cấp các ion để hỗ trợ cho độ dẫn
+ Thuốc nhuộm huỳnh quang EtBr: quan sát DNA trong agarose gel thuận lợi.
Quy trình điện di
− Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel
+ Dung dịch đệm thường dùng là TBE
Trang 3+ Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm 1x TBE hòa tan với hàm lượng agarose cần thiết đặt trong lò vi sóng đến khi tan hoàn toàn, đổ vào khuôn có các lược cài sẵn để tạo bản gel với số giếng nạp mẫu cần thiết.
+ Khi bản gel đã đông cứng, đặt bản gel vào buồng điện di, đổ dung dịch đệm ngập bản gel khoảng 1-2 mm.
− Nạp mẫu: Mẫu được trộn đều với đệm và thuốc nhuộm và được tra vào từng giếng.
− Chạy điện di: sử dụng nguồn điện thế 100V, cường độ 100mmA, thời gian chạy điện di khoảng 40’.
− Nhuộm bản gel và soi gel: kết thúc điện di bản gel được lấy ra nhuộm và được đặt vào máy soi UV để quan sát kết quả điện di.
Ứng dụng của điện di agarose gel
− Ước lượng kích thước của các phân tử DNA sau khi thực hiện phản ứng cắt hạn chế (ví dụ: lập bản đồ hạn chế của DNA được tạo dòng…)
− Phân tích các sản phẩm PCR (ví dụ: trong chẩn đoán di truyền phân tử hoặc
in dấu di truyền…)
− Phân tách DNA hệ gen đã được cắt hạn chế trước khi thẩm tích Southern, hoặc RNA trước khi thẩm tích Northern.
Ưu điểm và nhược điểm
− Ưu điểm của phương pháp này là gel được rót dễ dàng, không gây biến tính mẫu và bền vững vật lý hơn polyacrylamide Mẫu cũng dễ thu hồi
− Nhược điểm là agarose gel có thể bị nóng chảy trong quá trình điện di, đệm
có thể bị tiêu hao, và các dạng khác nhau của nucleic acid có thể chạy không
ổn định.
Câu 2 trình bày hiểu biết về kĩ thuật điện di.
− Nguyên tắc của kĩ thuật điện di:
− Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các phân tử tích điện dưới tác động của điện trường, hay nói cách khác là kỹ thuật phân chia các phân tử DNA, RNA, protein dựa trên các đặc điểm vật lý như khối lượng hay điện tích thực của chúng
Trang 4− Khi các phân tử tích điện được đặt trong một điện trường, chúng sẽ dịch chuyển về các cực (+) hoặc (-) tùy theo điện tích của chúng Protein có điện tích thực hoặc dương hoặc âm, còn các nucleic acid có một điện tích âm không đổi nhờ khung phosphate của mình và vì thế chỉ dịch chuyển hướng đến cực dương
− Các phân tử protein và nucleic acid có thể được chạy điện di trên một khuôn
đỡ (support matrix) như giấy, cellulose acetate, gel tinh bột, agarose hoặc polyacrylamide gel Thông thường, gel là một khuôn đúc dạng phiến mỏng có cácgiếng để nạp (loading) mẫu Gel được ngâm trong đệm điện di cung cấp các ion để dẫn truyền dòng điệnvà một vài loại đệm để duy trì pH ở một giá trị không đổi tương đối.
Thiết bị điện di.
− Thiết bị điện di gồm 3 bộ phận cơ bản: nắp, khay vận hành và buồng điện di
+ Nắp: trên nắp có đầu ra của dây cáp điện nối điện cực trên buồng điện di với nguồn điện
+ Khay vận hành bao gồm: khay đổ gel, khuôn đổ gel, lược.
+ Buồng điện di: là nơi đặt gel trong quá trình điện di Buồng có rãnh để cài lược, hai điện cực tạo ra điện trường trong dung dịch
− Các thông số điện di:
+ Lực dẫn cơ bản của điện di là hiệu điện thế của hệ thống.
+ Vận tốc của phân tử tỉ lệ thuận với gradient hiệu điện thế xung quanh.
Các yếu tố quan trọng trong quá trình điện di
− Đệm và pH:
+ Protein là các chất lưỡng tính, do vậy có thể tích điện âm hoặc dương, vì chúng có chứa cả hai loại gốc acid và base Điện tích thực của protein được xác định bằng pH của môi trường xung quanh, số lạo a.a mang nhóm carboxyl và amine
+ Axit nucleic không phải lưỡng tính, do vậy có thể tích điện âm ở đa số dệm điện di
+ pH cần giữ ổn định để duy trì điện tích.
− Tác động của nhiệt lên quá trình phân tách
+ Sự điều khiển nhiệt là then chốt trong mỗi bước của điện di
+ Nhiệt độ cao có thể gây ra nhiều vấn đề: nhiệt quá cao sẽ khiến gel agarose bị nóng chảy, hư hại thiết bị điện di.
+ Các protein có thể bị biến tính và bất hoạt.
Các loại gel thông dụng trong quá trình điện di
− Gel agarose
Trang 5+ Là dẫn xuất polysacharide từ agar có độ tinh khiết cao, thường được cung cấp dưới dạng bột khô, trạng thái lỏng ở nhiệt độ cao, tạo gel ở nhieeetj độ khoảng 40 o C.
+ Nông độ càng cao, mạng lưới càng nhỏ, thông thường nồng độ thích hợp cho
sử dụng là từ 0.4% đến 4%.
+ Ưng dụng để tách và phân tích ADN, sử dụng EtBr và tia UV để phát hiện các băng DNA.
− Gel polyacrylamide
+ Điện di trên gel polyyacrymide có SDS: tách protein dựa trên KLPT
+ Khi tách bằng sds, sự di động được xác định không phải do điện tích của chuỗi polypeptide mà so khối lượng phân tử
+ SDS là một chất tẩy anion gây biến tính protein.
Các bước cơ bản
Trang 6− B1: xác định được chất phân tích, loại, khối lượng phân tử.
− B2: xác định gel
− B3: pha loãng dung dịch gel có nồng độ ( C%) xác định cần thiết cho việc điện di.
− B4: đun nóng chảy gel, đổ gel vào khuôn, chờ gel đông
− B5:đặt gel vào bể điện di có dung dịch đệm, rút lược.
− B6: tra mẫuvào giếng.
− B7: khởi động thiết bị điện di
− B8: lấy bản gel từ bể điện di ra ngâm thuốc nhuộm bắt màu huỳnh quang, cho len máy soi UV có kết nối máy tính và phân tích kết quả.
ứng dụng của điện di
− Phương pháp điện di cho khả năng phân tách nhanh và chính xác, giúp nhận biết, phân tích và tinh sạch DNA, phân tách protein Nhờ phương pháp này
mà người ta ứng dụng để phân tích giải trình tự DNA, ứng dụng trong các nghiên cứu về DNA rất hiệu quả
Hạn chế:
− Nhiệt độ cao có thể gây ra nhiều vấn đề: nhiệt quá cao sẽ khiến gel agarose bị nóng chảy, hư hại thiết bị điện di.Các protein có thể bị biến tính và bất hoạt Nhưng hiện nay được khắc phục bằng cách dùng sự hỗ trợ của các thiết bị làm lạnh và hóa chất điều nhiệt,
Câu 3 trình bày hiểu biết về kĩ thuật PCR
Nguyên lí cơ bản:
− Đặc điểm tự nhiên của DNA: là một phân tử acid nucleic mang thông tin di truyền mã hóa cho hoạt động sinh trưởng và phát triển của các vật chất hữu
cơ Đặc biệt DNA có khả năng tự nhân đôi, sau khi nhân đôi 2 phân tử ADN mới (mỗi phân tử chứa một chuỗi cũ và một chuỗi mới) đều giống hệt trình
tự nhau.
− Sự phân tách sản phẩm PCR khi điện di: sau khi kết thúc quá trình PCR thì vô
số bản sao DNA được tạo thành, các sản phâm này sẽ được phân tích và đánh giá thông qua quá trình điện di nhờ vào đặc điểm và kích thước, độ cồng kềnh… của từng đoạn DNA.
Nguyên lí kỹ thuật:
− Nhiệt độ: nhiệt độ cao dùng để tháo xoắn, tách sợi đôi DNA thành 2 sợi đơn thay chp enzyme helicase.
− Mồi: các cặp mồi được thiết kế để mồi này nhận biết được sợi có nghĩa của DNA mà ta cần tái bản còn mồi kia nhận biết được sợi đối nghĩa.
− Enzyme: xúc tác cho quá trình lắp giáp nucleotide A,T,G,X vào mạch DNA mới tổng hợp
− Đơn phân: 4 loai dNTP là nguyên liệu tham gia tạo lên DNA mới
Trang 7− Dung dịch đệm, pH: giúp cho enzyme Taq hoạt động chức năng, cân bằng pH trong dung dịch.
Thiết bị PCR:
− Phản ứng PCR được thực hiện trong máy chu trình nhiệt
− Cần đáp ứng yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác
− Mỗi kiểu thiết bị có đặc điểm khuếch đại riêng nên mọi thí nghiệm của một nghiên cứu cần tiến hành trên cùng một loại.
Các bước cơ bản:
− Xác định thành phần PCR
+ Các thành phần của PCR
• DNA khuôn được tinh sạch ( sử dụng Proteinase K, CTAB để loại bỏ các thành phần không phải DNA)
• Mồi: gồm mồi xuôi và mồi ngược tùy vào mục đích mà thiết kế các cặp mồi.
• Enzyme: thường sử dụng enzyme taq polymerase.
• Các loại dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP,
• Dung dịch đệm: thành phần dung dịch đệm phụ thuộc vào loại enzyme sử dụng, quan trọng nhất là Mg 2+
+ Tính toán: cần xác định số lượng, thể tích mẫu cần tra vào giếng để định lượng thể tích các thành phần cần cho phản ứng chạy PCR Tính toán tổng số thể tích các thành phần cho vào tuýp lớn sao cho khi chia được các tuýp nhỏ
có thể tích bằng nhau.
+ Kỹ thuật mix: Mix các thành phần trên theo nguyên tắc cho nước đầu tiên và cho Taq cuối cùng Sau đó chia hỗn hợp mix cho từng tuýp Cho nước đầu tiên
để khi lấy những hóa chất tiếp theo sẽ dê tan không bị bám dính ở đầu côn Cho taq cuối đẻ tránh taq mất hoạt tính vì để ngoài lâu
− Đặt chu trình PCR
+ Phản ứng PCR gồm nhiều chu kì, mỗi chu kì gồm 3 giai đoạn:
• Thời kì biến tính DNA: tách sợi đôi thành sợi đơn, nhiệt độ thiết kế là 95 độ C, với nhiệt độ này DNA sẽ tạo ra sợi đơn DNA.
• Thời kì lai giữa primer và DNA: nhiệt độ thay đổi trong khoảng 50 độ C đến
60 độ C Nhiệt độ này tùy thuộc vào từng loại marker mà ta sử dụng ở giai đoạn này các đoạn mồi sẽ bắt cặp với mạch đơn DNA khuôn mẫu ở vị trí bổ sung.
• Thời kì kéo dài DNA mới nhờ Taq polymerase Ở nhiệt độ 72 độ C là nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của DNA polymeerase Dưới sự tác động của DNA polymerase những đoạn mồi đã bắt cặp với DNA khuôn mẫu sẽ được kéo dài Các DNA mới được hình thành lại được sử dụng làm khuôn để tổng hợp cho các chu kì tiếp theo.
Trang 8− Thu nhận kết quả: sau khi chạy xong PCR cần tiến hành điện di sản phẩm trên gel agarose đê phân tích, đánh giá kết quả.
+ Ưu điểm – Nhược điểm:
− Ưu điểm: thời gian thực hiện nhanh, đơn giản, ít tốn kém, độ tinh sạch của mẫu không cần cao
− Nhược điểm: sự ngoại nhiễm, các sai sót gây ra do Taq polymerase cho tỉ lệ sai quá cao 10 -4
Hướng ứng dụng và hướng phát triển:
− Hướng ứng dụng:
+ Chuẩn đoán bệnh di truyền
+ Tách dòng các sản phẩm pcr
+ Nhật biết đột biến, xen mất đoạn.
+ Nghiên cứu quá trình tiến hóa.
+ Chọn giống vật nuôi, cây trồng
+ Xác định huyết thống, truy tìm dấu vết tội phạm.
− Hướng ứng dụng:
+ RT-PCR: nhạy hơn, được dùng cho sự phân tách ARN
+ RT-PCR cạnh tranh: định lượng các loại mARN chuyên biệt
+ Real- Time PCR: đánh giá sự tích lũy và định lượng sản phẩm PCR.
Câu 4 Trình bày hiểu biết về kỹ thuật AFLP
Nguyên lý cơ bản
− AFLP là một trong số những kĩ thuật phát hiện dấu vết DNA, đánh giá sự đa dạng cjieeuf dài của DNA
− Kĩ thuật gồm 3 bước: (1) sự cắt hạn chế DNA có sự tham gia của RF (2) sự khuếch đại có chọn lọc các phân mảnh hạn chế đang tìm kiếm (3) sự phân tích các đoạn khuếch đại bằng điện di gel
− Khuếch đại PCR các phân mảnh hạn chế được thực hiện bằng cách sử dụng các adapter và trình tự hạn chế để tạo ra các trình tự cho các primer khi chạy PCR Khuếch đại có chọn lọc được diễn ra khi sử dụng các primer bắt cặp được với các phân mảnh hạn chế bằm ở phía đầu 3’ của các adapter và trình
tự hạn chế
=> Vì thế khi sử dụng AFLP để phân tích độ đa dạng chiều dài của các DNA không cần biết trình tự của các nucleotide
Các bước của kĩ thuật AFLP
− Bước 1 chuẩn bị khuôn mẫu AFLP
+ Mẫu DNA được phân lập và tinh chế từ một sinh vật Toàn bộ DNA có trình tự cắt của MseI và EcoRI
MseI cắt trình tự T T A A T T A A
A A T T A A T T
Trang 9EcoRI cắt trình tự G A A T T C G A A T T C
C T T A A G C T T A A G
− Bước 2 Cắt hạn chế RE và nối
+ Cắt hạn chế bằng RE
• Bằng cách ủ DNA khuôn với RE: chú ý các khuôn mẫu với enzyme hạn chế được chuẩn bị, sử dụng nhất thiết cùng protocol( biếu thị các chất giống nhau, nồng độ, điều kiện như nhau)
Phân mảnh hạn chế có đặc điểm:
T A A G end € EcoRI
End € MseI T C T T A A
• Được cắt bởi 2 enzyme Một đàu là trình tự bắt cặp bổ sung giữa hau đầu dính của adapter MseI-trình tự cắt MseI Một đầu là trình tự bổ sung giữa hai đầu dính của adapter EcoRI- Trình tự cắt EcoRI( adapter > 20 nu) Đoạn giữa 2 đầu không biết trình tự.
+ Nối RE với adapter
• RE + 2 adapter ( đoạn trình tự nhân tao, có đặc điểm kết hợp được với đầu dính của ez cắt theo nguyên tắc bổ sung) + ligase dsARE( DNA phân đoạn hạn chế sợi kép)
− Bước 3 khuếch đại chọn lọc.
+ Trong bước này cần chú ý đến mồi AFLP gồm 3 phần: trình tự lõi, trình tự đặc hiệu enzyme ( ENZ) và trình tự mở rộng chọn lọc ( EXT)
• Primer được thiêt kế dựa vào trình tự của các adapter và trình tự cắt của RE
• Primer đối với EcoRI: 5’-lõi – EN2 – EXT = 19.
• EXT = 1 thì primer có 4 loại EXT = 2 thì primer có 16 loai EXT=3 thì primer
có 64 loại.
+ Chạy PCR:
• Chuẩn bị thành phần PCR: Khuôn mẫu DNA là sản phẩm của bước 2.Enzyme taq DNA polymerase Prime: được thiết kế theo nguyên tắc trên dNTP: khi chuẩn bi vật liệu thì buộc phải ở điều kiện 3 gốc phosphate
• Chu trình nhiệt:
Trường hợp 1 chạy 20 ch kì đơn với AFLP sử dụng mồi có EXT = 1 hoặc 0
Trường hợp 2 chạy 36 chu kì đơn với AFLP sử dụng có mồi EXT = 2 hoặc 3
Cả hai trường hợp thì mỗi chu kì đều có các giai đoạn sau:
Nhiệt độ biến tính ở 94 độ trong 30s
Trang 10 Nhiệt độ hồi tính 36 độ trong 30s
Kéo dài 72 độ trong 1 phút
Nhiệt độ hồi tính trong chu kì đầu tiên là 65 độ, sau đó giảm ở mỗi chu kì tiếp theo là 0.7 độ cho 12 chu kì tiếp theo và tiếp tục tại 56 độ cho 23 chu kì còn lại.
− Bước 4: chạy điện di
+ Gel polyacrymadie có khả năng biến tính
+ Chuẩn bị gel, chuẩn bị hệ thống điện di
+ Tra mẫu vào gel
+ Kết nối với ngồn điện
− Bước 5: đánh giá độ đa dạng
Ưu nhược điểm và ứng dụng
− Ưu điểm: AFLP nhanh hơn, không phức tạp như RELP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gen Kỹ thuật đòi hỏi ít lượng DNA ban đầu, không cần biết trước trình tự đích và độ lặp lại phản ứng cao các mồi sử dung không cần đặ hiệu loại
− Nhược điểm: là một maker trội, điều này hạn chế phân biệt cá thể đồng trội
và dị hợp.
− ứng dụng: đánh giá đa dạng sinh học, phân tích và thu thập quỹ gen, đánh giá kiểu gen cá thể, phân tích khoảng cách di truyền thiết lập nhóm liên kết các chỉ thị đối với gen quan tâm, đánh giá mức độ liên quan hoặc sự khác biệt giữa các giông.
Câu 5 trình bài hiểu biết và kĩ thuật RFLP
Nguyên lí cơ bản:
− Phản ứng PCR được thực hiện để khuếch đại một vùng DNA cần khảo sát bằng cách sử dụng một cặp mồi oligonucleotide và các thành phần phần khác của phẩn ứng PCR để tạo ra vô số bản sao DNA.
− Sau đó các sản phẩm của PCR được ủ với enzyme RE sẽ tạo ra những phân đoạn DNA có kích thước khác nhau.
− Sử dụng kĩ thuật điện di trên gel để tách rời các đoạn DNA có kích thước khác.
− Sử dụng kĩ thuật Southern bot: Gây biến tính DNA trên gel ,sau đó chuyển DNA từ gel sang màng lai Thẩm tích các phân tử DNA lên màng lai, Lai phân
tử (lai với mẫu dò đặc hiệu có mang phóng xạ hoạt động) Chụp ảnh phóng xạ
tự ghi để thu nhận và đánh giá kết quả.
− Sơ đồ nguyên lý:
PCR+RE Điện di thẩm tách lai chụp
Nguyên tắc kĩ thuật: