Nghiên cứu sản xuất chitosan hòa tan trong nước và ứng dụng để kích thích sự nảy mầm của lúa

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Nghiên cứu sản xuất chitosan hòa tan trong nước và ứng dụng để kích thích sự nảy mầm của lúa” là công trình nghiên cứu của cá nhâ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

-

BÙI THỊ KIM THU

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITOSAN HÒA TAN TRONG

NƯỚC VÀ ỨNG DỤNG ĐỂ KÍCH THÍCH

SỰ NẢY MẦM CỦA LÚA

LUẬN VĂN THẠC SĨ

KHÁNH HÒA - 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG

-

BÙI THỊ KIM THU

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITOSAN HÒA TAN TRONG

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan mọi kết quả của đề tài: “Nghiên cứu sản xuất chitosan hòa

tan trong nước và ứng dụng để kích thích sự nảy mầm của lúa” là công trình nghiên

cứu của cá nhân tôi và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình khoa học nào khác cho đến thời điểm này

Khánh Hòa, Ngày tháng năm

Tác giả luận văn

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này:

Trước hết tôi xin gửi đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban Chủ nhiệm Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường niềm kính trọng, sự tự hào được học tập tại trường trong những năm qua

Sự biết ơn sâu sắc nhất tôi xin được dành cho PGS.Ts Trang Sĩ Trung – hiệu trưởng trường Đại học Nha Trang đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp này

Đặc biệt xin được ghi nhớ và chân thành cảm ơn đến NCS Nguyễn Công Minh

đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ, truyền đạt kinh nghiệm và động viên tôi trong suốt quá trình

Xin được cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy, cô giáo trong Bộ môn Công nghệ Sinh học – Viện Công nghệ Sinh học và Môi trường và Bộ môn Công nghệ Thực Phẩm – Khoa Công nghệ Thực Phẩm – trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi về hóa chất, dụng cụ, thiết bị… cho tôi trong suốt quá trình

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua cũng như thực hiện luận văn này

Xin chân thành cảm ơn!

Khánh Hòa, Ngày tháng năm

Tác giả luận văn

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ vii

TRÍCH YÊU LUẬN VĂN x

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1TỔNG QUAN 3

1.1 Tổng quan về chitosan và chitosan hòa tan trong nước 3

1.1.1.Cấu trúc và tính chất của chitosan 3

1.1.1.1 Cấu trúc của chitosan 3

1.1.1.2 Tính chất của chitosan 3

1.1.1.3 Ứng dụng của chitosan 6

1.1.2.Chitosan hòa tan trong nước 8

1.1.2.1 Muối chitosan 8

1.1.2.2 Chitosan phân tử lượng thấp 10

1.2 Tổng quan về lúa (thóc) và một số chất kích thích sinh trưởng cho cây lúa 13

1.2.1 Lúa gạo 13

1.2.1.1 Hạt lúa 13

1.2.1.2 Sự nảy mầm của hạt lúa 14

1.2.2 Một số chất kích thích sinh trưởng cho cây lúa 17

1.3 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về chitosan hòa tan trong nước và khả năng kích thích nảy sinh trưởng của cây trồng 21

1.3.1.Tình hình nghiên cứu trên thế giới 21

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 25

CHƯƠNG 2VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28

2.1 Vật liệu nghiên cứu 28

2.1.1 Chitosan 28

2.1.2 Lúa giống 28

2.1.3 Hoá chất 28

2.2 Phương pháp nghiên cứu 29

2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 29

2.2.2 Sơ đồ bố trí thí nghiệm quy trình sản xuất muối chitosan bằng phương pháp

rắn 30

2.2.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của loại acid đến khả năng tạo muối chitosan 30

2.2.2.2 Ảnh hưởng của kích thước chitosan đến khả năng tạo muối chitosan 45

2.2.2.3 Xác định ảnh hưởng của tỉ lệ chitosan/acid lactic đến khả năng tạo muối chitosan 46

2.2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm quy trình sản xuất muối chitosan bằng phương pháp sấy phun 34

2.2.3.1 Ảnh hưởng của loại acid đến khả năng tạo muối chitosan 34

2.2.3.2 Ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến khả năng tạo muối chitosan 36

2.2.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy – nhiệt độ tách ẩm đến khả năng tạo muối chitosan 37

2.3 Các phương pháp phân tích 40

2.3.1 Phương pháp phân tích hóa học 40

2.3.2.Phương pháp xác định các chỉ tiêu vật lí của lúa giống 41

2.4 Phương pháp xử lí số liệu 41

CHƯƠNG 3KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 Nghiên cứu quy trình sản xuất muối chitosan hòa tan trong nước 42

3 1 1 Nghiên cứu quy trình sản xuất muối chitosan bằng phương pháp rắn 42

3.1 1.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của loại acid ảnh hưởng đến khả năng tạo muối 42

3.1.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước chitosan nguyên liệu thích hợp 44

3.1.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan/acid lactic đến khả năng tạo muối chitosan 47

3.1.2 Nghiên cứu quy trình sản xuất muối chitosan hòa tan trong nước bằng phương pháp sấy phun 49

3.1.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của loại acid đến khả năng tạo muối chitosan hòa tan trong nước 49

3.1.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chitosan ban đầu đến khả năng tạo muối chitosan hòa tan trong nước 51

3.1.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ sấy – nhiệt độ gió ra của quá trình

sấy đến khả năng tạo muối chitosan hòa tan trong nước 52

3.2 Nghiên cứu chế độ bảo quản muối chitosan 55

3.3 Nghiên cứu khả năng kích thích nảy mầm lúa của muối chitosan 63

3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của muối chitosan sản xuất bằng phương pháp rắn đến khả năng kích thích nảy mầm lúa 63

3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của muối chitosan lactate sấy phun đến khả năng kích thích nảy mầm lúa 76

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 73

KẾT LUẬN 73

KIỀN NGHỊ 73

TÀI LIỆU THAM KHẢO 74 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

HTPC: N-[(2-hydroxy-3-trimethylammonium)propyl] chitosan chloride

N,O-CMC: N,O-carboxy methyl chitosan

O-CMC: O-carboxymethyl chitosan

O-CM-HTPC: Dẫn xuất carboxymethyl HTPC

PGK: Phosphoglycerate kinase

T-L: Đóng gói thường và bảo quản ở nhiệt độ lạnh (8-10 0C)

T-RT: Đóng gói thường và bảo quản ở nhiệt độ phòng

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình1.1 Cấu trúc hóa học của chitosan 3

Hình 1.2 Cấu trúc của chitosan và các đồng phân của chitosan 5

Hình 1.3 Sơ đồ các dẫn xuất đi từ chitin, chitosan 6

Hình 1.4 Công thức cấu tạo của muối chitosan 10

Hình 1.5 Đồ thị biểu diễn mức độ hấp thụ chất béo của chitosan 13

Hình 1.6 Cấu tạo của hạt lúa 14

Hình 1.7 Quá trình nảy mầm và phát triển của cây lúa 15

Hình 1.8 Quá trình biến đổi dẫn đến nảy mầm của hạt lúa 16

Hình 1.9 Cơ chế kéo dài tế bào của các chất kích thích 19

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình bố trí thí nghiệm tổng quát 29

Hình 2.2 Sơ đồ bố trí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của loại acid đến khả năng tạo muối chitosan 31

Hình 2.3 Sơ đồ bố trí nghiệm xác định kích thước của chitosan ban đầu 32

Hình 2.4 Sơ đồ bố trí nghiệm xác định tỉ lệ acid tạo muối chitosan 36

Hình 2.5 Sơ đồ bố trí nghiệm xác định loại acid tạo muối chitosan 35

Hình 2.6 Sơ đồ bố trí nghiệm xác định nồng độ của chitosan trước khi sấy 36

Hình 2.7 Sơ đồ bố trí nghiệm xác định nhiệt độ sấy muối chitosan 37

Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện bảo quản muối chitosan…… 38

Hình 2.9 Sơ đồ bố trí nghiệm xác định nồng độ muối chitosan thích hợp 39

Hình 3.1 Ảnh hưởng của loại acid đến độ tanvà độ nhớt biểu kiến của muối chitosan sản xuất bằng phương pháp rắn 42

Hình 3.2 Muối chitosan được sản xuất bằng phương pháp rắn 43

Hình 3.3 Ảnh hưởng của kích thước chitosan ban đầu đến độ tanvà độ nhớt biểu kiến của muối chitosan 45

Hình 3.4 Ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan/ acid bổ sung vào đến độ tanvà độ nhớt biểu kiến của muối chitosan 47

Hình 3.5 Ảnh hưởng của loại acid đến độ tanvà độ nhớt biểu kiến của muối chitosan 50

Hình 3.6 Muối chitosan được sản xuất bằng phương pháp sấy phun 51

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nồng độ chitosan ban đầu đến độ tan, hiệu suất thu hồi và độ nhớt biểu kiến của muối chitosan 51

Hình 3.8 Ảnh hưởng của loại acid đến độ tan, hiệu suất thu hồi và độ nhớt biểu kiến

của muối chitosan 54

Hình 3.9 Phổ FTIR của chitosan 56

Hình 3.10 Phổ FTIR của muối chitosan sản xuất bằng phương pháp rắn 56

Hình 3.11 Phổ FTIR của muối chitosan sản xuất bằng phương pháp sây phun 57

Hình 3.12 Kết quả phân tích Xray của chitosan và muối chitosan lactate 57

Hình 3.13 Ảnh hưởng chế độ và thời gian bảo quản đến độ ẩm của muối chitosan sản xuất theo phương pháp rắn (A) và phương pháp sấy phun (B) 58

Hình 3.14 Ảnh hưởng chế độ và thời gian bảo quản đến độ tan của muối chitosan sản xuất theo phương pháp rắn (A) và phương pháp sấy phun (B) 59

Hình 3.15 Ảnh hưởng chế độ và thời gian bảo quản đến độ nhớt của muối chitosan sản xuất theo phương pháp rắn (A) và phương pháp sấy phun (B) 60

Hình 3.16 Mẫu muối chitosan sản xuất theo phương pháp rắn ở các chế độ và thời gian bảo quản khác nhau 61

Hình 3.17 Mẫu muối chitosan sản xuất theo phương pháp sấy phun ở các chế độ và thời gian bảo quản khác nhau 62

Hình 3.18 Ảnh hưởng của nồng độ muối chitosan sản xuất theo phương pháp rắn đến khả năng nảy mầm và tỷ lệ nảy mầm của cây mạ 63

Hình3.19 Ảnh hưởng của nồng độ chitosan lactate sản xuất theo phương pháp rắnđến chiều dài thân và chiều dài rễ của cây mạ 65

Hình 3.20 Ảnh hưởng của nồng độ muối chitosan sản xuất theo phương pháp rắn đến hàm lượng ẩm của cây mạ 66

Hình 3.21 Ảnh hưởng của nồng độ muối chitosan sản xuất theo phương pháp rắn đến hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b và carotene của cây mạ 67

Hình 3.22 Các mẫu lúa được kích thích bằng muối chitosan lactate sản xuất theo phương pháp rắn 68

Hình 3.23 Ảnh hưởng của nồng độ muối chitosan sản xuất theo phương pháp sấy phun đến khả năng nảy mầm và tỷ lệ nảy mầm của cây mạ 69

Hình 3.24 Ảnh hưởng của nồng độ muối chitosan sản xuất theo phương pháp sấy phunđến chiều dài thân và chiều dài rễ của cây mạ 70

Hình3.25 Ảnh hưởng của nồng độ muối chitosan sản xuất theo phương pháp sấy phun đến hàm lượng ẩm của cây mạ 71

Hình 3.26 Ảnh hưởng của nồng độ muối chitosan sản xuất theo phương pháp sấy phun đến hàm lượng chlorophyll a, chlorophyll b và carotene của cây mạ 71

Hình 3.27 Các mẫu lúa được kích thích bằng muối chitosan lactate 72

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Tính chất của một số loại chitosan thương mại 4

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của hệ dung môi sử dụng đến ứng suất kéo, độ giãn dài giới hạn, độ trương nở của màng chitosan với độ deacetyl khác nhau 5

Bàng 1.3 Các thông số hóa lý của vi hạt chitosan 9

Bảng 1.4 Chế độ cắt mạch và độ nhớt của các sản phẩm chitosan 11

Bảng 3.1 pH của muối chitosan sản xuất bằng phương pháp rắn 44

Bảng 3.2 Trạng thái của muối chitosan lactate với kích thước chitosan ban đầu khác nhau sản xuất bằng phương pháp rắn 46

Bảng 3.3 Trạng thái của muối chitosan lactate với tỷ lệ chitosan/acid khác nhau sản xuất bằng phương pháp rắn 48

Bảng 3.4 Độ ẩm của các mẫu muối chitosan được sấy ở các thông số nhiệt độ khác nhau 53

Bảng 3.5 Phân tích phổ hồng ngoại của chitosan và mối chitosan lactate sản xuất bằng phương pháp rắn và sấy phun 55

TRÍCH YẾU LUẬN VĂN

Chitosan (CTS) là một polymer sinh học có nhiều ứng dụng trong công nghiệp, nông nghiệp, thực phẩm, mỹ phẩm, y tế… Chitosan tan tốt trong môi trường acid và không tan nước và môi trường kiềm do vậy đã làm hạn chế khả năng ứng dụng của chitosan khi áp dụng quy mô lớn Chitosan hòa tan trong nước có tính tiện dụng hơn rất nhiều, chitosan hòa tan trong nước tồn tại hai dạng là muối chitosan và chitosan phân tử lượng thấp (COS) COS đã được nhiều nhà nghiên cứu trong nước và ngoài nước quan tâm, tuy nhiên ở Việt Nam thì chưa nhiều công bố nghiên cứu về muối chitosan do đó nghiên cứu sản xuất muối chitosan là cần thiết

Mục tiêu của để tài là tìm điều kiện sản xuất muối chitosan hòa tan trong nước

có độ tan tốt nhất và ứng dụng sản phẩm muối để bước đầu nghiên cứu khả năng kích thích nảy mầm lúa của muối chitosan đồng thời đề tài nghiên cứu sự biến đổi của muối chitosan theo thời gian Để đáp ứng mục tiêu trên, đề tài tiến hành thử nghiệm khả năng sản xuất muối chitosan bằng phương pháp rắn và phương pháp sấy phun, muối chitosan sau khi sản xuất được tiến hành bảo quản ở các chế độ khác nhau trong thời gian 3 tháng nhằm tìm điều kiện bảo quản tốt nhất đồng thời muối chitosan được thử nghiệm khả năng kích thích nảy mầm lúa

Kết quả nghiên cứu bước đầu cho thấy, muối chitosan có thể được sản xuất bằng phương pháp rắn và phương pháp sấy phun Muối chitosan có độ tan tốt, màu sắc đẹp, dạng bột và có khả năng bảo quản trong thời gian 3 tháng ở điều kiện lạnh-hút chân không Các kết quả thử nghiệm khả năng kích thích nảy mầm lúa của muối chitosan cho thấy mầm lúa sau khi được kích thích bằng muối chitosan có khả năng nảy mầm tốt, tỷ lệ nảy mầm cao, độ dài rễ, thân cao hơn so với mẫu không kích thích

Từ khóa: chitosan hòa tan trong nước, muối chitosan, sấy phun, phương pháp rắn, lúa

MỞ ĐẦU

Chitosan là một polysacarit mạch thẳng được cấu tạo bởi các hợp phần glucosanmin và N-acetylglucosamin thông qua liên kết β-glucozit-1,4 Chúng được tách chiết từ vỏ động vật giáp xác, là một trong những polymer sinh học phổ biến trên thế giới chỉ sau xenluloz Chitosan có nhiều tính chất sinh học quý báu như kháng khuẩn, kháng nấm, khả năng tự phân hủy sinh học, không gây độc, kích thích sinh trưởng thực vật… Vì vậy chitosan được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như thực phẩm, mỹ phẩm, nông nghiệp, y học, dược học…

Ngày nay, muối chitosan là một trong những dẫn xuất được sử dụng thường xuyên để sản xuất thuốc Một số muối chitosan như glutamate, aspartate, hydrochloride và acetate đã được sử dụng để sản xuất các loại thuốc trị đại tràng và tăng cường việc cung cấp các peptide để chữa bệnh qua biểu mô ruột (Orienti và cộng sự,2002) Một số tác giả cho thấy acid ascorbic hỗ trợ chitosan trong quá trình bao bọc chất béo thông qua quá trình nhũ hóa trung gian của acid ascorbic (Tsujikawa và cộng sự, 2003) Theo Senel và cộng sự (2000) đã chứng minh cho thấy chitosan hòa tan trong dung dịch acid loãng có thể làm tăng khả năng hấp thụ peptid trên niêm mạc miệng lợn Ngoài ra, một bằng chứng khác là với nồng độ 40ppm oligoglicosamin làm tăng cường lượng diệp lục trong lá và lượng nốt sần chứa nito, năng suất cây lạc tăng

từ 19,34% đến 40,65% (Lehduwi và cộng sự, 1997; Chandkrachang, 2002)

Các đặc tính của chitosan phụ thuộc nhiều vào dung môi hòa tan Thông thường chitosan hòa tan tốt trong môi trường acid yếu như acid acetic, acid lactic, acid focmic Hạn chế lớn nhất của chitosan là không tan trong nước và dung môi hữu cơ Đã có nhiều công trình công bố đưa ra các giải pháp khác nhau như bẻ ngắn mạch chitosan, thực hiện các phản ứng chuyển hóa… nhằm chuyển chitosan sang dạng dễ tan trong nước Tuy nhiên tùy theo mục đích của sản phẩm sử dụng mà sử dụng các quy trình công nghệ thích hợp

Lúa đã được trồng lâu đời ở Việt Nam nhưng làm sao để nâng cao năng suất, rút ngắn thời gian nuôi trồng mà không gây ô nhiễm môi trường bằng các hóa chất hóa học thì vẫn còn là câu hỏi khó

Xuất phát từ những lý do trên tôi quyết định thực hiện đề tài “Nghiên cứu sản

xuất chitosan hòa tan trong nước và ứng dụng để kích thích sự nảy mầm của lúa”

do PGS.TS Trang Sĩ Trung hướng dẫn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN1.1 Tổng quan về chitosan và chitosan hòa tan trong nước

1.1.1 Cấu trúc và tính chất của chitosan

1.1.1.1 Cấu trúc của chitosan

Chitosan là một dẫn xuất của chitin được hình thành khi tách nhóm acetyl (quá trình deacetyl hoá chitin) khỏi chitin nên chitosan chứa rất nhiều nhóm amino Chitosan được phát hiện lần đầu tiên bởi Rouget vào năm 1859

Chitosan là một polysacarit mạch thẳng được cấu tạo bởi các hợp phần

glucosanmin và N-acetylglucosamin thông qua liên kết β-glucozit-1,4 Chúng được tách chiết từ vỏ động vật giáp xác, là một trong những polymer sinh học phổ biến trên thế giới chỉ sau xenluloz

Hình1.1 Cấu trúc hóa học của chitosan (Trang Sĩ Trung, 2010)

Tên hóa học của chitosan là: Poly-β-(1,4)-D-glucosamin, hay còn gọi là poly-

β -(1,4)-2-amino-2-deoxy-D-glucose

Công thức phân tử: (C6H11O4N)n

Phân tử lượng: Mchitosan= (161,07)n

1.1.1.2 Tính chất của chitosan

- Chitosan là một chất rắn, xốp, nhẹ, ở dạng vảy có màu đục

- Chitosan có tính kiềm nhẹ, không hoà tan trong nước, trong dung dịch kiềm Nhưng hoà tan trong dung dịch acid loãng, tạo thành dung dịch keo dương Nhờ đó, keo chitosan không bị kết tủa khi có mặt của một số ion kim loại nặng như: Pb3+,

Hg+,…

- Chitosan là một polymer mang điện tích dương nên được xem là một polycationic (pH < 6,5), có khả năng bám dính trên bề mặt có điện tích âm như protein, alginate, acid béo và phospholipid nhờ sự có mặt của nhóm amino (- NH2)

- Dung dịch chitosan có tính kháng nấm, kháng khuẩn cao (Trang Sĩ Trung, 2010) cơ chế chính xác của hoạt động kháng khuẩn của chitosan còn chưa biết rõ, nhưng đã có một số cơ chế được đề xuất Do sự tương tác giữa các phân tử chitosan mang điện tích dương và màng tế bào mang điện tích âm dẫn đến biến tính màng tế bào và rò rỉ các thành phần trong tế bào Chitosan thâm nhập vào nhân tế bào liên kết với DNA ức chế tổng hợp mRNA và protein

- Chitosan có tính chất cơ học tốt, không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân huỷ sinh học, có tính hoà hợp sinh học cao với cơ thể (Nguyễn Trọng Bách, 2004; Trang Sĩ Trung, 2010)

Những đặc tính quý giá trên đã nâng cao khả năng ứng dụng của chitosan trong sinh học, y học, công nghệ thực phẩm

Trên thị trường hiện nay có rất nhiều loại chitosan với tính chất và chất lượng rất khác nhau, thể hiện rất rõ ở hàm lượng protein, tro, độ deacetyl và độ nhớt (Bảng 1.1) Do đó, các tính chất công nghệ cũng rất khác nhau (Bảng 1.2)

Bảng 1.1 Tính chất của một số loại chitosan thương mại (Trang Sĩ Trung,

Mật độ khối (g/ml)

Ðộ nhớt (cps)

Bảng 1.2 Ảnh hưởng của hệ dung môi sử dụng đến ứng suất kéo, độ giãn dài giới hạn, độ trương nở của màng chitosan với độ deacetyl khác nhau (Trang Sĩ

Trung, 2009)

Dung môi

Ứng suất kéo (N/mm3)

Ðộ giãn dài giới hạn

(%)

Ðộ trương nở (%) Chitosan

độ deacetyl thấp

Chitosan

độ deacetyl

cao

Chitosan

độ deacetyl

thấp

Chitosan

độ deacetyl

cao

Chitosan

độ deacetyl

thấp

Chitosan

độ deacetyl cao

Acid formic 18,64 35,35 0,95 1,95 403,90 69,81 Acid acetic 27,91 40,53 0,84 1,70 359,00 65,69 Acid

glycolic 18,78 35,71 0,88 2,50 450,39 97,35 Acid citric 24,80 36,55 1,85 3,50 437,24 7,54

Những biến đổi hóa học được dùng để cải thiện khả năng hòa tan của chitosan ở

pH trung tính và kiềm Chitosan có ba nhóm hoạt tính: nhóm chính hydroxyl tại C-6, một nhóm hydroxyl ở C-3 trên mỗi đơn vị lặp đi lặp lại và một nhóm amin ở C-2 trên mỗi đơn vị đã được deacetyl Hình 1.2 là bốn loại dẫn xuất chitosan hòa tan trong nước

Hình 1.2 Cấu trúc của chitosan và các đồng phân của chitosan: (R,R’=H); CMC (R=CH 2 COOH,R’=H); N,O-CMC (R, R’ =CH 2 COOH); HTPC (R=H, R’=CH 2 CH(OH)CH 2 N +( CH 3 ) 3 Cl - ); O-CM-HTPC (R=CH 2 COOH,

0-R’=CH 2 CH(OH)CH 2 N + (CH 3 ) 3 Cl -) (Tungtong và cộng sự, 2012)

Hình 1.3 Sơ đồ các dẫn xuất đi từ chitin, chitosan (Nutraceutical, 2009)

Một số dẫn xuất nữa của chitosan được thể hiện ở hình 1.3 Ta thấy có thể tạo nhiều dẫn xuất chitosan bằng các phản ứng hóa học khác nhau Tạo ra các đồng phân

có tính chất khác nhau và có tính hòa tan cao hơn đáng kể so với chitosan gốc Ví dụ: Chitosan sulfation anticoagulant; Chitosan O-acylation emulsifier; Chitosan -O-IN-carboxy alkylation moisture retainer (sản phẩm chăm sóc da) (B Nutraceutical, 2009)

Quá trình phân hủy hoặc thủy phân chitin/chitosan tạo ra được chitosan có khối lượng phân tử thấp gọi là chitooligosacarit cũng có khả năng hòa tan trong nước ở dải

pH rộng (pH = 5÷8)

1.1.1.3 Ứng dụng của chitosan

Khả năng ứng dụng của chitosan theo nhiều hướng khác nhau, chẳng hạn như trong thực phẩm và dinh dưỡng, công nghệ sinh học, khoa học vật liệu, thuốc và dược phẩm, nông nghiệp và bảo vệ môi trường, gần đây được sử dụng rất tốt trong liệu pháp gen Mạng lưới ion điện tích dương cũng như sự hiện diện của nhiều nhóm chức năng

làm cho phân tử chitosan là phân tử sinh học được chào đón Ý nghĩa đối với y sinh học và điều trị của các dẫn xuất chitin/chitosan là một chủ đề quan tâm đáng kể của nhiều người trên khắp thế giới Tính kháng khẩn, tính chống oxy hóa, tính tạo kết cấu, tạo màng làm cho chitosan là một phụ gia phổ biến được ứng dụng trong phát triển sản phẩm thực phẩm và bảo quản khác nhau Chitosan là một polycation nên được dùng trong lọc nước, nước trái cây, sữa, cố định enzyme… Đối với khả năng tạo màng chitosan được sử dụng như một thành phần các hợp chất dinh dưỡng và thành phầm trong dược phẩm bao gồm cả chất chống ung thư (Nutraceutical, 2009) Các ứng dụng của chitosan phụ thuộc vào mức độ polymer hóa và mức độ deacetyl xảy ra

Hoạt động kháng khuẩn của chitosan đối với một số vi sinh vật bao gồm cả

Aeromonas hydrophila, Bacillus cereus, B.licheniformis, B subtilis, Clostridium perfringens, Brochothrix spp., Lactobacillus spp., Listeria monocytogenes, Pseudomonas spp., Salmonella typhimurium, S enteritidis, Serratia liquifaciens, và

bao gồm cả nấm men (Candida spp và Saccharomyces spp.) và nấm mốc (Aspergillus

spp, Penicillium spp, Rhizopus spp.) trong một loạt các loại thực phẩm đã được tổng

hợp Tính nhạy cảm của vi sinh vật phụ thuộc vào loại và nồng độ chitosan (Nutraceutical, 2009)

Các hoạt động chống oxy hóa có thể là do chitosan có khả năng nắm giữ các kim loại và liên kết với lipid

Màng được làm từ chitosan có độ thấm khí oxy thấp do đó có thể làm các màng cản khí tốt Những màng này sử dụng trên các loại thực phẩm bao gồm các loại trái cây, rau quả, kéo dài thời gian bảo quản của chúng bằng cách chống khí và độ ẩm và còn có khả năng kháng khuẩn của màng chitosan Với khả năng chống oxy hóa, kháng khuẩn và đặc tính thấm của màng, chitosan có thể được sử dụng để tạo lớp màng phủ cho các sản phẩm thực phẩm

Nhiều nhà nghiên cứu xác định, chitosan và oligomer có hiệu quả trong việc làm giảm thấp mức độ lipoprotein (LDL) cholesterol trong gan và máu Chitosan giúp giảm sự hấp thụ chất béo bằng cách giữ chất béo trung tính như cholesterol và sterol khác, bằng tương tác kỵ nước Vì hoạt động ức chế này hấp thụ chất béo, gom những phân tử đóng vai trò như chất béo trong đường tiêu hóa, và loại bỏ chất béo, cholesterol thông qua bài tiết Bên cạnh chitosan, oligomer chitosan có khối lượng

phân tử trung bình 10.000 Da có thể tăng cường đáng kể quá trình bài tiết steroid trung tính từ phân Nó cũng có thể tăng cường hoạt động lysozyme trong máu và các mô Các polysaccharide cũng thuận lợi cho quá trình chuyển hóa đường lactose Oligosaccharide chitosan hoạt động như một chất kích thích tăng trưởng có chọn lọc

của lactobacilli và bifidobacteria (Nutraceutical, 2009)

Các ứng dụng trong y tế của chitosan bao gồm đa dạng nhiều lĩnh vực bao gồm việc sử dụng như màng lọc máu, da nhân tạo, vật liệu mang thuốc và cũng là một chất cầm máu

Trong công nghệ sinh học, chitosan sử dụng như một mạng lưới để cố định các enzyme và các tế bào vi khuẩn

Chitosan là một bazo yếu với pKa = 6,2 - 7 (Kerch và cộng sự, 2010) nên không tan ở pH trung tính và kiềm Chitosan tan ở trong nước ở pH thấp hơn 6,5, tại

đó nhóm amin của chitosan được ion hóa Nói chung là chitosan tan trong các dung dịch có tính acid như acid acetic, acid lactic và acid clohydric loãng (Cardile và cộng

sự, 2008) do đó gây khó khăn khi ứng dụng và khi áp dụng quy mô lớn Chitosan hòa tan trong nước có tính tiện dụng cao tuy nhiên các đặc tính cơ bản của chitosan hòa tan trong nước phụ thuộc nhiều vào các điều kiện xử lý và bảo quản

1.1.2 Chitosan hòa tan trong nước

Độ hòa tan là một đặc điểm rất quan trọng đối với chitosan Cải thiện hòa tan có thể tạo điều kiện cho các ứng dụng của chitosan trong y học và thực phẩm Trọng lượng phân tử cao thì khả năng hòa tan trong nước thấp, do đó có thể cải thiện khả năng hòa tan trong nước bằng cách giảm trọng lượng phân tử (Du và cộng sự, 2009) hoặc tạo muối chitosan cũng là một phương pháp để cải thiện độ hòa tan trong nước của chitosan

chitosan có thể proton (NH3+OCOR-) của các axit nói trên, và các polysaccharide tan trong nước kết quả được tích điện dương

Tác giả Janusz Adamiec (2005) đã sản xuất thành công muối chitosan bằng phương pháp sấy phun sau khi pha chitosan có độ deacetyl 71%, Mw = 500 kDa trong dung dịch acid ascobic (1,7% w/w) và acid acetic (0,6% w/w) Nồng độ dung dịch chitosan là 1,7% (w/w).Thêm mẫu bổ sung 0,02 g Glutaraldehyde/g chitosan hoặc 0,5g triphotphate/g chitosan vào dung dịch muối chitosan Sau đó tiến hành sấy phun và thu được kết quả như sau:

Bảng 1.3 Các thông số hóa lý của vi hạt chitosan (Adamiec và Modrzejewska

2005)

Mẫu Ðộ ẩm (%) Mật độ (g/cm3) Ðường kính

(µm)

Cầu thể (dmin/dmax) Chitosan acetate 10,18 1,1460 3 - 16 0,8 - 0,9 Chitosan ascorbate 3,37 1,4332 2 - 4 0,9

Mirna Fernández Cervera và cộng sự (2011) cũng đã sản xuất thành công muối chitosan bằng phương pháp sấy phun như sau: Chitosan được hòa tan trong các dung dịch acid lactic, acid citric và acid acetic để tạo dung dịch chitosan 4% Các mẫu được

để trong 24 giờ cho tan hoàn toàn Tỷ lệ chitosan/acid hữu cơ là 1/24 Sau đó đem sấy phun bằng máy sấy phun Buchi B -191 của Thụy Sỹ Với kích thước vòi phun 0,7 mm Tốc độ dòng sấy phun 558 ml/h Tốc độ luồng khí nén là 600 l/h, tốc độ không khí 60

m3/h và áp suất không khí là 42mbar Thu được độ nhớt của muối acetate (273.6 mPas) > muối chitosan lactate (249.0 mPas) > muối chitosan citric (220.9 mPas) Muối chitosan acetate có độ ẩm cao hơn muối chitosan lactate và muối chitosan citrate (Cervera và cộng sự, 2011)

Cơ chế: Chitosan là một bazơ, dễ tạo muối với các acid, hình thành những chất điện ly cao phân tử có tính tan phụ thuộc vào bản chất của các anion có liên quan

Chitosan và acid liên kết với nhau bằng liên kết tĩnh điện thay vì liên kết cộng hóa trị Ở vị trí C2 của chitosan, acid sẽ liên kết vào để hình thành phân tử mang điện

- Phương pháp hóa học : Dùng tác nhân hóa học để thủy phân

Có nhiều tác nhân hóa học đã được nghiên cứu và ứng dụng để thủy phân chitosan để thu chitosan PTLT hoặc COS: acid acetic, acid sulfuric, acid phosphotungtic và acid hydrofluoric (Anayancy Osorio và cộng sự, 2010; Emmanuel Belamie và Alain Domard, 1997)

Ngoài ra, các tác giả Allan, Chang, Tanioka đã sản xuất thành công chitosan có trọng lượng phân tử thấp bằng việc cắt mạch chitosan trạng thái lỏng (sau khi đã phaloãng trong môi trường acid) bởi các tác nhân oxy hóa như ozone, natri nitrite và hydroperoxit (H2O2) (Allan và cộng sự, 1995) Tuy nhiên, phương pháp này vẫn chưa khắc phục được những nhược điểm lớn nhất của phương pháp hóa học là có nguy cơ gây ô nhiễm môi trường và quá trình tinh chế sản phẩm còn gặp nhiều khó khăn Vì vậy, acid HCl đã được nghiên cứu để thuỷ phân chitosan trạng thái rắn với mong muốn tì ra phương pháp mới với nhiều ưu điểm như giảm chi phí, giảm nguy cơ gây ô nhiễm môi trường và dễ thực hiện Nghiên cứu đã thành công với 80% chitosan được chuyển thành glucosamin Tuy nhiên, phương pháp này rất khó để thương mại hóa sản

phẩm vì việc xử lý nước thải gặp nhiều khó khăn và sản phẩm chủ yếu không phải là chito-olysaccharide (Anayancy Osoriovà cộng sự, 2010)

Đáng kể nhất là các công trình của GS.Trần Thị Luyến và các cộng sự, 2006 đã nghiên cứu sản xuất COS bằng HCl Sản phẩm thu được có màu sắc trắng, đẹp và chất lượng tốt

Đỗ Thị Liền (2008), đã nghiên cứu cắt mạch chitosan trong dung dịch acid acetic bằng hydroperoxit (H2O2) (Đỗ Thị Liền, 2008) Tác giả Đỗ Thị Liền đã sản xuất thử nghiệm thành công 9 sản phẩm chitosan ngắn mạch Bảng 1.4 là loại chitosan, các chế độ cắt mạch và độ nhớt của sản phẩm chitosan ngắn mạch, do tác giả Liền chế tạo được

Nhiệt

độ (0C)

Thời gian (giờ)

Nồng

độ

H202(%)

Nhiệt

độ (0C)

Thời gian (giờ)

Nồng

độ

H202(%)

Nhiệt

độ (0C)

Thời gian (giờ)

100 1,40 40 1,9 1,35 35 1,69 0,05 30 1,0

10 1,65 65 3,4 1,60 60 3,04 1,62 60 2,9

5 1,7 70 3,7 1,65 65 3,31 1,68 65 3,1 Phương pháp hóa học thường cho hiệu quả cắt mạch cao Tuy nhiên, các nhà khoa học lo ngại về hoạt tính sinh học của sản phẩm thủy phân tạo thành (hoạt tính kháng khuẩn, chống oxi hóa, khả năng hấp thụ chất béo) không cao và có nguy cơ gây

ô nhiễm môi trường Do đó cần phải tìm ra một phương pháp hóa học hoàn hảo hơn có thể khắc phục được hai nhược điểm trên

- Phương pháp sinh học: thủy phân chitosan bằng enzyme: chitinase, chitosanase, β-glycosidase, cellulase, lysozyme

Có hơn 30 loại enzyme có thể được sử dụng để cắt mạch chitosan: Chitosanase, cellulase thu được từ các VSV khác nhau (vi khuẩn, nấm mốc), papain chiết tách từ đu đủ Phương pháp cắt mạch bằng enzyme có hiệu quả cắt mạch tốt và không gây ô nhiễm môi trường Tuy vậy, phương pháp này vẫn còn những hạn chế khi sản xuất ở

quy mô lớn như: Chi phí sản xuất cao do công đoạn tinh sạch sản phẩm khó khăn, qui trình sản xuất phức tạp, tính đặc hiệu của enzyme cao nên có những enzyme chỉ cắt liên kết giữa các đơn vị có chứa nhóm acetyl, hoặc chỉ cắt liên kết giữa các đơn vị đã

bị khử nhóm acetyl nên hiệu quả thủy phân chưa cao

Năm 2006, GS.Trần Thị Luyến đã nghiên cứu sản xuất COS có nguồn gốc từ chitin, chitosan bằng enzyme papain, hemicellulose, enzyme cellulase từ xạ khuẩn Theo tác giả Trần Thị Luyến khi dùng enzyme papain chiết rút từ đu đủ xanh, kết quả thu được 95% COS từ chitosan Khi dùng enzyme thương phẩm thì thu được 97% COS Khi dùng enzyme hemicellulose thương phẩm, kết quả thu được 88,9% COS từ chitosan và 86,7% COS từ chitin Khi dùng enzyme cellulase từ xạ khuẩn sẽ thu được 52,6% COS từ chitosan và 45,6% COS từ chitin

- Phương pháp vật lý

Wasikiewicz và cộng sự, 2004 đã dùng tia gamma, tia UV và sóng siêu âm để thủy phân chitosan Kết quả thu được COS có phân tử lượng khá thấp (> 25kDa) Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là chitosan phải hòa tan trong môi trường acid trước khi thủy phân với nồng độ thấp (0,1 – 1)% và thời gian thủy phân dài, nên

đã gây khó khăn cho quá trình sản xuất ở qui mô công nghiệp (Jaroslaw và cộng sự, 2005)

Czechowska-Biskup và cộng sự (2005) đã thử nghiệm với phương pháp vật lý

để thủy phân chitosan thu được COS đồng thời thử nghiệm khả năng kết hợp giữa COS và chất béo với mục đích ứng dụng COS trong dược phẩm hoặc thực phẩm chức năng để làm giảm khả năng hấp thụ chất béo của con người (với 1g chitosan có thể hấp thu 8 – 20g chất béo) Hình 1.5

Hình 1.5 Đồ thị biểu diễn mức độ hấp thụ chất béo của chitosan

(Czechowska và cộng sự, 2005)

Có những phương pháp chiếu xạ sau:

 Chiếu xạ ở trạng thái khô: dùng tia gamma phát ra từ nguồn 60Co với liều lượng là 0.56 Gy s-

 Chiếu xạ trong dung dịch: dùng tia gamma phát ra từ nguồn 60Co với liều lượng là 0.023 Gy s-

 Siêu âm trong dung dịch Phương pháp này cũng dễ dàng thu được chitosan phân tử lượng thấp phụ thuộc vào tần số của sóng siêu âm sử dụng

Nguyễn Ngọc Duy (2011) đã kết hợp phương pháp vật lý và hóa học khi cho thủy phân chitosan bằng tia gamma trong môi trường có bổ sung H2O2và thu được olygochitosan có khối lượng phân tử thấp (5 – 10kDa) (Nguyễn Ngọc Duy, 2011)

1.2 Tổng quan về lúa (thóc) và một số chất kích thích sinh trưởng cho cây lúa 1.2.1 Lúa gạo

Loài (Species): Oryza sativa

Oryza glaberrima

Cấu tạo hạt lúa gồm có: phần vỏ lúa và hạt gạo

Vỏ lúa gồm 2 vỏ trấu ghép lại (trấu lớn và trấu nhỏ) Phần vỏ chiếm khoảng 20% trọng lượng hạt lúa

Hạt lúa gồm 2 phần: Phần phôi hay mầm (embryo): nằm ở góc dưới hạt gạo, chỗ đính vào đế hoa, ở về phía trấu lớn Phôi nhũ (hạt gạo): chiếm phần lớn hạt lúa, chứa chất dự trữ, chủ yếu là tinh bột (phần gạo chúng ta ăn hàng ngày) Bên ngoài hạt gạo được bao bọc bởi một lớp vỏ lụa mỏng (cám) chứa nhiều vitamin, nhất là vitamin nhóm B Khi xay xát (giai đoạn chà trắng) lớp nầy tróc ra thành cám mịn

Hình 1.6 Cấu tạo của hạt lúa 1.2.1.2 Sự nảy mầm của hạt lúa

Giống cây nói chung và hạt giống nói riêng là một điều kiện không thể thiếu trong trồng trọt vì vậy mà người nông dân rất quan tâm đến chất lượng của hạt giống Nhưng nếu một hạt giống tốt mà không có khả năng nảy mầm và khả năng nảy mầm thấp thì hiệu quả kinh tế thấp Vì vậy sự nảy mầm của hạt là một tiêu chuẩn quan trọng

để đánh giá chất lượng hiệu quả kinh tế mà cây trồng đem lại

Hình 1.7 Quá trình nảy mầm và phát triển của cây lúa (irri photos, 2014)

Cơ sở lý thuyết của sự nảy mầm hạt lúa:

Sự nảy mầm của hạt là giai đoạn bắt đầu của một chu kì sống mới Sự nảy mầm của hạt là một quá trình biến đổi hết sức sâu sắc về sinh hoá và sinh lý trong chúng Khi trong hạt hàm lượng Abxixic ( ABA) giảm xuống mức tối thiểu và quá trình tổng hợp Gibberellin (GA) mạnh lên thì phôi hạt bắt đầu sinh trưởng

Các giai đoạn nảy chính của quá trình nảy mầm

Giai đoạn 1: Giai đoạn hấp thu nước: hạt hấp thu nước và tăng lên về kích thước

Giai đoạn 2: Giai đoạn nảy mầm: Hình thành và hoạt hóa enzyme do trong phôi

và nội nhũ của hạt ở trạng thái ngủ, enzyme thường ở dạng không hoạt tính và bị liên kết Có sự phân giải các chất dự trữ như sau:

Giai đoạn 3: Giai đoạn tăng trưởng của cây mầm: Hạt thu thêm nước và tăng cường độ hô hấp Hoạt tính biến dưỡng của cây mầm tăng mạnh, hoạt tính biến dưỡng của mô dự trữ giảm mạnh

Qúa trình biến đổi dẫn đến nảy mầm của hạt cây họ lúa được mô tả như sau: Khi hạt hút ẩm thì trong phôi hạt xảy ra mạnh mẽ quá trình tổng hợp GA làm hàm lượng GA tăng nhanh trong phôi hạt GA sẽ khuếch tán vào lớp aleuron của hạt, tại đấy GA hoạt hoá sự tổng hợp các enzyme amilaza và các enzyme thuỷ phân khác như protease, photphatase và làm tăng hoạt tính của các enzyme này, vì vậy mà xúc tiến quá trình phân hủy tinh bột thành đường cũng như phân hủy các polime thành monome khác, tạo điều kiện về nguyên liệu và năng lượng cho quá trình nảy mầm (Koning, 1994)

Hình 1.8 Quá trình biến đổi dẫn đến nảy mầm của hạt lúa (Koning, 1994)

Cơ sở lý thuyết của quá trình kích thích nảy mầm lúa bằng muối chitosan:

Cơ chế kích thích nảy mầm hạt lúa của muối của chitosan còn chưa biết rõ, tuy nhiên muối chitosan khi hòa tan trong nước có tính chất tương tự như chitosan hòa tan trong acid đó Do đó cơ chế kích thích nảy mầm của muối chitosan có thể là:

Lipid

Glycerol

- Chitosan có hoạt tính làm mềm vách tế bào như vậy có thể tạo điều kiện cho nước dễ di chuyển vào trong hạt, dẫn tới sự khả năng nảy mầm tốt hơn, độ ẩm của cây

mạ cao hơn (ngoài lí do bộ rễ)

- Chitosan là chất kích thích tăng trưởng của tế bào nên giúp cho cây mạ có ưu thế về kích thước

- Chitosan là một chất kích thích nên khi có mặt của chitosan nó kích hoạt mạnh

mẽ một số enzyme đặc trưng như proteinase, 65 b-1,3-glucanases (Walker Simmons

và cộng sự, 1984) Các enzyme thủy phân này được khuếch tán vào nội nhũ để thủy phân các polymer thành các monomer và sinh năng lượng phục vụ cho quá trình nảy mầm

1.2.2 Một số chất kích thích sinh trưởng cho cây lúa

Chất điều hòa sinh trưởng thực vật (còn gọi là các hocmon sinh trưởng) là những chất được sinh ra trong cây để điều khiển các quá trình sinh trưởng phát triển của cây Trong suốt đời sống, cây phải trải qua nhiều giai đoạn phát triển như nảy mầm, lớn lên, ra hoa, kết quả Các chất điều hòa sinh trưởng giúp cây tiến hành các giai đoạn này một cách cân đối hài hòa theo đặc tính và quy luật phát triển của cây với liều lượng rất thấp Mỗi giai đoạn được điều khiển bởi một nhóm chất nhất định Ở thời kỳ sinh trưởng lớn lên có nhóm chất kích thích sinh trưởng Đến mức độ nhất định cây tạm ngừng sinh trưởng để chuyển sang thời kỳ phát triển ra hoa, kết quả thì có nhóm chất ức chế sinh trưởng được hình thành

Nhóm chất kích thích sinh trưởng có các chất Auxin, Gibberellin (GA) và Cytokinin

Nhóm chất ức chế sinh trưởng có acid Absicic, Ethylen và các hợp chất Phenol Ngày nay, các chất điều hòa sinh trưởng thực vật tổng hợp được ứng dụng trong nông nghiệp ngày càng phổ biến với rất nhiều mục đích Có thể nêu lên một số mục đích chính thường được ứng dụng như sau:

Kích thích hạt giống nẩy mầm nhanh và đều: thường dùng các chất Auxin và

GA

Kích thích ra rễ cho cành chiết, cành giâm: Chất có hiệu quả cao là Auxin

Kích thích nhanh sự sinh trưởng của cây: Với những cây trồng cần tăng chiều cao như mía, các cây lấy sợi (như đay, gai) thì sử dụng chất GA Đối với lúa, rau, màu, hoa, cây ăn quả và cây công nghiệp lâu năm có thể dùng Auxin, GA hoặc Cytokinin

Kích thích ra hoa: Với nhiều loại cây ăn quả như dứa, nhãn, xoài … muốn ra hoa sớm và tập trung thường dùng các chất điều hòa sinh trưởng Tùy theo loại cây, có thể dùng nhiều chất như Auxin, GA hoặc Ethylen, Paclobutrazol Với mỗi loại cây và mỗi loại chất có cách dùng cụ thể riêng

Hạn chế rụng hoa, rụng quả: Thường dùng các chất Auxin và GA

Làm quả mau chín và chín đồng loạt: Chất thường dùng là Ethylen, có thể áp dụng cho các cây ăn quả như xoài, chuối, dứa, sapô, cà chua, ớt Phun thuốc khi quả đã già hoặc có một vài quả bắt đầu chín Ngược lại, muốn cho quả chậm chín để kéo dài thời gian thu hoạch có thể dùng chất GA Với hoa, muốn tươi lâu có thể dùng chất Cytokinin

Kích thích tiết nhựa của các cây có mủ: Trong ngành cao su thường dùng thuốc Ethylen bôi lên miệng cạo để kích thích ra mủ, tăng sản lượng mủ

Điều khiển sự phát sinh rễ và chồi trong kỹ thuật nuôi cấy mô: Trong môi trường nuôi cấy thường phải cho một tỷ lệ thích hợp giữa Auxin và Cytokinin để tạo thành một cây hoàn chỉnh, cân đối đủ cả rễ, thân và lá Trong đó, Auxin kích thích ra

rễ, còn Cytokinin kích thích ra chồi

Ngoài ra, còn được ứng dụng với nhiều mục đích khác như kích thích hoặc kìm hãm nẩy mầm của củ giống (khoai, hành, tỏi), kích thích ra nhiều hoa đực hoặc hoa cái (dưa, bầu, bí), tạo quả ít hoặc không hạt (nho, cam, chanh, cà chua, dưa), làm rụng lá

để dễ thu hoạch (đậu, bông), làm cây thấp lại để tăng mật độ trồng (bông vải), tạo dáng cho cây cảnh…

Sử dụng chitosan để kích thích sinh trưởng

Trong nông nghiệp, chitin, chitosan được sử dụng để tăng cường sự hoạt động của các vi sinh vật có lợi trong đất, bọc các hạt giống nhằm mục đích ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất và tăng cường khả năng nảy mầm của hạt, giảm stress cho cây, kích thích sinh trưởng và tăng năng suất thu hoạch Đặc biệt, chitosan có đóng vai trò là chất kích thích hệ miễn dịch của cây (plant defence booster) và sự hoạt động của

enzyme chitinase ( Chandrkeachang, 2002; Dzung và Thang, 2002; Vasudevan và Reddy, 2002; Bautista-Banos và cộng sự, 2005; Luan và cộng sự, 2006; Dzung, 2009)

Cơ chế của Chitosan trong trồng trọt

Hoạt tính kéo dài tế bào

Vì tế bào thực vật có vách bao bọc nên tế bào chỉ có thể tăng trưởng được khi vách được kéo dài Khi có mặt của chitosan, tế bào hoạt hóa bơm ion H+ trên màng sinh chất (Hình A) Ion H+ được vận chuyển tích cực từ tế bào chất vào trong vách Sự gia tăng ion H+ hoạt hóa enzyme bẻ gảy một số liên kết chéo giữa các đường

đa cấu tạo vách và vách trở nên mềm dẻo hơn (Hình B) Vì nước vào không bào càng lúc càng nhiều vách sẽ bị căng ra, nhưng chỉ theo một hướng Hầu như không có sự tổng hợp tế bào chất mới trong suốt thời gian tăng trưởng theo kiểu này Sự gia tăng thể tích tế bào là do sự phát triển của không bào (Hình C) Các không bào nhỏ hòa vào nhau thành một không bào to duy nhất; ở tế bào trưởng thành dãy tế bào chất ở ngoại biên chỉ chiếm 10% thể tích tế bào (Hình D)

Hình 1.9 Cơ chế kéo dài tế bào của các chất kích thích

Hoạt tính trực tiếp chống lại mầm bệnh:

Hoạt tính trực tiếp của chitosan trong việc kháng virut và viroid chủ yếu ở khả năng chitosan bất hoạt quá trình sinh sản của virut hoạc viroid Đặc biệt khi chitosan ở dạng nano, nó thâm nhập vào mô tế bào cây, liên kết chặt chẽ với các acid nucleic và gây ra một loạt các thương tổn và gây ức chế lựa chọn Ngay lập tức, ức chế có chọn lọc này có thể bất hoạt các mRNA mã hóa các gen cần cho quá trình điều trị thương tổn của vi khuẩn

Ngược lại, các nấm, vi khuẩn, oomycete và các côn trùng khác, chitosan tác động thông qua cơ chế gia tăng khả năng đề kháng của cây, giúp cây tiết ra các kháng thể chống lại sự xâm nhập của nấm, vi khuẩn, oomycete

Hàng rào vật lý quanh vị trí xâm nhập mầm bệnh

Khi chitosan xâm nhập vào mô cây, thường kết dính quanh các vị trí xâm nhập

và có 3 tác động chính:

Thứ nhất là lập 1 hàng rào cách ly vị trí xâm nhập để tránh mầm bệnh lây lan và bảo vệ các tế bào khỏe mạnh khác Tại vị trí cách ly, cây sẽ nhận biết để kích thích sự phản ứng nhạy cảm giúp tiết ra H2O2 để giúp tăng cường thành tế bào và báo động cho các tế bào bên cạnh

Thứ hai chitosan liên kết các kim loại khác nhau và giúp kích hoạt nhanh chóng quá trình làm lành vết thương

Thứ 3 chitosan có điện tích dương, vi khuẩn có điện tích âm do đó chitosan kết dính với vi khuẩn gây ra quá trình rò rỉ protein và các cơ quan nội bào của vi khuẩn, khiến vi khuẩn bị tổn thương nghiêm trọng và chết

Khả năng tạo chelate với dinh dưỡng và khoáng chất

Chitosan có khả năng liên kết các kim loại và khoáng (như Fe, Cu) giúp tránh mầm bệnh xâm nhập, gây ức chế quá trình sinh sản và tạo ra độc tố Chitosan còn tạo phức với mycotoxin (độc tố do nấm tiết ra), giúp giảm tổn hại ở tế bào chủ do độc tố nấm

Chất tăng cường làm lành vết thương

Vì khả năng bám chặt vào màng sinh học và các phân tử sinh học cùng với điện tích dương, chitosan cung cấp khả năng làm lành vết thương nhanh chóng khi có tổn hại cơ học hay mầm bệnh tấn công

Vì là chất kích hoạt, chitosan hoạt hóa quá trình tổng hợp và hình thành một loạt các protein PR và các protein bảo vệ trong đó có phenylalanine ammonia-lyase và peroxidase Hai enzyme này giúp tổng hợp và xây dựng lên ma trận lignin và hình thành tyllose, những chất đóng vai trò quan trọng trong làm lành vết thương

Kích thích cơ chế phòng thủ của cây trồng

Chất kích hoạt là các chất có khả năng kích thích các phản ứng bảo vệ khi được đưa vào các mô tế bào cây (như oligosaccharit, glycoprotein, peptit và lipit) Các chất kích thích oligosaccharit bao gồm oligoglucan, oligochitin, oligochitosan và oligogalacturonic Khi cây trồng được tăng cường cơ chế bảo vệ sẽ chịu được sự tấn công mầm bệnh, nhanh chóng khoanh vùng tế bào bị chết và tạo ra các chất sinh hóa xung quanh tế bào bị chết Các cơ chế này bao gồm tạo ra các oxygen hoạt tính, thay đổi cấu trúc tế bào, tổng hợp các protein kháng thể và tổng hợp sinh học phytoalexin Chitosan là chất có khả năng kích hoạt các cơ chế phòng thủ của cây Khi sử dụng chitosan, cây trồng sẽ có 1 loạt biến đổi về vật lý và sinh lý học Thay đổi vật lí là sẽ giảm khe hở khí khổng, giảm khả năng tiếp cận của nấm vào mô tế bào lá Các tế bào bảo vệ của lá sẽ tạo ra H2O2, để phản ứng lại với sự giảm khe hở khí khổng Nồng độ acid phenolic trong lá, đặc biệt ferulic acid sẽ gia tăng đáng kể khi gia tăng nồng độ chitosan Nồng độ lignin trong lá cũng sẽ tăng cao Sinapoc acid và phenolic acid có khả năng kháng khuẩn đều bị kích hoạt bởi chitosan

1.3 Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về chitosan hòa tan trong nước và

khả năng kích thích nảy sinh trưởng của cây trồng

1.3.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Chitosan phát hiện lần đầu năm 1850 nhưng mãi đến cuối năm 1859 Rouget mới thảo luận về quá trình deacetyl của chitosan Bên cạnh đó các nghiên cứu về việc

sử dụng chitin, chitosan phát triển mạnh mẽ trong những năm 1930 và đầu năm 1940 Đến nay việc nghiên cứu sản xuất cũng như ứng dụng của chitin, chitosan cũng vẫn là hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học quan tâm

Gần đây oligochitosan (COS) đã nhận được nhiểu sự quan tâm về mặt dược lý

và ứng dụng trong dược liệu do khả năng cao và không độc hại COS có nhiều lợi ích sinh học như hạ cholesterol trong máu, hạ huyết áp cho người cao huyết áp, có tác dụng bảo vệ cơ thể chống lại bênh nhiễm trùng, kiểm soát bệnh viêm khớp, cải thiện

sự hấp thu canxi và tăng khả năng chống ung thư Theo Mendis và cộng sự (2007) thì COS tham gia việc thu nhặt những gốc tự do trong tế bào và cũng ức chế hoạt động của NF-B (Mendis và cộng sự, 2007)

Khả năng kháng u của COS lần đầu tiên được báo cáo năm 1970 (Muzzarelli, 1977) điều nay được đề xuất là do COS sở hữu các cation ở các nhóm amin sau đó đề xuất này cũng được chấp thuận và trọng lượng phân tử của COS cũng đóng vai trò quan trọng trong hoạt động kháng u (Qin và cộng sự, 2002) Một số nhà nghiên cứu phát hiện ra rằng tác dụng chống khối u của COS là do việc làm tăng sự hoạt động của

tế bào lympho giết chết tự nhiên như đã quan sát thấy trong Saccom 180-bearing của chuột (Y Maeda và Y Kimura, 2004) Các nghiên cứu khác cũng cho thấy tác dụng

tự phân hủy các tế bào biểu mô ung thư gan của con người của COS bởi việc tăng bài xuất cả Bax (Bcl-2-associated X protein) (Q Xu và cộng sự, 2008)

Pangestuti và cộng sự (2008) cho thấy COS với trọng lượng phân tử < 1 kDa có hoạt động chống viêm mạnh

Mei và cộng sự (2013) cũng cho rằng COS cũng có thể có hiệu quả trong tăng cường phản ứng miễn dịch toàn thân và trong điều kiển các chức năng của tế bào miễn dịch

Senevirathne và cộng sự (2011) nghiên cứu về ảnh hưởng của COS trên butyl hydroperoxide (t-BHP) gây hại trong tế bào gan Chang cho thấy COS bảo vệ tế bào gan Chang chống lại quá trình ôxy hoá gây ra bởi t-BHP qua việc ức chế sản xuất của ROS và lipid peroxide Các tác dụng ức chế của COS trên degranulation và hệ cytokine ở chuột bị bệnh bạch cầu tế bào basophilic RBL - 2H3 đã được nghiên cứu bởi Vơ và cộng sự (2011) kết quả chỉ ra rằng COS góp phần làm suy giảm các phản ứng dị ứng Nghiên cứu của họ cho rằng COS (có trọng lượng phân tử từ 1-3 kDa) có tác dụng ức chế cao nhất trên degranulation và cytokine tạo các tế bào mast

tert-Hiệu quả của COS trong việc điều trị bệnh tiểu đường ở alloxan gây ra ở chuột

đã được đánh giá bởi Katiyaretal (2011) nghiên cứu của họ cho rằng COS có ảnh

𝜅

hưởng đáng kể như chống bệnh tiểu đường, hoạt động hypolipidemic, chống oxy hóa

và các thuộc tính trong alloxan gây ra ở chuột

Chitosan đã được thuỷ phân nhẹ bằng chitosanase có khả năng kháng khuẩn tốt hơn là chitosan ban đầu và oligomer của chúng (Uchida và cộng sự, 1989)

Chitosan hòa tan trong nước có đáp ứng miễn dịch không chỉ với tác nhân giun tròn mà còn trên tác nhân kí sinh trùng (Vasyukova và cộng sự, 2001)

Nghiên cứu quá trình sản xuất cũng như đặc tính của chitosan hòa tan trong nước được sinh ra từ phản ứng Maillard của Ying Chien CHUNG và cộng sự (2006), (2011) cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của các dẫn xuất chitosan tan trong nước được

sinh ra bởi phản ứng Maillard đối với Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes,

Bacillus cereus, Escherichia coli, Shigella dysenteriae và Salmonella typhimurium của

dẫn xuất chitosan-glucosamine (chitosan hòa tan trong nước) cao hơn so với các chitosan hòa tan trong acid

Nghiên cứu sản xuất chitosan hòa tan trong nước từ vỏ tôm và hoạt tính ức chế

vi khuẩn của Yunjian Du và cộng sự (2009) cho thấy điều kiện tối ưu thu được chitosan hòa tan trong nước là ngâm chitosan thô với H2O2 5,5% ở 42,80C trong 3,5 giờ, thu hồi được 93,5 % Số liệu thực nghiệm cho thấy cả chitosan thô ban đầu và

chitosan hòa tan trong đều ức chế tốt đối với B subtilis (Du và cộng sự, 2009)

Một số nghiên cứu cho thấy sử dụng chitosan oligomer từ tôm có trọng lượng phân tử 1 kDa hơi hiệu quả hơn so với trọng lượng 10 kDa và hiệu quả hơn 4 lần so với trọng lượng 100 kDa Nhưng chitosan oligomer từ nấm có trọng lượng phân tử 10 kDa lại hiệu quả hơn so với trọng lượng phân từ 1 kDa Hiêu quả tối ưu đối với thế hệ 5-7 cây con trong vòng 12 tuần khi sử dụng chitosan oligomer 10 kDa từ nấm và 1 kDa từ tôm ở nồng độ 20 ppm (Lay và cộng sự, 2006)

Các nghiên cứu cho thấy rằng, khi sử dụng COS nồng độ tối ưu 15 ppm thì có tác dụng làm tăng trường của mô lấy từ cây lan thực thể giống như mầm rễ Tốc độ hoạt hóa của COS gấp bốn lần so với chitosan khối lượng phân tử cao, kết quả cho thấy với một lượng nhỏ chitosan có tác động mạnh đến sự tăng trưởng của cây phong lan (Chandkrachang, 2002)

Khi sử dụng COS có khối lượng phân tử 19kDa, nồng độ 3,75 ppm thì làm tăng tốc độ nảy mầm của hạt lúa mạch loại nảy mầm chậm và trung bình COS ( trọng lượng phân tử 13 kDa) với nồng độ 3,75 ppm cho tốc độ tăng trưởng tốt nhất ở hạt lúa mạch Trung Quốc (Hadwiger và Kloslerman, 2002) Ngoài ra, olioglucosamin có ảnh hưởng đến tăng trưởng, phát triển của bắp cải, năng suất của cây tăng lên 20% (Rinaudo và Domard, 1989)

Kết quả thực tế ở Myanmar cho thấy năng suất lúa vụ màu tăng từ 41,7% lên 91,5% (Nitar New và cộng sự) Một bằng chứng khác là với nồng độ 40ppm oligoglicosamin làm tăng cường lượng diệp lục trong lá và lượng nốt sần chứa nito, năng suất cây lạc tăng từ 19,34% đến 40,65% (Lehduwi và cộng sự, 1997; Chandkrachang, 2002)

Theo Zhishen Jia và Dongfeng Shen (2002) đã nghiên cứu thì trọng lượng phân

tử của chitosan là 20,0×104 – 1,90×104 có thể đạt được bằng việc sử dụng acid phosphoric 85% ở 600C trong 1-15 giờ Cả độ nhớt và trọng lượng phân tử của chitosan đều giảm rất nhanh khi được gia nhiệt Độ nhớt của chitosan giảm từ 323 đến 69,0 ml/g sau 8 giờ thủy phân ở 400C, tương ứng với trọng lượng phân tử giảm từ 21,4×104 xuống 3,70×104 Khi thủy phân ở 800C độ nhớt và trọng lượng phân tử đạt được 40,9ml/g và 2,00×104 Khả năng hòa tan trong nước của chitosan tăng cùng với việc giảm trọng lượng phân tử chitosan

Đối với lúa mì thì Chandrkrachang (2002) đã nghiên cứu thấy rằng chitosan được phun từ 1-3 lần/vụ và nồng độ sử dụng là 10-15 ppm thì cho sản lượng thu hoạch tăng lên mà lượng phân bón sử dụng giảm đi nên hiệu quả tăng lên đáng kể

Nhà nghiên cứu New và cộng sự (2006) tại Miến Điện cho thấy kết hợp ngâm hạt giống kích thích nảy mầm bằng chitosan và phun chitosan lên lá có thể tăng năng suất lên 1,6 lần Còn theo Freepons (1997) nghiên cứu đối với hạt lúa mì, khi được xử

lý trong dung dịch chitosan thì tỷ lệ nẩy chồi hình thành cây con tăng lên 25%, rễ và lá phát triển mạnh hơn so với mẫu không xử lý chitosan

Nghiên cứu quá trình ngâm hạt bằng chitosan cải thiện sự nảy mầm và phát triển của cây ngô non liên quan đến sự thay đổi các yếu tố vật lí ở nhiệt độ thấp của Ya-jing GUAN và cộng sự (2009) cho thấy quá trình ngâm hạt với chitosan có ảnh hưởng đáng kể đến tỉ lệ nảy mầm ở nhiệt độ thấp, chỉ số nảy mầm tăng, thời gian nảy

mầm giảm, chiều cao của chồi, chiều dài của rễ và khối lượng khô của rễ và chồi tăng

Có sự khác nhau khi sử dụng các nồng độ chitosan khác nhau Ngâm với chitosan nồng độ 0,5% trong 60-64 giờ cho kết quả tốt nhất (Guan và cộng sự, 2009)

Nghiên cứu ứng dụng chitosan hòa tan trong nước ở phòng thí nghiệm và trong nhà kính để tăng năng suất và chất lượng của hạt giống khoai tây dạng củ nhỏ của Britta Kowalski và cộng sự (2007) cho thấy nồng độ chitosan có ảnh hưởng tích cực đến sự phát triển của các cây trong ống nghiệm Cây trồng được tưới dung dịch chitosan vào rễ khi ở phòng thí nghiệm cho năng suất thấp hơn so với cây trồng ngoài được tưới vào rễ còn được phun trên lá ở giai đoạn ổn định

Nghiên cứu ứng dụng của chitosan trong sản xuất lúa của S.Boonlertnirun và Boonraung (2008) trên 4 mẫu gồm: mẫu không sử dụng chitosan, mẫu ngâm hạt giống với chitosan, mẫu ngâm hạt giống với chitosan kết hợp tưới chitosan trong đất, mẫu ngâm hạt giống với với chitosan kết hợp tưới phun trên lá với chitosan Kết quả cho thấy mẫu ngâm hạt giống với chitosan kết hợp tưới chitosan trong đất 4 lần trong suốt quá trình nuôi giúp tăng năng suất lúa đáng kể so với 3 mẫu còn lại Mẫu ngâm hạt giống với với chitosan kết hợp tưới phun trên lá với chitosan cho thấy khả năng kiểm soát bệnh dịch là tốt nhất (Boonlertnirun và Boonraung, 2008)

1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, đã có những nghiên cứu về chitosan hòa tan trong nước hay các dẫn xuất của chitosan hòa tan được trong nước, tuy nhiên vẫn chưa có nhiều nhà nghiên cứu quan tâm

Theo Bùi Phước Phúc (2013), hằng số tốc độ cắt mạch oxi hóa tăng theo chiều tăng của độ deaxetyl; Hằng số tốc độ cắt mạchcủa -chitosan cao hơn -chitosan Chitosan được cắt mạch bằng H2O2 trước có hằng số tốc độ bức xạ và hiệu suất cắt mạch cao hơn so với chitosan ban đầu Hằng số tốc độ và hiệu suất cắt mạch bức xạ tăng theo chiều tăng của độ deaxetyl Khảo sát hiệu ứng đồng vận bức xạ γ-Co 60/ 1%

H2O2 cắt mạch chitosan dung dịch đã xác định được hằng số tốc độ và hiệu suất cắt mạch bức xạ dung dịch có sự hiện diện của H2O2 cao hơn so với không có H2O2 Đã giảm liều xạ xuống khoảng 5 lần để giảm chi phí sản xuất oligochitosan Đã nhận được oligochitosan có Mw = 2700 Da (chỉ ở liều thấp 16 kGy) tan hoàn toàn ở pH = 7 (Bùi Phước Phúc, 2013)

Trần Thị Luyến và cộng sự (2006) đã nghiên cứu sản xuất oligosaccharide bằng HCl Kết quả nghiên cứu cho thấy, sản phẩm có màu sắc trắng, đẹp và chất lượng tốt Cũng trong năm 2006, Trần Thị Luyến và cộng sự các nghiên cứu sản xuất oligosaccharide có nguồn gốc từ chitin, chitosan bằng enzyme papain, hemicellulose,

và enzyme cellulase từ xạ khuẩn Theo tác giả khi dùng enzyme papain chiết rút từ đu

đủ xanh, kết quả thu được 95% COS từ Chitosan và 97% COS khi dùng enzyme thương phẩm 88,9% COS từ Chitosan và 86,7% COS từ chitin thu được khi dùng enzyme hemicellulose thương phẩm Từ Chitosan thu được 52,6% COS và từ chitin thu được 45,6% COS khi dùng enzyme cellulase từ xạ khuẩn (Trần Thị Luyến, 2007) Nghiên cứu này đã có những thành công nhất định trong việc thu nhận các oligosaccharide có các tính chất riêng biệt so với phương pháp hoá học

Nghiên cứu của Phạm Văn Cường và Trần Anh Tuấn (2008) về ảnh hưởng của chitosan đến sinh trưởng và năng suất của lúa trồng trong điều kiện bón đạm thấp cho thấy phun chitosan không ảnh hưởng đến thời gian sinh trưởng và số bông/khóm nhưng làm tăng chiều cao cây và diện tích lá Phun chitosan cũng làm tăng chỉ số hàm lượng diệp lục (SPAD), tăng cường độ quang hợp ở giai đoạn làm đòng và sau trỗ 20 ngày Ở mức phân đạm bón thấp, các cây được xử lý chitosan có các yếu tố cấu thành năng suất và năng suất cao hơn đối chứng (chitosan 0 ppm) Trong đó, phun chitosan nồng độ 30 ppm cho năng suất cá thể cao nhất, đạt 28,6 g hạt/khóm (N1) và 29,9 g hạt/khóm) (Phạm Văn Cường và Trần Anh Tuấn, 2008)

Nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan oliosacharide lên sinh trưởng và năng suất cây lạc giống lạc L14, tác giả Võ Thị Mai Hương và Trần Thị Kim Cúc (2012) đã kết luận rằng COS có tác dụng kích thích sinh trưởng ở lạc, tăng khả năng hình thành nốt sần, kích thích sự ra hoa và tăng năng suất của lạc, đặc biệt ở nồng độ COS 100-150 ppm (Võ Thị Mai Hương và Trần Thị Kim Cúc, 2012)

Ngoài ra một số nghiên cứu khác đã triển khai như: Nghiên cứu hiệu ứng cắt mạch chitosan trong nước bằng bức xạ Gamma Co-60 do các tác giả Bùi Duy Du và cộng sự (2008) Nghiên cứu tổng hợp nano vàng sử dụng chitosan tan trong nước làm chất khử và chất ổn định của Lê Thị Lành và cộng sự (2010) Nghiên cứu hiệu ứng đồng vận cắt mạch chitosan bằng bức xạ gamma Co-60 kết hợp với hydroperoxit của Nguyễn Quốc Hiến và cộng sự (2011)

Nói tóm lại, tuy đã có một số nghiên cứu về điều kiện sản xuất muối chitosan nhưng vẫn còn rất hạn chế và nhất là độ tan, vấn đề hiệu suất thu hồi, các đặc tính cơ bản của muối chitosan cũng như các biến đổi trong quá trình bảo quản muốichitosan chưa được quan tâm đúng mức

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu