Tiểu luận glycome chẩn đoán của con người induced cells pluripotent stem sử dụng lectin microarray

Tế bào gốc đa năng cảm ứng (iPSCs) bây giờ có thể được sản xuất từ nhiều tế bào soma (SC) dòng bằng cách biểu hiện ngoài tử cung trong bốn yếu tố phiên mã. Mặc dù các thủ tục đã được chứng minh để tạo ra sự thay đổi toàn cầu trong gen và biểu microRNA và thậm chí sửa đổi biểu sinh, nó vẫn là một bí ẩn lớn như thế nào yếu tố gây ra phiên mã này reprogramming ảnh hưởng đến tổng số tiết mục polisacarit thể hiện trên các tế bào. Ở đây chúng ta thực hiện một phân tích toàn diện polisacarit sử dụng 114 loại iPSCs con người tạo ra từ năm khác nhau SC và so glycomes của họ với những tế bào gốc phôi người (ESCs; chín loại tế bào) bằng cách sử dụng một mật độ cao lectin microar ray. Trong phân tích cụm không giám sát các kết quả thu được bằng lectin microarray, cả iPSCs không phân định ESCs được nhóm là một nhóm lớn. Tuy nhiên, họ rõ ràng đã sepa đánh giá từ các nhóm SCS biệt, trong khi tất cả bốn SCS có hồ sơ glycome dường như khác biệt với nhau, chứng minh rằng SC với hồ sơ ban đầu polisacarit biệt đã thu được những giống ESCs khi cảm ứng

TIỂU LUẬN

Glycome Chẩn đoán của con người Induced Cells Pluripotent Stem Sử

dụng lectin Microarray

TỔNG QUAN

Tế bào gốc đa năng cảm ứng (iPSCs) bây giờ có thể được sản xuất từ nhiều tế bào soma (SC) dòng bằng cách biểu hiện ngoài tử cung trong bốn yếu tố phiên mã Mặc dù các thủ tục đã được chứng minh để tạo ra sự thay đổi toàn cầu trong gen và biểu microRNA và thậm chí sửa đổi biểu sinh, nó vẫn là một bí ẩn lớn như thế nào yếu tố gây ra phiên mã này reprogram- ming ảnh hưởng đến tổng số tiết mục polisacarit thể hiện trên các tế bào Ở đây chúng ta thực hiện một phân tích toàn diện polisacarit sử dụng 114 loại iPSCs con người tạo ra

từ năm khác nhau SC và so glycomes của họ với những tế bào gốc phôi người (ESCs; chín loại tế bào) bằng cách sử dụng một mật độ cao lectin microar- ray Trong phân tích cụm không giám sát các kết quả thu được bằng lectin microarray, cả iPSCs không phân định ESCs được nhóm là một nhóm lớn Tuy nhiên, họ rõ ràng đã sepa- đánh giá từ các nhóm SCS biệt, trong khi tất cả bốn SCS có hồ sơ glycome dường như khác biệt với nhau, chứng minh rằng

SC với hồ sơ ban đầu polisacarit biệt đã thu được những giống ESCs khi cảm ứng của ripotency plu- Ba mươi tám lectins phân biệt đối xử giữa SC và iPSCs / ESCs đã được lựa chọn thống kê, và các tính năng đặc trưng của nhà nước đa năng đã được sau đó thu được ở cấp độ của các glycome lar cellu- Các biểu hiện của các gen có liên quan đồng ý glycosyltransferaza tốt với các kết quả thu được bằng lectin microarray Trong số 38 lectin, rBC2LCN đã được tìm thấy để phát hiện chỉ undiffer- entiated iPSCs / ESCs và SCS không phân biệt Do đó, mật độ cao lectin microarray đã được chứng minh có hiệu lực không chỉ com- phân tích toàn diện các polisacarit mà còn chẩn đoán tế bào gốc theo khái niệm của glycome di động

Tăng sự chú ý đã được trả tiền để iPSCs và ESCs trong pluripotency của họ và các ứng dụng y tế (1, 2) tuy nhiên thành lập một hệ thống đánh giá mạnh mẽ của các tài sản của họ, bao gồm cả sự phân biệt xu hướng và nguy cơ có thể tamination góp của xenoantigens và thậm chí cả khả năng của sis tumorigene-, đã bị cản trở bởi sự thiếu thì phương pháp toàn diện trực tiếp áp dụng để nhắm mục tiêu các tế bào gốc, mặc dù điều này là một vấn đề đang nổi lên cần thiết cho việc sử dụng an toàn iPSCs trong y học tái tạo Từ nhiều khía cạnh, polisacarit bề mặt tế bào đang xem xét việc đến khía cạnh là mục tiêu lý tưởng để phân tích hoặc xác định các loại pheno- của từng tế bào một cách trực tiếp bởi các lý do sau đây (3,4) (a) polysacarit nằm ở bề mặt tế bào ngoài cùng (b) Tổng tiết mục của polysacarit bề mặt tế bào khác nhau ở mọi cấp của tổ chức sinh học (tức là các loài, các mô, loại tế bào, và ecules mol-) (c) thay đổi toàn cầu của glycome di động cũng xảy ra trong quá trình phát triển, hoạt hoá tế bào, sự phân biệt, chuyển đổi Nant malig-, và viêm Do đó, lon gly- bề mặt tế bào được gọi là "chữ ký di động" phản ánh chặt chẽ nguồn gốc và điều kiện di động, có lẽ bởi vì họ

đang thực sự hoạt động như tế bào-to-cell trung gian trong các hiện tượng sinh học sive mở rộng cho Tính chất cơ bản này của polysacarit nên được hiểu với thực tế là họ không được mã hóa trực tiếp trong hệ gen nhưng được tạo ra bởi một hệ thống phức tạp của một số glycosidases và glycosyltransferases, mà biểu thức và các hoạt động bị ảnh hưởng đáng kể bởi

cả hai thay đổi môi trường nội bào và ngoại bào Thật vậy, các phân tử bề mặt tế bào, chẳng hạn như gens giai đoạn cụ thể phôi chống (SSEA1 và -3/4) (5) và kháng nguyên khối u từ chối (Tra-1-60 và Trà-1-81) (6-8) được sử dụng rộng rãi glycobiomarkers để đánh giá pluripotency Đáng chú ý, tuy nhiên, những "đại diện quyền lợi chính kịp thời" glycomarkers đã được xác định sau đây phát triển itous thay fortu- của kháng thể đặc hiệu của họ, bởi vì hầu hết các cấu trúc carbohydrate là kháng nguyên kém giữa mam- mals Trong bối cảnh này, một hệ thống tìm kiếm là cần thiết để vẽ một bức tranh toàn cảnh của glycome tế bào gốc và khai thác hiệu quả của nó về sinh học tế bào gốc (8, 9) Ví dụ, sự phát triển và biệt hóa chỉ đạo của tế bào gốc để thế hệ con cháu dòng dõi cụ thể trong tế bào vẫn còn có vấn đề Hiểu như thế nào tế bào gốc liên lạc với nhau và các tế bào trung chuyển qua polisacarit bề mặt tế bào có thể dẫn đến thiết kế hợp lý của hệ thống văn hóa cụ thể Tuy nhiên, các glycome là một mục tiêu khá khó khăn để ngăn dict chỉ dựa trên bất kỳ cơ sở dữ liệu về gen bởi vì quá trình thetic biosyn-của các gốc thuốc polisacarit biosyn-của glycoprotein không phải là mẫu định hướng và là phụ thuộc vào nhiều con đường enzyme petitive tuần tự và cạnh Trong ý nghĩa này, một hệ thống nhanh chóng và nhạy cảm cho phép giám sát trực tiếp của polysacarit bề mặt tế bào là điều cần thiết

Một số phương pháp đã được phát triển để phân tích polisacarit dựa trên nguyên tắc hóa lý, chẳng hạn như tography chroma- lỏng và khối phổ (10 -12) Lectin microarray là một công nghệ thay thế cho glycomics cấu trúc, nơi một bảng điều khiển của lectin với nhiều đặc điểm riêng polisacarit ràng buộc được in trên microarray, cung cấp một nền tảng linh hoạt cho việc phân tích thông nhanh và cao của các cấu trúc polisacarit mà không eration lib- của glycan (13, 14 ) Lectin là một lớp các bộ giải mã mole- cules của polysacarit bề mặt tế bào phân bố khắp các sinh vật, mà trung gian chức năng khác nhau thông qua định nghĩa recog-glycan cụ thể Giao thức phân tích sử dụng lectin microarray đã được phát triển với nhiều loại mẫu khác nhau: oligosaccharides miễn phí (14,15), phần mô (16), màng tế bào phân số kỵ nước (17, 18), và thậm chí toàn bộ tế bào (19, 20) Công nghệ này vừa mới bắt đầu được áp dụng cho một loạt các nghiên cứu sinh học, bao gồm virus profiling (21) và hồ sơ di động (17, 20), và sự phát triển của ung thư glycobiomarkers (22-24) Đối với tế bào nộp đơn trình, ít hơn

100 ng protein trong phần kỵ nước là đủ cho mỗi phân tích (25, 26) Xử lý dữ liệu và thủ tục malization chuẩn tắc đã được tối ưu hóa để đảm bảo việc giải thích đúng đắn của dữ liệu (25, 26) Gần đây, chúng tôi đã dem- onstrated rằng lectin microarray cũng được áp dụng để ngăn chặn các tế bào (27, 28), mặc dù chúng tôi vẫn chưa đạt được một kết luận rõ ràng về cách thay đổi glycome di động khi cảm ứng của tency pluripo- Hơn nữa, khả năng ứng dụng thực

tế của công nghệ này để kiểm soát chất lượng của các tế bào gốc chưa được biết rõ

Ở đây, chúng tôi phát triển một nền tảng tiên tiến của mật độ cao lectin microarray với

số lượng tăng lên của lectin thăm dò (96 lectin) để mở rộng phạm vi bảo hiểm glycome để so sánh chính xác hơn glycomes tế bào gốc khác nhau Một cuộc khảo sát có hệ thống của glycome di động sau đó đã được thực hiện đối với 135 loại tế bào trong tổng số, bao gồm cả iPSCs (114 loại tế bào) và ESCs (chín loại tế bào) Thông qua phân tích toàn diện này, chúng

ta có được bằng chứng mạnh mẽ rằng tất cả bốn SCS với hồ sơ ban đầu polisacarit biệt đã thu được những giống ESCs khi tion induc- của pluripotency Chúng tôi cũng nhận thấy đặc điểm cấu trúc com- mon để iPSCs và ESCs, tương ứng tốt với kết quả phân tích biểu hiện gen của glycosyltransferases Cuối cùng, chúng tôi chứng minh khả năng áp dụng của lectin microarray trong chẩn đoán tế bào gốc của nhiều yếu tố, trong đó có phân biệt đối xử giữa các

tế bào không phân biệt và khác biệt cũng như phát hiện của sự ô nhiễm của các xenoantigen, Gal epitope Các tế bào nội mạc tử cung-(UTE) (29), động mạch nhau thai endothe- lium (PAE) (30), và màng ối (AM) (31, 32) đã được thành lập một cách độc lập UTE, AM, và MRC5 tế bào được duy trì trong thời gian trung POWEREDBY10 (MED SHIROTORI CO., Ltd) Các tế bào được nuôi cấy trong PAE EGM-2mV BulletKit (Lonza) có chứa 5% FBS IPSCs con người từ UTE, PAE, và AM tế bào đã quát erated theo các thủ tục được mô tả bởi Yamanaka và đồng nghiệp (1) có sửa đổi chút ít (27, 28, 33) Các iPSCs bắt nguồn từ MRC5, Ute, PAE, và AM tế bào được duy trì trong iPSellon trung bình (Cardio Inc.) bổ sung với 10 yếu tố ng / ml tái tổ hợp cơ bản của con người tăng trưởng nguyên bào sợi (Wako Tinh Khiết Chemical Industries, Ltd) trên các tế bào trung chuyển MEF chiếu xạ tế bào hiPS201B7 và hiPS253G1 được duy trì trong DMEM / F-12 vừa (Invitrogen) có bổ sung 20% KSR (Invit-Rogen), 0,1 mM 2-mercaptoethanol (Sigma-Aldrich), axit tối thiểu cần thiết vừa không cần thiết amin (Invitrogen), và 5-10 ng / ml tái tổ hợp của con người FGF cơ bản (Wako) trên các

tế bào nguyên bào sợi trung chuyển phôi chuột Mycin mito- C được điều trị ESCs đã được tạo ra và duy trì như mô tả trước đây (34) Lectin-lectin từ các nguồn tự nhiên (58 lectin) đã pur- đuổi từ J-DẦU MILLS, Vector Laboratories, EY Laborato- Ries, và Seikagaku Corp (xem danh sách lectin trong Bảng bổ sung S2) Lectins tái tổ hợp đã được chuẩn bị như sau Một thời gian ngắn, các gen của lĩnh vực nhận dạng carbohydrate đã được nhân bản vô tính thành pET27b (Stratagene) và được biểu hiện quá mức trong Escherichia coli BL21-CodonPlus (DE3) -RIL căng thẳng dưới sự kiểm soát của isopropyl- -D-thiogalactopyranoside (Fermentas Hanover) ở nhiệt độ thích hợp Tất cả các lectins tái tổ hợp đã được tinh chế bằng sắc ký ái lực sử dụng phù hợp đường cố định Sepharose 4B-CL (GE Healthcare) dựa trên các đặc tính ràng buộc polisacarit của mỗi lectin Sau đó họ được thẩm tách chống pha loãng PBS (nồng độ cuối cùng 2.5 mM phate phospho đệm chứa 0.015 M NaCl) Tion nồng độ protein được xác định bằng xét nghiệm protein BCA (Bio-Rad) Lectin được đông khô và bảo quản ở nhiệt độ 4 ° C cho đến khi sử dụng Độ tinh khiết đã được kiểm tra bởi SDS-PAGE và sắc ký lọc gel trên Shodex PROTEIN KW-802,5 (Shodex) Các hoạt động ràng buộc glycan và độ đặc hiệu đã được phân tích bởi hoạt động hemagglutinating sử dụng 4% hồng cầu thỏ, ái lực trán tography chroma- (35), và glycoconjugate microarray (36)

Lectin Microarray Sản xuất-The microarray lectin được sản xuất như mô tả trước đây với những thay đổi nhỏ (14, 15) Năm mươi tám lectins tự nhiên và 38 lectins tái tổ hợp (xem Bảng bổ sung S2 cho một danh sách lectin) được hòa tan ở nồng độ 0,5 mg / ml trong dung dịch đốm (Matsunami Glass) và phát hiện lên lam kính epoxysilane-kẽm (Schott) ở ba lần sử dụng không tiếp xúc in microarray robot (MicroSys4000, Genomic Solutions) Các slide kính sau đó được ủ ở 25 ° C qua đêm để cho phép lectin immobi- lization Sau đó các slide kính lectin-cố định đã được rửa sạch với thăm dò đệm (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 140 mM NaCl (TBS) có chứa 2,7 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, và 1% Triton X-100) và ủ với chặn thuốc thử N102 (NOF Co.) ở 20 ° C trong 1 giờ Cuối cùng, các slide kính lectin-cố định đã

được rửa sạch với TBS có chứa 0,02% NaN 3 và bảo quản ở nhiệt độ 4 ° C cho đến khi sử dụng Chất lượng tại chỗ và tái sinh của những con chip được sản xuất đã được kiểm tra trước khi sử dụng, sử dụng đầu dò kiểm tra Cy3-dán nhãn có chứa 250 g / ml asialofetuin (Sigma-Aldrich), 25 ng / ml Sia 2-3Gal 1- 4GlcNAc-BSA (Dextra), 10 ng / ml Fuc 1-2Gal 1-3GlcNAc 1-3Gal 1- 4Glc-BSA (Dex- tra), 10 ng / ml GlcNAc-BSA (Dextra), 10 ng / ml GalNAc 1-3 (Fuc 1-2) Gal-BSA (Dextra), 10 ng / ml Gal 1-3Gal 1-4GlcNAc-BSA (Dextra), 10 ng / ml Man 1-3 (Man 1- 6) Man- BSA (Dextra ), 10 ng / ml Fuc-BSA (Dextra), 10 ng / ml GalNAc-BSA (Dextra), và 10 ng / ml Sia 2- 6Gal 1- 4Glc-GalNAc-BSA (Dextra) hòa tan trong thăm dò đệm Phân số lectin Microarray Phân tích-kỵ đã được chuẩn bị bằng cách sử dụng CelLytic chiết protein trung bình cần thiết tối thiểu (Sigma-Aldrich) phù hợp với các thủ tục turer manufac của (25, 27) Sau khi định lượng protein bằng cách sử dụng một thử nghiệm BCA (Thermo Fisher Scientific), phần kỵ nước được huỳnh quang dán nhãn với Cy3 nhuộm monoreactive (GE Healthcare), và dư thừa Cy3 đã được gỡ bỏ với Sephadex G-25 cột -khử muối (GE Healthcare) Sau khi điều chỉnh nồng độ protein đến 2 g / ml với PBST (10 mM PBS, pH 7.4,

140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1% Triton X-100), các phần nhỏ kỵ đã được dán nhãn với Cy3 NHS este (GE Healthcare ) Sau khi pha loãng với thăm dò đệm tại 0,5 g / ml, phần kỵ nước Cy3-dán nhãn đã được áp dụng cho các microarray lectin và ủ ở 20 ° C qua đêm Sau khi rửa với prob- ing đệm, hình ảnh huỳnh quang đã được thu thập bằng cách sử dụng một máy quét nescent eva- trường kích hoạt huỳnh quang (GlycoStationTM đọc 1200; GP BioSciences) Các tín hiệu huỳnh quang của mỗi vị trí được định lượng bằng cách sử dụng mảng Pro Analyzer phiên bản 4.5 (Media khiển học, Bethesda, MD), và các giá trị nền tảng đã được trừ Các giá trị nền được lấy từ khu vực mà không lectin cố định Các tín hiệu lectin trong những điểm cate tripli- được tính trung bình và bình thường hóa với giá trị trung bình của 96 lectins bất động trên mảng Một xét nghiệm ức chế đã được thực hiện bằng cách ủ Cy3-dán nhãn phân màng tế bào của MEF (# 1) hoặc MRC5-iPS # 25 (P22) (# 13) với một mảng vi lectin hoặc trong trường hợp không có hoặc có mặt của 100 g / ml Gal 1-3Gal 1- 4GlcNAc-PAA (danh mục không có 01-079, Gly- COTECH) hoặc một PAA tiêu cực kiểm soát (không có danh mục 01-000, Glycotech)

Phân tích biểu hiện gen-RNA tổng số được tách chiết từ mỗi mẫu bằng cách sử dụng ISOGEN (NipponGene) Các mô hình biểu hiện gen toàn cầu được theo dõi bằng cách sử dụng Agilent toàn bộ bộ gen chip microarray con người (G4112F) với một màu (cyanine 3) thuốc nhuộm Microarray này bao gồm 41.000 gen của con người cũng trưng ized và bảng điểm Trong số 41.000 tàu thăm dò, 16.483 tàu thăm dò đại diện tương ứng với các gen kiểm soát chất lượng độc đáo microarray được sử dụng để phân tích sau đây (37) Cụm kê-có giám sát được thực hiện bằng cách sử dụng phương pháp trung bình liên kết bằng cách sử dụng cụm 3,0 đồ mềm Các bản đồ nhiệt với phân nhóm đã được mua lại bằng cách sử dụng Java Treeview Sự khác biệt giữa hai bộ dữ liệu tùy ý được đánh giá bởi t kiểm tra của học sinh để mỗi tín hiệu lectin sử dụng SPSS kê 19 (SPSS) Đáng kể tín hiệu lectin khác nhau hoặc các biểu hiện glycosyltransferaza đã được lựa chọn nếu họ thỏa mãn một tỷ lệ lỗi familywise (FWER) theo phương pháp Bonferroni của 0,001 Phân tích Immunocytochemistry-Immunocytochemical được thực hiện như mô tả trước đây (29, 33, 38) IPSCs con người đã được cố định với 4% paraformaldehyde trong PBS trong 10 phút ở nhiệt độ 4 ° C Sau khi rửa với 0,1% Triton X-100 trong PBS (PBST), các tế bào được prehybridized trong việc ngăn

chặn đệm cho 1-12 h ở 4 ° C và sau đó ủ trong 6 -12 h ở 4 ° C với các kháng thể chính sau: chống -SSEA4 (1: 300 pha loãng; Chemicon), anti-TRA-1-60 (1: 300; Chemicon), anti-Oct4 (1:50; Santa Cruz Biotech-nology, Inc.), anti-Nanog (1: 300; ReproCELL), và chống Sox2 (1: 300; Chemicon) Các tế bào này sau đó được ủ với chống thỏ IgG, chống chuột IgG hoặc IgM anti-chuột liên hợp với Alexa Fluor 488 hoặc Alexa Fluor 546 (1: 500; dò phân tử) trong việc ngăn chặn đệm cho 1 h ở nhiệt độ phòng Các tế bào được counterstained với DAPI và sau đó được gắn bằng những bộ đèn antifade SlowFade (đầu dò phân tử)

Hình thành u quái-Teratoma được thực hiện như de- tả trước đây (1, 2) 1: 1 hỗn hợp của iPSC đình chỉ và tầng hầm màng ma trận con người (BD Biosciences) được cấy dưới da ở mức 1.0 107 tế bào / trang web vào suy giảm miễn dịch, không bị béo phì mắc bệnh tiểu đường / nặng kết hợp chuột nodeficiency miễn dịch U quái đã được phẫu thuật mổ xẻ ra 8 -12 tuần sau khi thụ tinh và được cố định với 4% formaldehyde para- trong PBS và nhúng trong parafin Các phần củaM dày 10 đã được nhuộm màu với hematoxylin-eosin.Glycoconjugate Microarray Phân tích-Glycoconjugate mi- croarray sản xuất và phân tích được thực hiện như

mô tả trước đây (36) Một thời gian ngắn, các glycoprotein và hợp chất amide glycoside-polyacryl- được hòa tan trong dung dịch đốm Matsunami ở nồng độ cuối cùng của 0,5 và 0,1

mg / ml, respec- nhiễm Sau khi lọc, họ đã phát hiện trên epoxy- Schott tráng slide kính bằng cách sử dụng Microsys không tiếp xúc in microarray robot

Lectins Cy3-dán nhãn hòa tan trong dung thăm dò (10 hoặc 1 g / ml) được áp dụng cho mỗi buồng của microarray glycoconjugate (100 l / giếng) và được ủ ở 20 ° C qua đêm Sau khi rửa các phòng với các giải pháp thăm dò, hình ảnh huỳnh quang đã được mua lại ngay lập tức bằng cách sử dụng một trăm trường kích hoạt máy quét huỳnh quang evanes-, các GlycoStationTM đọc 1200, dưới chế độ Cy3 Dữ liệu được phân tích với các phiên bản Pro Mảng phân tích 4.5 (Media khiển học, Inc.) Giá trị cường độ net cho mỗi vị trí được xác định bởi cường độ tín hiệu trừ đi giá trị nền Các tín hiệu lectin trong những điểm cate tripli- được tính trung bình và bình thường với cường độ tín hiệu cao nhất trong số 98 glycoconjugates bất động trên mảng

KẾT QUẢ

Phát triển mật độ cao lectin Microarray-Để tăng glycome bảo hiểm và phạm vi lựa chọn của lectins phù hợp để đánh giá tế bào gốc, trước tiên chúng ta tăng số lượng các lectins

cố định 43-96, đó là num lượng lớn nhất của lectin cố định báo cáo ( 39) Với mục đích này, tins lec- với cấu trúc được xác định lần đầu tiên được phân loại thành các gia đình lectin với giàn giáo protein khác nhau Chúng tôi sau đó chọn hộp lec- từ gia đình lectin khác nhau, có ý định để trang trải một phạm vi rộng hơn các đặc điểm riêng ràng buộc polisacarit Đặc biệt, chúng tôi tăng lectins cụ thể để sửa đổi thiết bị đầu cuối, như Sia và Fuc, mà thường xuyên thay đổi đáng kể tùy thuộc vào tính chất của tế bào Đối với sản xuất của lectin tái tổ hợp, các

hệ thống biểu hiện E coli đã được lựa chọn để tránh glycosyl hóa của các hộp thiếc đựng lec-sản xuất, mà có thể gây không đặc hiệu ràng buộc để ecules mol- lectin giống như trong các mẫu khách quan Các lectins tái tổ hợp do đó tạo ra được tinh chế bằng sắc ký ái lực bằng cách sử dụng đường cố định Sepharose thích hợp nhất Các đặc glycanbinding 96 lectin được

sử dụng trong nghiên cứu này đã phân tích các lyzed bằng cả glycoconjugate microarray (bổ

sung hình S1 và Bảng S1; Cũng thấy "Thủ tục Experimental") (36) và số lượng nhiều hơn, mối quan hệ trực diện sắc ký (xem cơ sở dữ liệu lectin Frontier Trang Web) (35, 40) Ificities phổ kế cơ bản của họ được đánh giá theo hai phương pháp phân tích ở trên được tóm tắt ngắn gọn trong bổ sung Bảng S2 96 lectins đã được phát hiện lên lam kính epoxy-kích hoạt bởi một trinh sát không tiếp xúc (bổ sung hình S2), và chất lượng của họ được đánh giá rộng rãi

sử dụng đầu dò kiểm tra Cy3-dán nhãn (25) Lô-to-nhiều sai (hệ số biến đổi) của các nước phát triển mật độ cao lectin microarray được xác nhận là thấp (0.14) sau khi hóa normal- trung bình (25)

Tái lập trình các yếu tố sao chép gây Dẫn đến một toàn cầu đảo chiều xuống cho Nhà nước Pluripotent tại một Cellular Glycome Cấp như Well-Sử dụng lectin microarray phát triển, chúng tôi đã phân tích 135 mẫu tế bào trong tổng số, trong đó có 114 iPSCs,11 SC, và chín ESCs, tất cả từ nguồn gốc con người, cũng như là một nguyên bào sợi phôi chuột (MEF) IPSCs con người đã nhìn chung ated từ bốn dòng SC khác nhau: MRC5, AM, Ute, và PAE (Bảng bổ sung S3) (28) Chúng tôi đã phân tích cũng iPSCs con người tạo ra từ nguyên bào sợi da người với bốn (201B7) (1) và ba yếu tố phiên mã (253G1) (41) và ba dòng tế bào của con người ESCs (42) Tất cả iPSCs được sử dụng trong nghiên cứu này là có hình thái tương

tự như ESCs, và pluripotency của họ đã được xác nhận bằng cách nhuộm với các dấu mốc thành lập undifferentia- tion (SSEA4, Tra1- 60, Oct4, Nanog, và Sox2) và DNA microarray (28)

Màng tế bào phân số kỵ nước đã được chuẩn bị, và các glycoprotein chiết xuất này sau

đó được dán nhãn với Cy3-N-hy- droxysuccinimide ester và phân tích bằng lectin microarray (25) Chúng tôi đã phân tích các phần phân đoạn màng tế bào bởi vì chúng có thể được lưu trữ trong tủ lạnh cho đến khi sử dụng và rất dễ dàng để xử lý, cho phép phân tích toàn diện của một số lượng lớn các mẫu (25, 26)

Sau khi được bình-bình thường, các dữ liệu thu được được phân tích đầu tiên bởi không được giám sát cụm phân cấp (Fig 1) Kết quả là, phân biệt SCS và không phân biệt iPSCs / ESCs được phân chia rõ ràng thành hai cụm lớn, trong khi bốn SCS được tách thêm theo nguồn gốc của họ Điều này chỉ ra rằng SCS (MRC5, AM, Ute, và PAE) với hồ sơ polisacarit khác nhau đã được mua lại hồ sơ khá giống với một khác và thậm chí để ESCs khi cảm ứng của pluripotency Như vậy, việc tái lập trình phiên mã yếu tố gây ra đã được tìm thấy để dẫn đến một sự thâu hồi toàn cầu xuống tới trạng thái đa năng ở mức glycome tế bào cũng như (27, 28) Các tính năng đặc trưng của Glycome Alteration khi tion Induc- của pluripotency-Chúng tôi sau đó kiểm tra chi tiết hơn cách cấu trúc polisacarit thay đổi trong cảm ứng của pluripotency Các dữ liệu trung bình-bình thường được xử lý bằng cách t kiểm tra của học sinh để chọn lectins thăm dò ý nghĩa phân biệt đối xử giữa SC và iPSCs / ESCs (Bảng bổ sung S4) Kết quả là, 38 lectins đã được lựa chọn với FWER 0.001 Trong số đó, chín đã cho tín hiệu cao hơn trong iPSCs hơn SCS, trong khi 29 trưng bày tín hiệu thấp Trong số 38 lectin,

35 lectin này sau đó được phân thành sáu nhóm dựa trên đặc điểm riêng ràng buộc polisacarit của họ, từ đó thay đổi polisacarit đã xảy ra khi cảm ứng của pluripotency ước tính (Hình 2)., Trong khi ba lectin với đặc trưng lớn hơn (mầm lúa mì agglutinin ( WGA), một chất kết dính Sia; rRSIIL và aleuria lectin aurantia (AAL), chất kết dính Fuc rộng) không được đưa vào phân loại này Ở đây, các hộp thiếc đựng lec- với tín hiệu cao hơn trong iPSCs / ESCs hơn

SCS được hiển thị bên dưới dòng màu xám, trong khi tín hiệu thấp hơn được hiển thị bên dưới đường màu đen Các tính năng đặc trưng của cấu trúc polisacarit của iPSCs ferentiated undif- / ESCs so với SCS phân biệt được tóm lược như sau marized 1) Các tín hiệu của 2 lectins 6Sia-ràng buộc (SNA, SSA, TJAI, và rPSL1a) đã được tăng lên, trong khi đó những người Lectins 2-3Sia-ràng buộc (MAL, rACG, và ACG) đã giảm tương ứng (28) Điều này cũng đồng ý với báo cáo trước đó vious 2- 6-sialylated biểu polisacarit cao trong không biệt hoá (nhân ESCs)

so với các tế bào khác biệt (cơ thể embryoid) (43) 2) Trong điều kiện của fucosylation, các tín hiệu của Lectins 1-2Fuc cụ thể (rGC2 và rBC2LCN) đã được tăng lên, trong khi đó những người trong 1- lectins 6Fuc cụ thể (LCA, PSA, và rPTL) đã giảm Điều này phù hợp với các báo cáo gần đây rằng ESCs con người được nhuộm màu với chống Globo H (Fuc 2Gal 1-3GalNAc 1-3Gal 1- 4Gal 1- 4Glc) và anti-H loại1 (Fuc 1-2Gal 1-3GlcNAc), có kháng nguyên chứa 1-2Fuc (9) 3) Các tín hiệu của loại 1 LacNAc (Gal 1-3GlcNAc) -binding lectin (BPL)

đã được tăng lên, trong khi những loại 2 LacNAc (Gal 1- 4GlcNAc) -binding lectin (rLSLN, ECA, RCA120, và rCGL2) đã giảm Điều này cũng đồng ý với những phát hiện gần đây rằng loại 1 LacNAc là epitope polisacarit được công nhận bởi các dấu pluripotency nổi tiếng

Trà-1-60 và Trà-1-81 (7) 4) Các tín hiệu lectin cụ thể để cắt đôi GlcNAc (Phae), tetra-anten- nary N-glycan (Phal), loại mannose N-glycan cao (Heltuba, rRSL, VVAII, rHeltuba, Heltuba, rBanana, rGRFT, và CCA), và O-glycan (MPA, HEA, WFA, Jacalin, ABA, Raba, rSRL, rCNL, và rDiscoidin II) đã được giảm.Các biểu hiện của glycosyltransferases tổng hợp polisacarit đồng ý cũng với kết quả thu được bằng lectin microar- ray (Hình 3 và Bảng bổ sung S5.); sự biểu hiện của 2- 6- sialyltransferases (ST6GAL1 và -2) (28), ferases 1-2-fucosyltrans- (FUT1 và -2), các glycosyltransferaza yếu tham gia vào quá trình tổng hợp loại 1 LacNAc (B3GALT5) (28), và MGAT5, một glycosyltransferaza tham gia vào quá trình tổng hợp tetra-anten- nary N-glycan, đã được tăng lên, trong khi đó của transferases 2-3-sialyl-(ST3GAL1, -3, -4, và -5), 1- 6- ferase fucosyltrans- (FUT8), và các glycosyltransferaza chính liên quan đến việc tổng hợp các loại 2 LacNAc (B4GalT1) đã giảm tương xứng về spondingly trong iPSCs / ESCs so với SC Dựa trên các kết quả thu được bằng lectin và DNA microarray,

có thể hiểu rằng biểu hiện của 2- 6-sialylation, 1-2-fucosylation, và loại 1 LacNAc được tăng lên, trong khi đó của 2-3-sialylation và tetra-antennary N -glycans được giảm khi cảm ứng của pluripotency (Fig 4)

Lựa chọn của lectin Probe tốt nhất để phân biệt pluripotency-Chúng tôi sau đó giải quyết các thách thức để phát triển một thủ tục lectin dựa trên cách phân biệt giữa phân biệt SCS và không phân biệt iPSCs / ESCs, mà có thể được sử dụng để theo dõi trạng thái của sự khác biệt Như đã mô tả, rGC2, rBC2LCN, SNA, TJAI, SSA, rPSL1a, rRSIIL, BPL, và AAL cho tín hiệu cao hơn đáng kể ở iPSCs / ESCs hơn SCS với FWER 0,001 (Bảng 1) Trong số

đó, rBC2LCN cho thấy hiệu suất tốt nhất như một thăm dò để phát hiện chỉ có chưa phân hóa iPSCs / ESCs nhưng không bao giờ phản ứng với phân biệt SCS và MEF, trong khi lectins khác cũng phản ứng với SCS (Bảng 1) Cụ thể, mặc dù rGC2 cho thấy một số điểm tốt hơn về FWER (110 21) hơn rBC2LCN (2 10 19), cựu đã phản ứng mạnh

với MEF (Fig 5) Tương tự như vậy, SNA (4 10 11), một đại diện 2- 6Sia-binding lectin, cho thấy ý nghĩa phản ứng chéo với một phần của SCS có nguồn gốc từ PAE ngoài MEF (Fig 5) Giám sát ô nhiễm của Xenoantigen, Gal epitope-Từ một quan điểm thực tế, giám sát có thể

tamination dựng bởi các kháng nguyên xenotransplantation trong iPSCs / ESCs là điều cần thiết cho sử dụng an toàn trong y học tái tạo Một binant MOA nghị (rMOA) công nhận sự chống xenotransplantation gen Gal 1-3Gal 1- 4GlcNAc (44) hiện diện trong hầu hết các tế bào

từ khỉ New World và động vật có vú phi linh trưởng bao gồm chuột, nhưng không phải ở người Thật vậy, rMOA liên kết mạnh với MEFs nhưng không để bất kỳ người SCS (Fig 6)

Do đó, tín hiệu rMOA không nên được phát hiện trong iPSCs con người Tuy nhiên, trip-licate mẫu của hai dòng tế bào iPS MRC5-# 25 (P22) (# 13-15) và UTE-iPSB05 (P13) (# 64-66) trưng bày các tín hiệu quan trọng về rMOA Để xác minh xem các ràng buộc của rMOA qua trung gian một miền nhận dạng carbohydrate của rMOA, sau đó chúng tôi thực hiện sự ức chế khảo nghiệm Như thể hiện trong hình 6B, ing bind- của rMOA đến việc tế bào phân màng của MEF và MRC5- iPS # 25 (P22, # 13) đã được bãi bỏ trong sự hiện diện của 100 g /

ml tương tác cụ thể thông qua các rMOA carbohydrate miền sự thừa nhận Theo dự kiến, không có tác dụng ức chế của Gal 1 3Gal 1- 4GlcNAc-PAA trên một lectin Fuc-ràng buộc, rAAL, là các xenoantigen Gal epitope, trong hai dòng tế bào ở trên, mà có lẽ hầu hết bị nhiễm MEF

THẢO LUẬN

Sử dụng phát triển mật độ cao lectin microarray, chúng tôi quả thực hiện một phân tích

có hệ thống các polisacarit bề mặt tế bào của một tập hợp lớn các iPSCs con người (114 loại tế bào) và ESCs (chín loại tế bào) Kết quả là, một cơ sở cho một hệ thống đánh giá tế bào gốc hợp lý đã được thành lập, trong đó có thể tiết lộ cả hai trạng thái của undifferentiation và bao gồm của Gal epitope (một xenoantigen đại diện) Như một phân tích toàn diện nhắm glycome iPSCs và ESCs chưa bao giờ được thực hiện cho đến nay Có ít nhất ba lợi thế quan trọng trong việc sử dụng một microarray lectin 1) Một hồ sơ polisacarit tổng thể của mỗi loại tế bào được dễ dàng thu được bằng cách sử dụng một số lượng tương đối nhỏ các tế bào (1 103), và

do đó, phương pháp này được áp dụng rộng rãi cho các tế bào gốc 2) Việc đánh giá hệ thống được đề xuất bao gồm lựa chọn của tàu thăm dò tốt nhất bằng một chiến lược thống kê trong một số lectins, được cố định trên mảng Như là thăm dò ứng cử viên, các kháng thể carbohydrate-binding soạn thảo những cho đến nay có thể cũng được bao gồm 3) Các tài sản khác nhau của tế bào gốc có thể được đánh giá đồng thời (tức là với "một-chip" kỹ thuật điều khiển) Phương pháp đánh giá bằng cách sử dụng cùng một chiến lược được mô tả trong nghiên cứu này, dựa lectin- nhắm mục tiêu khối u và các ferentiation xu hướng lệch của các tế bào gốc cũng có thể được phát triển

Dựa trên các tín hiệu lectin và các biểu hiện của cosyltransferases gly-, chúng tôi kết luận rằng biểu hiện của 2- 6- sialylation, 1-2-fucosylation, và loại 1 LacNAc tăng, trong khi

đó của 2-3-sialylation và tetra-antennary lon N-gly- giảm tương ứng theo cảm ứng của tency pluripo- Những thay đổi này là phù hợp với các báo cáo gần đây rằng polisacarit có liên quan (tức là sự biểu hiện của Globo H và H loại 1 với một 1-2Fuc và 2- 6Sia trong con người ESCs)

là cao hơn so với trong cơ thể embryoid biệt (9, 43) Thật thú vị, các biểu hiện tăng 1-2Fuc và loại 1 LacNAc, được tổng hợp bởi các hành động của FUT1 / 2 và B3GalT5, tương ứng, liên quan chặt chẽ đến sự tổng hợp các dấu hiệu nổi tiếng pluripo tency, SSEA3 / 4 và Trà-1 -60/81 (cho một chương trình, xem hình bổ sung S4)

Trong nghiên cứu này, rBC2LCN đã được lựa chọn như thăm dò lectin tốt nhất để đánh giá pluripotency trong số 96 lectins BC2LCN là một phân tử lectin TNF-như xác định từ một

vi khuẩn gram âm Burkholderia cenocepacia (45) Phân tích microarray Glycoconjugate tiết lộ rằng rBC2LCN gắn đặc hiệu để Fuc 1-2Gal 1-3GlcNAc (GalNAc) -containing polisacarit, như

H type 1 (Fuc 2Gal 3GlcNAc), H type 3 (Fuc 2Gal 3GalNAc), và Lewis b (Fuc 1-2Gal 1-3 (Fuc 1-4) GlcNAc), trong đó bao gồm hai đặc điểm cấu trúc liên quan đến pluripotency (1-2Fuc và loại 1 LacNAc) như mô tả ở trên (bổ sung hình S3) Quan sát này là phù hợp với các báo cáo trước đây (45) trong đó Sulak et al nghiên cứu các đặc polisacarit-ràng buộc của BC2LCN chi tiết sử dụng microarray glycan và chuẩn độ microcalorimetry Họ cũng chứng minh rằng lectin này cũng liên kết với Globo H (Fuc 1-2Gal 1-3GalNAc 1-3Gal 1- 4Gal 1- 4Glc), mà gần đây đã được đề xuất như là một dấu hiệu loại glycosphingolipid pluripotency (bổ sung hình S4) (9, 45 ) Những kết quả này giải thích cơ chế như thế nào lectin này có thể được sử dụng như thăm dò để phân biệt pluripotency rBC2LCN có thể được

sử dụng để thăm dò các glycoprotein và có thể tất cả glycoconjugates mang Fuc 2Gal 1-3GlcNAc (GalNAc), trong khi chống SSEA3 và chống SSEA4 nhắm glycosphingolipids Từ một quan điểm tical người thực hiện, rBC2LCN là chi phí-hiệu quả bởi vì nó có thể được sản xuất với số lượng lớn bởi các E coli thường biểu hiện hệ thống sion (84 mg / lít) Như vậy, lectin này có thể là một đầu dò đa năng để đánh giá pluripotency

Ngược lại, Globo H cũng đã được báo cáo là overex- ép trong các khối u tế bào biểu

mô (46) Hơn nữa, 2- 6Sia up-regulated trong iPSCs / ESCs đã được báo cáo là overex- ép trong nhiều loại ung thư ở người, và sion biểu hiện cao của nó tích cực tương quan với sự di căn của khối u và chẩn tiên lượng kém (47) Như vậy, sự thay đổi polisacarit khi cảm ứng của pluripotency quan sát trong nghiên cứu này là dường như tương tựnhững xảy ra trong biến đổi

ác tính, như đã được ngụ ý gần đây (9) Mặc dù lý do cho sự tương đồng này vẫn còn để được làm sáng tỏ, những thay đổi glycan đặc trưng nên liên quan đến khả năng tăng sinh tế bào và bảo trì vĩnh cửu, tính chung cho cả hai tế bào ung thư và tế bào gốc đa năng

Polisacarit được đặt ở bề mặt tế bào ngoài cùng, nơi var- sự kiện ới diễn ra trên cơ sở công nhận và tương tác tế bào-to-cell Lectins nội sinh, ecules đối lớn mol- các polisacarit, cần đóng vai trò rất quan trọng trong các sự kiện (ví dụ bằng cách điều chỉnh số đường tín hiệu) Trong bối cảnh này, tương tác xảy ra giữa tions polisacarit bề mặt tế bào và lectins nội sinh được coi là cần thiết cho việc duy trì pluripotency, tự đổi mới, và sự khác biệt của iPSCs / ESCs (48) Thật vậy, proteoglycans sulfate heparan đã được báo cáo để điều chỉnh tự đổi mới

và pluripotency của tế bào gốc phôi (49) Hơn nữa, giảm sulfat trên sulfate heparan và chon-droitin sulfate đã được chứng minh để chỉ đạo sự khác biệt hóa thần kinh của ESCs chuột và iPSCs con người (50) Gần đây, các chất nền tổng hợp polisacarit bề mặt tế bào nhận được báo cáo để tạo thuận lợi cho các nền văn hóa lâu dài của các tế bào gốc đa năng (48) Như vậy, phân tích toàn cầu của glycomes tế bào của iPSCs và ESCs thực hiện trong nghiên cứu này sẽ là cần thiết để cung cấp cơ sở để khám phá những chức năng và các ứng dụng của tế bào gốc glycobi- ology Họ bao gồm thiết kế hợp lý của các chất nền có hiệu quả và điều kiện nuôi cấy để hỗ trợ công tác tuyên truyền lâu dài của ESCs và iPSCs (48) Tất nhiên, kết quả thu được trong nghiên cứu này cũng có thể được dễ dàng áp dụng cho nhuộm (đặc điểm kỹ thuật của nơi xảy ra sự kiện), làm giàu (ví dụ như Turing cap- lectin-hỗ trợ của các tế bào cần

thiết), và mục tiêu của các tế bào cụ thể (ví dụ như loại bỏ không mong muốn các tế bào không phân biệt) Về vấn đề này, tế bào gốc glycoengineering với sự trợ giúp của một microarray lectin là một vấn đề quan trọng trong việc thực hiện y học tái sinh trong tương lai gần