NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ CÂY BẰNG LĂNG NƯỚC (LAGERSTROEMIA SPECIOSA) THUỘC CHI TỬ VI (LAGERSTROEMIA)

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊNĐỖ MINH KIỆP NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ CÂY BẰNG LĂNG NƯỚC LAGERSTROEMIA SPECIOSA THUỘC CHI TỬ VI LAGERSTROEMIA LUẬN VĂN THẠC SỸ HÓA HỌC 2014

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐỖ MINH KIỆP

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ CÂY

BẰNG LĂNG NƯỚC (LAGERSTROEMIA SPECIOSA)

THUỘC CHI TỬ VI (LAGERSTROEMIA)

LUẬN VĂN THẠC SỸ HÓA HỌC

2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

ĐỖ MINH KIỆP

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA LÁ CÂY

BẰNG LĂNG NƯỚC (LAGERSTROEMIA SPECIOSA)

THUỘC CHI TỬ VI (LAGERSTROEMI)

LUẬN VĂN THẠC SỸ HÓA HỌC NGÀNH HÓA HỮU CƠ

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS TRƯƠNG CHÍ THÀNH

TS TÔN NỮ LIÊN HƯƠNG

2014

LỜI CẢM ƠN

Sau gần hai năm học tập và làm thực nghiệm, ngày hôm nay em đã hoànthành luận văn tốt nghiệp Một lời cám ơn chắc chắn sẽ không nói hết được tất cảnhưng xin cho em được gởi lời cám ơn chân thành đến:

Quý Thầy Cô trong bộ môn Hóa – khoa Khoa học Tự Nhiên, trường Đại họcCần Thơ Đặc biệt, em xin cám ơn thầy Lê Thanh Phước và cô Bùi Thị Bửu Huêđã truyền đạt cho em những kiến thức qúy báu cũng như là tạo những điều kiệntốt nhất để em hoàn thành luận văn

Xin cám ơn thầy Trương Chí Thành, người thầy đã tận tình hướng dẫn vàtạo mọi điều kiện để em hoàn thành đề tài

Xin gởi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành đến cô Tôn Nữ Liên Hương, cô

là người đã chỉ dẫn em thực hiện đề tài Trong quá trình làm đề tài có nhiều điều

em còn chưa biết, chưa hiểu thì cô là người đã chỉ dạy cho em, khơi dậy trong emniềm tin và sức mạnh tinh thần để em vượt qua khó khăn và từ đó hoàn thànhluận văn của mình

Cảm ơn các anh chị và các bạn trong lớp Hóa Hữu Cơ K19 đã động viên vàgiúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập

Cuối cùng là lời cảm ơn của con muốn gởi tới cha mẹ, cảm ơn cha mẹ đãluôn là chỗ dựa vững chắc cho con

Xin chân thành cảm ơn!!

Đỗ Minh Kiệp

Lagerstroemia speciosa L, is commonly in many countries in Asia such as

China, Philippines, Malaysia and Vietnam The leaves of this plant are used inPhilippines medical folk for many years The phytochemistry studies show thatthis plant contains active and medicinal compounds like corosolic acid,ellagitannins, tannic acids, phytosterols,…This study deals with the isolation andidentification of the compounds

The air-dried powdered leaves of Lagerstroemia speciosa L., (3kg) were

extracted three times with MeOH for 24 h at room temperature The methanolicextract was suspended in water and extracted with petroleum ether, chloroformand ethyl acetate to give petroleum ether (50 g), chloroform (6 g) and ethylacetate (6 g) as respectively This study only focus on the petroleum ether extract.From petroleum ether extract (50 g) was fractionated by column chromatographywith the gradient of solvents to yield 12 fractions Further separation andpurification of these fractions led to the isolation of seven compounds, including:

Stigmast-4-en-3-one, β-sitosterol-3-O-glucopyranoside, Ursolic acid, Arjunolic

acid, BL7, BL10, BL11 and one mixture of oleanolic and ursolic acid Thestructure of these compounds were characterized by 1H–NMR, 13C–NMR, DEPT–NMR, HMBC, HSQC, GC – MS and MS spectroscopic data

TÓM TẮT

Cây Bằng lăng nước thì rất phổ biến ở nhiều nước Châu Á như Trung Quốc,Philippines, Malaysia và Việt Nam Lá của loài cây này được dùng trong nền yhọc dân gian ở Philippines trong nhiều năm qua Những nghiên cứu về thànhphần hóa học cho thấy trong cây Bằng lăng nước có chứa nhiều chất có hoạt tínhdược học như acid corosolic, ellagitannins, tannic acids, phytosterols,…trongnghiên cứu này chỉ đề cập đến việc cô lập và nhận danh các hợp chất

Bột lá Bằng lăng khô (3 kg) được chiết 3 lần với methanol ở nhiệt độ phòngtrong 24 giờ Dịch chiết methanol được thêm nước vào và chiết với ether dầu hỏa,chloroform và ethyl acetate để thu được cao ether dầu hỏa (50 g), chloroform (6g) và ethyl acetate (6 g) Trong nghiên cứu này chỉ tập trung tiến hành khảo sáttrên cao ether dầu hỏa Từ 50 g cao ether dầu hỏa thực hiện sắc ký cột với dungmôi có độ phân cực tăng dần thu được 12 phân đoạn Tiến hành tinh chế các phânđoạn này cho phép cô lập được bảy hợp chất, bao gồm: Stigmast-4-en-3-one, β-

sitosterol-3-O-glucopyranoside, Ursolic acid, Arjunolic acid, BL7, BL10, BL11

và một hỗn hợp của oleanolic và ursolic acid Cấu trúc của các hợp chất được xácđịnh thông qua các dữ liệu phổ 1H–NMR, 13C–NMR, DEPT–NMR, HMBC,HSQC GC – MS và MS

LỜI MỞ ĐẦU

Nghiên cứu hóa thực vật về cây dược liệu đã và đang là lĩnh vực thu hút sựquan tâm của nhiều nhà khoa học Ngay từ khi nguồn thuốc tổng hợp chưa xuấthiện thì con người đã biết dùng các cây cỏ trong tự nhiên để làm thuốc chữa bệnh

Do đó, các nghiên cứu về cây dược liệu không chỉ là định danh, xác định cấu trúchóa học mà còn góp phần giải thích thỏa đáng những thành phần dược chất nàotrong cây có tác dụng chữa bệnh

Cây Bằng lăng nước vốn đã rất quen thuộc và phổ biến ở Việt Nam, là mộttrong những cây có trong danh mục cây thuốc Lá Bằng lăng non có vị hơi chátnên được người dân Nam Bộ dùng như là một loại rau ăn kèm với các món chiên,lẩu Ở Philippines, lá Bằng lăng non được sử dụng như một loại đông dược để trịbệnh béo phì và bệnh tiểu đường

Dù được tìm thấy ở nhiều nơi trên lãnh thổ Việt Nam nhưng cho đến naydược tính cũng như thành phần hóa học của Bằng lăng nước chưa thực sự đượcnghiên cứu nhiều Do đó, việc tìm hiểu về thành phần hóa học, dược tính của câyBằng lăng nước nói chung và lá Bằng lăng nước nói riêng là một công việc rất có

ý nghĩa Chính vì những lý do đó mà đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học

của lá cây Bằng lăng nước (Lagerstroemia speciosa) thuộc chi Tử vi (Lagerstroemia)” được chọn làm đề tài luận văn tốt nghiệp.

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề

Bằng Lăng nước (BLN) có tên khoa học là Lagerstroemia speciosa (L.) Pers., là một trong số 50 loài thuộc chi Tử Vi (Lagerstroemia) BLN có rất nhiều

công dụng trong đời sống hằng ngày, kể cả trong y học thì dược tính của nó cũngrất đáng để các nhà khoa học quan tâm

Từ những năm 1990, sự phổ biến của loại thảo dược này đã thu hút sự chú ý

của các nhà khoa học trên khắp thế giới, đã có một số nghiên cứu in vitro và in

vivo cho thấy dịch chiết từ lá Bằng lăng nước có tác dụng làm hạ đường huyết và

chống bệnh tiểu đường Nhiều hoạt chất khác nhau, cũng như sự phân bố củachúng theo từng bộ phận của cây đã được báo cáo Những loại hợp chất trong câyđược quan tâm nhiều nhất, đã thử nghiệm và được xác nhận là có hoạt tính nhưcác tannin, triterpene, các sterol thực vật,…Ví dụ như trong vỏ BLN đã tìm được

một số chất như corosolic acid, ellagic acid, β-sitosterol và các đồng phân của nó,

…[1-2]

HO

CO 2 H HO

H

O O

O

HO

H 3 CO

O O

OH

HO HO

3'-O-methyl-3,4-methylenedioxy ellagic acid

Hình 1.1 Một số hợp chất đã được phân lập từ cây Bằng Lăng nước

Năm 2009, Banrun Kanti Saha và các cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng hạđường huyết – chống tiểu đường của dịch chiết từ lá BLN dựa trên nghiên cứucủa Kakuda vào năm 1996 [3-4] Theo đó đã chứng minh được dịch chiết BLN cótác động chống tăng cân và hạ đường huyết Ellagitannin thu được từ dịch chiết láBLN được xem là chất hoạt hóa sự vận chuyển glucose trong tế bào [5] Sự đánhgiá hoạt tính kháng xơ hóa ở gan của BLN được Vinoth Prabhu xác định [6].Ngoài ra, nhiều nghiên cứu khác đã xác định BLN có chứa rất nhiều hoạt tínhkhác nhau, ngoài những hoạt tính kể trên, dịch chiết từ lá BLN còn có tác dụngbắt giữ gốc tự do, kháng viêm, giảm uric acid bằng cách ức chế xanthine oxidase,

…[5-7]

Trong tất cả các hoạt tính có được thì khả năng chống tiểu đường, béo phìlà tiêu biểu nhất, với rất nhiều nghiên cứu được thực hiện nhằm khẳng định hoạtchất chính trong cây BLN chịu trách nhiệm cho tác dụng đó Đặc biệt là ở Nhật

Bản, các nghiên cứu in vivo và in vitro cho thấy các chất trong BLN có hoạt động

tương tự insulin Trên chuột béo phì và bị tiểu đường, lá BLN làm chậm tăng cânvà kiểm soát nồng độ glucose trong máu Nhiều nhà khoa học cho rằng corosolicacid là hoạt chất chính có khả năng hạ đường huyết – chống tiểu đường Một sốlại cho rằng các gallotannin mới chính là chất chịu trách nhiệm cho tác dụng đó,

trong đó Penta-O-galloyl-glucopyranose (PGG) là gallotannin tiềm năng nhất [1].

Để xác định chính xác từng tác dụng dược lý của BLN có được là do hợpchất nào đảm nhận Việc xác định đầy đủ khách quan thành phần hóa học của câylà một yêu cầu cấp thiết Do đó, các nghiên cứu về thành phần hóa học của cácloại dịch chiết từ BLN đã được thực hiện Năm 2009, S.M Mizanur Rahman vàcộng sự đã nghiên cứu các chất có hoạt tính trong dịch chiết petroleum ether củalá cây BLN Họ đã xác định được hai hợp chất là octanol và một đồng phân của

β-sitosterol [8] Gần đây nhất các nhà hóa học Trung Quốc đã công bố báo cáo về

14 hợp chất thu được từ lá BLN, bao gồm 4 triterpene, 8 ellagic acid, 1 courmarinvà 1 neolignan [2] Việc tách chiết và xác định cấu trúc của các chất từ BLN ngàycàng mở rộng

Từ kết quả của nhiều nghiên cứu trên thế giới, giá trị của cây BLN đã đượcbiết đến nhiều hơn ở Việt Nam Các công dụng của nó cũng đã được nhiều ydược sĩ biết đến, thành phần hóa học của dịch chiết từ các bộ phận của cây BLN

lý của BLN là do hoạt chất nào đảm nhận, nó phân bố ở bộ phận nào trong cây rấtkhó khăn Vấn đề đó đòi hỏi phải có nhiều nghiên cứu chuyên sâu, có sự kết hợpgiữa hóa học, sinh học, y học,…mà tiên phong phải là các nghiên cứu về thànhphần hóa học của BLN.

Ở một số nước trên thế giới như: Hoa Kỳ, Nhật Bản, Philippines,… các chếphẩm từ lá Bằng Lăng nước đã có mặt trên thị trường Ở Việt Nam, với lợi thế làđiều kiện khí hậu và thổ nhưỡng rất thích hợp cho cây Bằng Lăng nước, do đó, sốlượng cây phân bố trong các cánh rừng cũng như mọc hoang dại rất lớn Mặckhác, do được trồng làm cảnh rất nhiều, hằng năm phải tỉa cành, số lượng cành lásau khi tỉa đa số được bỏ đi Việc làm đó vô tình đã đánh mất đi một lượng dượcliệu vô cùng lớn

Đáp ứng những thực trạng trên, các nghiên cứu về cây Bằng Lăng nước ởnước ta cũng đã manh nha trong những năm gần đây Ví dụ như nghiên cứu sơ bộvề thành phần hóa học của cây BLN của Nguyễn Quyết Tiến [9], tuy nhiên vẫnchưa có nghiên cứu nào cho kết quả đầy đủ và khách quan và số lượng cũng rấthạn chế, chưa được lặp lại Việc mở rộng nghiên cứu về cây Bằng Lăng nước làcần thiết, do đó, trong khuôn khổ một luận văn đại học, đề tài: “Góp phần khảosát thành phần hóa học cao petroleum ether của lá cây Bằng Lăng nước

Lagerstroemia speciosa (L.) Pers.” đã được chọn làm mục tiêu nghiên cứu chính.

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Tìm hiểu về loài Bằng Lăng nước Lagerstroemia speciosa (L.) Pers., họ

Lythraceae

Phân lập và xác định cấu trúc chất thu được từ lá cây Bằng Lăng nước

Lagerstroemia speciosa (L.) Pers., họ Lythraceae.

1.3 Nội dung nghiên cứu

- Thu hái và xử lý nguyên liệu lá Bằng Lăng nước, nghiền lấy bột lá

- Tiến hành chiết cao methanol (cao tổng)

- Thực hiện chiết các cao phân đoạn

- Phân lập chất từ cao petroleum ether bằng sắc ký cột và sắc ký lớp mỏng

- Xác định cấu trúc hợp chất tinh khiết từ dữ liệu phổ thu được

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về thực vật

2.1.1 Khái quát về chi Tử Vi

Chi Tử Vi hay chi Bằng Lăng (Lagerstroemia) là một chi có khoảng 50 loài

cây, riêng ở Việt Nam đã thống kê được khoảng 20 loài thuộc chi này Các loàitrong chi này có đặc tính rụng lá sớm vào mùa đông, thân gỗ hay cây bụi lớn, cónguồn gốc ở vùng Đông Á và Australia

Cấu trúc thân cây Bằng Lăng có gân tạo nếp máng, hàng năm đều lột vỏ,bên trong là phần gỗ cứng Lá mọc đối, đơn, mép lá có răng cưa và dao động từ 5– 20 cm theo chiều dài Hoa có 6 hay 7 cánh, mép cánh có ngấn nhăn nhỏ trên cáccuống hoa, phình ra giữa các đài hoa Hoa mọc thành cụm dài dạng bông và cóthể có màu trắng, hồng, tía hay tím Quả dạng nang, ban đầu có màu xanh lục, khichín chuyển thành màu đen, được mở dọc theo 6 hay 7 đường, dạng răng giốngnhư của đài hoa, và giải phóng nhiều hạt nhỏ

 Một số loài thuộc chi Tử Vi :

Ở Việt Nam có nhiều loài thuộc chi Tử Vi, có thể kể đến một số loài nhưsau:

- Lagerstroemia speciosa (L.) Pers (Bằng Lăng nước): cây gỗ lớn, hoa đỏ tím,

phiến lá hình bầu dục, cứng, không lông

- Lagerstroemia calyculata Kurz (Bằng Lăng ổi hay Bằng Lăng vỏ nhẵn): cây

gỗ lớn, hoa trắng, phiến lá thon, có lông dày mặt dưới

- Lagerstroemia floribunda Jack (Bằng Lăng nhiều hoa): cây gỗ lớn, cao 10 –

15 m, hoa trắng và hoa tím trộn nhau, phiến lá bầu dục, không lông

- Lagerstroemia indica Linn (Tử Vi hay Bằng Lăng sẻ): cây gỗ, hoa màu

hường, lá có phiến xoan, không lông

- Lagerstroemia tomentosa Presl (Bằng Lăng lông hay Săng lẻ): cây gỗ lớn,

cao khoảng 15 m, lá có phiến to, mặt dưới đầy lông hình sao vàng

- Lagerstroemia lecomtei Gagn (Bằng Lăng lùn hay Bằng Lăng lá nhỏ): cây

gỗ, cao 4 – 6 m, lá có phiến tương đối nhỏ, không lông

- Lagerstroemia reginae Roxb (Bằng Lăng tiên): cây gỗ lớn, cao khoảng 10 m,

hoa màu lam, lá có phiến to, không lông [10]

2.1.2 Giới thiệu về Bằng Lăng nước

2.1.2.1 Thực vật học, hình thái và phân bố

Bằng Lăng nước là một trong số khoảng 50 loài thuộc chi Tử Vi Bằng Lăng

nước còn có nhiều tên gọi khác nhau như: Tử Vi tàu, Bàng Lang tiên, Giant

Crape-myrtle, Queen’s Crape-myrtle, Banabá Plant (Philippines), Pride of India.

Phân loại thực vật:

Hình 2.1 Vị trí của Bằng Lăng nước trong hệ thống phân loại thực vậtBằng Lăng nước là loại cây thân gỗ lớn cao khoảng 12 đến 18 m, đườngkính từ 20 – 40 cm Tán hình trứng rộng, dày, xanh thẫm Thân không thật thẳng,phân cành sớm, cành mọc ngang với rất nhiều cành nhỏ mang lá Vỏ nâu xám, ítnứt, thịt vỏ mỏng, màu vàng nhạt, dày 1 – 1,2 cm Lá đơn, mọc cách hay gần đối,màu xanh lục khi non, màu đỏ khi già Phiến lá hình bầu dục, cứng, không lông,

Giới: Plantae (Thực vật)

Ngành: Magnoliophyta (Thực vật có

hoa)

Lớp: Magnoliopsida (Thực vật 2 lá

mầm)

Bộ: Myrtales (Đào kim nương)

Họ: Lythraceae (Bằng Lăng)

Chi: Lagerstroemia (Tử Vi)

Loài: L speciosa (Bằng Lăng nước)

dài đến 20 cm, cuống to Cụm hoa chùm, mọc ở đỉnh cành, hình tháp, mang nhiềuhoa Nụ hoa hình cầu, màu tím hồng Hoa lớn có 6 cánh, nhăn nheo trong nụ vàkhi mới nở, có cựa ngắn, màu đỏ tím hay tím hồng [10-11].

Hình 2.2 Cây Bằng Lăng nước

Hình 2.3 Lá và thân cây Bằng Lăng nướcBằng Lăng nước ra hoa vào giữa mùa hè, thường nở rộ vào khoảng tháng 6.Quả nang, hình trứng, quả mọc thành chùm, kích thước 20×18 mm, nằm trong đài

Hình 2.4 Hoa và quả Bằng Lăng nướcMặc dù có nguồn gốc từ Ấn Độ, Bằng Lăng nước đã nhanh chóng được dunhập và phát triển ở nhiều nước trên thế giới Cây sinh trưởng tốt ở những nơi khíhậu ấm áp, như khu vực Đông Á, Ý, miền nam nước Pháp và bán đảo Iberia.Ngoài ra, chúng cũng phát triển mạnh ở vùng khí hậu ôn đới nhưng độ ẩm tươngđối thấp như miền nam Texas và California, ở các nước vùng Nam và Đông Nam

Á như: Mianma, Malaysia, Thái Lan, Lào, Campuchia, Philippines Ở Nam TrungQuốc, Ấn Độ và Australia cũng gặp loài này

Ở Việt Nam, cây được gọi đơn giản là Bằng Lăng, mọc rất nhiều ở khu vựcmiền Bắc Trung Bộ, Đông Nam Bộ và Tây Nguyên Cây phát triển mạnh và mọcthành rừng Gần đây, cây được trồng phổ biến ở các đô thị hoặc khu dân cư để tạocảnh quan đẹp, tiêu biểu là các đô thị vùng Đồng bằng sông Cửu Long như thànhphố Cần Thơ, thị xã Sa Đéc, Trà Vinh Do đó, BLN từ lâu đã trở thành loài câyquen thuộc và gần gũi với mọi người

2.1.2.2 Đặc điểm sinh học

Ở Việt Nam, Bằng Lăng nước là loài cây phân bố trong các kiểu rừng nửa

rụng lá và rừng khô rụng lá cùng với loài Bằng Lăng vỏ nhẵn (Lagerstroemia

calyculata Kurz.), nhưng không phổ biến bằng loài này vì BLN đòi hỏi đất sâu,

dày và ẩm hơn Cây có biên độ sinh thái rộng Độ cao phân bố của BLN khôngquá 700 m so với mặt nước biển, thường mọc trên đất feralit đỏ vàng phát triểntrên sa thạch hoặc phiến thạch sét, ở vùng có khí hậu nhiệt đới với hai mùa mưavà khô rõ rệt BLN thường mọc xen với các loài cây rụng lá khác [10]

BLN là cây ưa sáng khi trưởng thành, nhưng khi còn non hơi ưa bóng, vìvậy nên nó phát triển tốt dưới tán rừng có tàn che nhẹ Cây tái sinh bằng chồi tốt,tái sinh tự nhiên bằng hạt kém, thường tái sinh tự nhiên tốt nơi quang trống,nhưng khả năng cạnh tranh với cỏ dại kém, nên quanh cây mẹ thường ít gặp câycon [11].

Cây rụng lá vào đầu mùa đông, ra lá non vào tháng 3 – 4 Mùa hoa vàotháng 5 – 6, mùa quả từ tháng 8 – 10

2.1.2.3 Một số ứng dụng và dược lý của Bằng Lăng nước

Bằng Lăng nước là cây gỗ có kích thước trung bình, thân cây thường khôngthẳng nhưng cứng và bền nên được dùng làm cột, các vật dụng gia đình, đồ gỗ,khung cửa Đôi khi, gỗ của nó còn được dùng để sản xuất bột giấy

Vì cây có dáng đẹp: thân xù xì, cành nhiều, tán lá rộng, hoa đẹp với màu tímđặc trưng được nhiều người ưa thích nên ứng dụng phổ biến và quen thuộc nhấtcủa BLN là trồng để tạo bóng mát và cảnh quan cho công viên, trường học, côngsở Mặc khác, BLN có chiều cao trung bình, không vượt quá tầm cao dây điệnnên cũng thường được trồng dọc theo các con đường tạo cảnh quan đô thị

Cây mọc khỏe, nảy chồi mạnh nên thích hợp để trồng làm bonsai, cây thế,hoặc làm gốc ghép cho các chồi cây có hoa đẹp khác thuộc chi Bằng Lăng

(Lagerstroemia).

Hoa chứa tinh dầu có mùi thơm nên có thể dùng để điều chế nước hoa [11].Lá Bằng Lăng từ xưa đã được người Philippines sử dụng như một loại đôngdược để trị bệnh tiểu đường và béo phì Họ dùng lá BLN sắc lấy nước uống hoặcdùng lá non làm trà uống hằng ngày

Ngoài ra, một số vùng còn sử dụng vỏ cây BLN sắc với nước uống để trịđau và loét dạ dày, rễ trị sốt, trái đắp trị lở miệng, hạt trị mất ngủ Mặc dù phân bốrộng và nhiều với rất nhiều công dụng khác nhau nhưng cho đến nay, dược tínhvà thành phần hóa học của BLN chưa được nghiên cứu sâu và ứng dụng ở ViệtNam [11]

2.2 Một số hợp chất được cô lập từ lá cây Bằng lăng nước

Kết tinh trong chloroform, tinh thể hình kim

Nhiệt độ nóng chảy: 169 – 170oC

Công thức phân tử: C29H48O

Công thức cấu tạo:

Kết tinh trong chloroform, tinh thể hình kim

Nhiệt độ nóng chảy: 156 – 160oC

Công thức phân tử: C28H48O

Công thức cấu tạo:

 β – sitosterol

Kết tinh trong chloroform, tinh thể hình kim

Nhiệt độ nóng chảy: 139 – 142oC

Công thức phân tử: C29H50O

Công thức cấu tạo:

Kết tinh trong hỗn hợp chloroform và methanol, tinh thể màu trắngNhiệt độ nóng chảy: 283 – 285oC

Công thức phân tử: C30H48O3

Công thức cấu tạo:

 Oleanolic acid

Kết tinh trong hỗn hợp chloroform và methanol, tinh thể màu trắngNhiệt độ nóng chảy: 308 – 310oC

Công thức phân tử: C30H48O3

Công thức cấu tạo:

Kết tinh trong hỗn hợp chloroform và methanol, tinh thể màu trắngNhiệt độ nóng chảy: 277 – 278oC

Công thức phân tử: C30H48O4

Công thức cấu tạo:

Oleanolic acid

HO

OH O

Corosolic acid

HO

OH O

H

HO

 β-sitosterol-3-O-glucopyranoside

Kết tinh trong methanol, tinh thể màu trắng

Nhiệt độ nóng chảy: 269 – 270oC

Công thức phân tử: C35H60O6

Công thức cấu tạo:

 3,7,8-tri-O-methylellagic acid

Kết tinh trong methanol, tinh thể dạng bột màu trắngNhiệt độ nóng chảy: 289 – 290oC

Công thức phân tử: C17H12O8

Công thức cấu tạo:

β-sitosterol-3-O-glucopyranoside

O O

3,7,8-tri-O-methylellagic acid

O

O O

HO O O

O O

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện

3.1.1 Hóa chất

Bảng 3.1: Bảng liệt kê hóa chất sử dụng

3.1.2 Dụng cụ, thiết bị

- Tủ sấy Ecocell, đèn UV

- Đèn cồn, ống mao quản

- Cột sắc ký, giá đỡ

- Bếp điện ALMA

- Bình lóng, phễu chiết

- Máy cô quay Heidolph

- Cốc thủy tinh, bình cầu, ống nhỏ giọt, pipet, ống đong, lọ thủy tinh…

3.1.3 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài

Từ 9/2013 đến 12/2013

Địa điểm: Phòng Thí nghiệm Hóa Hữu Cơ 1 và Phòng Thí Nghiệm HóaDược, Khoa Khoa học Tự Nhiên, trường Đại học Cần Thơ

3.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Phương pháp chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây

− Sắc ký cột

- Sắc ký lớp mỏng

- Kỹ thuật chiết ngâm dầm và chiết lỏng – lỏng

3.2.2 Phương pháp xử lý làm sạch hợp chất hữu cơ

Các hợp chất sau quá trình sắc ký cột, dù đôi khi quan sát bằng mắt thườngthấy hợp chất ở dạng bột trắng, sắc ký lớp mỏng sử dụng nhiều loại hệ dung môikhác nhau vẫn chỉ cho một vết gọn đẹp, những hợp chất này chỉ đạt độ tinh khiết

90 – 95% mà thôi Sở dĩ như thế là vì một tinh thể của hợp chất nếu có thể quansát được bằng mắt thường là gồm rất nhiều phân tử của hợp chất đó kết hợp vớinhau, trong quá trình kết hợp này, chúng cũng gom luôn một ít các phân tử tạpbẩn từ môi trường bên ngoài vào và lượng này khá ít nên không thể nhìn thấybằng mắt thường Do đó, cần phải kết tinh lại để hợp chất đạt độ tinh khiết caohơn, thuận lợi cho quá trình xác định cấu trúc của hợp chất sau này Thôngthường có thể kết tinh nhờ nhiệt độ lạnh hoặc kết tinh phân đoạn – tức là dựa vàođộ hòa tan khác nhau của chúng trong một dung môi thích hợp

3.2.3 Phương pháp thủy giải các ceramide và cerebroside

Đối với các hợp chất béo có chứa các dây carbon dài như các hợp chấtceramide và cerebroside thì rất khó để xác định cấu trúc hóa học bằng phươngpháp phổ nghiệm Vì thế, người ta thường tiến hành thủy giải để khảo sát riêngphần đường và dây béo

Thủy giải bằng dung dịch acid trong methanol để cắt đứt nối amide của dâybéo đồng thời cắt đứt nối của phần đường gắn vào phần aglycon qua nhóm −OH

3.3 Thực nghiệm

3.3.1 Thu hái và xử lý nguyên liệu

- Thu hái nguyên liệu

Lá Bằng Lăng nước được thu hái từ những cành cần tỉa trong đợt tỉa cành,dọn dẹp khuôn viên ở trường Đại học Cần Thơ

- Xử lý nguyên liệu

Lá Bằng Lăng nước sau khi thu hái được rửa sạch bằng nước, để ráo tựnhiên trong mát, cắt nhỏ, phơi gió, sau đó đem sấy ở 55ºC đến khi khối lượngkhông đổi

Hình 3.1 Lá Bằng Lăng nước sau khi thu hái và rửa sạch

Hình 3.2 Lá Bằng Lăng nước sau khi cắt nhỏ và phơi khô

Mẫu khô được nghiền bằng máy đến kích thước thích hợp, khối lượng bột láthu được là 3 kg, tiếp đến cho mẫu vào các túi vải đã chuẩn bị sẵn

3.3.2 Tách chiết và thu cao

Mẫu bột cây được chiết với methanol bằng phương pháp ngâm dầm mỗi lầnngâm khoảng 24 giờ để thu được dịch chiết Dịch chiết của các lần được gom lại

cô quay đuổi dung môi thu được cao methanol (cao tổng)

Điều chế cao Petroleum ether, cao Chloroform, cao Ethyl acetate bằngphương pháp chiết lỏng – lỏng, sơ đồ tổng quát (Hình 3.4) bên dưới

Hình 3.3 Sơ đồ tổng quát điều chế các cao phân đoạn

 Quá trình điều chế thu cao methanol (cao tổng)

Đặt các túi mẫu vào trong các bình thủy tinh 10 lít, đổ dung môi methanolvào bình đến vừa ngập các túi mẫu

Lá cây tươi

Cao methanol

Ngâm dầm với methanol

Cô quay dịch chiết đuổi dung môi

Dịch chiết còn lại (không khảo sát)

Loại bỏ các lá hư, có sâu bọ

Rửa sạch, phơi gió

Sấy ở 55ºCNghiền mịn

Chiết lỏng – lỏng với PE

Dịch chiết còn lại

Bột lá cây

Cao PE

Chiết lỏng – lỏng với chloroform

Cao chloroformDịch chiết còn lại

Cao Ea

Chiết lỏng lỏng với Ea

Sau khi ngâm các túi mẫu trong methanol khoảng 24 giờ, dịch chiết trongbình được thu lại, sau đó tiếp tục cho các túi mẫu lại vào bình thủy tinh, cho tiếpmethanol vào bình và ngâm trong 24 giờ nữa Quá trình này được lặp lại 4 lần,đến lần thứ 4 thì dịch chiết trong bình đã rất nhạt màu, đồng thời tiến hành SKLMdịch chiết này thấy không còn vết nên không tiến hành chiết nữa Tất cả dịchchiết được gom lại đem đi lọc để loại bỏ các bột cây mịn mà túi vải không giữ lạiđược.

Dịch chiết sau khi lọc được đem đi cô quay, thu hồi dung môi, thu được caomethanol ở dạng sệt, đậm màu, chủ yếu là vật chất khô và nước, có khối lượng là

80 g

Hiệu suất điều chế cao tổng:

% 67 , 2 1000

* 3

100

* 80

 Điều chế các cao phân đoạn từ cao methanol

Các cao phân đoạn được điều chế từ cao methanol qua phương pháp chiếtlỏng – lỏng Ở đây, thực hiện chiết cao tổng với PE, chloroform, và Ea Phần dịchchiết còn lại sau khi chiết với ba dung môi trên được lưu trữ lại, không khảo sát.Cao petroleum ether sau đó được lựa chọn để tiếp tục khảo sát trước tiên

a) Quá trình điều chế thu cao petroleum ether

Sử dụng bình lóng loại 500 mL, lấy mỗi lần khoảng 40 g cao methanol Chonước vào bình lóng trước, thể tích nước cho vào tương đương với thể tích 40 gcao trên theo tỉ lệ 1 : 1 Thêm tiếp khoảng 200 – 300 mL PE vào, lắc đều bìnhlóng, sau đó để yên khoảng 15 phút cho dung dịch phân lớp Lấy lớp PE ở trên,lớp nước ở dưới tiếp tục được chiết với PE, quá trình được lặp lại nhiều lần Chođến khi quan sát thấy lớp PE ở trên không màu, đồng thời kiểm tra lại bằngSKLM không thấy hiện vết nữa thì dừng việc chiết

Quá trình trên được lặp lại tương tự với 40 g cao tổng còn lại Lớp PE của

Hiệu suất chiết cao PE từ cao methanol là:

% 5 , 62 80

100

* 50





H

b) Quá trình điều chế cao chloroform

Lớp nước còn lại sau khi chiết với dung môi PE tiếp tục được chiết vớichloroform Quá trình chiết với chloroform cũng tương tự như với PE, nhưng dochloroform nặng hơn nước nên trong phân đoạn này sẽ thu lấy lớp chloroform ởdưới, lớp nước sẽ ở phía trên Khi lớp dung môi ở dưới hết màu, đồng thời SKLMkhông còn thấy vết thì dừng lại Gom lớp chloroform của tất cả lần chiết lại, côquay thu hồi dung môi Sau khi khô, khối lượng cao chloroform thu được là 6 g.Hiệu suất chiết cao chloroform từ cao tổng là:

% 5 , 7 80

100

* 6





H

c) Quá trình điều chế cao Ea

Sau khi chiết với chloroform, dịch chiết còn lại tiếp tục được chiết với Ea.Quá trình chiết cao tương tự như chiết với PE, vẫn lấy lớp dung dịch phía trên do

Ea nhẹ hơn nước Các công đoạn sau thực hiện như khi lắc cao PE, sau khi côquay thu hồi dung môi, khối lượng cao Ea thu được là 6 g

Dịch chiết còn lại sau khi chiết với Ea được lưu trữ lại, không khảo sát.Hiệu suất chiết cao ethyl acetate từ cao tổng là:

% 5 , 7 80

100

* 6

3.3.3 Phân lập và tinh chế

Sử dụng SKC để tách và tinh chế các chất

Dò tìm hệ dung môi giải ly cột, kiểm tra quá trình SKC và mức độ tinh sạchcủa hợp chất bằng SKLM

Cao chloroform và ethyl acetate được lưu trữ lại, cao PE được tiến hànhkhảo sát tiếp tục.

 Sắc ký cột cao petroleum ether

Sử dụng phương pháp sắc ký cột thường để phân tích cao PE có khối lượng

50 g, sử dụng 1000 g silica gel loại F254, cột sắc ký có đường kính 10 cm Từ kếtquả SKLM cao PE thu được bên trên, thực hiện sắc ký cột với dung môi giải lyđầu tiên là PE (100%), sau đó tăng dần độ phân cực của dung môi giải ly bằngcách tăng dần tỉ lệ Ea Dung dịch ra khỏi cột được cho vào các lọ thủy tinh vớithể tích mỗi lần hứng là 100 mL

Hình 3.4 SKLM và SKC của cao PETheo dõi quá trình SKC bằng SKLM, các lọ dung dịch có vết giống nhauđược gom lại một phân đoạn Kết quả SKC cao PE được trình bày trong Bảng 3.1và Hình 3.5

CHCl3 : CH3OH(9 : 1)

Bảng 3.1: Kết quả sắc ký cột cao PE

Ghi chú

hiện rõ

4, 15 Khảo sát

Hình 3.5 Kết quả của quá trình sắc ký cột cao PE

Cao PE (50 g)

Phân đoạn VI

Phân đoạn XI

BL4, BL5

BL10

BL11 BL3

Phân đoạn

BL8

Phân đoạn VIII

BL9

 Khảo sát phân đoạn III

Tiến hành SKC phân đoạn III có khối lượng 3,70 g với cột có đường kính 3

cm, sử dụng 40 g silica gel làm pha tĩnh Giải ly cột đầu tiên với hệ dung môi PE :

Ea (95 : 5), sau đó tăng dần độ phân cực của hệ dung môi giải ly lên

Dung dịch ra khỏi cột được hứng vào các lọ thủy tinh với thể tích khoảng 30

mL Thực hiện SKLM để theo dõi quá trình chạy cột, các lọ dung dịch có kết quảSKLM giống nhau được gom lại, cô quay thu hồi dung môi Kết quả SKC phânđoạn này thu được 5 phân đoạn nhỏ hơn (Bảng 3.2)

Bảng 3.2: Kết quả SKC phân đoạn III

giải ly SKC

Dung môi giải ly SKLM

Kết quả

SKLM

Khốilượng(g)

Ghi chú

- Khảo sát phân đoạn III.3

Phân đoạn III.3 sau khi đuổi dung môi có khối lượng 0,73 g Tiến hành SKCphân đoạn này bằng 10,0 g silica gel Sử dụng cột có đường kính khoảng 2 cm.Giải ly cột đầu tiên với hệ dung môi PE : Ea (9 : 1), sau đó tăng dần độ phân cựccủa hệ dung môi giải ly lên

Dung dịch ra khỏi cột được cho vào các lọ thủy tinh với thể tích khoảng 10

mL mỗi lần Thực hiện SKLM để theo dõi quá trình chạy cột, các lọ thủy tinh cókết quả SKLM giống nhau được gom lại, để khô tự nhiên Kết quả SKC phânđoạn này thu được 4 phân đoạn nhỏ hơn (Bảng 3.3)

Bảng 3.3: Kết quả SKC phân đoạn III.3

giải ly SKC

Dung môi giải ly SKLM

lượng(g)

Ghi chú

- Khảo sát phân đoạn III.3.3

Phân đoạn III.3.3 sau khi đuổi dung môi có khối lượng 0,27 g Tiến hànhSKC phân đoạn này bằng 5,0 g silica gel Sử dụng cột có đường kính khoảng 2

cm Giải ly cột đầu tiên với hệ dung môi PE : Ea (9 : 1), sau đó tăng dần độ phâncực của hệ dung môi giải ly lên

Dung dịch ra khỏi cột được cho vào các lọ thủy tinh với thể tích khoảng 10

mL mỗi lần Thực hiện SKLM để theo dõi quá trình chạy cột, các lọ thủy tinh cókết quả SKLM giống nhau được gom lại, để khô tự nhiên Kết quả SKC phânđoạn này thu được 3 phân đoạn nhỏ hơn (Bảng 3.4)

Bảng 3.4: Kết quả SKC phân đoạn III.3.3

Phân

đoạn

Dung môi giải ly SKC

Dung môi giải ly SKLM

lượng(g)

Ghi chú

III.3.3.2 PE:Ea (8:2) PE:Ea (8:2) 1 vết còn dơ trên 0,022 Khảo sát

Phân đoạn III.3.3.2 thu được là một vết nhưng còn dơ phía trên Sau khiđuổi hết dung môi, tiến hành tinh chế bằng cách rửa tinh thể Kết quả trên SKLMcho thấy chỉ có một vết tròn, duy nhất Hợp chất này được ký hiệu là BL3 vàđược gởi đi đo phổ.

Tiến hành SKC phân đoạn IV có khối lượng 3,75 g với cột có đường kính 3

cm, sử dụng 40 g silica gel làm pha tĩnh Giải ly cột đầu tiên với hệ dung môi PE :

Ea (9 : 1), sau đó tăng dần độ phân cực của hệ dung môi giải ly lên

Dung dịch ra khỏi cột được hứng vào các lọ thủy tinh với thể tích khoảng 30

mL Thực hiện SKLM để theo dõi quá trình chạy cột, các lọ dung dịch có kết quảSKLM giống nhau được gom lại, cô quay thu hồi dung môi Kết quả SKC phânđoạn này thu được 4 phân đoạn nhỏ hơn (Bảng 3.5)

Bảng 3.5: Kết quả SKC phân đoạn IV

Ghi chú

IV.3 PE : Ea (7 : 3) C : Me (9 : 1) 2 vết hiện rõ 0,65 Khảo sátIV.4 PE : Ea (1 : 1) C : Me (8 : 2) 1 vệt dài nhiều màu 0,29

- Khảo sát phân đoạn IV.3

Phân đoạn IV.3 sau khi đuổi dung môi có khối lượng 0,65 g Tiến hànhSKC phân đoạn này bằng 10,0 g silica gel Sử dụng cột có đường kính khoảng 2

cm Giải ly cột đầu tiên với hệ dung môi PE : Ea (8 : 2), sau đó tăng dần độ phâncực của hệ lên

Dung dịch ra khỏi cột được cho vào các lọ thủy tinh với thể tích khoảng 10

mL mỗi lần Thực hiện SKLM để theo dõi quá trình chạy cột, các lọ thủy tinh cókết quả SKLM giống nhau được gom lại, để khô tự nhiên (Bảng 3.5)

Bảng 3.6: Kết quả SKC phân đoạn IV.3

Ghi chú

giải ly SKC (g)

Phân đoạn IV.3.2 cho 2 vết rõ ràng, do đó các lọ bi được gom lại và làm khôdung môi Sau đó, tiến hành SKC phân đoạn này Sử dụng pipet dài 15 cm, đườngkính khoảng 1 cm, silica gel (Merck) Giải ly cột đầu tiên bằng hệ dung môi PE:

Ea (8:2), sau đó tăng dần độ phân cực của dung môi, dùng lọ hứng có thể tích 10

mL Kết quả thu được hai phân đoạn cùng cho một vết duy nhất, ký hiệu là BL4và BL5

BL4 và BL5 được tiến hành kiểm tra bằng SKLM với 3 hệ dung môi khácnhau trước khi gửi đi đo phổ Ba hệ dung môi chọn là CHCl3 : CH3OH (95 : 5),

PE : Acetone (6 : 4), PE : Ea (7 : 3), kết quả là với cả ba hệ dung môi đều cho kếtquả là một vết xanh dương duy nhất Qua kết quả SKLM nhận thấy hợp chất BL4và BL5 đã sạch Gửi hợp chất này đi đo phổ

Phân đoạn VI sau khi đuổi dung môi có khối lượng 0,76 g Tiến hành SKCphân đoạn này bằng 10,0 g silica gel Sử dụng cột có đường kính khoảng 2 cm.Giải ly cột đầu tiên với hệ dung môi PE : Ea (8 : 2), sau đó tăng dần độ phân cựccủa hệ lên

Dung dịch ra khỏi cột được cho vào các lọ thủy tinh với thể tích khoảng 10

mL mỗi lần Thực hiện SKLM để theo dõi quá trình chạy cột, các lọ thủy tinh cókết quả SKLM giống nhau được gom lại, để khô tự nhiên (Bảng 3.7)

Bảng 3.7: Kết quả SKC phân đoạn VI

Kết quả

SKLM

Khốilượng(g)

Ghi chú

VI.5 Ea 100% Ea: Me (9:1) Vệt dài 0,11

- Khảo sát phân đoạn VI.4

Tiến hành SKC phân đoạn VI.4 có khối lượng 0,14 g với cột là pipet dàikhoảng 15 cm, đường kính 1 cm Sử dụng silica gel (merck) làm pha tĩnh Giải lycột đầu tiên với hệ dung môi PE : Ea (7 : 3), sau đó tăng dần độ phân cực của hệdung môi giải ly lên

Dung dịch ra khỏi cột được hứng vào các lọ thủy tinh với thể tích khoảng 10

mL Thực hiện SKLM để theo dõi quá trình chạy cột, các lọ dung dịch có kết quảSKLM giống nhau được gom lại, để khô tự nhiên Kết quả SKC phân đoạn nàythu được 4 phân đoạn nhỏ hơn (Bảng 3.8)

Bảng 3.8: Kết quả SKC phân đoạn VI.4

Kết quả

SKLM

Khốilượng(g)

Ghi chú

- Khảo sát phân đoạn VI.4.3

Phân đoạn VI.4.3 thu được là một vết nhưng còn dơ phía trên Sau khi đuổihết dung môi, tiến hành tinh chế bằng cách rửa tinh thể Kết quả trên SKLM chothấy chỉ có một vết tròn, duy nhất Hợp chất này được ký hiệu là BL7 và được gởi

đi đo phổ

 Khảo sát phân đoạn VII

Tiến hành SKC phân đoạn XI có khối lượng 4,15 g với cột có đường kính 3

cm, sử dụng 40 g silica gel làm pha tĩnh Giải ly cột đầu tiên với hệ dung môiPE:Ea (2:8) sau đó tăng dần độ phân cực của hệ dung môi giải ly lên

Dung dịch ra khỏi cột được hứng vào các lọ thủy tinh với thể tích khoảng 50

mL Thực hiện SKLM để theo dõi quá trình chạy cột, các lọ dung dịch có kết quảSKLM giống nhau được gom lại, cô quay thu hồi dung môi Kết quả SKC phânđoạn này thu được 5 phân đoạn nhỏ hơn (Bảng 3.9)

Bảng 3.9: Kết quả SKC phân đoạn VII

Phân

đoạn

Dung môi giải ly SKC

Dung môi giải ly SKLM

Kết quả

SKLM

Khốilượng(g)

Ghi chú

- Khảo sát phân đoạn VII.3

Phân đoạn VII.3 sau khi đuổi dung môi có khối lượng 0,50 g Tiến hànhSKC phân đoạn này bằng 30,0 g silica gel Sử dụng cột có đường kính khoảng 2

cm Giải ly cột đầu tiên với hệ dung môi PE : Ea (2:8), sau đó tăng dần độ phâncực của hệ lên

Dung dịch ra khỏi cột được cho vào các lọ thủy tinh với thể tích khoảng 10

mL mỗi lần Thực hiện SKLM để theo dõi quá trình chạy cột, các lọ thủy tinh cókết quả SKLM giống nhau được gom lại, để khô tự nhiên Kết quả SCK phânđoạn VII.3 như Bảng 3.10

Bảng 3.10: Kết quả SKC phân đoạn VII.3

Ghi chú