Khóa luận bước đầu nghiên cứu ảnh hưởng của ba kết hợp với NAA và 2,4 d lên mẫu cây lá kim ngân ( lonicera japonica thunb )

Bước đầu khảo sát phản ứng của mẫu lá Kim Ngân trong điều kiện in vitro. Xác định thời gian khử trùng thích hợp đối với mẫu cấy lá để tìm ra thời gian khử trùng cho tỉ lệ nhiễm thấp nhất và mẫu cấy vẫn còn có khả năng tăng trưởng. Khảo sát cách đặt mẫu lá của Kim Ngân Hoa để tìm ra cách đặt mẫu cho khả năng phát sinh hình thái nhanh và tốt nhất.Đánh giá tác động của chất kích thích tăng trưởng (BA, 2,4D, NAA) ở các nồng độ khác nhau lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HỒ CHÍ MINH

KHOA MÔI TRƯỜNG VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-o0o -ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA BA KẾT HỢP VỚI NAA VÀ 2,4-D LÊN MẪU CẤY LÁ KIM NGÂN

(Lonicera japonica Thunb)

Chuyên ngành: Công Nghệ Sinh Học

Mã ngành : 111

GVHD: CN BÙI VĂN THẾ VINH SVTH : NGUYỄN THÁI QUỲNH QUYÊN MSSV : 105111053

Tp Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2009

PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MÔN

Người duyệt (chấm sơ bộ):

Đơn vị:

Ngày bảo vệ:

Điểm tổng kết:

Nơi lưu trữ Đồ án tốt nghiệp:

1 Đầu đề đồ án tốt nghiệp

BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA BA KẾT HỢP VỚI NAA VÀ

2,4-D LÊN MẪU CẤY LÁ KIM NGÂN (Lonicera japonica Thunb)

2 Nhiệm vụ (yêu cầu về nội dung và số liệu ban đầu)

 Bước đầu khảo sát phản ứng của mẫu lá Kim Ngân trong điều kiện in vitro

 Xác định thời gian khử trùng thích hợp đối với mẫu cấy lá để tìm ra thời gian khử trùng cho tỉ lệ nhiễm thấp nhất và mẫu cấy vẫn còn có khả năng tăng trưởng

 Khảo sát cách đặt mẫu lá của Kim Ngân Hoa để tìm ra cách đặt mẫu cho khả năng phát sinh hình thái nhanh và tốt nhất

 Đánh giá tác động của chất kích thích tăng trưởng (BA, 2,4-D, NAA) ở các nồng độ khác nhau lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy

3 Ngày bàn giao Đồ án tốt nghiệp: 1/04/2009

4 Ngày hoàn thành nhiệm vụ: 30/6/2009

CN Bùi Văn Thế Vinh Toàn bộ Đồ án

Nội dung và yêu cầu LVTN đã được thông qua Bộ môn

Ngày …… tháng…… năm 2009

( Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên)

HỌ VÀ TÊN : NGUYỄN THÁI QUỲNH QUYÊN

NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

MSSV:105111053 LỚP: 05DSH

Lời cảm ơn

Em xin chân thành cảm ơn:

 Ban Giám hiệu Trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh,Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đãtruyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường

 Thầy Bùi Văn Thế Vinh đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm và giúpđỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

 Thầy Phạm Minh Nhựt và các thầy cô, anh chị nhân viên tại Phòng ThíNghiệm khoa Môi Trường và Công Nghệ Sinh Học thuộc Trường Đại học KỹThuật Công Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ

em hoàn thành khoá luận này

 Cha mẹ đã suốt đời tận tụy để con có được ngày hôm nay

 Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp 05DSH đã gắn bó, giúp đỡ tôi trong suốt 4năm qua

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thái Quỳnh Quyên

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

 BA : 6-benzyladenine

 MS : Môi trường MS (Murashige và Skoog,1962)

 NAA : α – Naphthalene acetic acid

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Các cơ quan thực vật được dùng trong nuôi cấy mô

Bảng 3.1 Môi trường MS bổ sung 2,4-D và BA ảnh hưởng lên sự phát sinh hình

thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa

Bảng 3.2 Môi trường MS bổ sung NAA và BA ảnh hưởng lên sự phát sinh hình

thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa

Bảng 4.1 Kết quả khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy lá Kim Ngân Hoa

Bảng 4.2 Ảnh hưởng của cách đặt mẫu cấy lên sự phát sinh hình thái sau 1

tháng nuôi cấy

Bảng 4.3 Aûnh hưởng của chất kích thích tăng trưởng BA kết hợp 2,4-D lên sự

phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa được ghi nhận sau 1tháng nuôi cấy

Bảng 4.4 Aûnh hưởng của chất kích thích tăng trưởng BA kết hợp NAA lên sự

phát sinh hình thái của mẫu lá Kim Ngân Hoa được ghi nhận sau 1tháng nuôi cấy

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Cây Kim Ngân Hoa (Lonicera japonica Thunb)

Hình 2.2. Một số hình ảnh về Kim Ngân Hoa

Hình 2.2 Hoa Kim Ngân phơi khô

Hình 4.1. Cách đặt mẫu lá

Hình 4.2 Mô sẹo phát sinh từ mẫu lá được đặt theo 2 cách khác nhau

Hình 4.3 Ảnh hưởng của BA kết hợp với 2,4-D lên sự phát sinh mô sẹo của

mẫu lá Kim Ngân Hoa

Hình 4.4 Ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA lên sự phát sinh mô sẹo của mẫu

lá Kim Ngân Hoa

1.1 Đặt vấn đề

Kim Ngân hoa (Lonicera japonica Thunb) thuộc Họ Kim Ngân (Caprifolianceae)

là cây dược liệu chứa tanin và một saponin Hoa chứa một flavonoid là scolymosidlonicerin và một số carotenoid ( caroten, cryptoxanthin, auroxanthin) Quả mọnggiàu carotenoid mà phần lớn là cryptoxanthin Lá chứa một glucosid gọi là loganin vàkhoảng 8% tanin

Theo Y học cổ truyền: Kim Ngân Hoa có tác dụng thanh nhiệt giải độc

Theo kết quả nghiên cứu dược lý hiện đại chứng minh cây thuốc Kim Ngân Hoacó tác dụng: kháng khuẩn, chống viêm, làm giảm chất xuất tiết, giải nhiệt và làmtăng tác dụng thực bào của bạch cầu, tác dụng hưng phấn trung khu thần kinh cườngđộ bằng 1/6 của cà phê, làm hạ cholesterol trong máu, tăng bài tiết dịch vị và mật

Khi nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn in vitro bằng các phương pháp khuyếch tán

và hệ nồng độ, người ta thấy nước sắc cô đặc 100% của hoa Kim Ngân có tác dụngkháng khuẩn mạnh đối với các trực khuẩn lỵ, dịch hạch, thương hàn, cận thương hàn,liên cầu khuẩn tan máu, phẩy khuẩn tả Tác dụng yếu hơn đối với các trực khuẩnbạch hầu, E.Coli, phế cầu, tụ cầu khuẩn vàng Nước sắc lá Kim Ngân với nồng độ201,2% ức chế trực khuẩn Shiga, với nồng độ 2050% ức chế trực khuẩn cận thươnghàn, nồng độ 100% có tác dụng đối với tiêu cầu khuẩn (Tài Nguyên Cây Thuốc ViệtNam)

Mặc khác, Kim Ngân cũng là dược liệu quý được dùng điều trị ung thư trong Đôngvà Tây y như ung thư tuyến vú, gan, vòm họng, cổ tử cung, u bướu giáp trạng, trựctràng,

Ngoài tác dụng hoa lá làm thuốc, ng d ng trong m ph m, ứng dụng trong mỹ phẩm, ụng trong mỹ phẩm, ỹ phẩm, ẩm, cho cảnh đẹp,hoa thơm, mành che nắng và mái che nắng, Kim Ngân còn có tác dụng hấp thu nhiệtcủa ánh nắng mặt trời (cho cây quang hợp và phát triển) nên mát hơn mành tre, mànhnhựa và mái tôn chống nóng Ngoài ra, nó còn hút thán khí (CO2), nhả dưỡng khí (O2)làm sạch môi trường, tạo bầu không khí trong lành

Việt Nam được xem là một nước có nguồn dược liệu phong phú và đa dạng với sốlượng trên 3.800 loài cây làm thuốc trên tổng số hơn 10.600 loài thực vật và là thịtrường đầy hứa hẹn khi nhu cầu sử dụng rất lớn không chỉ là thuốc mà xu thế mỹphẩm dùng nguyên liệu từ thiên nhiên thay thế nguyên liệu tổng hợp đã chiếm 90%tổng số mỹ phẩm được sản xuất

Tuy nhiên, trong vấn đề sản xuất, kinh doanh và lưu thông, phân phối dược liệu,nguồn dược liệu chưa tương xứng với tiềm năng hiện có và còn rất nhiều bất cập.Hơn 90% nguyên liệu sản xuất thuốc trong nước vẫn phải nhập khẩu, chủ yếu sảnxuất những loại thuốc thông thường, ngay cả những mặt hàng thuộc về thế mạnh củaViệt Nam là các loại thuốc y học cổ truyền (YHCT), dược liệu lưu hành trên thịtrường cũng chủ yếu nhập từ Đài Loan, Trung Quốc, Singapore

Tại TP.HCM, nơi chiếm đến 70% tỷ trọng số lượng thành phẩm và nguyên liệudược liệu của cả nước, 90% mặt hàng đông dược lưu hành trên thị trường là hàngnhập lậu

Một điều đáng lưu tâm nữa là chất lượng dược liệu hiện nay vẫn chưa được kiểmsoát (trên 50% mẫu kiểm tra không đạt tiêu chuẩn chất lượng) và tỷ lệ này với cácloại thuốc từ dược liệu là 10%

Ngoài ra, việc trồng dược liệu hiện nay vẫn thiếu sự quy hoạch tập trung, thiếu sựhỗ trợ căn cơ từ nhà nước khiến thị trường dược liệu không ổn định, cây dược liệu vìthế cũng không phát triển

Vẫn chưa có một cơ quan chuyên môn nào đảm trách khâu kỹ thuật sản xuất dẫnđến tình trạng các cây dược liệu không đảm bảo được năng suất – chất lượng – giá cảổn định để cạnh tranh được với dược liệu nhập khẩu Như vậy với giá trị to lớn của cây Kim Ngân, là cây thuốc mọc tự nhiên ở Việt Namtrong tình hình dược liệu của nước ta hiện nay nói chung và Kim Ngân nói riêng thìviệc đẩy mạnh nghiên cứu nhân giống bằng nuôi cấy mô theo quy mô công nghiệp đểcó thể nâng cao năng suất và số lượng cây trồng trong thời gian ngắn nhất đáp ứngđược nhu cầu tiêu thụ cho thị trường Việt Nam và trên thế giới là điều hết sức cầnthiết

1.2 Mục đích và nội dung nghiên cứu

1.2.1 Mục đích

Bước đầu khảo sát phản ứng của mẫu lá Kim Ngân trong điều kiện in vitro Đồng

thời tạo tiền đề cho những nghiên cứu tách chiết các hợp chất có giá trị dược lý trongcây Kim Ngân làm nguyên liệu phục vụ cho ngành công nghiệp dược

1.2.2 Nội dung nghiên cứu

Bước đầu khảo sát ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng đến mẫu cấy lácủa cây Kim Ngân.

2.1 Khái quát về nuôi cấy mô tế bào thực vật

2.1.1 Khái niệm

Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức nuôi

cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều kiệnvô trùng Môi trường có chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng,vitamin, các hormone tăng trưởng và đường (Dương Công Kiên, 2002)

2.1.2 Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật

Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật có ý nghĩa vô cùng to lớn đối vớinghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời nó có giá trị đóng góp trực tiếp cho thựctiễn sản xuất và đời sống

2.1.2.1 Về mặt lý luận sinh học cơ bản

Nuôi cấy mô đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu sắc về bản chất củasự sống

Thông qua nuôi cấy mô và tế bào, chúng ta có thể tiến hành so sánh đặc tính của

cơ thể với hợp phần của chúng khi tách rời khỏi cơ thể, từ đó rút ra qui luật về mốitương quan giữa các bộ phận trong cây

Thực tế đã cho phép chúng ta tách và nuôi cấy trước hết là mô phân sinh rồi từ đócho ra nhóm tế bào không chuyên hóa gọi là mô sẹo, và từ mô sẹo có thể kích thíchđể tái sinh cây hoàn chỉnh và có thể gây ra những thay đổi định hướng ở mức độ tếbào (trước khi cho ra cây hoàn chỉnh)

Trong một cơ thể, rất khó phân biệt được từng giai đoạn một cách cụ thể và chínhxác theo chu kỳ phát triển của cá thể Bằng phương pháp nuôi cấy mô, chúng ta cóthể khắc phục được khó khăn trên và dễ dàng tạo ra các bước phát sinh hình thái đượcphân biệt một cách rõ rệt Từ đó có thể tìm ra các mấu chốt thúc đầy sự phát triển củacây trồng theo chiều hướng mong muốn

Bằng phương pháp nuôi cấy mô và tế bào, chúng ta có thể tìm hiểu và tiến hànhnghiên cứu mối quan hệ khởi đầu giữa ký sinh và ký chủ Từ đó, người ta tìm ra đượcnhững cơ chế miễn dịch thực vật Khi con người hoàn toàn làm chủ được cơ chế nàythì các biện pháp phòng bệnh được hoàn thiện và như vậy việc chống bệnh sẽ trở nênđỡ tốn kém hơn rất nhiều

2.1.2.2 Về mặt thực tiễn sản xuất

Ngoài tác dụng nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, phương pháp nuôi cấy mô còncó những đóng góp hết sức cụ thể đối với sản xuất và đời sống.

Ý nghĩa thực tiễn quan trọng nhất của nuôi cấy mô tế bào là áp dụng kỹ thuật sảnxuất đại trà có kiểm soát trong tạo giống và nhân giống cây trồng Những lợi ích trongviệc áp dụng nuôi cấy mô trong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp được tóm tắtnhư sau:

 Kiểm soát được dịch bệnh cây trồng Bằng phương pháp nuôi cấy mô haynuôi cấy tế bào, ta hoàn toàn có thể loại được những cá thể nhiễm bệnh haymang mầm bệnh

 Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gen của giốngđem vào sản xuất

 Kiểm soát được toàn bộ kỹ thuật từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch

 Tạo ra sự đồng loạt về giống, từ đó tạo ra sự đồng loạt của sản phẩm cuối.Sự đồng loạt này sẽ giúp cơ giới hóa được khâu trồng trọt và khâu thu hoạch

Do đó, năng suất lao động sẽ tăng lên Chất lượng sản phẩm đồng nhất, tạođiều kiện cho khâu tiêu thụ và chế biến

Tóm lại, nuôi cấy mô hay nuôi cấy tế bào thực vật đã đem lại hiệu quả to lớntrong sản xuất nông nghiệp và lâm nghiệp Đây thực sự đã và đang là cuộc cáchmạng xanh trong ngành trồng trọt

2.1.3 Những thuận lợi và khó khăn của phương pháp nhân giống in vitro

Một số thuận lợi của phương pháp nhân giống in vitro (Pierik, 1975, Anonymous,

1980; van Assche, 1983; Gebhard và cộng sự, 1983; Kunneman-Kooij, 1984):

 Nhân giống vô tính in vitro nhanh hơn nhân giống vô tính in vivo.

 Có thể tái sinh được một số loài thực vật mà không thể tiến hành in vivo và sự tăng trưởng của những cây nhân giống vô tính in vitro thường mạnh hơn do nhân giống in vitro có thể cảm ứng được sự trẻ hóa của mô và tạo được cây

sạch bệnh vì có sự chọn lọc các đối tượng sạch bệnh để đưa mẫu vào nuôi cấy,đồng thời cũng có thể xử lý mẫu cấy của các cây có mang mầm bệnh trước khiđưa vào môi trường nuôi cấy Các cây sạch bệnh này có thể được trao đổi dễdàng giữa các nơi với nhau do cây có kích thước nhỏ và không trồng trong đất

 Trong nuôi cấy in vitro chỉ sử dụng những mẫu cấy ban đầu rất nhỏ cho nên có

thể chọn lọc kỹ lưỡng và dễ dàng

 Do cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện hoàn toàn thích hợp (nguồn dinh

dưỡng và điều kiện môi trường) do đó có thể sản xuất cây con quanh năm

 Có thể sử dụng cây nhân giống in vitro để làm cây mẹ cho các bước nhân

giống kế tiếp

 Có thể tạo ra các đột biến điểm trong quá trình nuôi cấy

 Phương pháp nhân giống in vitro đặc biệt hữu dụng để tạo ra các ngân hàng

gen

 Các tế bào trần và huyền phù tế bào là đối tượng hữu dụng trong việc lai soma

 Một số loại cây bị mất khả năng sinh sản hữu tính như các cây đơn bội, cây bấtthụ đực, cây bất thụ do đột biến… có thể được duy trì và nhân giống bằng

phương pháp nhân giống in vitro.

Tuy nhiên bên cạnh những thuận lợi trên, phương pháp nhân giống in vitro có

những bất lợi sau:

 Kiểu gen thực vật không được ổn định trong một số hệ thống nuôi cấy

 Đặc biệt đối với một số loài cây thân gỗ, việc cảm ứng rễ rất khó thực hiện

 Việc chuyển cây từ trong ống nghiệm ra vườn ươm rất khó đối với một sốcây

 Cây khi được chuyển từ phòng thí nghiệm ra vườn ươm rất dễ bị tấn côngbởi một số loại bệnh hại do nó đã quen sống trong điều kiện vô trùng Vì vậy,cần phải xử lý môi trường và giá thể sống của cây thật cẩn thận

 Khả năng tái sinh cây có thể bị mất đi do việc cấy chuyển mô sẹo và huyềnphù tế bào được lặp lại nhiều lần

 Đối với một số mô, việc vô trùng trước khi đưa vào cấy rất khó thực hiện

 Phương pháp nhân giống in vitro tốn nhiều công lao động làm cho giá thành

của cây tăng lên

2.1.4 Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy mô

Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật được ứng dụng trong một số lĩnh vựcnhư:

 Lai tạo giữa những loài xa nhau về di truyền bằng phương pháp dung hợp (nuôicấy tế bào trần).

 Nuôi cấy tế bào thực vật trong môi trường lỏng (nuôi cầy huyền phù tế bào)trên quy mô lớn để sản xuất các hợp chất thứ cấp như alkaloid, glycoside, cácsteroid (dùng trong y học), chất dính dùng trong công nghiệp thực phẩm, nhữngchất kìm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn dùng trong nông nghiệp

 Chọn lọc tế bào có những đặc tính mong muốn, cho phát triển thành cây conthay vì chọn lọc cây ngoài đồng ruộng (nuôi cấy tế bào đơn)

 Sản xuất dòng cây đồng hợp tử (nuôi cấy bao phấn và túi phấn)

 Vi nhân giống những giống cây có giá trị khoa học và thương mại

 Bảo quản phôi và cơ quan trong điều kiện nhiệt độ thấp

 Nuôi cấy phôi sinh dưỡng, phôi hợp tử

 Nuôi cấy quang tự dưỡng

2.1.5 Các cơ quan thực vật được dùng trong nuôi cấy mô

Bảng 2.1 Các cơ quan thực vật được dùng trong nuôi cấy mô

Nguồn gốc mẫu cấy Kích thước Mẫu được tách

Chồi đỉnh 0,5 – 1 cm Chốp đỉnh có chứa mộtphần thânChồi bên 0,5 – 1 cm Chồi bên có chứa mộtphần thân, lá và chồi

náchMẫu lá 0,2 – 0,3 cm Mẫu lá được cắt nhỏ,phân nửa được cấy chìm

vào môi trườngPhiến lá 0,2 – 1 cm Phiến lá non được đặttrên môi trường, mặt dưới

đặt trên mặt thạch

thạchDạng củ hành 1 – 2 cm Mẫu được đặt trên mặthay được cấy chìm phân

nữa vào môi trường

2.1.6 Các bước nhân giống in vitro

Quá trình nhân giống in vitro được chia thành các giai đoạn sau:

2.1.6.1 Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy

Khi chọn cây mẹ phải chú ý xác định đúng cây cần nhân giống Cây mẹ phải sạchbệnh và tốt nhất là chọn cây trồng trong nhà kính hoặc trong phòng tăng trưởng

Kết quả nhân giống tốt nhất có thể đạt được khi mẫu cấy được lấy vào thời điểmtăng trưởng mạnh nhất của cây mẹ

Mục tiêu của việc khử trùng mẫu cấy là thu được một lượng lớn các mẫu cấy vôtrùng và vẫn còn khả năng tăng trưởng Khử trùng bề mặt mẫu cấy bao gồm rửa mẫuvà khử trùng mẫu cấy

+ Mẫu thu được phải rửa dưới vòi nước chảy từ 30 phút – 2 giờ, sau đó rửa mẫubằng xà phòng sẽ làm giảm đáng kể nguồn lây nhiễm trên mẫu cấy

+ Mẫu sau khi rửa sạch sẽ được ngâm chìm trong dung dịch khử trùng để khử cácnguồn lây nhiễm trên bề mặt mẫu cấy Dung dịch thường được sử dụng để khử trùngmẫu là hypochlorite sodium 0,5 – 5,25%, cồn, hypochlorite calcium, oxy già, nitratebạc, dung dịch bromine, chlorur thủy ngân Khi thêm Tween 20 (polyoxyethylenesorbitan monolaurate) vào dung dịch khử trùng thì sẽ làm tăng hiệu quả khử trùng vìlàm giảm sức căng bề mặt giữa nước và mô thực vật như vậy bề mặt mẫu tiếp xúc vớichất khử trùng tốt hơn

+ Sau khi khử trùng mẫu cấy phải được rửa lại vài lần bằng nước cất vô trùngtrong tủ cấy để rửa sạch các chất khử trùng còn bám trên bề mặt mẫu, những phần bịtổn thương phải được cắt bỏ, đồng thời mẫu cấy phải được cắt theo kích thước thíchhợp

+ Mẫu thực vật thường bị nhiễm bên trong và có thể được khử trùng bằng cách bổsung benomyl hoặc benlate 10mg/l trong môi trường nuôi cấy hoặc xử lý mẫu bằngcác chất này trước khi khử trùng

+ Mẫu cấy của vài loài thực vật có thể hóa nâu hoặc đen sau vài ngày kể từ khibắt đầu nuôi cấy Khi bị hóa nâu thì sự tăng sinh của mẫu sẽ bị ức chế và lâu ngàymẫu sẽ chết Hiện tượng hóa nâu này xảy ra khi trong mẫu cấy có chứa một lượng lớntannin hoặc các hợp chất hydroxyphenol Các mô non thường ít bị hóa nâu hơn môtrưởng thành hay mô già Hiện tượng hoại tử hoặc hóa nâu là do hoạt động của

enzyme oxidase có nhân Cu (ví dụ như polyphenoloxidase và tryosinase), nó đượctổng hợp và phóng thích tùy thuộc vào vết thương trong suốt quá trình cắt và khửtrùng mẫu.

Phương pháp thường được sử dụng nhiều nhất để ngăn cản hiện tượng hóa nâu làdùng than hoạt tính để hấp thụ bớt các hợp chất phenol được tiết ra Lượng thườngdùng 0,5 – 5 g/l Ngoài ra còn có một số chất khác như: polyvinyl pyrolidone (PVP),acid ascorbic, acid citric, L–cystein, hydrochlorite, 1,4 – ditheithreitol, glutathione vàmercaptoethanol

Khi nghiên cứu enzyme phenolase người ta thấy rằng enzyme này hoạt động mạnh

ở pH 6,5 và hoạt động yếu ở pH thấp Vì vậy, nếu giảm pH thì sẽ giảm được hiệntượng hóa nâu

Tóm lại, từ kinh nghiệm thực tiễn người ta rút ra rằng để làm giảm hiện tượng hóanâu của mẫu cấy nên:

 Sử dụng mẫu cấy nhỏ ở mô non Gây vết thương trên mẫu với kích thướcnhỏ nhất

 Ngâm mẫu vào dung dịch acid ascorbic trong vài giờ trước khi cấy vào môitrường

 Nuôi cấy mẫu trong môi trường lỏng có lượng O2 thấp, không có ánh sángtrong 1 – 2 tuần đầu

 Chuyển mẫu từ môi trường có chất kích thích sinh trưởng nồng độ thấp sangmôi trường có chất kích thích sinh trưởng nồng độ cao

 Chuyển mẫu liên tục trong khoảng thời gian 2 – 4 tuần kể từ khi bắt đầunuôi cấy thì một lượng lớn các hợp chất phenol sẽ không tích tụ

2.1.6.2 Tạo thể nhân giống in vitro

Mẫu nuôi cấy được cấy trên môi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo thể

nhân giống in vitro Có hai thể nhân giống in vitro: thể chồi, thể cắt đốt.

Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngoài tự nhiên của cây

trồng Tuy nhiên, có những loài cây trồng không có khả năng nhân giống, người tathường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mô sẹo

Để nhân giống, trong môi trường nuôi cấy thường bổ sung cytokinin, GA3 và cácchất hữu cơ khác

2.1.6.3 Nhân giống in vitro

Đây là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương phápnuôi cấy mô tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống Vật liệunuôi cấy là những thể chồi, môi trường nuôi cấy thông thường giống với môi trườngtạo thể chồi, đôi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trìnhnhân giống kéo dài Điều kiện nuôi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh được

nhanh Cây nhân giống in vitro có trạng thái sinh lý trẻ và được duy trì trong thời gian

vô hạn

2.1.6.4 Tái sinh cây hoàn chỉnh in vitro

Đây là giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh có đầy đủ thân, lá và rễ chuẩn bị chuyển

ra vườn ươm cây Cây con phải khỏe mạnh nhằm nâng cao sức sống khi ra môi trườngbình thường Các chất có tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đó là các chất kíchthích quá trình tạo rễ Điều kiện nuôi cấy tương tự với điều kiện tự nhiên bên ngoài,

một bước thuần hóa trước khi được tách ra khỏi điều kiện in vitro Sự ra rễ phụ thuộc

vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hòa của mẫu,

kiểu di truyền Người ta thường bổ sung auxin để kích thích quá trình ra rễ in vitro.

2.1.6.5 Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm

Đây là giai đoạn khó khăn nhất trong quá trình nhân giống vô tính Cây in vitro

được nuôi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm…Nên khi chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên hoàn toàn khác hẳn như dinh dưỡngthấp, ánh sáng có cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, cây con dễ dàng bịstress, dễ mất nước và mau héo

Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mô phải mát, cường độ chiếu sángthấp, nhiệt độ không khí mát, ẩm độ cao,… cây con thường được cấy trong luống ươmcây có cơ chất dễ thoát nước, tơi xốp, giữ được ẩm, trong những ngày đầu cần phảiđược phủ nylon để giảm quá trình thoát nước ở lá (thường 7-10 ngày kể từ ngày cấy).Rễ được tạo ra trong quá trình cấy mô sẽ dần dần bị lụi đi và rễ mới xuất hiện, câycon thường được xử lý với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên để rútngắn thời gian ra rễ

2.1.7 Quá trình tái sinh cơ quan trong nhân giống in vitro

Sự tái sinh cơ quan trong nuôi cấy mô không xảy ra ngay khi vừa cô lập mẫu cấymà phải trải qua một quá trình rất phức tạp vì:

 Quá trình tái sinh chỉ xảy ra khi mối tương quan cũ được phá vỡ và những mốitương quan mới được hình thành

 Quá trình này bao gồm nhiều giai đoạn khác nhau:

 Loại bỏ sự phản biệt hóa của các tế bào phản biệt hóa (dẫn đến sự trẻ hóa tếbào)

 Sự phân chia tế bào (đôi khi dẫn đến sự hình thành mô sẹo): sự hình thành cơquan bắt đầu xảy ra khi sự phân chia tế bào diễn ra

 Sự hình thành cơ quan

 Sự phát triển cơ quan

 Sự tái sinh bị giới hạn về số lượng và chất lượng do nhiều nhân tố:

 Các yếu tố nội sinh trong mẫu cấy

 Điều kiện tăng trưởng của cây mẹ trong nhà kính hoặc ngoàithiên nhiên

 Vị trí của mẫu cấy trên cây

 Thời gian thu mẫu trong năm

 Hàm lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh

 Kích thước của mẫu cấy, phương pháp cấy, nuôi, thành phầndưỡng chất trong môi trường nuôi cấy, các chất điều hòa sinh trưởng, các yếutố vật lý trong quá trình nuôi cấy như nhiệt độ, ánh sáng,… sự bổ sung một số cơchất khác vào trong môi trường,…

Những nguyên nhân trên cho thấy quá trình tái sinh cơ quan trong nuôi cấy mô rấtphức tạp, chúng ta không thể đề cập hết những khía cạnh liên quan nhưng cần lưu ýđến một số vấn đề sau:

 Quá trình tái sinh phức tạp do chịu sự tương tác của nhiều nhân tố khác nhau(môi trường dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ và các chất điều hòa sinh trưởng,…)

 Không thể khái quát chung quá trình tái sinh cho tất cả các loài vì mỗi loàikhác nhau cần điều kiện tái sinh khác nhau

 Khó có thể điều hòa quá trình tái sinh vì khả năng tái sinh của mỗi loài khácnhau: trong những trường hợp này các nhân tố nội sinh đóng vai trò quyết định dođó các yếu tố ngoại sinh như chất điều hòa ảnh hưởng không nhiều.

 Sự hình thành rễ bất định thường đối lập với sự hình thành chồi bất định Nếucả hai quá trình này được thúc đẩy đồng thời, cây con tạo ra sẽ mang nhiều thiếusót Để thu nhận một cây hoàn chỉnh tốt nhất chúng ta nên tạo chồi bất định trướcsau đó cảm ứng tạo rễ

2.1.7.1 Sự hình thành chồi bất định

Người ta sử dụng phương pháp tạo chồi bất định như một phương pháp nhân giốngvô tính nhằm làm tăng số lượng cây mong muốn

Các loại cây thường được áp dụng phương pháp này để nhân giống ví dụ như:

Saintpaulia, Begonia, Achimenes, Streptocarpus, Lily, lan dạ hương, Nerin…

Có nhiều điểm giống nhau giữa tạo chồi bất định và tạo rễ bất định:

 Sự hình thành chồi bất định ở cây hạt trần chỉ thành công khi sử dụng cácbộ phận của cây con (Anonymous, 1984)

 Đường luôn luôn đóng vai trò quan trọng trong sự tạo cơ quan (chồi và rễ)

 Sự hình thành chồi và rễ đều bị ức chế bởi gibberellin và acid abscisic.Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo chồi bất định

Ánh sáng kích thích sự tạo chồi nhưng cũng có một số trường hợp ngoại lệ là có

một số cây trồng lại có thể tạo chồi dễ dàng hơn khi ở trong tối: chồi hoa của Freesia (Pierik và Steegmans, 1975), cuống hoa Eucharis grandiflora và Nerine bowdenii

(Pierik, 1985; Pierik và Steegmans, 1986) Economou và Read (1986) cho biết rằng

các mẫu cấy lá của Petunia hyrbida tăng trưởng trên môi trường không có cytokinin

và được xử lý với ánh sáng đỏ thì tạo ra nhiều chồi có trọng lượng tươi lớn hơn làđược nuôi cấy dưới ánh sáng đỏ xa Tuy nhiên, trên môi trường có BA thì khi xử lývới ánh sáng đỏ và ánh sáng đỏ xa thì sẽ tạo ra số lượng chồi và trọng lượng tươi củachúng tương tự nhau và nhiều hơn trên môi trường không có cytokinin

 Nhiệt độ

Nhiệt độ cao cần thiết cho sự tạo chồi nhưng cũng có một số trường hợp ngoại lệ

như Begonia (Heide, 1965) và Streptocarpus (Appelgren và Heide, 1972).

 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Nhu cầu về auxin và cytokinin trong sự tạo chồi bất định có phần phức tạp:

 Có những loài thực vật về mặt cơ bản không cần cả auxin lẫn cytokinin để

tạo chồi bất định như: rau diếp xoăn (Pierik, 1966), Streptocarpus (Appelgren

và Heide, 1972; Rossini và Nitsch, 1966)

 Hầu hết các loài thực vật đều cần đến cytokinin để cảm ứng sự tạo chồi,trong khi auxin lại có vai trò ngược lại (Miller và Skoog, 1953; Paulet, 1965;Nitsch, 1968)

 Có một số thực vật cần đến auxin ngoại sinh để tạo chồi, đó là trường hợpLili (van Aartrijk, 1984), lan dạ hương (Pierik và Steegmans, 1975)

 Một nồng độ cytokinin cao phối hợp với auxin nồng độ thấp rất quan trọng

trong việc tạo chồi ở nhiều loài thực vật khác nhau như Begonia (Ringe và

Nitsch, 1968; Heide, 1965) và cây bông cải (Margara, 1969)

Chúng ta có thể kết luận rằng ở những loài cần cytokinin và auxin cho sự tái sinhchồi, nồng độ cytokinin bao giờ cũng cao hơn nồng độ auxin Tỉ lệ của hai chất điềuhòa sinh trưởng này sẽ quyết định sự hình thành cơ quan (Skoog và Tsui, 1948; Millervà Skoog, 1953) Cytokinin BA rất hiệu quả trong việc thúc đẩy tạo chồi ở nhiều loàithực vật nhưng nếu sử dụng BA ở nồng độ cao sẽ xuất hiện nhiều biến dị (chồi biếndạng)

Trong một số trường hợp, sự kết hợp giữa cytokinin và adenine (sulphate) sẽ tănghiệu quả tạo chồi (Skoog và Miller, 1957; Nitsh và cộng sự, 1969) Một số trường

hợp, việc sử dụng một mình adenine cũng có thể cảm ứng tạo chồi: Begonia (Ringle

và Nitsch, 1968), cây thuốc lá (Skoog và Tsui, 1948)

Sự gia tăng nồng độ gibberellin ức chế quá trình tạo chồi: ở loài Begonia rex (Schrandolf và Reinert, 1959), Plumbago indica (Nitsch, 1968)… Acid abscisic ức chế

sự hình thành chồi bất định mặc dù vẫn có trường hợp cảm ứng sự hình thành chồi như

ở cây Ipomoea batatas.

2.1.7.2 Sự hình thành rễ bất định

Rễ bất định được hình thành trên các cơ quan khác nhau của cây, nơi mô củachúng còn giữ khả năng phân sinh

Quá trình hình thành rễ rất quan trọng vì nó ảnh hưởng đến khả năng sống sót của

mẫu cấy khi cây in vitro được chuyển ra vườn ươm.

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành rễ bất định: đặc điểm di truyền củaloài, tuổi của mẫu, vị trí của mẫu cấy trên thân, kích thước mẫu cấy, vết thương, sốlần cấy chuyển, nguồn oxy, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều hòa sinh trưởng, than hoạttính, đường, agar, pH,…

2.1.8 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro

2.1.8.1 Ảnh hưởng của mẫu cấy

Vật liệu nuôi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh

trưởng và phát triển in vitro:

 Kiểu di truyền

Khả năng tái sinh của thực vật rất đa dạng Những cây hai lá mầm thông thườngcó khả năng tái sinh mạnh hơn cây một lá mầm và cây hạt trần rất khó tái sinh (trừkhi chúng còn non) Trong số các cây hai lá mầm, Solanaceae, Begoniaceae,Crassulaceae, Gesneriaceae, Cruciferae là những họ thực vật dễ tái sinh nhất

Nếu một loài dễ tái sinh cơ quan trong tự nhiên (các giống lai Saintpaulia

ionantha, Begonia rex, Streptocarpus) thì chúng hầu như dễ tái sinh in vitro Cũng có

những trường hợp ngoại lệ như những đoạn cắt từ lá của Kalanchoe farinacea hầu như không có khả năng hình thành chồi bất định in vivo nhưng có thể thực hiện trong điều kiện in vitro, điều này có thể do sự hấp thu các chất điều hòa sinh trưởng có trong môi

trường nuôi cấy

 Tuổi của cây

Các mô phôi thường có khả năng tái sinh cao do đó ở ngũ cốc người ta thườngdùng phôi và hạt làm vật liệu nuôi cấy mô Khi cây già đi, khả năng tái sinh củachúng cũng giảm theo và các bộ phận của cây non dễ tái sinh hơn như trong trườnghợp cây bụi

Khi mô phân sinh và chồi đỉnh được tách khỏi cây mẹ thì chúng vẫn giữ những đặc

tính già hay non trong điều kiện in vitro tùy vào điều kiện ban đầu Đôi khi qua nhiều

lần cấy chuyển, mô phân sinh già từng bước được trẻ hóa do tăng khả năng tái sinh và

phân chia tế bào Điều này được chứng minh trên những đối tượng như Pinus vinifera,

Malus sylvestris, Cryptomeria japonica.

 Tuổi của mô và cơ quan

Những mô còn non và mềm thường dễ nuôi cấy hơn những mô cứng nhưng cũngcó nhiều trường hợp ngoại lệ Các mẫu cấy từ cuống lá còn non tái sinh tốt hơn nhữngmẫu cấy từ cuống lá già do cơ quan của chúng già hơn nên khả năng tái sinh và phânchia tế bào giảm Khả năng tái sinh của những loài khác nhau tăng lên trong suốt giaiđoạn ra hoa: các bộ phận của phát hoa còn non đôi khi tái sinh rất mạnh, ví dụ như

Freesia (Bajaj và Pierik, 1974), Lunaria annua (Pierik và cộng sự, 1974), Primula obconica ( Coumans và cộng sự, 1979).

 Tình trạng sinh lý

Tình trạng sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả năng tái sinh và phân chia tế bào in

vitro Thông thường các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh hơn

trong giai đoạn sinh sản Các mẫu cấy từ vảy của cây huệ tây ở giai đoạn sinh dưỡngtái sinh tốt hơn những mẫu cấy ở giai đoạn sinh sản (Robb, 1957) Các chồi của cây

trong giai đoạn ngủ đông (cuối thu đầu đông) khó nuôi cấy in vitro hơn chồi của

những cây đã vượt qua được giai đoạn này (vào mùa xuân trước khi chúng bắt đầuphát triển)

 Vị trí của mẫu cấy trên cây

Ever (1984) đã khảo sát sự ảnh hưởng của vị trí mẫu cấy lên sự sinh trưởng và

phát triền in vitro sau khi tách mẫu ở cây Pseudotsuga menziesii, ông nhận thấy những chồi ban đầu được tách từ những vị trí thấp trên cây phát triển trong môi trường in

vitro tốt hơn, và chồi gốc tăng trưởng nhanh hơn chồi nách Sự hình thành các giả

hành bất định của mẫu cấy lan dạ hương được tách ra từ phần gốc của vảy hành tốthơn từ phần đỉnh Điều này cũng xảy ra tương tự đối với Lily (Robb, 1957) Điều đánglưu ý là những mô sẹo phát sinh từ những mẫu cấy có nguồn gốc từ các phần khác

nhau của cây như rễ, chồi, cuống lá đều có phản ứng in vitro giống nhau.

 Kích thước mẫu cấy

Các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mô phân sinh khó cảm ứng để tăngtrưởng hơn những cấu trúc lớn như thân, lá, củ Các phần được tách rời khỏi cây tự nó

cung cấp chất dinh dưỡng và hormone, do đó mẫu cấy có kích thước càng lớn càng dễtái sinh và phát triển Các bộ phận của cây có chứa nhiều chất dinh dưỡng dự trữ như

củ, thân hành thường dễ tái sinh trên môi trường in vitro hơn những cơ quan ít chất dự

trữ Đối với những mẫu bị cắt, phần trăm bề mặt bị tổn thương cũng ảnh hưởng đếnkhả năng tái sinh Ảnh hưởng của vết thương lên sự tái sinh của các mẫu cấy từ vảyhành Lily đã được Aartrijk (1984) chứng minh

 Vết thương

Sự tổn thương trên bề mặt mẫu cấy đóng vai trò quan trọng trong sự tái sinh mẫucấy Bề mặt tổn thương tăng lên làm gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng và các chấtđiều hòa đồng thời ethylene được tạo ra nhiều hơn Ngoài ra, có thể tăng cường sựhình thành rễ bất định bằng vết thương

 Phương pháp cấy

Các mẫu cấy có thể được đặt trên môi trường theo nhiều cách khác nhau: có cực(thẳng đứng với phần gốc cắm xuống môi trường) hoặc không cực (cắm phần ngọnxuống môi trường) Chồi và rễ thường tái sinh dễ và nhanh khi mẫu được cấy khôngcực (Pierik và Steegmans, 1975) Mẫu tái sinh tốt khi được cung cấp đầy đủ oxynhưng những nhân tố khác cũng đóng vai trò quan trọng Phần gốc của mẫu cấykhông cực có các chất dự trữ không có khả năng khuếch tán vào trong agar do nókhông tiếp xúc với môi trường Như ở trường hợp tất cả các cây thuộc họAmaryllidaceae (Pierik và cộng sự, 1974), sự tái sinh chỉ xảy ra ở phần gốc của vảyhành, do đó phương pháp cấy không cực dẫn đến sự hình thành thân hành bất định tốthơn phương pháp cấy có cực

2.1.8.2 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy

Một trong những yếu tố quan trọng nhất đối với sự tăng trưởng và phát sinh hìnhthái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường Thành phầnnày thay đổi tùy theo loài và bộ phận nuôi cấy

Đối với cùng một mẫu cấy nhưng tùy theo mục đích thí nghiệm mà thành phầnmôi trường cũng thay đổi Môi trường còn thay đổi tùy theo giai đoạn phân hóa củamẫu cấy Tuy nhiên, tất cả các môi trường đều bao gồm năm thành phần: khoáng đa

lượng, khoáng vi lượng, vitamin, đường (nguồn carbon) và các chất điều hòa sinhtrưởng thực vật

Khoáng đa lượng: nhu cầu khoáng của mô, tế bào thực vật tách rời không khácnhiều so với cây trồng trong điều kiện tự nhiên Các nguyên tố đa lượng cần phảicung cấp là N, P, K¸Ca, Mg và Fe

Khoáng vi lượng: nhu cầu khoáng vi lượng trong nuôi cấy mô thực vật in vitro

là lĩnh vực còn ít nghiên cứu Trước đây, khi kỹ thuật nuôi cấy mô mới ra đời,người ta không nghĩ đến việc bổ sung khoáng vi lượng vào môi trường nuôi cấy.Các thí nghiệm lúc đó thành công là do agar và hóa chất dùng để pha môi trườngkhông tinh khiết mà có lẫn một số nguyên tố vi lượng cung cấp phần nào cho môitrường nuôi cấy Các nguyên tố vi lượng cần cung cấp cho tế bào là: Mn, Zn, Cu,

B, Co, I, Mo

Carbon và nguồn năng lượng: trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon giúp mô và

tế bào thực vật tổng hợp nên các hữu cơ để tế bào phân chia, tăng sinh khối khôngphải từ quá trình quang hợp mà chính từ nguồn carbon bổ sung vào môi trườngdưới dạng đường Hai dạng đường thường gặp nhất là glucose và sucrose Cácnguồn carbonhydrate khác cũng được tiến hành thử nghiệm như lactose, galactose,rafinose, maltose và tinh bột nhưng các carbonhydrate này có hiệu quả kém hơn sovới glucose và sucrose Sucrose là một nguồn carbon quan trọng đối với mô và tếbào nuôi cấy

Vitamin: thông thường thực vật tổng hợp các vitamin cần thiết cho sự tăngtrưởng và phát triển của chúng Chúng cần vitamin để xúc tác các quá trình biến

dưỡng khác nhau Khi tế bào và mô được nuôi cấy in vitro thì một vài vitamin trở

thành yếu tố giới hạn cho sự phát triển của chúng Các vitamin thường được sửdụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô là: thiamine (B1), acid nicotinic, pyridoxine(B6) và myo-inositol

Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật

Chất điều hòa sinh trưởng hoạt động với liều lượng rất thấp, ở liều lượng caochúng trở nên độc, điều này cho phép một vài chất kích thích tố được sử dụng như cácchất diệt cỏ dại

Các chất điều hòa nội sinh có thể được kiểm soát do cơ chế chuyển hóa của tế bàonên chúng được kiểm soát hoặc đào thải khá nhanh Trái lại các chất điều hòa tổnghợp tồn tại lâu hơn nhiều nên thường được sử dụng cho các ứng dụng trong thực tế.Có 5 nhóm chất điều hòa quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật: auxin, cytokinin,gibberellin, abscisic acid và etylen:

 Auxin

Auxin là hợp chất có nhân indole, có công thức nguyên là C10H9O2N Auxin gồmcó hai loại là auxin có nguồn gốc nội sinh do thực vật tạo ra (IAA), và auxin tổng hợp

do con người tạo ra (IBA, NAA, 2,4-D, )

Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nó tùy thuộc vàonồng độ và tác động bổ trợ của chúng với các chất điều hòa tăng trưởng khác

Auxin tác động lên sự kéo dài tế bào Hiệu quả này là sự nối tiếp cho sự gia tăngtính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nước vào bên trong tế bào, sứccăng của thành tế bào giảm đi và tế bào tự kéo dài ra

Auxin thay đổi tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng mộtsự phóng thích ion H+ Ion này gây ra một hoạt tính acid chịu trách nhiệm làm giảmtính đề kháng của thành tế bào bởi sự hấp thu ion K+

Auxin tác động lên các quá trình chuyển hóa, đặc biệt nhất là trên sự tổng hợpRNA ribosome

Auxin kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trình hình thànhmô sẹo và sự hình thành rễ bất định Auxin cũng ức chế sự phát triển của chồi náchvà sự hình thành phôi sinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy mô sẹo

Tất cả cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo giai đoạn phát triển của chúng.Auxin được tổng hợp ở lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở phát hoa, ở các quảcòn non và lưu thông từ đỉnh xuống phía dưới với một sự phân cực rõ ràng được nhìnthấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non Nhưng trong quá trình vận chuyển này,chúng bị oxy hóa do hoạt động của các enzyme auxin – oxidase, điều này cho thấynồng độ auxin luôn cao hơn ở những vùng tổng hợp ra chúng

Đối với một số loài, auxin cần cho sự hình thành rễ của các cành giâm (Võ ThịBạch Mai, 2004)

 Cytokinin

Cytokinin (gồm kinetin, BA, zeatin và 2iP) được phát hiện sau auxin vàgibberellin Người ta biết rằng trong môi trường nuôi cấy, việc bổ sung cytokinin sẽtạo điều kiện thuận lợi cho sự phân chia tế bào và hình thành chồi Cytokinin là cáchợp chất adenin được thay thế, có 2 nhóm cytokinin nội sinh được biết đến là zeatinvà IPA, ngoài ra còn có 2 nhóm cytokinin tổng hợp được sử dụng nhiều nhất trongnuôi cấy mô thực vật là Kinetin và BAP.

Cytokinin tác động hiệu quả lên sự phân chia tế bào khi có sự hiện diện của auxin:auxin tạo điều kiện thuận lợi cho sự nhân đôi DNA và cytokinin cho phép tách rờinhiễm sắc thể

Cytokinin có vai trò trong sự tạo cơ quan thực vật, chúng kích thích mạnh mẽ sựthành lập chồi non, trái lại chúng là chất đối kháng với sự tạo rễ

Cytokinin kích thích quá trình chuyển hóa, bảo vệ các chất chuyển hóa chống lạitác động của enzyme phân giải, làm chậm quá trình lão hóa Các chồi nách được xửlý bằng cytokinin sẽ tăng trưởng và cạnh tranh với chồi ngọn

Tóm lại, cytokinin giúp duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và

định hướng tế bào trong con đường phân hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho nuôi cấy in

vitro.

 Gibberellin

Gibberellin cũng như chất auxin, đã nổi bật rất lâu trước khi được nhận dạng Chấtgibberellin đầu tiên được nhận dạng là GA3 Đây là các chất có cấu trúc nội sinh Tất cả các gibberellin thể hiện một nhân giống nhau, chúng có sự khác nhau bởichất lượng và vị trí của các chất thế trên nhân

Tính chất chính của gibberellin là sự kéo dài của các đốt cây Tác động này cũngcó thể áp dụng trên các cuống hoa và điều này cho phép có một sự chín tốt hơn hoặcnhững phát hoa phát triển hơn (trên các loài nho có chùm nhiều trái, chất gibberellincho phép làm các chùm nho thưa trái, thoáng hơn)

GA3 được sử dụng trong môi trường dinh dưỡng kích thích vươn thân, đặc biệttrong trường hợp có hàm lượng cytokinin cao dẫn đến việc hình thành các cụm chồi cócấu trúc chặt (Economou, 1982)

Trong nuôi cấy in vitro, gibberellin có tác dụng đối với nhiều đỉnh sinh trưởng, nếu

thiếu gibberellin đỉnh sinh trưởng thể hiện một dạng hình cầu, tạo nên các mắt cây

Các gibberellin cũng có tác động trên sự đậu trái của các trái không hạt, chẳnghạn trái lê, quýt, mận và một vài loại cây khác.

 Etylen

Gia tăng quá trình rụng lá và trái; với mục đích này, nó được sử dụng để cho phépthu hoạch cơ giới trái (thí dụ trái olive, cerise…)

Tính cảm ứng hoa trên cây trồng thuộc họ dứa

Tác động làm thuận lợi cho sự tạo củ

Tất cả các bộ phận của cây đều có khả năng tổng hợp etylen, quan trọng nhất làtrái cây, kém hơn là hoa và ở các cơ quan thực vật bị chấn thương

Khi áp dụng trên các cây ngắn ngày được nuôi cấy bằng chu kỳ sáng thích hợp, nó

có thể bị ức chế hoàn toàn (như cây Volubilis) hoặc từng phần bị ức chế (như cây

Chenopodium rubrum) thậm chí kích thích sự ra hoa (như cây Plumbago) Áp dụng

trên các cây dài ngày, nó có thể ức chế sự ra hoa trong chu kỳ sáng thuận lợi (như cây

Epinard, Lolium temulentum).

Trong nuôi cấy mô, acid abscisic ít được sử dụng, một phần tùy theo loại cây vàphần khác tùy các điều kiện nuôi cấy, chất này sẽ gây nên các phản ứng rất khácnhau và giải thích một cách khó khăn

Tóm lại, trong nuôi cấy in vitro, sự chế ngự của kỹ thuật sẽ vượt qua các sự cân

bằng giữa chất điều hòa với nhau và trong số đó có hai chất chính mà vai trò tạo cơquan là cơ bản: auxin và cytokinin Theo Skoog:

- Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin cao, người ta thu được chức năngsinh tạo rễ

- Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin thấp, mô sẽ phát triển về phía chứcnăng sinh tạo thân

- Nếu tỉ lệ này gần một đơn vị người ta sẽ thu được sinh tạo môsẹo.

2.1.9 Các chất khử trùng hóa học được sử dụng trong nuôi cấy mô

Khi tiến hành nuôi cấy mô khó khăn lớn nhất là phải tạo được thể nhân giống in

vitro vô trùng Có rất nhiều nguyên nhân gây ra sự nhiễm trùng, trong quá trình nuôi

cấy có thể bị nhiễm vi sinh vật từ: mẫu cấy, người cấy, hệ thống lọc khí trong tủ cấy,côn trùng, dụng cụ hay bản thân môi trường nuôi cấy

Mẫu cấy thường là nguồn nhiễm chính vì có rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt,trong các rãnh nhỏ hoặc giữa các lớp vảy chồi, mầm chồi Đối với một số loài thựcvật được bao phủ bên ngoài bởi một lớp sáp dày hoặc có lông tơ thì càng khó khửtrùng vì đây là nơi cư ngụ của rất nhiều vi sinh vật Ngoài ra, những cây đã bị nhiễmngay trong hệ thống mô mạch thì xem như không thể dùng phương pháp khử trùngthông thường để loại bỏ vi sinh vật được

Để giải quyết vấn đề này, đầu tiên người ta sử dụng các chất khử trùng Nhằmtăng cường hiệu quả khử trùng, người ta thường rửa sơ mô cấy với xà phòng để loạibỏ bụi đất và gia tăng sự tiếp xúc với các chất khử trùng hoặc sử dụng dung dịchTween-20 như là chất hoạt động bề mặt Sau khi khử trùng phải rửa sạch mẫu cấybằng nước cất vô trùng 3 - 5 lần

Một số chất khử trùng thường sử dụng như:

 Chlorur thủy ngân (HgCl2): Là chất khử trùng rất hiệu quả, thường dùng vớilượng rất thấp từ 0,01% - 0,05%, chất này rất khó đào thải, vì vậy cần cẩn thận khitiếp xúc

 Sodium hypochlorite NaOCl: Có trong các dung dịch tẩy trắng 5 - 20% (v/v).Thời gian khử trùng từ 5 – 30 phút, sau đó rửa sạch bằng nước cất vô trùng 3 – 5lần Chất này ngấm vào trong mô thực vật, làm cản trở sự tăng trưởng của mô vềsau

 Calcium hypochlorite Ca(OCl)2: Nồng độ khoảng 5 – 10% (v/v), xử lý mô cấytừ 5 – 30 phút

 Ethyl hay isopropyl alcohol 70% (v/v): Thường sử dụng để lau sạch các vật liệunuôi cấy trước khi khử trùng hoặc dùng để ngâm nguyên liệu trước hoặc sau khixử lý với NaOCl hoặc Ca(OCl)2 trong khoảng 1 -5 phút

 Nước oxy già (H2O2): Là một chất oxy hóa cực mạnh, có thể sử dụng ở nồng độ

3 – 10% trong 1 – 30 phút trước khi rửa bằng nước cất vô trùng khi sử dụng Sự kếthợp giữa NaOCl và H2O2 là rất độc với mô thực vật, do đó phải rửa thật sạch

 Khí Clo (Cl2): Thường được sử dụng nhiều trong khử trùng hạt khô

 Sodium dichloroisocyanurate (NADCC): Chất này ít độc đối với mô thực vật,không cần rửa lại mẫu cấy bằng nước cất vô trùng sau khi xử lý bằng chất này

 Chất kháng sinh: Gentamicine và Ampicilline: Những kháng sinh này có tácdụng hỗ trợ thêm cho việc sử dụng ethanol và thuốc tẩy Dung dịch kháng sinh 50– 100 mg/l được dùng để ngâm mẫu trong 30 phút trước khi nuôi cấy

Như vậy, việc tìm ra thời gian khử trùng ngắn nhất và nồng độ khử trùng thấp màvẫn thu được mẫu cấy vô trùng là điều rất quan trọng, vì các chất khử trùng có thểphá hủy mô của mẫu cấy và làm chết mẫu cấy (Dương Công Kiên, 2002)

2.2 Giới thiệu chung về Kim Ngân Hoa

 Loài: Lonicera japonica Thunb Hình 2.1 Cây Kim Ngân Hoa

(Lonicera japonica Thunb)

 Tên nước ngoài: Japanese honeysuckle (Anh), chèvrefeuille

du Japon (Pháp)

o Nhẫn đông hoa (Tân Tu Bản Thảo)

o Ngân hoa (Ôn Bệnh Điều Biện)

o Kim Ngân Hoa, Kim Ngân Hoa Lộ, Mật Ngân Hoa, Ngân Hoa Thán, Tế NgânHoa, Thổ Ngân Hoa, Tỉnh Ngân Hoa (Đông Dược Học Thiết Yếu)

o Song Hoa (Trung Dược Tài Thủ Sách)

o Song Bào Hoa (Triết Giang Dân Gian Thảo Dược)

o Nhị Hoa (Thiểm Tây Trung Dược Chí)

o Nhị Bảo Hoa (Giang Tô Nghiệm Phương Thảo Dược Tuyển Biên)

o Kim Đằng Hoa (Hà Bắc Dược Tài)

2.2.2 Đặc điểm quan trọng của cây Kim Ngân Hoa

Kim Ngân Hoa có tên khoa học là Lonicera japonica Thunb, là loại dược liệu quan

trọng thuộc họ Kim Ngân (Caprifoliaceae) Họ này g m kho ng 800 lồi t p trung ồm khoảng 800 lồi tập trung ảng 800 lồi tập trung ập trung phổbiến ở khu vực ôn đới Bắc bán cầu, với trung tâm đa dạng nằm ở miền đông Bắc Mỹvà miền đông châu Á, trong khi không có mặt tại khu vực châu Phi nhiệt đới và miềnnam của châu lục này

Trong phân loại của hệ thống APG II năm 2003

Tại Việt Nam, chi Lonicera L có khoảng 10 loài, tất cả đều được dùng làm thuốc.

Kim Ngân Hoa là cây bụi hay dây leo, ít thấy cây thân thảo có các đặc điểm hình tháisau:

 Thân có thể dài đến 9-10m, rỗng, có nhiều cành, lúc non màu xanh, khi giàmàu đỏ nâu, trên thân có những vạch chạy dọc

 Lá mọc đối nhau, hình trứng dài Phiến lá rộng 1,5 - 5cm, dài 38cm Lá câyquanh năm xanh tươi, mùa rét không rụng

 Hoa khi mới nở có màu trắng, nở ra lâu chuyển thành màu vàng Hoa mọc ởkẽ lá, mỗi kẽ lá có 2 hoa mọc trên 1 cuống chung Lá bắc giống như lá cây nhưngnhỏ hơn Tràng hoa cánh hợp, dài từ 2,5 – 3,5 cm, chia làm 2 môi không đều Môirộng lại chia thành 4 thùy nhỏ, 5 nhụy đính ở họng tràng, mọc thò dài ra ngoàihoa

 Quả hình cầu, màu đen Mùa quả: tháng 6 – 8

 Nụ hoa hình gậy, hơi cong queo, dài 25cm, đường kính đạt đến 5mm Mặtngoài màu vàng đến vàng nâu, phủ đầy lông ngắn Mùi thơm nhẹ vị đắng Mùahoa: tháng 3 – 5.

Theo Tài nguyên Cây Thuốc Việt Nam, ngoài Kim Ngân nói trên người ta còndùng một số loại Kim Ngân sau:

 Kim Ngân Dại (Lonicera dasystyla Rehd): Lá hình trứng nhọn dài 28 cm, rộng

14 cm; Mép lá trên nguyên, lá gốc chia thùy; Phiến lá mỏng, mặt trên nhẵn, mặtdưới phủ lông mịn; Hoa ống tràng, thẳng hoặc hơi cong, dài 1,8 – 2,2 cm; Bầunhẵn

 Kim Ngân Lông (Lonicera cambodiana Pierre): Lá hình thuôn hơi dài, dài

khoảng 5 – 12 cm, rộng 36 cm; Mép lá nguyên cuộn xuống dưới mặt lá; Phiến lákhá dày, mặt trên nhẵn, trừ cuối gân giữa, mặt dưới lông xù xì, nhất là ở gân lá;Hoa ống tràng, thẳng hoặc hơi cong, dài 56 cm; Bầu có nhiều lông

 Lonicera confusa D C: Lá hình thuôn dài, dài 46 cm, rộng 1,5 – 3 cm; Mép lá

nguyên; Phiến lá hơi dày, mặt trên nhẵn, mặt dưới có nhiều lông ngắn mịn; Hoaống tràng thẳng hoặc hơi cong, dài 3 cm; Bầu có lông

Trong cây Kim Ngân Hoa có chứa các thành phần hóa học như sau

 Luteolin, Inositol, Tannin, saponin (Trung Dược Học)

 Hoa chứa Scolymozid (Lonicerin), 1 số Carotenoid ( caroten, cryptoxanthin,auroxantin) Lá chứa Loganin (Tài Nguyên Cây Thuốc Việt Nam)

 Chlorogenic acid, Isochlorogenic acid (Lý Bá Đình, 1986)

Ginnol, b-Sitosterol, Stigmasterol, b-Sitosterol-D-Glucoside, Stimasteryl-D-Glucoside (Sim và cộng sự, 1981).

Bộ phận dùng làm thuốc thường là hoa mới chớm nở, lá và thân thì ít dùng hơn.Khi hoa sắp chớm nở thì thu hái; nên hái vào khoảng 9-10 giờ sáng (lúc này sương đãráo), nhặt bỏ tạp chất, đem tãi mỏng phơi trong râm mát hoặc sấy nhẹ đến khô Dâylá có thể thu hái quanh năm, thái nhỏ, phơi khô, bảo quản nơi khô ráo, tránh ẩm Cótác dụng dược lý như sau:

 Tác dụng kháng khuẩn: nước sắc hoa Kim Ngân có tác dụng ức chếmạnh đối với tụ cầu khuẩn, trực khuẩn thương hàn, trực khuẩn lỵ Shiga Nước sắccó tác dụng mạnh hơn các dạng bào chế khác (Tài Nguyên Cây Thuốc Việt Nam).

Khi nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn in vitro bằng các phương pháp khuyếch tán

và hệ nồng độ, người ta thấy nước sắc cô đặc 100% của hoa Kim Ngân có tác dụngkháng khuẩn mạnh đối với các trực khuẩn lỵ, dịch hạch, thương hàn, cận thương hàn,liên cầu khuẩn tan máu, phẩy khuẩn tả Tác dụng yếu hơn đối với các trực khuẩn

bạch hầu, E.Coli, phế cầu, tụ cầu khuẩn vàng Nước sắc lá Kim Ngân với nồng độ

201,2% ức chế trực khuẩn Shiga, với nồng độ 2050% ức chế trực khuẩn cận thươnghàn, nồng độ 100% có tác dụng đối với tiêu cầu khuẩn (Tài Nguyên Cây Thuốc ViệtNam)

 Tác dụng trên đường huyết: Nước sắc hoa Kim Ngân cho uống có tácdụng ngăn chặn choáng phản vệ ở chuột lang Ở chuột lang uống Kim Ngân, sốlượng và tính chất các dưỡng bào ở mạc treo ruột ít thay đổi Lượng Histamin ởphổi chuột lang bị choáng phản vệ cao gấp rưỡi so với chuột lang bình thường vàchuột lang uống Kim Ngân trước khi gây choáng (Tài Nguyên Cây Thuốc ViệtNam)

 Tác dụng kháng viêm: Làm giảm chất xuất tiết, giải nhiệt và làm tăngtác dụng thực bào của bạch cầu (Trung Dược Học)

 Tác dụng hưng phấn trung khu thần kinh: Cường độ bằng 1/6 của cà phê(Trung Dược Học)

 Tác dụng chống lao: Nước sắc Kim Ngân Hoa in vitro có tác dụng chống Mycobacterium tuberculosis Cho chuột uống nước sắc Kim Ngân hoa rồi

cho chích vi khuẩn lao cho thấy ít thay đổi ở phổi hơn lô đối chứng (Trung DượcHọc)

 Kháng Virus: Nước sắc Kim Ngân Hoa có thể làm giảm sức hoạt độngcủa PR8 ở virus cúm nhưng không có tác dụng ở phôi gà con đã tiêm chủng (TrungDược Học)

 Tác dụng chuyển hóa Lipid: Cho chuột béo phì dùng lượng lớnCholesterol vỗ béo cho chuột đồng thời cho uống nước sắc Kim Ngân Hoa, mức

Cholesterol trong máu của chúng thấp hơn so với nhóm đối chứng (Trung DượcHọc).

 Trong nhãn khoa: Nước sắc Kim Ngân Hoa có hiệu quả trong điều trịcho những trường hợp bị kết mạc viêm mạn, giác mạc loét (Trung Dược Học)

 Làm hạ Cholesterol trong máu (Trung Dược Học)

 Tăng bài tiết dịch vị và mật (Trung Dược Học)

 Tăng tác dụng thu liễm do có chất Tanin (Sổ Tay Lâm Sàng TrungDược)

 Có tác dụng lợi tiểu (Sổ Tay Lâm Sàng Trung Dược)

2.2.4 Điều kiện trồng trọt

Kim Ngân có nguồn gốc ở vùng Đông Á, phân bố ở Trung Quốc, Nhật Bản vàTriều Tiên Ở Việt Nam, Kim Ngân phân bố chủ yếu ở các tỉnh vùng núi và trung duphía bắc, như Quảng Ninh, Cao Bằng, Lạng Sơn, Bắc Giang, Hà Tây,…

Kim Ngân thích nghi với nhiều loại đất và khí hậu khác nhau Cây ưa sáng, thườngmọc ở rừng thứ sinh, đồi cây bụi và rừng thưa núi đá vôi

Giống

Cây Kim Ngân có 2 cách nhân giống: Nhân giống hữu tính và nhân giống vô tính

 Nhân giống hữu tính:

Dùng hạt để gieo, đầu tháng 11 thu hoạch quả chín, trong mỗi quả có 4-7 hạt Đemhạt phơi khô, cất giữ đến cuối tháng 3 năm sau đem gieo Bỏ hạt vào nước ấm 300Cngâm 21 giờ, vớt ra trộn với cát ẩm để thúc đẩy sự nảy mầm, khi hạt đã nứt vỏ trên30% thì đem gieo

 Nhân giống vô tính truyền thống

Cho tới nay các nơi trồng Kim Ngân phần lớn dùng cách nhân giống vô tính truyềnthống gồm hai cách: trồng bằng cắm hom và trồng bằng đánh tỉa chồi

+ Cách nhân giống bằng đánh tỉa chồi: Đánh tỉa chồi thường phải chọn lúc trên

chồi có nụ hoa đang nở Vì thế nếu đánh chồi đi trồng thì sang năm cây mẹ sẽ không

ra hoa và ảnh hưởng tới sản lượng Do đó cách này thường ít khi được sử dụng

+ Cách trồng bằng hom: Cách trồng bằng hom là cắt lấy đoạn thân cây chưa rahoa để mang đi trồng Cách làm này đơn giản, cây ra hoa sớm nên bà con nông dânthích dùng cách nhân giống này Lúc cắm hom tốt nhất là chọn ngày râm mát sau khimưa, vì đất ẩm, độ ẩm không khí cao, cắm xong tỷ lệ cây sống cao Hom cần phải chọn ở cây khoẻ mạnh, cây đã một, hai tuổi, tỷ lệ sống cao nhất, sinhtrưởng cũng nhanh Trước khi cắm phải cuốc hốc rồi đặt hom vào hốc; ở dốc núi vàđất bờ ruộng khoảng cách giữa các cây 1,3 – 1.7m chỗ đất đai khác nói chung hàngcây cách nhau là 1,7m, hốc sâu.

Chăm sóc

 Vun xới đất: Vun xới đất có thể làm cho đất tơi xốp giữ cho gốc câyđược vững chắc, làm cho rễ mọc nhiều, cây mọc nhiều cành Hàng năm vàotiết trước kinh trập (khoảng ngày 5 tháng 3 hàng năm), tiến hành vun xới đấtmột lần và vào trước lúc bước vào mùa đông lạnh giá cuối thu vun gốc cây lầnthứ hai

 Làm cỏ: Mỗi năm có thể làm cỏ 3 - 5 lần Khi làm cỏ nên chú ý trướchết bắt đầu từ ngoài vào gốc, về sau làm dần vào, lần trước xới đất sâu, các lầnsau xới nông dần để tránh rễ bị tổn thương

 Bón phân: Mỗi năm bón phân thúc một lần, bón vào lúc trước khi bướcvào mùa đông hoặc trước khi cây đâm chồi nảy lộc đầu xuân Những lần saucó thể bón vào sau lúc đâm chồi một lần và sau khi hái hết hoa bón một lần

 Tưới nước: Thực tế cho thấy tưới nước có tác dụng nhất định đối với việclàm tăng sản lượng Vì thế vào mùa xuân khô hạn nên tiến hành tưới nước chocây

 Tỉa bớt cành: Tỉa ở những cây cành mọc quá dày Khi tỉa phải nắm vữngnguyên tắc tỉa từ trong ra ngoài, chia ra từng lớp Việc tỉa cành này sẽ gópphần làm cho cây ra hoa nhiều hơn

Phòng trừ sâu bệnh

Kim Ngân rất ít sâu bệnh Sâu hại Kim Ngân có rệp là nghiêm trọng nhất, loàinày thường xuất hiện trước khi cây ra hoa Để phòng rệp thì cuối đông đầu xuân phátvà cuốc hết cỏ dại ở xung quanh gốc cây, đào xới cho đất tơi xốp ở xung quanh gốc

cây là đã tiêu diệt được môi trường lây lan của rệp Hạn chế dùng hoá chất trừ sâubệnh vì nó sẽ làm cho hoa bị nhiễm độc không an toàn cho dược liệu sau này.

Thu hoạch và chế biến:

Thu hoạch: Thời vụ thu hoạch Kim Ngân là từ cuối tháng 5 đến đầu tháng 6, từlúc cây có nụ hoa đến lúc hoa nở trong khoảng 15 ngày Thời gian hái hoa nên chọnlúc nụ hoa màu xanh trở thành màu trắng, lúc hoa bắt đầu nở là tốt nhất.Sau khi hái hoa về nên phơi và sấy khô ngay Hoa sau khi đã phơi sấy khô nên chú ýbảo quản ở nơi thoáng gió, tránh nơi ẩm ướt

2.2.5 Những nghiên cứu chính về Kim Ngân Hoa

Lê Thị Diễm Hồng và cộng sự (2007) đã nghiên cứu tác dụng chống viêm mãntính của saponin và flavonoid cây Kim Ngân kết hợp với α-chymotrypsin và -αamylase cho thấy saponin và flavonoid Kim Ngân có tác dụng chống viêm trên môhình gây viêm mạn tính Khi kết hợp saponin và flavonoid Kim Ngân với α-chymotrypsin và α-amylase, tác dụng tăng lên so với khi dùng đơn độc từng hoạtchất Saponin và flavonoid Kim Ngân kết hợp với α-chymotrypsin và α-amylase cótác dụng làm giảm số lượng bạch cầu, không làm thay đổi nồng độ protein huyếtthanh, làm tăng tỷ số A/G, làm giảm nồng độ seromucoid huyết thanh tương đươngvới của indomethacin ở lô đối chứng

 Ngoài nước

Nghiên cứu đầu tiên của sự phát sinh mô sẹo từ cây trên 6 tháng tuổi do D

Georges và cộng sự (1993) đã nghiên cứu thành công sự tái sinh cây Lonicera

japonica "Hall's Prolific" từ nuôi cấy mô lá trưởng thành, thân và đốt rễ trên môi

trường chứa 10,7 µM NAA và 2.7 µM BA, trong khi đó môi trường chứa 2,4-D lại làmchết nhanh chóng các mẫu cấy Kết quả cho thấy sự tái sinh chồi đạt được tỷ lệ caonhất trên môi trường chỉ chứa BA (4.4 từ 44.4 µM ) Sự phát sinh chồi dễ dàng và đãbén rễ trên môi trường dùng để nhân Cây con đem ra trồng ngoài tự nhiên có tỷ lệsống khá cao

Năm 2003, Suk Weon Kim và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tái sinh Lonicera

japonica Thunb thông qua phát sinh phôi soma từ nuôi cấy phôi và nuôi cấy huyền

phù tế bào Từ phôi hợp tử trưởng thành đã tạo được mô sẹo với tần suất cao 46.7%trên môi trường MS cơ bản có bổ sung 4.52 µM 2,4-D Nuôi cấy huyền phù tế bàotrên môi trường MS lỏng có bổ sung 4,52 µM 2,4-D đã phát sinh rất nhiều phôi somarồi phát triển thành cây con với tần suất 68% Cây con đem trồng ngoài tự nhiên có tỷlệ sống rất cao

3.1 Thời gian và địa điểm thí nghiệm

Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 4 đến tháng 6 năm 2009 tại phòng thí nghiệmthực vật trường Đại học Kỹ Thuật Công Nghệ TP HCM

3.2 Vật liệu

3.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng được sử dụng trong nghiên cứu là cây Kim Ngân Hoa (Lonicera

japonica Thunb) được trồng tại thành phố Hồ Chí Minh.

Nguồn mẫu được sử dụng để tiến hành các thí nghiệm là phần lá Kim Ngân đượctuyển chọn trực tiếp từ các vườn trong thành phố Hồ Chí Minh Các cây Kim Ngânđược chọn phải khỏe, gốc cây to, thân leo tốt, có sức sống tốt, phần lá non, xanh,phiến lá to, không bị sâu bọ phá hoại

Mẫu lá sau khi cắt ra từ cây được cho vào hộp nhựa và tiến hành tuần tự theo cácbước khử trùng mẫu như sau:

Khử trùng sơ bộ

 Mẫu lá được đặt dưới vòi nước chảy trong 30 phút để loại bỏ bớt sựnhiễm bẩn bề mặt

 Rửa kỹ từng mẫu lá trong nước rửa chén được pha loãng

 Rửa lại bằng nước máy từ 4 – 5 lần và đưa vào tủ cấy

Khử trùng mẫu bên trong tủ cấy

 Chuyển mẫu sang một erlen khác đã được hấp khử trùng

 Tiến hành lắc khử trùng mẫu lá bằng dung dịch Javel (NaOCl) 7% có bổ sungthêm vài giọt Tween 20 trong các khoảng thời gian khác nhau

 Rửa lại bằng nước cất vô trùng 3 – 4 lần cho sạch hết chất khử trùng

 Ngâm mẫu trong nước cất vô trùng để chuẩn bị tiến hành các thí nghiệm

3.2.2 Trang thiết bị và dụng cụ

Thiết bị: tủ vô trùng, nồi hấp, máy đo pH, cân phân tích, máy lạnh, kệ đặt bình,đèn neon, …

Dụng cụ: dao cấy, bình thủy tinh 500 ml, đĩa, đèn cồn, …

3.2.3 Các loại môi trường

Môi trường sử dụng là môi trường muối khoáng cơ bản của Murashige và Skoog(1962) có bổ sung thêm đường sucrose (30 g/l), agar (9 g/l) và các chất điều hòa tăngtrưởng thực vật

Tùy theo mục đích của từng thí nghiệm mà môi trường có thể bổ sung các chấtđiều hòa sinh trưởng ở những nồng độ khác nhau