Công nghệ thu nhận ezyme amylaza và ứng dụng trong thực phẩm

Trong tế bào sinh vật luôn xảy ra quá trình trao đổi chất, enzym đã góp phần thúc đẩy các phản ứng hóa học này xảy ra ở điều kiện bình thường với tốc độ cực nhanh mà không cần sự hỗ trợ

Công nghệ thu nhận ezyme amylaza và ứng dụng trong thực phẩm

I. Công nghệ thu nhận ezyme amylase:

1. Tổng quan về enzym:

- Enzym là chất xúc tác sinh học được hình thành trong tế bào dưới dạng hợp chất protein có cấu trúc hóa học rất đặc thù Trong tế bào sinh vật luôn xảy ra quá trình trao đổi chất, enzym đã góp phần thúc đẩy các phản ứng hóa học này xảy ra ở điều kiện bình thường với tốc độ cực nhanh

mà không cần sự hỗ trợ của các yếu tố nhiệt độ, áp suất….enzyme có thể thu nhận từ các nguồn khác nhau như thực vật, động vật, vi sinh vật

- Enzyme trong cơ thể sinh vật với chức năng là xúc tác chọn lọc, đóng vai trò định hướng tát cả mọi phản ứng xảy ra trong tế bào Khi ở ngoài tế bào nhiều enzyme vẫn có khả năng hoạt động tương tự chính vì lý do đó khi tách được enzyme ra khỏi cơ thể sống ở mức độ thuần khiết khác nhau người ta có thể sử dụng trong nhiều lĩnh vực Nguồn ezyme quan trọng hiện nay chủ yếu được thu nhận từ vi sinh vật

2. Định nghĩa enzyme amylase:

3. Phân loại ezyme amylase:

4. Cơ chất:

Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen

a. Tinh bột:

- Là nhóm cacbohydrat ở thực vật, chủ yếu trong các loại củ như khoai tây, khoai lang, khoai mì….trong các hạt ngũ cốc, các laoij hạt và có công thức tổng quát là (C6H12O6)n hạt tinh bột

cs hình dáng rất khác nhau có kích thước từ 2 đến 15m Tinh bột không nước có khối lượng riêng khoảng 1,633 – 1,648

- Tinh bột bao gồm: amylose và amylopectin

b. Glycogen:

5. Hệ enzyme amylase:

a Enzyme α-Amylase (α-1,4-glucanohydrolase)

 Cấu tạo:

Enzyme α-Amylase là protein có phân tử lượng thấp, thường nằm trong khoảng 50.000 đến 60.000 Dal Có một số trường hợp đặc biệt như α-Amylase từ loài vi khuẩn Bacillus macerans

có phân tử lượng lên đến 130.000 Dal Đến nay người ta đã biết rất rõ cácchuỗi acid amin của 18 loại α-Amylase nhưng chỉ có 2 loại α-Amylase là taka-Amylase từ Apergillus orysee

và α-Amylase của tụy lợn được nghiên cứu kỹ về hình thể không gian cấutrúc bậc 3 Mới đây các nghiên cứu về tính đồng nhất của chuỗi mạch acid amin và về vùng kịnước cho thấy các chuỗi mạch acid amin của tất cả các Enzyme α-Amylase đều có cấu trúc bậc 3 tương tự nhau

Cấu trúc không gian của enzyme @-amylase

 Cơ chế tác dụng của α-Amylase:

α-Amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau α-Amylase có khảnăng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất ( tinh bộthoặc glycogen ) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả α-Amylase không chỉthủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc độ rất chậm

Dưới tác dụng của α-Amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose,maltose, glucose và dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường α-Amylase chỉ thủy phântinh bột chủ yếu thành dextrin phân

tử thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose Khảnăng dextrin hóa cao của α-Amylase là tính chất đặc trưng của nó Vì vậy, người ta thườnggọi loại Amylase này là Amylase dextrin hóa hay Amylase dịch hóa

 đặc tính

α-Amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α-Amylase có một

tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng α-Amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic

và aspartic Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử Enzyme:

+ α-Amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine

+ Trọng lượng phân tử của α-Amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da ( Knir 1956;Fisher, Stein, 1960 ) + Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng

+ Protein của các α-Amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline

Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH=4,2 - 5,7 ( Bernfeld P, 1951 ).α-Amylase là một metaloEnzyme Mỗi phân tử α-Amylase đều có chứa 1-30 nguyêntử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1 - 6 nguyên tử gam/mol Ca tham gia vào sự hình thànhvà ổn định cấu trúc bậc 3 của Enzyme, duy trì hoạt động của Enzyme ( Modolova, 1965 ) Dođó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của Enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biếntính và tác động của các Enzyme phân giải protein Nếu phân tử α-Amylase

bị loại bỏ hết Cathì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất α-Amylase bền với nhiệt

độ hơncác Enzyme khác

b Enzyme β-Amylase (β-1,4-glucan-maltohydrolase)

 Cấu tạo:

β-Amylase hiện diện phổ biến ở thực vật, đặc biệt là hạt nảy mầm Ở trong các hạt ngũcốc nảy mầm, β-Amylase xúc tác sự thuỷ phân các liên kết 1,4 α-glucan trong tinh bột ,glucogen và polysaccharide, phân cắt từng nhóm maltose từ đầu không khử của mạch Maltose được tạo thành do sự xúc tác của β-Amylase có cấu hình β.Ở ngũ cốc, β-β-Amylase tham gia vào sự phân giải của tinh bột trong quá trình nảy mầmcủa hạt Ở lúa, β-Amylase được tổng hợp trong suốt quá trình của hạt và hầu như không đượctổng hợp ở hạt khô Ở lúa mạch, Enzyme có mặt ở trong hạt khô, nó được tích lũy trong suốtquá trình phát triển của hạt, khi ở dạng liên kết, Enzyme này là một phân tử có trọng lượng phân tử là 64.000 Da và khi bị phân cắt bởi một protease sẽ được phóng thích dưới dạng tự dovà có khối lượng phân tử là 59.000 Da

 cơ chế

β-Amylase là một Enzyme ngoại bào (exoenzyme) Tiến trình phân giải bắt đầu từ đầukhông khử của các nhánh ngoài cùng cơ chất β-Amylase phân cắt các liên kết α-1,4glucoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4 glucoside đứng kế cận liên kết α-1,6glucoside thìnó sẽ ngừng tác dụng Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân tử lớn có chứa rất nhiềuliên kết α-1,6 glucoside và được gọi là β-dextrin.Cơ chế tác dụng của β-Amylase lên tinh bột

Tinh bột maltose (54-58%)+ β-dextrin(42-46%)(glucogen)

Tinh bột bị thuỷ phân đồng thời bởi cả α và β-Amylase thì lượng tinh bột thuỷ phân tới 95%

Đặc tính của β-Amylase:

β-Amylase là một albumin , tâm xúc tác có chứa nhóm –SH , nhóm X-COOH và vòngimidazol của các gốc histidine và là Enzyme ngoại bào (exoEnzyme )Amylase không bền khi có Ca2+,

β-Amylase bị kìm hãm bởi Cu2+, Hg2+, urea,iodineoacetamide, iodine, ozon…β-β-Amylase chịu nhiệt kém hơn α-Amylase nhưng bền hơn với acid β-Amylase bị bất hoạt ở nhiệt độ 700C Nhiệt độ tối thích của β-Amylase là 550C , pH 5,1 – 5,5.Tham gia vào cơ chế tác dụng của β-Amylase thường có một nhóm caboxyl thể hiệntính chất ái nhân và một nhóm imidazol thể hiện tính chất ái electron Sự nghịch đảo hình thểcủa cacbon anome (C1) được thực hiện nhờ việc tạo thành hợp chất đồng hoá trị trung giankiểu este axetal giữa cacbon anome và nhóm cacboxyl của tâm hoạt động Sau

đó este này bị phân huỷ bởi tác động của 1 phân tử nước lên nhóm cacboxyl để giải phóng ra

α-maltose và hoàn nguyên nhóm cacbxyl của Enzyme

Nguồn gốc

Enzyme

(kD)

Các Đặc tính của β-Amylase:

c Enzyme γ-Amylase (glucoamylase)

 Cấu tạo:

γ-Amylase ( glucoamylase hay α-1,4-glucan-glucohydrolase ) là những Enzyme có thể thuỷ phân được cả hai kiểu liên kết của các mạch α-glucan để giải phóng ra ở dạng β

Glucoamylase hay γ-Amylase chủ yếu được tạo ra bởi các vi sinh vật Đặc biệt là kiểu nấmmốc aspergillus, penicillium và Rhizopus

 Cơ chế hoạt động:

Amyloglucosidase có thể giải phóng ra β-D-glucose bằng cách thuỷ phân lặp lại nhiềulần các liên kết α-1,4 của mạch α-glucan từ đầu không khử, chúng cũng thuỷ phân được cácliên kết α-1,6 và α-1,3 nhưng rất chậm (10 - 30 lần ) Tốc độ thuỷ phân cũng phụ thuộc vào bản chất của các liên kết kề cận với các liên kết glucozit được thuỷ phân , cũng như kíchthuớc và cấu trúc của cơ chất bị thuỷ phân Nhất là với các α-glucan mạch dài ( amylose và amylopectin ) thì bị thuỷ phân nhanh hơn là với các maltodextrin và các oligosaccharit

 Tính chất:

Glucoamylase có khả năng thuỷ phân các liên kết 1,4 lẫn 1,6 glucoside Khi thuỷ phân liên kết α-1,4-glucan trong chuỗi polysaccharide, glucoamylase tách lần lượt từng phântử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo ra glucose Enzyme này có nhiều tên gọikhác nhau: α-1,4 ; α-1,6-glucan-4; 6-glucohydrolase; glucoamylase; amyloglucosidase;taka-Amylase B; γ-Amylase… Là Enzyme ngoại bào Ngoài các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside , glucoamylase còn có khả năng thuỷ phâncác liên kết α-1,2 và α-1,3 glucoside Glucoamylase có khả năng thuỷ phân hoàn toàn tinh bột , glucogen , amylopectin ,dextrin , panose , iso maltose và maltose thành glucose, mà không cần có sự tham gia cuả cácloại Enzyme khác Glucoamylase thuỷ giải các polysaccharide có phân tử lớn nhanh hơn so với các chất có phân tử nhỏ Các polisaccharide có nhánh như amylopectin, glucogen, β-dextrin bị glucoamylase thủy phân khá nhanh

d Oligo 1,6-glucosidase (dextrinase tới hạn)

Enzyme này có thể thuỷ phân liên kết α-1,6 – glucoside trong isomaltose , panose vàcác dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được Enzyme này có ở VSV nhưng đồng thờicũng có trong các hạt nảy mầm ( đại mạch, thóc nảy mầm ) Ngoài oligo–1,6–glucosidase, hệdextrinase của hạt ngũ cốc , hạt nảy mầm còn có amylopectin–1,6–glucosidase hay R– Enzyme và dextrin–1,6–glucoside hay amylo–1,6–glucoside hay dextrin-6-glucocanhydrolase Hai loại Enzyme này đều thuỷ phân dextrin triệt để hơn α-Amylase vàβ-Amylase do đó trong dung dịch thuỷ phân có nhiều maltose hơn

Nhiệt độ tối thích cho các hoạt động của các dextrinase là 40C và pH tối thích là 5,1

6. Hoạt lực của enzyme amylase:

Khi sử dụng bất kì 1 chế phẩm enzyme no cũng cần biết hoạt lực của các enzyme này Các chế phẩm có hoạt tính phân giải tinh bột thường chứa 1 loại enzyme amylase Vì vậy hoạt lực tổng hợp của chúng phản nhận tác dụng tất cả các amylase trong chế phẩm

amylase dễ dàng thủy phân tinh bột thành dextrin, các glucoamylase lại phân giải tinh bột tới glucose và làm thay đổi màu với iodine chậm, vì lẽ trong dung dịch có một lượng nhỏ dextrin phân tử lớn Do vậy mà người ta đánh giá sự có mặt của -amylase trong chế phẩm (hoặc canh trường vsv) bằng sự thay đổi màu với iodine, đánh giá sự có mặt của glucoamylase bằng sự tích tụ glucose, mặc

dù cùng 1 hiện diện đồng thời của cả 2 enzyme này đề làm tăng hiệu quả phân giải

Hoạt độ thật của từng enzyme một thấp hơn so với số liệu thu được Cho nên, nếu như ta làm việc với chế phẩm phức hợp thì phải luôn luôn xác định hiệu lực tác dụng tổng hợp của mọi amylase lên cơ chất

Để xác định hoạt độ của các enzyme amylase có thể dùng một trong các phương pháp sau:

- Đo sự biến thiên độ nhớt của dung dịch bằng nhớt kế khi cho amylase tác dụng lên hồ tinh bột, khi đó các mạch phân tử cơ chất bị cắt ngắn, độ nhớt dung dịch giảm dần

- Đo mật độ quang của dung dịch sau khi thực hiện phản ứng màu với iodine Khi có amylase tc dụng thì cc sản phẩm phn giải của tinh bột sẽ cho mu khc nhau đối với iodine

- Đo lượng đường maltose hoặc glucose tạo thành sau khi cho enzyme tác dụng lên cơ chất

Đáng chú ý hệ enzyme amylase có các hoạt độ đặc trưng sau:

- Hoạt độ amylase (HĐA) đặc trưng cho khả năng thủy phân tinh bột bởi các enzyme amylase (chủ yếu là của -amylase) tới dextrin cho màu với iodine khác với màu của tinh bột ban đầu Hiện nay phương pháp so màu quang điện của Rukliadeva và Goriatreva (1985) được xem là phương pháp xác định hoạt độ amylase tiêu chuẩn

- Hoạt độ glucoamylase (HĐGI) đặc trưng cho khả năng của chết phẩm thủy phân tinh bột đến glucose Muốn xác định HĐGI cần đo được lượng glucose tạo thành

- Hoạt độ đường hóa (HĐĐH) phản ánh khả năng của các enzyme amylase đường hóa tinh bột đến các đường khử

- Hoạt độ maltose (HĐM) đặc trưng cho khả năng thủy phân maltose tới glucose của chế phẩm enzyme

- Hoạt độ dextrinase (HĐDEX) đặc trưng cho khả năng thủy phân “ các dextrin tới hạn “ tới đường khử của chế phẩm enzyme

7. Các phương pháp thu nhận enzyme amylase:

Enzyme amylase có trong các tế bào sinh vật, động thực vật, các loại nấm mốc Muốn thu nhận enzyme cần chiết rút ra khỏi tế bào

Trong cơ thể sinh vật, enzyme ở trong tế bào chất và các cấu tử tạo nên tế bào như nhân microsom… Enzyme không có khả năng đi qua màng tế bào , để đi vào dung dịch chiết Vì vậy việc đầu tiên là cần phải phá vỡ màng tế bào Việc phá vỡ cấu trúc tế bào có thể sử dụng một số cách sau :

• Biện pháp cơ học như nghiền xay với bột thủy tinh, cát thạch anh hoặc máy xay đồng hóa…

• Bằng dung môi hữu cơ như butanol, axeton , glycerin, etyl axetat …

• Bằng sóng siêu âm, tia X , tia UV …

Sau khi nghiền nhỏ enzyme được chiết rút bằng nước hay dung dịch đệm thích hợp , hoặc dung dịch muối trung tính…

Dung dịch thu được sau khi chiết ngoài enzyme còn có các tạp chất khác như protein phi enzyme , muối , gluxit…

Chúng ta cần loại bỏ để thu nhận enzyme có độ tinh khiết cao Có rất nhiều phương pháp tinh sạch enzyme sau đây là một số phương pháp cơ bản được sử dụng rộng rãi và có hiệu quả :

• Để loại muối và tạp chất có trọng lượng phân tử nhỏ ta dùng phương pháp thẩm tích qua màng bán thấm Tinh chất của màng này sẽ cho chất có trọng lượng phân tử nhỏ đi qua Các chất có trọng lượng lớn bị giữ lại ( enzyme, protein )

• Để loại protein lạ và tạp chất có trọng lượng phân tử cao ta dùng phối hợp nhiều phương pháp khác nhau như sắc kí hấp phụ , sắc kí trao đổi ion, điện di lọc gel…

8. Nguồn thu nhân enzyme amylase:

a. Từ động vật:

- Enzyme amylase có trong tụy tạng của động vật Tụy tạng là ống dạng chùm, dài, lớn , nằm ngang phía sau dạ dày , giữa lá rách và tá tràng Chiều dài của tụy tạng khoảng 30-35cm , và nặng khoảng 80-150g Bên trong có những vách ngăn nhỏ chia tụy tạng thành nhiều thùy nhỏ Tụy tạng vừa có chức năng nội tiết vừa có chức năng ngoại tiết

- Thu nhận amylase từ động vật phần lớn là từ dịch tụy tạng 98% tụy tạng được cấu tạo từ các tế bào ngoại tiết hoặc là tế bào tuyến Các tế bào này tiết enzyme tiêu hóa vào trong tá tràng

b. Từ thực vật:

- Đại mạch (Hordeum sativum): có giống hai hàng và giống nhiều hàng (4,6 hàng) , trong đó người ta sử dụng hai hàng để sản xuất malt làm bia, những loại còn lại để làm thức ăn cho gia súc

- Lúa (Oryse sativa L) : chủ yếu ở vùng Đông Nam Á

- Ngô (Zea mays): có nhiều loại ngô: ngô đá , ngô bột, ngô răng nhựa Hạt ngô có màu trắng , màu vàng hay màu hồng Ngô màu vàng do có sự hiện diện của carotenoid và zeaxanthine ở trong nội nhũ , ngô màu hồng là do trong nội nhũ của ngô có

anthocyanin

c. Từ vi sinh vật:

- Khi nuôi VSV tạo amylase có hai qáu trình liên quan mật thiết với nhau Quá trình tổng hợp sinh khối VSV và quá trình tích tụ enzyme trong tế bào hay ngoài môi trường

- Ở một số VSV, quá trình sinh tổng hợp amylase tiến hành song song với quá trình sinh trưởng, nghĩa là sự tích tụ enzyme phụ thuộc tuyến tính vào sự tăng khối

- Sự tạo thành amylase cực đại thường xảy ra sau khi quần thể tế bào VSV đạt điểm sinh trưởng Sinh trưởng của VSV hầu như không kèm theo sự tích lũy enzyme amylase trong canh trường, chỉ sau khi kết thúc pha sinh trưởng mới xảy ra sự tổng hợp enzyme cực lớn

- Amylase ngoại bào được tổng hợp liên tục và độc lập với amylase nội bào

- Sự tổng hợp các enzyme amylase bắt đầu khi việc tạo protein của tế bào đến kết thúc hoặc gần kết thúc và cạnh tranh với quy trình này

- Nồng độ tinh bột và các nguồn cacbon khác cũng có ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành các enzyme riêng biệt của hệ amylase khi nuôi chủng Asp

- oryzea 3-0-15 đột biến thể hiện ở bảng sau:

Sơ đồ quy trình thu nhận enzyme amylase từ VSV:

Chuẩn bị môi trường

Nuôi cấy VSV giống

Enzym ngoại bào Enzym nội bào

Páh vỡ tế bào

Lọc hoặc ly tâm

enzyme thô

Nguồn

cacbon

Hoạt độ của enzyme, đv/100ml Nguồn

Cacbon

Hoạt độ của enzyme, đv/100ml -amylase Oligo-1,6

glucozidase

-amylase Oligo-1,6

glucozidase