ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊNTRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM BÙI THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG LAN KIM TUYẾN Anoectochilus setaceus BẰNG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ – TẾ BÀO ĐỀ TÀI NGHI
Trang 1ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
BÙI THỊ HUYỀN
NGHIÊN CỨU MÔI TRƯỜNG NHÂN GIỐNG LAN KIM
TUYẾN (Anoectochilus setaceus) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI
CẤY MÔ – TẾ BÀO
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NGÀNH: SINH HỌC
Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Thị Tâm
Trang 2
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS TS Nguyễn Thị Tâm, người đã tận tìnhhướng dẫn, chỉ bảo để em hoàn thành đề tài.
Đồng thời, em cũng xin cảm ơn KTV Trần Thị Hồng phòng thí nghiệm Công nghệ
Tế bào đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ em tiến hành các thí nghiệm của đề tài
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè luôn quan tâm, ủng
hộ và tạo động lực cho em để em hoàn thành đề tài này
Trong quá trình làm đề tài không tránh khỏi những sai sót, em rất mong nhận đượcnhững ý kiến đóng góp chân thành từ phía thầy cô và các bạn
Xin chúc các thầy cô và các bạn luôn khỏe mạnh và thành công!
Thái Nguyên, ngày 15 tháng 03 năm 2013
Người thực hiện
Bùi Thị Huyền
Trang 3MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn i
Mục lục ii
Danh mục bảng iv
Danh mục hình v
Danh mục chữ viết tắt vi
MỞ ĐẦU 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Một vài nét giới thiệu về họ phong lan và cây lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) 3
1.1.1 Một vài nét giới thiệu về họ phong lan 3
1.1.2 Một vài nét giới thiệu về cây lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) 3
1.2 Kĩ thuật nuôi cấy in vitro trong công nghệ tế bào thực vật 7
1.2.1 Cơ sơ khoa học của kĩ thuật in vitro 7
1.2.2 Các hướng nghiên cứu ứng dụng và ưu thế của kĩ thuật nhân giống in vitro 8
1.2.3 Các phương thức nhân giống in vitro 8
1.2.4 Quy trình nhân giống in vitro 10
1.2.5 Một số thành tựu trong nhân giống in vitro 11
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1 Vật liệu thực vật 16
2.2 Hóa chất, thiết bị 16
2.3 Phương pháp nghiên cứu 18
2.3.1 Phương pháp pha môi trường nuôi cấy 18
2.3.2.Thăm dò môi trường nuôi cấy 19
2.4 Tính toán kết quả 20
Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21
Trang 43.1 Ảnh hưởng của BAP lên sự phát sinh chồi và tạo protocorm của lan Kim Tuyến
Trang 5DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Thành phần cơ bản của môi trường Phytamax 18Bảng 3.1 Ảnh hưởng của BAP tới tỷ lệ mô sống, tỷ lệ mô tạo chồi và tỷ lệ mô tạo
protocorm ở lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) 22
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của BAP tới sự bật chồi ở lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus)
24
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của kinetin tới tỷ lệ mô sống, tỷ lệ tạo chồi và tạo protocorm ở lan
Kim Tuyến ( Anoectochilus setaceus) 27
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của kinetin tới sự bật chồi ở lan Kim Tuyến (Anoectochilus
setaceus) .28 Bảng 3.5 Ảnh hưởng của α- NAA đến sự ra rễ ở lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus)
32
Trang 6DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Hình ảnh cây và cụm hoa lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) 6 Hình 2.1 Sơ đồ thí nghiệm nhân giống lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) 18
Hình 3.1 Biểu đồ ảnh hưởng của các nồng độ BAP tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm
ở lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) sau 8 tuần nuôi cấy 25
Hình 3.2 Ảnh hưởng của BAP tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm ở lan Kim Tuyến
(Anoectochilus setaceus) sau 8 tuần nuôi cấy 26
Hình 3.3 Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của các nồng độ kinetin tới sự phát sinh chồi và tạo
protocorm ở lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) sau 8 tuần nuôi cấy 29
Hình 3.4 Ảnh hưởng của kinetin tới sự phát sinh chồi và tạo protocorm ở lan Kim Tuyến
(Anoectochilus setaceus) sau 8 tuần nuôi cấy 30
Hình 3.5 Biểu đồ so sánh ảnh hưởng của các nồng độ α – NAA tới sự ra rễ của lan Kim
Tuyến (Anoectochilus setaceus) 34 Hình 3.6 Ảnh hưởng của α – NAA tới sự ra rễ ở lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus)
sau 8 tuần nuôi cấy 34
Trang 7DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
- CT: Công thức
- ĐC: Đối chứng
- KTST: Kích thích sinh trưởng
- PM: Môi trường PM (phytamax)
- BAP: 6 – benzyl amino purin
- α – NAA: Axit α- Naphtyl axetic
Trang 8Cây lan Kim Tuyến có tên khoa học là Anoectochilus setaceus, thuộc loài địa lan trong họ lan (Orchidaceae) Cây lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) không những
được dùng làm cảnh mà còn là một loài thảo dược có giá trị và tiềm năng rất lớn Câydùng làm thuốc chữa bệnh, tăng cường sức khỏe, làm khí huyết lưu thông, có tính khángkhuẩn, chữa ung thư [31]
Những loài lan quý ở Việt Nam được các chuyên gia nghiên cứu về phong lanđánh giá rất cao [23] Song quá trình nuôi trồng lan ở nước ta lại mang tính chất cá nhân
lẻ tẻ Nguồn giống chủ yếu từ khai thác lan rừng trong khi nguy cơ cạn kiệt nguồn lanrừng đang được báo động bởi tình trạng khai thác lan bừa bãi như hiện nay Vì thế để đápứng nhu cầu thị trường cũng như để thương mại hóa ngành sản xuất lan thì cần phải cómột nền kĩ thuật cao mà trước hết phải có một công nghệ nhân giống thật hiện đại Đóchính là công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật Công nghệ này đã trải qua hơn một trămnăm hình thành và phát triển, đem lại giá trị to lớn cho loài người [8] Ở Việt Nam kĩthuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được bắt đầu nghiên cứu và ứng dụng từ giữa nhữngnăm 80 của thế kỉ XX Những kết quả bước đầu trong nghiên cứu và ứng dụng đã đạt
Trang 9được kết quả khả quan đối với một số đối tượng cây trồng như: chuối, khoai tây, phonglan, lúa… [4],[8].
Với những giá trị rất lớn trong y học, hiện nay cây lan Kim Tuyến bị thu hái nhiềutới mức cạn kiệt ngoài tự nhiên Hiện nay lan Kim Tuyến được cấp báo thuộc nhóm IAcủa nghị định 32/2006/CP, nghiêm cấm khai thác vì mục đích thương mại [27] và lànhóm thực vật rừng đang nguy cấp EN A1a,c,d trong sách đỏ Việt Nam [3]
Từ những thực tế trên đồng thời góp phần bảo tồn các loại lan rừng quý hiếm,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu môi trường nhân giống lan Kim
Tuyến (Anoectochilus setaceus) bằng kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào”.
2 Mục tiêu nghiên cứu
Tìm được môi trường thích hợp cho việc nhân giống lan Kim Tuyến
(Anoectochilus setaceus) trong ống nghiệm.
3 Nội dung nghiên cứu
1) Thăm dò ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng (KTST) thuộcnhóm xytokinin (BAP và kinetin) lên sự phát sinh chồi của lan Kim Tuyến
(Anoectochilus setaceus) trong ống nghiệm.
2) Thăm dò ảnh hưởng KTST của nhóm auxin (NAA) đến việc ra rễ của chồi
lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) trong ống nghiệm.
Trang 10Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Một vài nét giới thiệu về họ phong lan và cây lan Kim Tuyến
1.1.1 Một vài nét giới thiệu về họ phong lan
Họ Lan, hay họ Phong lan (Orchidaceae) là họ thực vật có hoa, thuộc bộ Măng tây (Asparagales), lớp thực vật một lá mầm Họ Phong lan là một trong những họ lớn nhất
của thực vật [27] và có các thành viên trên toàn thế giới, ngoại trừ châu Nam Cực Có loàilan sống dưới mặt đất và chỉ nở hoa trên mặt đất cũng như có loài lan sống tại vùng caonguyên của dãy núi Himalaya Hoa lan có thể tìm thấy tại các vùng có khí hậu nhiệt đớinhư trong rừng già của Brasil đến các vùng có tuyết phủ trong mùa đông như tại bìnhnguyên của Manitoba, Canada Các loài lan chủ yếu mọc trên cây cao, sống biểu sinh lâunăm Chúng được gọi chung là phong lan Bên cạnh đó cũng có các loài mọc trong đất gọi
là địa lan và một số mọc trên đá gọi là thạch lan [9] Số lượng loài lan cao gấp 4 lần sốlượng loài động vật có vú hay hơn 2 lần số lượng loài chim Nó chiếm khoảng 6 – 11 %
số lượng loài thực vật có hoa [28] Hoa lan được nhiều người tiêu dùng ưa chuộng vì vẻđẹp đặc sắc và các hình thức đa dạng của chúng Hoa lan có màu sắc rất phong phú Hoanhỏ nhất chỉ bằng hạt gạo trong khi hoa lớn nhất có đường kính khoảng 1m Đa số cácloại lan được bán rộng rãi trên thị trường thường không có mùi thơm, nhưng trong tựnhiên có rất nhiều loại hoa lan có mùi thơm đặc trưng Vanilla là một loại hoa lan màhương thơm được dùng trong các loại ẩm thực của thế giới và có nguồn gốc từ Mexico,trong khi đó có loài hoa lan tỏa ra mùi khó chịu như thịt bị hỏng để hấp dẫn các loài côntrùng [28]
1.1.2 Một vài nét giới thiệu về cây lan Kim Tuyến
1.1.2.1 Phân loại và phân bố của lan Kim Tuyến
Phân loại
Lan kim tuyến có tên khoa học là: Anoectochilus setaceus, ngoài ra còn có tên khác là: Chrysobaphus roxburghi Wall., Anoectochilus roxburghii (Wall.) Wall Ex Lindl [26], hay Anoectochilus roxburglihayata [30]
Trang 11Ở Việt Nam, lan Kim Tuyến được gọi bằng nhiều tên khác nhau như: Cây KimCương, lan Gấm, Kim Tuyến, Kim Tuyến Liên, Mộc Sơn Thạch Tùng, Thạch Tằm, LáGấm [30] hay Kim Tuyến Tơ, Giải Thùy Tơ, Giải Thùy Roxburgh, Sứa Hồng, Lan NhungSét, Hoa Hiệp Khai Thần Lan,… [28]; nhưng tên thường gọi là cây lan Kim Tuyến.
Lan Kim Tuyến thuộc Chi (genus): Anoectochilus
Ở Việt Nam, lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) phân bố ở: Lào Cai
(Sapa), Hà Giang (Quản Ba), Yên Bái, Vĩnh Phúc (Tam Đảo), Hà Tây (Mỹ Đức, ChùaHương), Quảng Trị (Đồng Chè), Kontum (Đắc Tô, Đắc Uy), Gia Lai (Kbang, Kon HàNừng);
Trên thế giới, lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) xuất hiện ở: Trung Quốc
(Vân Nam, Quảng Đông), Ấn Độ, Lào, Indonexia [26]
1.1.2.2 Đặc điểm sinh học của cây lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus)
Lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) thuộc cây thân thảo, mọc ở đất, có thân
rễ mọc dài, thân trên đất mọng nước, mang các lá mọc xòe sát đất với các đặc điểm [12] :
Thân rễ: nằm ngang sát mặt đất, đôi khi hơi nghiêng, bò dài Chiều dài thân rễ từ
5,0cm - 12,0cm, trung bình là 7,9cm Đường kính thân rễ từ 3,0mm -4,0mm, trung bình là3,2mm Số lóng trên thân rễ từ 3-7 lóng, trung bình là 4,0 lóng Chiều dài lóng từ 1,0cm -6,0cm, trung bình là 2,0cm Thân rễ có màu xanh trắng, đôi khi có màu nâu đỏ, thườngnhẵn, không phủ lông [12]
Thân khí sinh: thường mọc thẳng lên trên mặt đất, ít khi mọc nghiêng Chiều dài
thân khí sinh từ 4,0-8,0 cm, trung bình là 6,0 cm Đường kính thân khí sinh từ 3,0-5,0cm,trung bình là 3,1cm.Thân khí sinh mang nhiều lóng, các lóng có chiều dài khác nhau Sốlóng trên thân khí sinh thường từ 2-4 lóng, trung bình là 2,9 lóng Chiều dài mỗi lóng là
Trang 121,0 - 4,0cm, trung bình là 2,2cm Thân khí sinh thường mọng nước, nhẵn, không phủlông, thường có màu xanh trắng, đôi khi có màu hồng nhạt [12].
Rễ: được mọc ra từ các mấu trên thân rễ Đôi khi rễ cũng được hình thành từ thân
khí sinh Rễ thường đâm thẳng xuống đất Thông thường mỗi mấu chỉ có một rễ, đôi khi
có vài rễ cùng được hình thành từ một mấu trên thân rễ Số lượng và kích thước rễ cũngthay đổi tùy theo cá thể Số rễ trên một cây từ 3-10, trung bình là 5,4 Chiều dài rễ thayđổi từ 0,5cm - 8,0 cm Rễ dài nhất trung bình là 6,7cm, ngắn nhất trung bình là 1,2cm.Chiều dài trung bình của các rễ trên một cây là 3,8cm [12]
Lá: mọc cách, xoắn quanh thân cây, xòe trên mặt đất Lá hình trứng, gần tròn ở
gốc, đầu lá hơi nhọn và có mũi ngắn, thường dài từ 3,0cm - 5,0cm, trung bình là 4,0cm,
và rộng từ 2,0-4,0cm, trung bình là 3,1cm Lá có màu nâu đỏ ở bên trên và có lông phủmịn như nhung Hệ gân có mạng lưới lông chim, thường có 5 gân gốc Các gân nàythường có màu hồng ở mặt trên và nổi rất rõ Đôi khi gân ở giữa có màu vàng nhạt Mặtdưới lá có màu nâu đỏ nhạt, nhẵn với 5 gân gốc nổi rõ Các gân bên ở phía rìa lá nổi rõ,gân ở giữa lá ở mặt dưới không rõ Cuống lá dài 0,6cm - 1,2cm, thường nhẵn và có màutrắng xanh, đôi khi hơi đỏ tía ở bẹ lá Bẹ lá nổi rõ và nhẵn Số lá trên một cây thay đổi từ
2 - 6 lá, thông thường là 4 lá Kích thước của lá cũng thay đổi Các lá trên một cây thường
có kích thước khác nhau rõ rệt [12]
Hoa quả: cụm hoa dài 10cm - 20 cm ở ngọn thân, mang 4-10 hoa mọc thưa Lá
bắc hình trứng dài 6,0mm - 10mm, màu hồng Các mảnh bao hoa dài khoảng 6,0 mm,cánh môi màu trắng, dài đến 1,5cm Ở mỗi bên gốc mang 6-8 dải hẹp, chẻ đầu đôi Mùahoa tháng 10-12, mùa quả chín tháng 12-3 năm sau [12]
Trang 13Hình 1.1 Hình ảnh cây lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus)
1.1.2.3 Một số ứng dụng của cây lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) trong y học
Theo Đông y, lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) có vị ngọt, hơi chát, tính
mát, có tác dụng chữa thần kinh suy nhược, ho khan, đau họng, cao huyết áp, suy thận;chữa di tinh, đau lưng, phong thấp, làm tiêu đờm, giải độc, giải nhiệt, viêm khí quản,viêm gan mãn tính, an thần, nhuận phế (mát phổi) và tăng cường sức khỏe, làm khí huyếtlưu thông [31]
Cây lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) được thu hái toàn cây quanh năm,
rửa sạch, đun tươi hay phơi khô dùng dần Trước đây, khi giá trị của lan Kim Tuyến chưađược biết tới, người dân thường hái về nấu canh ăn, vị ngọt mát như rau mồng tơi Nhữngnguồn tài liệu về y học của Đài Loan cho thấy cây lan gấm lại là vị thuốc được coi là rấtquý [31]
Sách Thanh thảo gia đình tự nhiên liệu pháp ghi: trẻ em hay khóc dùng kim tuyếnliên sắc uống sẽ khỏi
Sách khoa học quốc dược cho rằng: “Kim tuyến liên là một trong những dược thảoquý, giúp bổ máu, dưỡng âm, chữa trị nóng phổi và nóng gan” [31]
Những công trình nghiên cứu của ngành dược học và kinh nghiệm của các thầy
thuốc Đài Loan cho thấy lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) có một số công dụng
sau: Toàn thân cây thuốc được dùng để làm tăng cường sức khỏe, chủ trị bệnh phổi, ditinh, xuất tinh sớm, yếu gan, yếu tì và còn có tác dụng bổ máu Lan Kim Tuyến
(Anoectochilus setaceus) có vị ngọt, tính mát, có tác dụng thanh nhiệt, hạ sốt, giải trừ u
uất, phiền muộn, thanh huyết, bổ phổi, thông trung khí, bồi dưỡng sức khỏe, trẻ con chậmlớn, suy thận Ngưới dân tộc miền núi (Đài Loan) thường dùng Kim Tuyến
(Anoectochilus setaceus) để sắc uống trị đau ruột, đau bụng, sốt cao, đắp bên ngoài để trị
các chỗ sưng vết thương và chỗ bị rắn cắn Thanh huyết, nhuận phổi, trị bệnh phổi, trịbệnh cao huyết áp : sắc uống với nước đường [31]
Trang 14Theo ông Trần Ngọc Lâm, các thiền sư Tây Tạng sử dụng Kim Tuyến
(Anoectochilus setaceus) để tăng cường sức khỏe, giải độc cơ thể, trị ung thư Vận động
viên của Trung Quốc thường dùng cỏ nhung trước các cuộc thi đấu bởi nó có tác dụng
chẳng kém gì doping Viện quân y Trung Quốc sử dụng Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) cùng một số vị khác trong điều trị ung thư từ rất lâu rồi Nhưng Kim Tuyến còn
có một tác dụng thần kì mà người Việt chưa biết đó là có khả năng tái tạo tế bào gan Với
tác dụng này, lan Kim Tuyến (Anoectochilus setaceus) thực sự là thần dược, cỏ trường
sinh, quý hơn vàng ròng [30]
1.2 Kĩ thuật nuôi cấy in vitro trong công nghệ tế bào thực vật
Nhân giống in vitro (vi nhân giống) là quá trình sản xuất một lượng lớn cây hoàn
chỉnh từ các bộ phận, cơ quan như chồi, mắt ngủ, đoạn thân, lá… của cây mẹ ban đầu
thông qua kĩ thuật nôi cấy in vitro Khái niệm nuôi cấy mô tế bào thực vật dùng để chỉ tất
cả các phương pháp nuôi cấy sử dụng nguyên liệu thực vật sạch (tế bào đơn, mô,…) trênmôi trường nhân tạo ở điều kiện vô trùng [4]
1.2.1 Cơ sơ khoa học của kĩ thuật in vitro
Cơ sở khoa học của kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật là tính toàn năng của
tế bào thực vật Thuật ngữ tính toàn năng của tế bào thực vật được Habertland (Đức) đềxuất năm 1902 Đó là mọi tế bào thực vật đều có khả năng biểu hiện toàn bộ tiềm năng ditruyền và phát triển thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy phù hợp Nhờ cơ chếnguyên phân các tế bào đều được sinh sản từ một tế bào gốc ban đầu Nên chúng mangthông tin di truyền giống nhau, giống với tế bào mẹ ban đầu và đều có khả năng phát triểnthành một cây hoàn chỉnh [4]
1.2.2 Các hướng nghiên cứu ứng dụng và ưu thế của kĩ thuật nhân giống in vitro
Nhân giống in vitro (vi nhân giống) là một trong những ứng dụng chính của công
nghệ tế bào thực vật, sử dụng sự phát triển nhân tạo và nhân các đặc điểm sinh trưởnghoặc các mô phân sinh trong cây Theo các công trình nghiên cứu, chỉ có đỉnh sinhtrưởng của chồi mới đảm sự ổn định về di truyền, tiếp đến là đỉnh mô phân sinh với kíchthước nhỏ và kết hợp xử lí nhiệt làm sạch bệnh là nguyên liệu tốt cho nhân giống [20]
Trang 15Kĩ thuật nhân nhanh giống được sử dụng nhằm mục đích: (1) Duy trì và nhânnhanh các kiểu gen quý làm vật liệu cho công tác chọn giống; (2) duy trì và nhân nhanhcác cá thể đầu dòng tốt để cung cấp hạt giống các cây trồng khác nhau; (3) nhân nhanhtrong điều kiện vô trùng cách li đảm bảo cách li với giống không bị bệnh; (4) rút ngắnthời gian đưa các cây lai và các loài cây tự nhiên có đặc điểm tốt vào vào sản xuất; (5) bảoquản tốt tập đoàn giống vô tính về các loài cây giao phấn trong ngân hàng gen.
Ngành công nghiệp nhân giống (in vitro) phát triển và mở rộng trong những năm
gần đây do yêu cầu về chất lượng giống cây trồng tăng lên nhanh chóng trên toàn thế giớinhằm phục vụ những dự án trồng lại rừng, sản xuất lươg thực thực phẩm, thức ăn gia súc,
nông nghiệp và bảo vệ môi trường Vì nhân giống in vitro đã mang lại hiệu quả hết sức to
lớn nhờ ưu thế nổi bật Đó là: (1) hệ số nhân giống cao rút ngắn thời gian đưa con giốngvào sản xuất; (2) nhân được một số lượng cây lớn trong một diện tích nhỏ; (3) làm sạchbệnh cây trồng và cách li chúng với các nguồn bệnh; (4) thuận tiện việc vận chuyển vàbảo quản, (5) sản xuất quanh năm,quy trình sản xuất có thể được vận hành trong bất cứthới gian nào trong ngày, mùa nào trong năm [23]
1.2.3 Các phương thức nhân giống in vitro
1.2.3.1 Nuôi cấy mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng
Khái niệm mô phân sinh chỉ đúng khi mẫu vật nuôi cấy được tách đúng từ đỉnhsinh trưởng có kích thước trong vòng 0,1mm tính từ chóp của đỉnh sinh trưởng [4] Trongthực tế, mẫu nuôi cấy được tách với kích thước như vậy chỉ khi nào người ta tiến hànhnuôi cấy với mục đích làm sạch bệnh cây trồng, do đó phải kết hợp các yếu tố tìm raphương thức lấy mẫu tối ưu Một đỉnh sinh trưởng nuôi cấy ở điều kiện thích hợp sẽ pháttriển thành một hay nhiều chồi và các chồi sẽ phát triển thành cây hoàn chỉnh có rễ đầyđủ
Xét về nguồn gốc của cây có 3 khả năng:
- Cây phát triển từ chồi đỉnh ( Chồi ngọn),
- Cây phát triển từ chồi nách,
- Cây phát triển từ chồi mới phát sinh
Trang 16Ở lan có sự phát triển qua giai đoạn dẻ hành (protocorm) cùng một lúc đỉnh sinhtrưởng tạo hàng loạt protocorm và các protocorm lại tiếp tục phân chia cho ra cácprotocorm mới hay các chồi mới tạo cây hoàn chỉnh [4].
1.2.3.2 Tái sinh cây hoàn chỉnh từ các bộ phận khác của cây
Ngoài mô phân sinh và đỉnh sinh trưởng là bộ phận dễ nuôi cấy thành công các bộ
phận còn lại của một cơ thể thực vật đều có thể ứng dụng cho việc nhân giống in vitro [4]
như các đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, các bộ phận của hoa, nhánh củ…
1.2.3.3 Nhân giống qua giai đoạn mô sẹo
Trong khuôn khổ của mục đích nhân giống vô tính, nếu tái sinh được cây hoànchỉnh trực tiếp từ mẫu cấy ban đầu thì không những nhanh chóng thu được cây mà cáccây cũng đồng nhất về mặt di truyền Tuy nhiên trong nhiều trường hợp mô nuôi cấykhông tái sinh cay ngay mà phát triển thành khối mô sẹo Tế bào mô sẹo khi cấy nhiều lần
sẽ không ổn định về mặt di truyền Thông qua mô sẹo có thể thu được những cá thể sạchvirút như trường hợp của Kehr và Sechaffer thu được ở tỏi
Một phương hướng nhân giống vô tính nữa là tạo phôi soma từ tế bào mô sẹo Cho
đến nay thành công ở hai đối tượng đó là: Cà rốt (Daucus carota) và thuốc lá (Nicotiana tabacum) [4].
1.2.4 Quy trình nhân giống in vitro
Theo Đỗ Năng Vịnh (2002) quy trình nhân giống in vitro gồm 5 giai đoạn sau đây:
Giai đoạn 1: Chuẩn bị vật liệu khởi đầu
Vì trong nuôi cấy cây con sẽ mang lại những đặc tính và tính trạng của cây mẹ banđầu nên trong giai đoạn này cần chọn lọc cay mẹ cẩn thận, cay mẹ thường là cây tốt,cógiá trị kinh tế cao Sau đó chọn cơ quan để lấy mẫu thường là mô non, chồi thâncó chồingủ, lá non, hoa non … Mô chọn để nuôi cấy thường có khả năng tái sinh cao trong môitrường nuôi cấy sạch bệnh, giữ được các đặc tính sinh học quý báu của cây mẹ, ít có nguy
cơ biếm dị [23]
Giai đoạn 2: Thiết lập hệ thống cấy vô trùng
Trang 17Là giai đoạn chuyển mẫu vật vào môi trường nuôi cấy, giai đoạn này được tiếnhành theo các bước:
Một là: Khử trùng bề mặt mẫu vật và chuẩn bị các mẫu nuôi cấy
Hai là: Cấy mẫu vật liệu đã khử trùng vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy có sẵnmôi trường nhân tạo đảm bảo điều kiện vô trùng
Ba là: Nuôi cấy mẫu cấy trong phòng nuôi với các điều kiện nhiệt độ, độ ẩm, ánhsáng… thích hợp Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy đã xuất hiện các cụm tếbào, các cơ quan hoặc các phôi vô tính Giai đoạn này yêu cầu từ 2-12 tháng hoặc ít hơn
4 lần cấy các mảnh [23]
Giai đoạn 3: Nhân nhanh chồi
Đây là giai đoạn sản xuất cây nhân giống, quyết định hiệu quả của quy trình nuôi cấy
mô, cây được nhân nhanh theo nhu cầu của người nuôi cấy Khi mẫu cấy sạch đã được tạo
ra và từ đó nhận được các cụm chồi và các phôi vô tính sinh trưởng tốt quá trình nuôi cấy
sẽ bước vào giai đoạn sản xuất Người ta cần tạo ra tốc độ nhân nhanh cao nhất trong điềukiện nuôi cấy Thành phần và điều kiện môi trường cần tối ưu hóa nhằm đạt được mụctiêu nhân nhanh Quy trình cấy chuyển để nhân nhanh chồi thường từ 1-2 tháng loài cây
Tỉ lệ nhân nhanh khoảng 2-8 lần sau mỗi lần cấy chuyển Nhìn chung giai đoạn nàythường kéo dài từ 10-36 tháng, giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban đầu không
nên kéo dài quá lâu [23] Ví dụ: Từ đỉnh sinh trưởng của cây chuối chọn lọc ban đầu
người ta chỉ nhân lên 2000-3000 chồi sau 7-8 lần cấy chuyển để tránh biến dị soma Đốivới các cây khác như mía, hoa cúc, phong lan sau một năm có thể nhân lên 1.000.000 chồi
từ cây mẹ ban đầu [20]
Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh
Các chồi được hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh, nhưngthông thường các chồi này phải chuyển sang một môi trường khác để ních thích tạo rễ Ởmột số loài khác thì các chồi sẽ tạo rễ trước khi chuyển trực tiếp ra đất, thông thường giaiđoạn này cần 2-8 tuần [16]
Giai đoạn 5: Chuyển ra đất trồng
Trang 18Đây là giai đoạn đầu cây được chuyển từ điều kiện vô trùng của phòng thì nghiệm
ra ngoài môi trường tự nhiên, giai đoạn này quyết định khả năng ứng dụng của quy trình
nhân giống in vitro Đối với một số loài có thể chuyển cây ra đất khi cây chưa có rễ, nhưng
đối với đa số các loài cây trồng thì sau khi chồi đã tạo rễ và tạo cay hoàn chỉnh mới đượcđưa ra vườn ươm Qúa trình thích nghi với điều kiện bên ngoài của cây yêu cầu được chămsóc đặc biệt Vì vậy khi chuyển từ môi trường bão hòa hơi nước sang vườn ươm với nhữngđiều kiện khó khăn hơn nên vườn ươm cần phải đáp ứng các yêu cầu: che cây con bằngnilon bao phủ, có hệ thống phun sương cung cấp độ ẩm và làm mát cây, giá thể trồng cây
có thể là đất mùn, hoặc các hỗn hợp nhân tạo không chứa đất, mùn cưa và bọt biển, giaiđoạn này thường đòi hỏi 4-16 tuần [20]
1.2.5 Một số thành tựu trong nhân giống in vitro
Nuôi cấy mô tế bào thực vật đã được hình thành và phát triển từ những năm 80 của
thế kỉ XX và đã được ứng dụng trong các lĩnh vực: Nhân giống vô tính in vitro, nuôi cấy
mô phân sinh hoặc đỉnh sinh trưởng để tạo cay sạch bệnh, bảo quản nguồn gen in vitro,
tạo phôi vô tính và hạt nhân tạo [23]
Kĩ thuật nuôi cấy mô đã được trên 600 công ty lớn trên thế giới áp dụng để nhậpkhoảng 500 triệu cây giống trong một năm ở các giống cây trồng khác nhau Dự kiến trênthị trường cây giống, kĩ thuật nuôi cấy mô thu được khoảng 15 tỉ USD/năm và tốc độ tăngtrưởng của thị trường này hàng năm vào khoảng 15% [23]
Trong những năm gần đây, quy trình nhân giống bằng kĩ thuật in vitro được nhiều
cơ sở khoa học nghiên cứu và hoàn thiện trên các đối tượng khác nhau như: cây rừng, câylương thực, thực phẩm, cây ăn quả, hoa, cây cảnh, dược liệu…
Rừng Việt Nam chiếm diện tích lớn nhưng hiện nay đã bị chặt phá do nhiều donhiều nguyên nhân khác nhau Góp phần vào cung cấp nguồn giống cây rừng phục vụ chocông tác phủ xanh đất trống, đồi núi trọc của nhà nước ta, hàng loạt quy trình nhân giống
in vitro các loại cây rừng được nghiên cứu nhằm tạo ra lượng lớn cây giống có chất lượng
tốt Pomu (Fokienia hodginsii (Dun) A Henry & H.H Thomas) được xếp vào lọai cây gỗquý Việt Nam nhưng đang bị khai thác mạnh nên số lượng giảm nhanh Nguyễn Thế Anh,
Trang 19Trần Văn Minh (2007) đã nuôi cấy chồi đỉnh trên môi trường WPM để nghiên cứu khảnăng vươn thân và ra rễ của cây Pơmu và nhận thấy cây Pơmu vươn thân tốt nhất trongmôi trường WPM + IBP 0,3 mg/l + dịch chiết nấm men 1g/l, rễ nhiều và dài nhất trên môitrường WPM + IBP 5mg/l sau 45 ngày nuôi cấy [2] Năm 2009, Nguyễn Thị Tâm và CS
đã nghiên cứu quy trình nhân giống cây dẻ Trùng Khánh bằng kĩ thuật in vitro Tác giả đã
chỉ ra môi trường kết hợp BAP 0,5mg/l + NAA 0,2 mg/l cho khả năng tạo đa chồi tốt nhất
và môi trường có thành phần : WPM + agar 8,5 g/l + đường glucose 25 g/l + nước dừa
200 ml/l + NAA 0,2 g/l có ảnh hưởng tốt nhất đến sự ra rễ của chồi dẻ tronh ống nghiệm
Đề tài đã góp phần bảo tồn nguồn gen quý của giống dẻ Trùng Khánh – Cao Bằng [19]
Kĩ thuật nuôi cấy mô và tê bào thực vật phục vụ nhân giống cây trồng đã triển khaitrên 20 năm ở nước ta Nhân giống thương mại quy mô lớn đã đạt được ở một ố cây trồngnhư nhân chuối (nhân khoảng 2 triệu cây/năm ); nhân nhanh khoai tây sạch bệnh; nhânnhanh giống mía nhập nội, trong vài năm đã tạo ra 5.330 ha mía giống mới K84 -200 từmột ngọn mía nhập nội từ Thái Lan; nhân nhanh các giống bạch đàn chọn lọc và keo laiđạt công suất 3 triệu cây/năm Quy trình công nghệ nhân nhanh giống chuối và giống mía
đã được Bộ Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn công nhận và áp dụng để chuyển genkháng sâu đục thân [23]
Nước ta nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, rất thích hợp cho nhũng loài cây ănquả nhiệt đới phát triển Hiện nay, nươc ta có rất nhiều vùng chuyên canh cây ăn quảdược mở rộng, phục vụ cho nhu cầu xuất khẩu, nhu cầu công nghiệp chế biến nước hoaquả Bằng công nghệ nuôi cấy mô –tế bào thực vật đã co nhiều công trình được công bốtrên các đối tượng khác nhau như: đu đủ, dứa, mía…
Bùi Thị Tường Thu và cộng sự (2003), đã tiến hành vi nhân giống cây đu đủ (
Carica papaya linn) từ chồi đỉnh sinh trưởng của cây trưởng thành kích thước 1,0cm –
1,5cm được khử trùng và cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung các chất kích thích
sinh trưởng BAP, IAA, NAA, IBA, Nước dừa Kết quả đã đưa được quy trình nuôi cấy in vitro là 30 ngày Cây con sinh trưởng và phát triển bình thường ngoài môi trường tự nhiên
[22] Lâm Ngọc Phương và cộng sự (2003) đã tiến hành nhân giống dưa hấu tam bội [14]
Trang 20Trên đối tượng cây cảnh và cây hoa cũng được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và
có nhiều công trình công bố Hoàng Thị Giang và cộng sự (2010) nghiên cứu nhân giống
in vitro và nuôi trồng giống lan Hài P hangianum perner Gurss (Hài Hằng) Kết quả
nghiên cứu cho thấy, môi trường nhân nhanh protocorm và tạo chồi là môi trường RE có
bổ sung nước dừa 150ml/l và chuối chín 100g/l cho hệ số nhân cao nhất (4,3 lần) Bổsung α-NAA 0,4mg/l - 0,6mg/l vào môi trường cho khả năng ra rễ tốt nhất [5]
Phùng Văn Phê và cộng sự (2010) nghiên cứu kỹ thuật nhân nhanh chồi in vitro lan Kim tuyến Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl Tác giả kết luận, môi trường cơ bản là phù hợp nhất để nhân nhanh chồi lan Kim tuyến in vitro Thể chồi 8 tuần tuổi từ phôi hạt
chín và chồi từ thể chồi cao từ 2-3cm là phù hợp nhất để nhân nhanh trong môi trườngthích hợp KC, bổ sung BAP 0,5mg/l + Kinetin 0,3mg/l + NAA 0,3mg/l + nước dừa100ml/l + dịch chiết khoai tây 100g/l + saccharose 20g/l + agar 7,0g/l + than hoạt tính0,5g/l [13] Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2003) đã tiến hành nghiên cứu xây dựng
quy trình nhân giống và nuôi trồng phong lan Phalaenopsis (lan Hồ Điệp) Giống lan Hồ
Điệp được khử trùng bằng HgCl2, sau đó được cấy lên môi trường nhân nhanh Tác giả đãđưa ra được quy trình nhân giống và nuôi trồng lan Hồ Điệp [17]
Nghiên cứu môi trường nhân giống in vitro giống lan Dendrobium fimbriatum
Hook (Lan Hoàng Thảo Long nhãn), Nguyễn Thị Sơn (2011) đã khẳng định môi trườngthích hợp cho nảy mầm và phát sinh protocorm của hạt là môi trường MS, bổ sung nướcdừa 100ml/l, saccharose 10g/l, agar 6,0g/l; môi trường nhân nhanh protocorm tốt nhất làmôi trường Knud, bổ sung nước dừa 100ml/l, saccharose 10g/l, khoai tây 60g/l, agar 6,0g/l; môi trường MS, bổ sung nước dừa 100ml/l, saccharose 20g/l, chuối chín 60g/l, agar
6,0g/l là thích hợp nhất cho nhân nhanh chồi in vitro; môi trường tạo cây hoàn chỉnh là
môi trường RE, bổ sung saccharose 10g/l, than hoạt tính 1,0g/l, agar 6,0g/l [18] Nguyễn
Thái Hà và cộng sự (2003) đã tiến hành nhân giống củ in vitro các giống hoa Lilium spp.
Với giống hoa Lili nhập từ Mĩ được cấy trên môi trường cơ bản MS có bổ sung các chất
điều hòa sinh trưởng, tác giả đã đưa ra được quy trình nhân giống củ in vitro các giống
Trang 21hoa Lilium spp [6] Trịnh Cẩm Tú và Bùi Trang việt (2006),sử dụng kĩ thuật nuôi cấy in vitro để nghiên cứu sự phát triển của hoa Dendrobium sonia [23]
Việt Nam có hàng ngàn cây thuốc quý hiếm được ghi tên trong danh lục đỏ Nhiềucây thuốc quý có nguy cơ bị tuyệt chủng do khai thác mạnh phục vụ cho việc sản xuấttrên quy mô công nghiệp Để bảo tồn nguồn gen những cây thuốc quý này quy trình nhângiống cây dược liệu được nhiều tác giả nghiên cứu, hoàn thiện như: nhân giống vô tính
các dòng Kava (Pipermethysticum G Forster) có hoạt tính sinh học cao [9] Với công trình dòng hóa cây thanh hao (Artemisia annua L.) in vitro tác giả Nguyễn Thị Kim Uyên,
Trần Văn Minh (2007) đã nhân giống trên môi trường LV và nhận thấy: Môi trường có bổsung BAP 0,3 mg/l chồi phát triển cả về chiều cao và số lượng Bổ sung kết hợp BAP 0,5mg/lvà NAA 0,5 mg/l cho tế bào soma phát sinh đồng đều; cả BAP, NAA, và 2,4 –D đều
có tác dụng kích thích tăng tế bào soma và môi trường thích hợp nhất cho nuôi cấy tăngsinh tế bào soma là môi trường LV có bổ sung BAP 0,5mg/l + NAA 0,5mg/l Qua nghiêncứu cũng thấy rằng, cần thiết nuôi cấy tế bào soma trong điều kiện có chiếu sáng trên môitrường bán rắn và lỏng [24]
