Tìm hiểu vai trò của chất điều hòa tăng trưởng thực vật để kéo dài đời sống của hoa bibi (gypsophila paniculata l )

Hoa Bibi màu trắng, nhỏ li ti như những bông tuyết điểm khắp trên các nhánh hoa. Hoa Bibi thường được đệm trong các bó hoa hay cắm chung với những bông hoa lớn với nhiều màu sắc rực rỡ khác như hoa hồng, hoa lily, hoa đồng tiền…. Tuy là làm nền cho bó hoa nhƣng hoa Bibi cũng rất quan trọng để tạo ra được một bó hoa hoàn hảo, một mẫu trang trí hoa tuyệt vời. Tuy nhiên, hoa Bibi lại có khuyết điểm lớn về thời gian sống. Hoa trên phát hoa cắt rời thường héo tàn sau nửa ngày. Với đề tài “Tìm hiểu vai trò của chất điều hòa tăng trưởng thực vật để kéo dài đời sống của hoa Bibi (Gypsophila paniculata L.) trên phát hoa cắt rời” nhằm tìm hiểu ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trƣởng thực vật đến quá trình lão suy ở phát hoa Bibi cắt rời, từ đó tìm ra biện pháp giúp làm chậm quá trình này ở hoa Bibi.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi cam đoan luận văn này là công trình nghiên cứu của riêng tôi

Kết quả trình bày trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc các tác giả công

bố trong bất kì công trình nào

Các trích dẫn về bảng biểu, kết quả nghiên cứu của những tác giả khác, tài liệu tham khảo trong luận văn đều có nguồn gốc rõ ràng và theo đúng quy định

Tp Hồ Chí Minh, ngày tháng năm 2014

TÁC GIẢ LUẬN VĂN

Phan Thị Trang

LỜI CẢM ƠN Xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

- PGS TS Bùi Trang Việt, người đã truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức quý báu,

tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn Thầy đã gợi ý đề tài, hướng dẫn nghiên cứu và cho tôi những lời khuyên bổ ích trong thời gian tôi thực hiện đề tài

- TS Lê Thị Trung, người đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình

nghiên cứu và hoàn thiện luận văn này Cô đã truyền đạt cho tôi nhiều kinh nghiệm quý báu trong học tập, nghiên cứu khoa học cũng như trong cuộc sống

Và tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự giảng dạy, đóng góp ý kiến, động viên và giúp đỡ của:

- Các thầy cô giảng dạy Cao học ngành Sinh học thực nghiệm trường Đại học

- Khoa Sinh học, trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh

- Phòng Sau đại học, trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh

- Chị Hồ Thị Mỹ Linh – Cán bộ phòng thí nghiệm sinh lý thực vật, trường Đại học Sư Phạm Thành phố Hồ Chí Minh

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, những người

đã động viên và giúp đỡ tôi hết mình trong thời gian tôi thực hiện đề tài này

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC HÌNH

DANH MỤC CÁC BẢNG

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 GIỚI THIỆU VỀ HOA BIBI 3

1.1.1 Phân loại 3

1.1.2 Vài nét về hoa Bibi 3

1.2 QUÁ TRÌNH LÃO SUY HOA 5

1.2.1 Định nghĩa 5

1.2.2 Sơ lược về lão suy hoa 5

1.2.3 Hoạt động của chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong lão suy hoa 7

1.2.4 Điều kiện môi trường ảnh hưởng đến thời gian sống của hoa cắt cành 12

1.3 CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU 13

1.3.1 Công trình nghiên cứu trong nước 13

1.3.2 Công trình nghiên cứu nước ngoài 15

1.3 3 Các công trình nghiên cứu liên quan 15

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 VẬT LIỆU 17

2.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 17

2.2.1 Thời gian nghiên cứu 17

2.2.2 Địa điểm nghiên cứu 17

2.3 PHƯƠNG PHÁP 17

2.3.1 Quan sát hình thái của hoa Bibi 17

2.3.2 Quan sát sự biến đổi các giai đoạn phát triển của hoa Bibi theo thời gian 17

2.3.3 Xác định trọng lượng tươi và trọng lượng khô của hoa ở các giai đoạn phát triển 18

2.3.4 Đo cường độ hô hấp, quang hợp của hoa theo các giai đoạn phát triển 19

2.3.5 Sự thay đổi độ dẫn điện của dịch chiết mẫu hoa theo các giai đoạn phát triển 19

2.3.6 Xác định độ hấp thu sắc tố (ODmax) của dịch chiết mẫu hoa theo các giai đoạn phát triển 20

2.3.7 Đo hàm lượng đường tổng số và hàm lượng tinh bột của hoa theo các giai đoạn phát triển hoa 20

2.3.8 Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật 21

2.3.9 Xử lý chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên hoa Bibi 25

2.3.10 Phân tích số liệu 26

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 KẾT QUẢ 27

3.1.1 Quan sát hình thái của hoa Bibi trên phát hoa 27

3.1.2 Sự biến đổi các giai đoạn phát triển của hoa Bibi theo thời gian 31

3.1.3 Sự thay đổi trọng lượng tươi và trọng lượng khô của hoa Bibi theo các giai đoạn phát triển hoa 32

3.1.4 Cường độ hô hấp và cường độ quang hợp của hoa Bibi theo các giai đoạn phát triển hoa 33

3.1.5 Độ dẫn điện của hoa theo các giai đoạn phát triển hoa 33

3.1.6 Độ hấp thu sắc tố (ODmax) của hoa Bibi theo các giai đoạn phát triển hoa 34

3.1.7 Hàm lượng đường tổng số và hàm lượng tinh bột của hoa theo các giai đoạn phát triển hoa 35

3.1.8 Hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật của hoa Bibi theo

các giai đoạn phát triển hoa 35

3.1.9 Xử lý chất điều hòa tăng trưởng thực vật kéo dài thời gian nở của hoa Bibi 35

3.2 THẢO LUẬN 52

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

KẾT LUẬN 57

KIẾN NGHỊ 57

TÀI LIỆU THAM KHẢO 58

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACC 1 - Aminocyclopropane - 1 – carboxylate acid

IAA Indol-3- acetic acid

IBA Indole butyric acid

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.2 Sinh tổng hợp và điều hòa ethylene 10

Hình 1.3 Mô hình con đường truyền tín hiệu ethylene 12

Hình 2.1 Hoa Bibi giai đoạn hoa nở hoàn toàn trong đĩa Petri 18

Hình 2.2 Sơ đồ ly trích các chất điều hòa tăng trưởng thực vật 22

Hình 3.1 Kiểu phân nhánh của phát hoa Bibi lúc bắt đầu thí nghiệm 28

Hình 3.2 Hoa Bibi cắt dọc 28

Hình 3.3 Giai đoạn nụ hoa non 28

Hình 3.4 Giai đoạn nụ đang tăng trưởng 29

Hình 3.5 Giai đoạn hoa vừa nở 29

Hình 3.6 Giai đoạn hoa nở hoàn toàn 29

Hình 3.7 Giai đoạn hoa nở muộn 29

Hình 3.8 Giai đoạn hoa bắt đầu héo 29

Hình 3.9 Giai đoạn hoa héo hoàn toàn 29

Hình 3.10 Phổ hấp thu sắc tố của dịch chiết hoa Bibi ở giai đoạn hoa nở 34

Hình 3.11 Hoa nhìn mặt trên sau 24 giờ cắm trong nước cất 37

Hình 3.12 Hoa nhìn mặt bên sau 24 giờ cắm trong nước cất 37

Hình 3.13 Hoa nhìn mặt trên sau 24 giờ xử lý IAA 5 mg/l 37

Hình 3.14 Hoa nhìn mặt bên sau 24 giờ xử lý IAA 5 mg/l 37

Hình 3.15 Hoa nhìn mặt trên sau 24 giờ xứ lý IBA 5 mg/l 37

Hình 3.16 Hoa nhìn mặt bên sau 24 giờ xứ lý IBA 5 mg/l 37

Hình 3.17 Hoa nhìn mặt trên sau 24 giờ xứ lý NAA 5 mg/l 37

Hình 3.18 Hoa nhìn mặt bên sau 24 giờ xứ lý NAA 5 mg/l 37

Hình 3.19 Hoa nhìn mặt trên sau 24 giờ xử lý BA 20 mg/l 38

Hình 3.20 Hoa nhìn mặt bên sau 24 giờ xử lý BA 20 mg/l 38

Hình 3.21 Hoa nhìn mặt trên sau 24 giờ xử lý GA3 50 mg/l 39

Hình 3.22 Hoa nhìn mặt bên sau 24 giờ xử lý GA3 50 mg/l 39

Hình 3.23 Hoa nhìn mặt trên sau 24 giờ xử lý ABA 5 mg/l 40

Hình 3.24 Hoa nhìn mặt bên sau 24 giờ xử lý ABA 5 mg/l 40

Hình 3.25 Phát hoa bắt đầu xử lý 46

Hình 3.26 Phát hoa cắm trong nước cất sau 12 giờ 46

Hình 3.27 Phát hoa cắm trong nước cất sau 24 giờ 46

Hình 3.28 Phát hoa xử lý IAA 1 mg/l sau 12 giờ 47

Hình 3.29 Phát hoa xử lý IAA 1 mg/l sau 24 giờ 47

Hình 3.30 Phát hoa xử lý IAA 1 mg/l sau 36 giờ 47

Hình 3.31 Phát hoa xử lý IAA 1 mg/l sau 48 giờ 47

Hình 3.32 Phát hoa xử lý IAA 2 mg/l sau 12 giờ 48

Hình 3.33 Phát hoa xử lý IAA 2 mg/l sau 24 giờ 48

Hình 3.34 Phát hoa xử lý IAA 2 mg/l sau 36 giờ 48

Hình 3.35 Phát hoa xử lý IAA 2 mg/l sau 48 giờ 48

Hình 3.36 Phát hoa xử lý IAA 5 mg/l sau 12 giờ 49

Hình 3.37 Phát hoa xử lý IAA 5 mg/l sau 24 giờ 49

Hình 3.38 Phát hoa xử lý IAA 5 mg/l sau 36 giờ 49

Hình 3.39 Phát hoa xử lý BA 10 mg/l sau 12 giờ 50

Hình 3.40 Phát hoa xử lý BA 10 mg/l sau 24 giờ 50

Hình 3.41 Phát hoa xử lý BA 10 mg/l sau 36 giờ 50

Hình 3.42 Phát hoa xử lý GA3 20 mg/l sau 12 giờ 51

Hình 3.43 Phát hoa xử lý GA3 20 mg/l sau 24 giờ 51

Hình 3.44 Phát hoa xử lý GA3 20 mg/l sau 36 giờ 51

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Số lượng và tỉ lệ các nụ và hoa Bibi ở các giai đoạn phát triển 30 Bảng 3.2 Đường kính của hoa Bibi ở các giai đoạn phát triển 30 Bảng 3.3 Sự biến đổi theo thời gian của hoa Bibi từ giai đoạn hoa nở hoàn

toàn trên phát hoa cắt rời 31 Bảng 3.4 Sự biến đổi theo thời gian của hoa Bibi từ giai đoạn hoa nở hoàn

toàn tách rời từ phát hoa cắm trong đĩa Petri 32 Bảng 3.5 Trọng lượng tươi và trọng lượng khô của hoa qua các giai đoạn

phát triển 32 Bảng 3.6 Cường độ hô hấp và quang hợp của hoa Bibi qua các giai đoạn

phát triển 33 Bảng 3.7 Độ dẫn điện của dịch chiết mẫu hoa Bibi ở giai đoạn hoa nở hoàn

toàn, hoa nở muộn và hoa bắt đầu héo 34 Bảng 3.8 Độ hấp thu sắc tố của các dịch chiết mẫu hoa 34 Bảng 3.9 Hàm lượng đường và hàm lượng tinh bột của hoa ở các giai đoạn

phát triển 35 Bảng 3.10 Hoạt tính của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội sinh trên

mẫu hoa 35 Bảng 3.11 Sự phát triển của 5 hoa Bibi ở giai đoạn hoa nở hoàn toàn cắm

trong đĩa Petri trên môi trường có bổ sung auxin sau 24 giờ 36 Bảng 3.12 Sự phát triển của 5 hoa Bibi ở giai đoạn hoa nở hoàn toàn cắm

trong đĩa Petri trên môi trường có bổ sung cytokinin sau 24giờ 38 Bảng 3.13 Sự phát triển của 5 hoa Bibi ở giai đoạn hoa nở hoàn toàn cắm

trong đĩa Petri trên môi trường có bổ sung gibberellin sau 24 giờ 39 Bảng 3.14 Sự phát triển của 5 hoa Bibi ở giai đoạn hoa nở hoàn toàn cắm

trong đĩa Petri trên môi trường có bổ sung acid abscisic sau 24 giờ 40 Bảng 3.15 Trọng lương tươi và trọng lượng khô của hoa Bibi trên đĩa Petri

được xử lý với chất điều hòa tăng trưởng thực vật sau 24 giờ 42

Bảng 3.16 Sự thay đổi độ dẫn điện của hoa Bibi sau 24 giờ xử lý với các

chất điều hòa tăng trưởng thực vật ở các nồng độ khác nhau 43 Bảng 3.17 Độ hấp thu sắc tố của dịch chiết mẫu hoa sau 24 giờ xử lý chất

điều hòa tăng trưởng thực vật 44 Bảng 3.18 Thời gian hoa được giữ ở giai đoạn nở muộn trên phát hoa Bibi

cắt cành sau khi được xử lý 45 Bảng 3.19 Tỉ lệ hoa nở muộn trên phát hoa Bibi cắt cành sau khi được xử lý 45

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Hoa Bibi màu trắng, nhỏ li ti như những bông tuyết điểm khắp trên các nhánh hoa Hoa Bibi thường được đệm trong các bó hoa hay cắm chung với những bông hoa lớn với nhiều màu sắc rực rỡ khác như hoa hồng, hoa lily, hoa đồng tiền… Tuy

là làm nền cho bó hoa nhưng hoa Bibi cũng rất quan trọng để tạo ra được một bó hoa hoàn hảo, một mẫu trang trí hoa tuyệt vời Rất nhiều cô dâu khi chọn hoa trang trí cho đám cưới đặc biệt thích sự hiện diện của hoa Bibi, vì hoa này được coi là biểu tượng của tấm lòng, sự chân thành, niềm hạnh phúc Bên cạnh những ưu điểm

đó, hoa Bibi lại có khuyết điểm lớn về thời gian sống Hoa trên phát hoa cắt rời thường héo tàn sau nửa ngày, khi tiệc cưới chưa tàn Người ta cũng đã thay thế hoa Bibi bằng các loài hoa khác, như salem, sao tím, … nhưng thiếu đi vẻ thẩm mỹ và

độ tinh tế của bó hoa Chính vì vậy, để đáp ứng theo nhu cầu thẩm mỹ và thị hiếu của mọi người, giải quyết khó khăn của người trồng hoa cũng như người bán hoa thì việc tìm ra phương pháp kéo dài đời sống của hoa Bibi là rất cần thiết

Với đề tài “Tìm hiểu vai trò của chất điều hòa tăng trưởng thực vật để kéo

dài đời sống của hoa Bibi (Gypsophila paniculata L.) trên phát hoa cắt rời”

nhằm tìm hiểu ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật đến quá trình lão suy ở phát hoa Bibi cắt rời, từ đó tìm ra biện pháp giúp làm chậm quá trình này

2 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài “Tìm hiểu vai trò của chất điều hòa tăng trưởng thực vật để kéo dài

đời sống của hoa Bibi (Gypsophila paniculata L.) trên phát hoa cắt rời” nhằm tìm

hiểu ảnh hưởng của các chất điều hòa tăng trưởng thực vật đến quá trình lão suy ở hoa Bibi, từ đó tìm ra biện pháp giúp làm chậm quá trình này

3 Nhiệm vụ nghiên cứu

- Khảo sát các chỉ tiêu hình thái, sinh lý, sinh hóa của hoa Bibi

- Tìm hiểu vai trò của chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong giai đoạn lão suy của hoa

4 Đối tượng nghiên cứu

Các phát hoa Bibi (Gypsophila paniculata L.) có nguồn gốc từ Đà Lạt được mua từ

chợ hoa tại Thành phố Hồ Chí Minh

5 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ HOA BIBI

1.1.2 Vài nét về hoa Bibi

Hoa Bibi có nguồn gốc ở Châu Âu và vùng ôn đới Châu Á, được đưa vào Bắc

Mỹ như loài cây cảnh trang trí vườn vào cuối thế kỉ 19 Hiện nay, hoa phân bố rộng khắp ở Canada và Bắc Mỹ (Royer và Dickinson, 1999 trong Klien, 2007)

Vào năm 1992, công ty hoa Hasfarm của Hà Lan lần đầu đưa hoa Bibi về Việt Nam trồng thử nghiệm tại Đà Lạt Với điều kiện khí hậu và thổ nhưỡng thích hợp ở

Đà Lạt, hoa phát triển mạnh và cho năng suất cao (Dương Tấn Nhựt và cs, 2007) Cây thân thảo lâu năm, phát triển đến 1,2 m, phân nhiều cành nhánh, thân cây

có màu hơi xanh Thân non có nhiều lông nhỏ Lá mọc đối, hình mũi mác hẹp, rộng 2-9mm (Darwent, 1975)

Cây có hệ thống rễ dày, cắm sâu vào trong lòng đất đến 4m, phát triển rộng,

dự trữ nhiều chất dinh dưỡng phong phú cho quá trình phát sinh chồi mới vào cuối tháng tư (Klein, 2007) Hoa nở từ đầu tháng bảy và tháng tám Cây mất hầu hết lá vào thời điểm ra hoa (Klein, 2007)

Hoa có màu trắng, nhỏ bao phủ khắp nhánh cây Đường kính hoa khoảng 6-8

mm, năm cánh hoa, dài 2-4 mm, năm lá đài, hợp nhất có hình chén, không có lông,

lá đài dài 1,5-2,1 mm Hoa lưỡng tính, có mười nhị và hai vòi nhụy trong mỗi hoa (Darwent, 1975)

Trong tự nhiên, hoa chỉ xuất hiện sau 3 năm cây sinh trưởng sinh dưỡng Vào năm đầu tiên, mỗi cây chỉ có một chồi phát triển, không có sự phân nhánh Rễ phát triển nhanh trong suốt 2 năm đầu Khi trưởng thành, cây có hệ thống rễ khỏe, đâm

sâu xuống đất (Darwent et al., 1975; Rutledge và McLendon, 1996)

Quả được hình thành vào giữa tháng bảy Quả nang, hình cầu, chứa 2-5 hạt (Royer và Dickinson, 1999 trong Klien, 2007) Một cây thường cho trung bình 14.000 hạt Hạt có màu đen, dài 1-2 mm, hình hạt đậu Phần lớn các hạt được phát tán gần cây, một số hạt theo gió phát tán đến các địa điểm xa hơn Gió có khả năng vận chuyển hạt khoảng 1 km (Rutledge và McLendon, 1996) Hạt nảy mầm tối đa ở nhiệt độ từ 10°C đến 28°C (Darwent và Coupland 1966; Rutledge và McLendon, 1996)

Cây phát triển trong cả đất tốt và đất thô nhưng không chịu được đất chua (Nau, 1996 trong Klein, 2007) Cây thường sống trên các thảo nguyên ở những nơi khá khô, cát và đá, thường trên đất đá vôi, dưới ánh nắng mặt trời đầy đủ, có thể tồn tại trong mùa đông ẩm ướt, có thể chịu được sự thay đổi đáng kể của nhiệt độ và độ

ẩm Tại Canada, hoa Bibi phát triển mạnh mẽ nhất trong khu vực lượng mưa thấp Hoa thu hút nhiều loài ong và ruồi (Darwent và Coupland, 1966)

Cây thường được trồng trong vườn và luống hoa, có thể phát tán ra bên ngoài vườn trồng và xâm lấn vào đồng cỏ (Rutledge và McLendon, 1996)

Trong ngành công nghiệp hoa, hoa Bibi là loài hoa đẹp có giá trị kinh tế Ngoài vai trò được trồng để cắt cành làm trang trí và làm nền cho các loài hoa khác,

hoa còn được trồng làm cảnh Đặc biệt, rễ của hoa Bibi chứa nhiều chất Gypsophila paniculata saponin Có các tính chất đặc trưng của saponin như chất tẩy rửa, làm tan máu bầm và chống viêm,… (Henry, 2003 trong Hanafy et al., 2007)

Hoa Gypsophila rất nhạy cảm với ethylene và có sự gia tăng sản xuất ethylene

lúc bắt đầu lão suy (Woltering và van Doorn, 1988; van Doorn và Reid, 1992)

Hình 1.1 Gypsophila paniculata (Otto Wilhelm Thomé, 1885)

1.2 QUÁ TRÌNH LÃO SUY HOA

1.2.2 Sơ lược về lão suy hoa

Hoa nở hoàn toàn là khi hoa có trọng lượng tươi cao nhất Ở thời điểm đó góc trục hoa hợp với mặt phẳng vòng cánh hoa ngoài cùng là lớn nhất (900) Lúc đó hoa

đã thấm nước đầy đủ và tiếp tục dẫn đến sự héo, cánh hoa ngoài cùng xếp lại Cánh hoa có thể xếp lên hay xếp xuống tùy loài Hoa bắt đầu đổi màu và khô héo dần

Màng tế bào chịu trách nhiệm cho việc điều hòa hàm lượng ion dinh dưỡng và những chất chuyển hóa khác bên trong tế bào Sự vận chuyển có chọn lọc các chất vào và ra khỏi tế bào, ngoài ra màng tế bào còn bảo vệ các ngăn của tế bào và duy trì hàm lượng nước (Rubinstein, 2002) Trong quá trình lão suy hoa, màng tế bào bị

hư hỏng dẫn tới sự lão suy cánh hoa cùng với suy thoái hình thái, sự thay đổi sinh hoá và sinh lý Sự phá vỡ màng tế bào được cho là xảy ra trước một vài quá trình biến đổi sinh lý dẫn tới sự lão suy cánh hoa và toàn bộ hoa như: tăng sự sản xuất ethylene và hàm lượng acid abscisic, làm giảm sự hấp thu đường và giảm hoạt tính của ATPase Sự phá hỏng màng tế bào có thể gây ra sự mất tính thấm của màng tế bào và các phản ứng oxy hóa khử (Borochov và Woodson, 1989 trong Sosa Nan, 2007)

Sự thay đổi lớn nhất liên quan tới sự lão suy là sự phá vỡ carbohydrate đặc biệt là chuyển hóa toàn bộ tinh bột thành đường Ngoài ra, còn có sự phá vỡ hợp chất pectin và hemicellulose làm mềm vách và làm giảm lực liên kết giữa các vách với nhau (Jaime, 2003)

Trong cánh hoa cắt cành bị lão suy, hàm lượng protein giảm, hoạt tính protease tăng, tính lỏng của lipid trên màng giảm và tốc độ hô hấp tăng (van Doorn

và Stead, 1997)

Sự mất màu là hiện tượng phổ biến của sự lão suy Carotenoid và anthocyanin

là hai loại sắc tố chính chịu trách nhiệm cho những màu sắc khác nhau của hoa (Weerts, 2002) Trong hầu hết các loại hoa, carotenoid tạo thành nhiều sắc tố vàng, cam và đỏ trong khi anthocyanin và hợp chất liên quan (flavonoid) tạo màu đỏ, tím

và xanh dương (Jaime, 2003) Hai loại sắc tố này biến đổi rất nhiều trong suốt sự tăng trưởng và lão suy của các cơ quan thực vật Trong quá trình lão suy hoa có sự tăng nồng độ của carotenoid bị oxi hóa (Weerts, 2002)

Lão suy có climax (hoa cẩm chướng) có sự tăng sản xuất ethylene Khi xử lý hoa này với ethylene ngoại sinh sẽ cảm ứng làm uốn cong cánh hoa, thay đổi sinh lý

và hóa học trong lipid màng của cánh hoa Lão suy không có climax (hoa cúc)

không có vai trò của ethylene trong lão suy, quá trình lão suy có thay đổi ít về hàm lượng protein và một phần polypeptide (Jaime, 2003)

1.3.3 Hoạt động của chất điều hòa tăng trưởng thực vật trong lão suy hoa Acid abscisic

Acid abscisic (ABA) là chất điều hòa lão suy bao hoa ABA hiện diện với số lượng cao trong cánh hoa lão suy bị stress nước hay sự thay đổi chất lượng ánh sáng Khi xử lý ABA ngoại sinh làm đẩy nhanh sự lão suy một số hoa vì ABA cảm ứng nhiều hoạt động sinh hóa và phân tử xảy ra trong suốt quá trình lão suy (Zhong

và Ciafré, 2011) Trong hoa cẩm chướng, hoa hồng, sự lão suy gây ra bởi ABA thông qua hoạt động ethylene vì xử lý ABA ngoại sinh không gây ra lão suy khi hoa

được xử lý trước với chất ức chế hoạt động ethylene (Hunter et al., 2004)

Xử lý fluridone, một chất ức chế sinh tổng hợp ABA, làm giảm nồng độ ABA

và kéo dài tuổi thọ của hoa ca cao Tuy nhiên, trong hoa thủy tiên vàng, có quá trình lão suy tự nhiên không phụ thuộc vào ethylene, có thể đáp ứng với ethylene ngoại sinh, ABA ngoại sinh tăng tốc lão suy hoa nhưng tác dụng như vậy được coi là trung gian thông qua kích thích sản xuất ethylene như trong hoa phụ thuộc ethylene

Cytokinin làm chậm lão suy trong mô sinh dưỡng và mô hoa (Chang et al.,

2003) Cytokinin liên quan đến việc giảm sự nhạy cảm của cánh hoa với ethylene và

trì hoãn khởi đầu của sinh tổng hợp ethylene (Mor et al 1984) Xử lý với cytokinin

giúp trì hoãn lão suy hoa cẩm chướng Cytokinin giúp trì hoãn sự gia tăng trong sản xuất ethylene (van Staden, 1995 trong van Doorn và Woltering, 2008)

Ở hoa Iris, xử lý TDZ ở nồng độ cao hơn đáng kể (200-500 mM) cải thiện tỉ lệ

nở hoa và tuổi thọ của hoa (Macnish et al., 2010)

Auxin

Auxin có thể làm giảm độ nhạy ethylene trong một số mô như khu hiện tượng rụng lá, nhưng trong các mô khác nó có thể kích thích sản xuất ethylene (van Staden, 1995 trong van Doorn và Woltering, 2008) Auxin có thể kích thích quá trình lão suy ở một số hoa nhạy với ethylene hoặc ngăn cản quá trình lão suy (Tripthi và Tuteja, 2007) Trong túi phấn và hạt phấn hoa phong lan chứa nhiều auxin Auxin kích thích tích tụ ACC synthase và ACC oxidase Các gen tạo enzym này lại do ethylene kiểm soát và khi được cảm ứng chúng tự xúc tác tạo ethylene Như vậy có thể hiểu rằng auxin liên hệ với sự tạo ethylene sau thụ phấn

Xử lý IAA đẩy nhanh sự gia tăng sản xuất ethylene và héo cánh hoa ở hoa cẩm chướng cắt cành (van Staden, 1995 trong van Doorn và Woltering, 2008)

Gibberellin

Gibberellin làm chậm sự lão suy hoa Lupinus densiflorus do gibberellin làm chậm khả năng cảm ứng lão suy của ABA (Mackay et al., 2004) Gibberellin trì

hoãn lão suy trong một số hoa bằng cách hoạt động đối kháng với ethylene (Tripathi

và Tuteja, 2007) Khi quá trình lão suy bắt đầu, hàm lượng gibberellin trong nhiều

mô bị suy giảm do sự trao đổi chất mạnh mẽ (Rilley, 2004)

Xử lý gibberellic acid (GA) lên hoa cẩm chướng cắt cành làm trì hoãn sự gia tăng trong sản xuất ethylene và làm chậm héo cánh hoa (Saks và van Staden, 1993 trong van Doorn và Woltering, 2008)

Ethylene

Ethylene đóng vai trò chính trong lão suy hoa nhưng sự nhạdy cảm với

ethylene lại phụ thuộc vào loài hoa cắt cành (Redman et al., 2002 trong Jaime,

2003) Có sự tăng sản xuất ethylene ngay sau khi thụ phấn hoặc lúc bắt đầu lão suy

và sự lão suy được đẩy nhanh bằng cách tiếp xúc với nồng độ tương đối thấp của ethylene(Han et al., 1991)

Hoa được chia làm hai loại: loại có và không có climax trong quá trình lão suy hoa Trong những loài có climax (hoa hồng, hoa cẩm chướng), sự lão suy hoa được cảm ứng đáp ứng với ethylene, ethylene liên quan cả về sự khởi đầu và điều hòa lão

suy hoa.Trong loài không có climax (đồng tiền, cúc) không có vai trò của ethylene trong lão suy hoa (Jaime, 2003)

Ethylene cảm ứng biểu hiện gen ACC synthase, ACC oxidase ở cánh hoa, tự xúc tác cho sự sản xuất ethylene do đó gây ra sự cong cánh hoa và héo hoa Một lượng ethylene đáng kể được tạo ra ở bộ nhụy trước khi tạo ra ở cánh hoa có thể được cảm ứng bởi nhân tố như ABA và IAA (Jaime, 2003)

Sinh tổng hợp và điều hòa ethylene

Quá trình sinh tổng hợp ethylene hình thành hai sản phẩm trung gian chính đó

là S-adenosyl-L-methionine (SAM) và 1-aminocyclopropane-1-carboxylate acid (ACC) Sự hình thành SAM được xúc tác bởi SAM synthetase từ methionine tiêu tốn một phân tử ATP cho mỗi phân tử SAM tạo thành SAM còn là tiền chất của con đường tổng hợp polyamin (con đường sinh tổng hợp spermidine/spermine)

(Ravanel et al., 1998) ACC là tiền chất trung gian của ethylene (Yang và Hoffman,

1984) Sự tổng hợp ethylene được chuyển vị từ SAM thành MTA methylthioadenosine) nhờ ACC synthase MTA là sản phẩm đồng thời được tạo ra cùng với ACC MTA được chuyển ngược thành methionine giúp bảo đảm hàm lượng methionine trong tế bào và giúp tổng hợp ethylene nhanh chóng Sự malonyl hóa ACC thành malonyl-ACC (MACC) và làm giảm đi lượng ethylene được tổng hợp (Bleecker và Kende, 2000) ACC oxidase xúc tác bước cuối cùng của quá trình tổng hợp ethylene sử dụng ACC làm cơ chất và tạo CO2 và cyanid (Yang và Hoffman, 1984) (hình 1.2)

(5`-Sự điều hòa phiên mã ACC synthase và ACC oxidase được đặt bởi giả thuyết sau: có sự phosphoryl hóa ACC synthase được cảm ứng bởi phosphatase và kinase chưa biết, quá trình này có lẽ được kích hoạt bởi stress Cả hai dạng ACC synthase

tự nhiên và ACC synthase -Pi đều có chức năng tổng hợp ACC nhưng có lẽ dạng ACC synthase tự nhiên kém bền và kém hoạt động hơn (Yang và Hoffman, 1984) (hình 1.2)

Hình 1.2 Sinh tổng hợp và điều hòa ethylene (Yang và Hoffman, 1984)

Quá trình truyền tín hiệu của ethylene

Nghiên cứu ở một số loài hoa (cẩm chướng, phong lữ, Pentunia, phong lan và hoa hồng) đã thấy rằng lão suy hoa là kết quả của sự điều chỉnh phức tạp giữa 2 quá

trình: tổng hợp và nhận biết ethylene

Trong nhiều nghiên, các tác giả đã đưa ra những hiểu biết về mô hình truyền tín hiệu ethylene ở cây Arabidopsis và những loài hoa cảnh có giá trị khác Sử dụng

mô hình Arabidopsis đã mô tả được một họ gồm 5 gene receptor ethylene (Bleecker

and Kende, 2000), thuộc 2 họ phụ

Liên kết của ethylene với thụ thể có tính ái lực cao đòi hỏi một cofactor Cu RAN1 là một bơm ion Cu cũng tham gia vào quá trình vận chuyển đồng đến thụ thể

ethylene (hình 1.3) Đột biến mạnh mẽ gen ran1 khóa chức năng của các thụ thể

ethylene (Woeste và Kieber, 2000)

CTR1 xuất hiện có liên quan đến Raf, một MAPKKK loại serine/threonine protein kinase có liên quan đến việc dẫn truyền các tín hiệu điều hòa bên ngoài và

con đường phát triển bên trong các sinh vật (Yoo et al., 2008) Protein CTR1 trực

tiếp tương tác với các thụ thể ethylene, tạo thành một phần phức hệ protein liên

quan đến sự nhạy ethylene

Protein EIN2 bị suy thoái nhanh bởi proteasome 26S và ethylene ức chế quá

trình suy thoái EIN2 (Qiao et al., 2009) Vì EIN2 làm thay đổi sự nhạy cảm với

ethylene, chính vì vậy sự suy thoái EIN2 cung cấp một cơ chế điều tiết độ nhạy của

tế bào thực vật với ethylene

Một trong những ảnh hưởng chính của tín hiệu ethylene là sự thay đổi trong sự biểu hiện của gen đích khác nhau Ethylene ảnh hưởng đến mức độ dịch mã mRNA của nhiều gen, bao gồm cả những gen mã hóa cellulase và các gen liên quan đến quá trình chín và sinh tổng hợp ethylene Trình tự điều hòa được gọi là yếu tố phản

ứng ethylene, hoặc EREs, đã được xác định trong số các gen điều hòa ethylene

EIN3 (giống như EIL) yếu tố phiên mã rất quan trọng trong ethylene - quy định quá trình lão suy Sự hiện diện của lượng đường thích hợp trong tế bào làm

chậm quá trình lão suy và ngăn chặn sự gia tăng mức độ mRNA EIL

Việc điều tiết ổn định protein EIN3 đóng vai trò quan trọng trong việc truyền tín hiệu ethylene, cũng như trong việc điều chỉnh các con đường sinh tổng hợp ethylene Để đáp ứng với tín hiệu ethylene, các đồng đẳng của EIN3 hoặc các protein liên quan gắn kết với các promoter của các gen nhanh chóng cảm ứng bởi ethylene, bao gồm ERF1 (yếu tố phản ứng ethylene 1), để kích hoạt phiên mã

(Sonalo et al., 1998) EIN3 gắn vào F-box, EBF1/EBF2 và gắn vào promoter của

gen erf1, kích hoạt phiên mã, biểu hiện các gen quy định ethylene (hình 1.3)

1.3.4 Điều kiện môi trường ảnh hưởng đến thời gian sống của hoa cắt cành

Nhiệt độ là nhân tố môi trường quan trọng ảnh hưởng tới sự lão suy hoa cắt cành Những loài hoa nhiệt đới và cận nhiệt đới khi giữ ở nhiệt độ thấp sẽ xuất hiện triệu chứng như sự hóa nâu, hoa bị mất màu và héo Hầu hết các hoa cần được giữ trong nước hay trong dung dịch dinh dưỡng (Jaime, 2003)

Không khí để giữ hoa cắt cành lâu tàn cần được kiểm soát bằng cách tăng nồng độ CO2 và giảm nồng độ O2 để giảm bùng phát hô hấp (Jaime, 2003)

Quá trình quang hợp cung cấp đường cho mô thực vật tăng trưởng và hoạt động Màu cánh hoa phụ thuộc vào lượng carbohydrate có sẵn trong các mô xung quanh và màu của cánh hoa cũng bị tác động bởi cường độ ánh sáng thấp Trong quá trình vận chuyển hoa cắt cành, để hoa nơi tối hay nơi có cường độ ánh sáng

thấp làm giảm chất lượng vì lá và hoa dễ bị rụng (Cushman et al., 1998)

Stress nước trong tế bào cánh hoa góp phần vào hiện tường héo ở hoa

(Nooden et al., 1997 trong Xu và Hanson, 2000) Chất lượng nước rất quan trọng để

duy trì đời sống hoa cắt cành Nước sạch, tinh khiết cần thiết cho việc giữ hoa lâu tàn Sự khác nhau trong thành phần của nước máy, nước khử ion và nước cất có thể

Hình 1.3 Mô hình con đường truyền tín hiệu ethylene (Bleecker and Kende, 2000)

gây ra sự khác nhau về chất lượng giữ hoa cắt cành cũng như của dung dịch hóa chất dùng để giữ hoa hay làm nở hoa (Jaime, 2003)

Thiếu đường là nguyên nhân của sự lão hóa cánh hoa (van Doorn, 2004) Lượng đường thấp có thể nâng cao sản xuất ethylene và kích hoạt chết tế bào cánh

hoa Theo Hoeberichts et al (2007) trong Tripathi và Tuteja (2007) báo cáo rằng

loại đường hòa tan, như sucrose, trong cánh hoa cẩm chướng giúp ức chế quá trình lão suy ở mức độ phiên mã, nó hoạt động hiệu quả hơn STS trong ức chế tín hiệu ethylene Đối với hoa cắt cành, dung dịch giữ hoa có sucrose hay nguồn carbohydrate giúp duy trì tốc độ hô hấp và kéo dài đời sống hoa (Jaime, 2003) Thụ phấn tương thích kích hoạt một loạt các sự kiện sau thụ phấn giúp phát triển bầu nhụy (Zhang và O'Neill, 1993), thay đổi sắc tố cánh hoa, lão suy cánh hoa, kích hoạt enzym thủy phân và sự xuống cấp của các đại phân tử, gia tăng sản xuất ethylene

1.3 CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU

1.3.1 Công trình nghiên cứu trong nước

Theo Võ Ngọc Lê Khanh (2008), hoa Bibi thuộc nhóm hoa nhạy với ethylene

và sự sản xuất ethylene có đỉnh cao nhất trước khi hoa bước vào giai đoạn lão suy

- Đặc điểm hình thái, giải phẫu của hoa Bibi

Phát hoa mọc theo kiểu xim hai ngã Hoa Bibi có màu trắng, đường kính tối đa khi nở khoảng 6-8 mm, lưỡng tính, đài hoa năm thùy, năm lớp cánh hoa ngũ phân, mười nhị và hai nhụy, cánh hoa mỏng gồm ba lớp tế bào

Trên phát hoa cắt cành, khoảng 40% nụ hoa non, 29,2% nụ hoa tăng trưởng, 28,1% hoa đã nở, 2,7% hoa lão suy Các nụ non và nụ tăng trưởng không tiếp tục phát triển mà bị héo sau 24 giờ Hoa nở, sau 24 giờ cánh hoa mờ, mỏng hơn, tiếp đó

là khô, xoăn lại sau 48 giờ và sau 72 giờ thì úa vàng

- Sự thay đổi một số chỉ tiêu sinh lý trong quá trình phát triển của hoa Bibi Trọng lượng tươi, trọng lượng khô, cường độ hô hấp và hàm lượng đường của hoa Bibi tăng dần theo từng giai đoạn phát triển của hoa và cao nhất là sau khi hoa

nở và giảm khi bước vào lão suy

Hoạt tính của abscisic acid, zeatin, gibberelline đều tăng lên trong quá trình tăng trưởng và nở hoa, và giảm khi bước vào lão suy Auxin (IAA) có nhiều trong giai đoạn nụ hoa non và hoa nở, giảm khi bước vào lão suy Hoa Bibi thuộc nhóm hoa nhạy với ethylene và sự sản xuất ethylene có đỉnh cao nhất trước khi hoa bước vào giai đoạn lão suy

- Vai trò của đường và chất điều hòa tăng trưởng thực vật (naphthaleneacetic

acid (NAA) và benzyladenin (BA)) trong giai đoạn tăng trưởng và nở hoa in vitro

của Bibi:

Sự phát triển của nụ hoa Bibi in vitro trong môi trường MS không đường, nụ

non không tiếp tục phát triển và bị héo sau 6 ngày nuôi cấy

Ở môi trường MS có bổ sung đường sacaroz với nồng độ 20 g/l, 40 g/l, 60 g/l,

80 g/l thì nụ hoa tiếp tục phát triển, thời gian hoa nở sớm và tỉ lệ hoa nở cao nhất trong môi trường MS kết hợp sacaroz nồng độ 60 g/l và 80 g/l Áp dụng sacaroz

80 g/l trên nhánh hoa Bibi được tách từ phát hoa cắt cành đã giúp 40% số nụ ở giai đoạn tăng trưởng nở sau 2 ngày và 60% số nụ non nở sau 4 ngày xử lý

Nụ hoa Bibi trên phát hoa có thể tăng trưởng mạnh và nở in vitro trên môi

trường có sacaroz 40-80 g/l có hay không có bổ sung BA 0,5 mg/l và NAA 0,5 mg/l

Có thể tạo hoa Bibi màu xanh, tươi rất lâu (15 ngày) trên môi trường có sacaroz

20 g/l với BA 0,5 mg/l và NAA 0,5 mg/l Hoa màu xanh có trọng lượng tươi, trọng lượng khô, hàm lượng nước, hàm lượng diệp lục tố và hoạt tính của auxin và cytokinin cao hơn so với hoa màu trắng

- Xử lý kéo dài thời gian nở hoa của Bibi trên phát hoa cắt cành

Nhúng ngập nhánh hoa Bibi (tách từ phát hoa cắt cành) 4 phút trong dung dịch NAA 10 mg/l , BA 1 mg/l và GA3 20 mg/l giúp nhánh hoa tươi lâu hơn 0,5-1 ngày

so với đối chứng (chỉ nhúng ngập nhành hoa trong nước)

Nhúng ngập nhánh hoa hoặc cắm cuống nhánh hoa trong dung dịch sacaroz

80 g/l giúp kéo dài thời gian nở của hoa, đồng thời giúp các nụ hoa nở thành hoa

Cắm cuống nhánh hoa hoặc phát hoa Bibi cắt cành (như được bày bán trên thị trường) trong dung dịch sacaroz 80 g/l kết hợp với thiosulfate bạc (STS) 0,5 mM hoặc CoSO4 400 mg/l giúp kéo dài thời gian nở hoa khoảng 4 ngày so với đối chứng (trong nước) chỉ khoảng 1 ngày và giúp cho 100% số nụ hoa nở thành hoa rất đẹp, lớn hơn bình thường

1.3.2 Công trình nghiên cứu nước ngoài

Hoa Bibi ra hoa vào tháng bảy, tháng tám, nhưng người ta có thể xử lý cho hoa ra quanh năm, nâng cao kinh tế bằng cách thay đổi quang kì, cường độ ánh

sáng, nhiệt độ đêm và độ dài ngày (Hicklenton et al., 1993)

Hoa Bibi thuộc nhóm hoa nhạy với cả ethylene trong môi trường và ethylene

sản xuất bởi những bông hoa Quá trình lão suy cánh hoa ở G paniculata được quy

định bởi ethylene, và sự lão suy sớm của những hoa trên phát hoa cắt cành có liên quan đến sản xuất ethylene, phổ biến là tình trạng stress nước (Apelbaum và Yang, 1981; van Doorn và Reid, 1992)

Tuy nhiên, tuổi thọ của hoa có thể đạt được hơn 2 tuần khi hoa được xử lý trước với thiosulphate bạc (STS) 4 mM trong 30 phút, và sau đó được bảo quản trong dung dịch chứa 200 mg/l Physan (một hợp chất diệt khuẩn) và 15 g/l sucrose

(Newman et al., 1998)

Hoa sau thu hoạch được giữ trong nước, tuổi thọ của hoa kéo dài 4 ngày trước khi cánh hoa héo, 6 ngày khi xử lý 200 mg/l Physan, và 10 ngày khi bảo quản trong dung dịch chứa Physan và sucrose (15 g/l) Sự héo cánh hoa được bắt đầu với sự gia tăng sản xuất ethylene mạnh Xử lý trực tiếp hoa sau khi thu hoạch với STS (4 mM) trong 30 phút tăng tuổi thọ của hoa trong mỗi dung dịch nói trên Hoa cắt cành, nụ hoa và hoa sẽ kéo dài thêm 2 ngày nếu cuống hoa được giữ ở độ ẩm 90% chứ không phải là 60% (van Doorn và Reid, 1992)

1.3.3 Các công trình nghiên cứu liên quan

Thiosulfate bạc (STS) ngăn chặn ethylene hoạt động và kéo dài tuổi thọ hoa

trong nhiều hoa (Han et al., 1991) Xử lý 0.1 mM hoặc 1.0 mM kinetin hoặc

0.1 mM 6-methyl purine (chất ức chế cytokinin oxidase) trì hoãn lão suy và hiện

tượng rụng hoa sau thu hoạch (Price et al., 2008) Xử lý hoa cẩm chướng với 6- methyl purine, kết quả là trì hoãn sự lão suy hoa (Taverner et al., 2000 trong van

Doorn và Woltering, 2008)

Trong nhóm hoa mà lão suy được điều khiển bởi ethylene, xử lý với đường ngoại sinh làm chậm đáng kể sự tăng ethylene và thời gian lão suy Bổ sung đường vào hoa cẩm chướng cắt cành làm chậm thời gian héo cánh hoa từ ngày 7 (đối chứng) xuống ngày 15 và kết quả là tuổi thọ của hoa tương tự như hoa còn trên cây Lượng đường ngoại sinh làm giảm sự tăng sản xuất ethylene bằng cách giảm độ nhạy ethylene (Mayak và Dilley, 1976 trong van Doorn, 2004)

Nghiên cứu ảnh hưởng của acid 5-sulfosalicylic (5- SSA) trên đời sống hoa cắt

cành của Gladiolus grandiflora cho thấy có sự tăng hấp thu nước, kéo dài đời sống

hoa, tăng số lượng hoa nở Hoa ngâm trong dung dịch 5-SSA có cường độ hô hấp thấp, hoạt tính lipid peroxid và lipoxygenase thấp và tính ổn định của màng cao,

nồng độ protein hòa tan cao và hoạt tính catalase cao (Ezhilmathi et al., 2007)

Nitric oxide ức chế hoạt động của ethylene (Jaime, 2003) Aminoethoxyvinylglycine (AVG) và acid aminooxyacetic (AOA) cản sự đổi S-adenosyl-L-methionine (SAM) thành ACC (1-aminocyclopropane-1-cacboxylate acid) Hoa hồng cắt cành xử lý với AOA thì không có sự mất màu cánh hoa

Chương 2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 VẬT LIỆU

- Phát hoa Bibi được mua tại chợ hoa Hồ Thị Kỷ Tp HCM

- Khúc cắt diệp tiêu lú a (Oryza sativa L.) cho các sinh trắc nghiệm auxin và acid

abscisic

- Trụ hạ diệp của cây mầm xà lách (Lactuca sativa L.) cho sinh trắc nghiệm

gibberellin

- Tử diệp dưa leo (Cucumis sativus L.) cho sinh trắc nghiệm cytokinin

2.2 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

2.2.1 Thời gian nghiên cứu

2.3.1 Quan sát hình thái của hoa Bibi

Quan sát cấu trúc và sự phát triển của hoa bằng mắt thường

Tỉ lệ các nụ hoa và hoa theo từng giai đoạn phát triển được xác định bằng cách đếm số lượng trên toàn bộ phát hoa Mỗi phát hoa được dùng cho mỗi lần đếm

Nghiệm thức lặp lại 5 lần

Sự thay đổi đường kính của hoa Bibi qua từng giai đoạn phát triển hoa được

đo bằng thước kẹp điện tử Mỗi giai đoạn đo 5 hoa

2.3.2 Quan sát sự biến đổi các giai đoạn phát triển của hoa Bibi theo thời

gian

2.3.2.1 Quan sát sự biến đổi các giai đoạn phát triển của hoa trên phát hoa theo thời gian

Phát hoa Bibi mua từ chợ, được cắt lại dưới vòi nước và đặt trong Erlen

250 ml chứa 100 ml nước cất Ba phát hoa được chọn ngẫu nhiên cho mỗi lần quan sát Trên mỗi phát hoa 10 hoa Bibi thuộc giai đoạn hoa nở hoàn toàn được chọn

ngẫu nhiên để quan sát biến đổi hình thái mỗi ngày Nghiệm thức được lặp lại ba lần Thay nước cất mỗi ngày

Điều kiện phòng thí nghiệm: nhiệt độ 28,5 ± 20

C, ánh sáng 2500 ± 500 lux, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ ngày, độ ẩm 62 ± 5%

2.3.2.2 Quan sát sự biến đổi các giai đoạn phát triển của hoa tách rời từ phát hoa theo thời gian

Các hoa Bibi thuộc giai đoạn hoa nở hoàn toàn được tách rời khỏi phát hoa, có cuống dài 0,5 cm sử dụng để tiến hành các thí nghiệm quan sát Cắm cuống hoa vào đĩa Petri được lót 7 lớp giấy thấm, chứa 15ml nước cất Thêm 2 ml nước cất/ngày Nghiệm thức lặp lại 6 lần, mỗi lần 5 hoa Bố trí thí nghiệm theo hình 2.1 Quan sát biến đổi hình thái của các hoa mỗi ngày

Điều kiện phòng thí nghiệm: nhiệt độ 28,5 ± 20C, ánh sáng 2500 ± 500 lux, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ ngày, độ ẩm 62 ± 5%

2.3.3 Xác định trọng lượng tươi và trọng lượng khô của hoa ở các giai đoạn

phát triển

Hoa Bibi ở các giai đoạn phát triển được tách từ phát hoa, loại bỏ phần cuống

và đài, được cân ngay sau đó để tính trọng lượng tươi

Hình 2.1 Hoa Bibi giai đoạn hoa nở trong đĩa Petri

Sau khi cân trọng lượng tươi, hoa được đặt vào tủ sấy ở 1050C trong 2 giờ, sau

đó tiếp tục sấy ở 800C và được cân mỗi ngày cho đến khi trọng lượng không thay đổi Nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại là 5 hoa (Grodzinxki, 1981)

2.3.4 Đo cường độ hô hấp, quang hợp của hoa theo các giai đoạn phát triển

Cường độ hô hấp và quang hợp của hoa Bibi được xác định bằng máy Hansatech, ở nhiệt độ 25oC

Hoa Bibi ở các giai đoạn phát triển được tách từ phát hoa, loại bỏ phần cuống hoa, được sử dụng để đo cường độ hô hấp và quang hợp

Cường độ hô hấp của hoa được đo trong phòng tối để tính lượng oxygen được hấp thu với đơn vị: mol O2/g/phút 1g mẫu hoa được dùng cho mỗi lần đo, thí nghiệm lặp lại 3 lần (Biale, 1978)

Cường độ quang hợp được đo dưới nguồn sáng 2000  200 lux, lượng oxy sản sinh với đơn vị: mol O2/g/phút là số mol oxygen được phóng thích 1g mẫu hoa được dùng cho mỗi lần đo, nghiệm thức lặp lại 3 lần (Biale, 1978)

Các kết quả được hiển thị trên màn hình và là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại

2.3.5 Sự thay đổi độ dẫn điện của dịch chiết mẫu hoa theo các giai đoạn

phát triển

Độ dẫn điện của dịch chiết mẫu hoa Bibi được xác định bằng máy WTW LF

320

Hoa Bibi ở các giai đoạn phát triển được tách từ phát hoa, loại bỏ phần cuống

và đài, được sử dụng để đo độ dẫn điện Chỉ số ổn định màng được xác định dựa trên sự rò rỉ ion của dịch chiết mẫu hoa

Mẫu hoa Bibi được thả vào cốc chứa 10 ml manitol 20%, thỉnh thoảng lắc đều cốc Sau 1 giờ, loại bỏ hoa, lấy dung dịch đem đo với máy đo độ dẫn điện WTW LF

320, và đọc thông số hiện thị trên máy Nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 hoa cho mỗi mẫu hoa ở các giai đoạn

2.3.6 Xác định độ hấp thu sắc tố (OD max) của dịch chiết mẫu hoa theo các

giai đoạn phát triển

Hoa Bibi ở các giai đoạn phát triển được tách từ phát hoa, loại bỏ phần cuống

và đài, được sử dụng để xác định độ hấp thụ sắc tố

Mẫu hoa Bibi thuộc từng giai đoạn được tách rời từ phát hoa, nghiền trong

7 ml methanol 80% Dịch chiết được bảo quản trong tủ lạnh Sau 24 giờ đem quét phổ hấp thụ trong vùng bước sóng khả kiến ( = 380 - 730 nm) trên máy quang phổ UVProbe

Đỉnh hấp thu của dịch chiết mẫu hoa ở giai đoạn hoa nở hoàn toàn được chọn làm chuẩn để đo dịch chiết của các mẫu còn lại Nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 hoa cho mỗi mẫu hoa

2.3.7 Đo hàm lượng đường tổng số và hàm lượng tinh bột của hoa theo các

giai đoạn phát triển hoa

2.3.7.1 Đo hàm lượng đường tổng số của hoa theo các giai đoạn phát triển

Lập đường chuẩn

Pha saccaroz theo các nồng độ 10 - 80 mg/l Nhuộm dung dịch saccaroz bằng phenol 5% và H2SO4 đậm đặc theo tỉ lệ saccaroz: phenol 5%: H2SO4 đđ (1:1:5 theo thể tích) Đo mật độ quang ở bước sóng 490 nm với chuẩn là nước cất: phenol 5%:

nóng Lặp lại 2 lần Cô cạn các dịch lọc thu được rồi pha loãng với nước cất

để thực hiện phản ứng màu với phenol 5% và H2SO4 đậm đặc theo tỉ lệ 1: 1: 5 theo thể tích Đo mật độ quang ở bước sóng 490 nm Tính hàm lượng theo đường

saccaroz chuẩn (Coombs et al., 1987)

2.3.7.2 Đo hàm lượng tinh bột của hoa theo các giai đoạn phát triển hoa

Dùng phần bã từ các mẫu đã lọc ở trên sấy khô ở 700C trong 30 phút Sau đó đun cách thủy với 5 ml nước cất trong 15 phút, để nguội Thêm 2 ml HClO4 9,2N khuấy đều trong 15 phút Thêm nước cất vào cho đủ 10 ml và li tâm 4000 vòng trong 3 phút Lọc Để riêng dịch lỏng (1) Phần bã tiếp tục li trích với 2 ml HClO44,6N, khuấy đều 15 phút Pha loãng thành 10 ml rồi li tâm như trên, lấy phần dịch lỏng (2) Gộp chung (1) và (2), xác định hàm lượng đường theo đường chuẩn như trên nhưng đường mẫu là glucoz Qui đổi ra hàm lượng tinh bột theo công thức

n : trọng lượng mẫu lấy phân tích

2.3.8 Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật

Ly trích

Nghiền 1g vật liệu tươi (hoa ở các giai đoạn phát triển đã loại bỏ đài hoa) trong 20ml metanol 80%, để qua đêm Sau 24 giờ lọc dịch chiết Thêm 15ml metanol 80% vào phần bã, lắc trong 20 phút Lọc Lặp lại hai lần (mỗi lần với 15ml metanol 80%) Gộp chung các dịch lọc Tiếp tục ly trích theo hình 2.1 Thực hiện trong ánh sáng đỏ (Bùi Trang Việt, 1992)

Tinh bột (%) =

n x axbx 0 , 9 100

Hình 2.2 Sơ đồ ly trích các chất điều hòa tăng trưởng thực vật (Bùi Trang Việt, 1992)

Sắc kí lớp mỏng

Dịch acid và trung tính (trong ether) của các mẫu hoa được chấm trên bản sắc

kí lớp mỏng bằng nhôm tráng silica gel 60 F254 (Merck) kích thước 20 x 20 cm Sử

dụng micropipet chấm ether cô cạn và chất chuẩn cách mép 2 cm Sau mỗi lần

Mẫu nghiền với methanol 80%

Hòa tan trong 5ml nước cất

cô cạn 1 ml

pH 2,5; Ether

Dịch nước

Dịch nước (bỏ) Ether

Sắc ký

Hoạt tính Zeatin

pH 7; Ether Ether

chấm, dùng máy sấy làm khô vị trí này và sau đó tiếp tục chấm cho đến khi hết dịch ether Chấm các điểm tương tự với hỗn hợp chất chuẩn gồm IAA, ABA và GA3 và zeatin tinh khiết nồng độ 1mg/l cho mỗi chất

Đặt bản silica gel vào thùng sắc kí, dùng dung môi di chuyển (Isopropanol: Amon hydroxyd: H2O = 10:1:1 (theo tỉ lệ), nhiệt độ 30 - 32oC) Theo mao dẫn dung môi sẽ di chuyển dọc trên bản mỏng sắc kí, tùy thuộc vào đặc tính hòa tan của các chất mà chúng sẽ được phân ly tại các vị trí khác nhau trên bản sắc kí Khi mức dung môi cách mép 1cm thì sắc kí kết thúc Lấy bản sắc kí ra khỏi thùng, dùng bút chì đánh dấu mực dung môi và làm khô bản sắc kí

Phát hiện và cô lập

Vị trí các chất điều hòa tăng trưởng thực vật dạng tự do được nhận diện bằng các phương pháp đặc trưng rồi so với bản sắc kí chứa dung dịch các chất điều hòa tăng trưởng thực vật dạng hỗn hợp

- Auxin khi để khô tự nhiên cho màu nâu vàng

- Acid abscisic cho màu vàng nâu khi phun H2SO4 10%, sấy ở 1300C trong 8 phút

- Cytokinin cho vệt màu xanh khi phun hỗn hợp xanh bromophenol: AgNO31% (tỉ

Sự giải hấp

Các chất điều hòa tăng trưởng thực vật sau khi được cô lập vào các hạt silic trên bảng sắc kí có thể tách rời và hòa tan tốt trong dung môi

Dung môi chuẩn bị cho quá trình giải hấp gồm có methanol: chloroform (tỉ lệ

8 : 2 theo thể tích), sau đó cứ 100 ml hỗn hợp cho thêm vào 3 ml dung dịch acid acetic Trộn đều dung môi giải hấp này trước khi sử dụng

Thêm 3 ml dung môi giải hấp vào ống nghiệm đã chứa các hạt silic ở trên và vortex 3 phút Li tâm với vận tốc 1.500 vòng/phút (trong 3 phút) Dịch nổi sau hai lần giải hấp của mỗi chất được cho vào đĩa Petri hoặc Erlen 100 ml và cô cạn, sau

đó thêm 10 ml nước cất và dùng đũa thủy tinh khuấy đều để hòa tan hoàn toàn các chất vào dung dịch để chuẩn bị sinh trắc nghiệm

Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật bằng các sinh trắc nghiệm

Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật ở vật liệu sau khi ly trích

và phân đoạn qua sắc kí bản mỏng: gồm các chất trích từ mẫu hoa Bibi (ở các giai đoạn phát triển khác nhau) ở 10 băng trên bản mỏng silica gel

Hoạt tính auxin (IAA) và acid abscisic (ABA) được đo bằng sinh trắc nghiệm

khúc cắt diệp tiêu lúa (Oryza sativa L.) (Bùi Trang Việt, 1992; Nguyen Thi Ngoc

Lang, 1970) Hạt lúa gieo trên bông ẩm trong tối, ở nhiệt độ 310C ± 20C Diệp tiêu lúa sau khi gieo khoảng ba ngày (khi bao diệp tiêu chưa bị xé), diệp tiêu cao

15 mm Cắt diệp tiêu (trong phòng tối + ánh sáng đỏ): cắt bỏ một đoạn 5 mm ngọn diệp tiêu, cắt bỏ gốc diệp tiêu về phía hột và rút lá mầm ra khỏi diệp tiêu Dùng dao cắt chuyên biệt để tạo khúc cắt diệp tiêu dài bằng nhau (2 mm) cho vào hộp Petri chứa nước cất Dùng kẹp gắp ngẫu nhiên 10 khúc cắt diệp tiêu cho vào mỗi hộp Petri chứa dung dịch trích và dung dịch chuẩn, trong tối Sau 24 giờ, đo sự sai biệt chiều dài khúc cắt diệp tiêu lúa so với chuẩn sẽ xác định được hoạt tính tương đương IAA hay ABA Hoạt tính auxin tỷ lệ thuận với chiều dài khúc cắt diệp tiêu trong IAA tinh khiết 1 mg/l, hoạt tính ABA tỷ lệ nghịch với chiều dài khúc cắt diệp tiêu trong ABA tinh khiết 1 mg/l

Hoạt tính gibberellin được đo bằng sinh trắc nghiệm trụ hạ diệp cây mầm xà

lách (Lactuca sativa L.) Gieo hạt xà lách trên bông ẩm, nhiệt độ 310C ± 20C sau

18 giờ chọn hạt có rễ mầm vừa lú ra khỏi vỏ đặt trong các Becher nhỏ (100 ml) chứa dịch trích sau sắc ký Các Becher được đặt dưới ánh sáng liên tục 2500 lux ±

500 lux, nhiệt độ 280

C ± 20C Sau 72 giờ, đo sai biệt chiều dài trụ hạ diệp so với chuẩn Hàm lượng gibberellin tỷ lệ thuận với chiều dài trụ hạ diệp trong GA3 tinh khiết 1mg/l

Hoạt tính zeatin được đo dựa trên sự tăng trọng lượng của tử diệp dưa leo

(Cucumis sativus L.) Hạt dưa leo gieo trong tối, trên bông ẩm, ở nhiệt độ

310C ± 20C Khi rễ mầm vừa lú ra khỏi vỏ hạt khoảng 5 mm, thu các tử diệp, cân 5 mảnh tử diệp và đặt trên giấy thấm ẩm chứa dịch trích cytokinin ở 280

C ± 20C, ánh sáng liên tục 3000 lux ± 500 lux Sau 48 giờ, đo và tính sai biệt trọng lượng tử diệp

so với chuẩn Hoạt tính zeatin tỷ lệ thuận với trọng lượng sai biệt của tử diệp dưa leo so với chuẩn nước cất và zeatin tinh khiết 1 mg/l

2.3.9 Xử lý chất điều hòa tăng trưởng thực vật trên hoa Bibi

2.3.9.1 Xử lý kéo dài thời gian nở của hoa Bibi tách rời từ phát hoa

Các hoa Bibi thuộc giai đoạn hoa nở hoàn toàn được tách rời khỏi phát hoa, có cuống dài 0,5 cm sử dụng để tiến hành các thí nghiệm quan sát Cắm cuống hoa vào đĩa Petri được lót 7 lớp giấy thấm, chứa 15ml dung dịch có bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật Nghiệm thức lặp lại 6 lần, mỗi lần 5 hoa Bố trí thí nghiệm như mục 2.3.2.2 Quan sát biến đổi của các hoa sau 24 giờ

Thí nghiệm 1: Quan sát sự phát triển của hoa Bibi trong đĩa Petri trên môi trường

có bổ sung auxin (IAA, IBA, NAA) với các nồng độ 0; 2; 3; 5 mg/l sau 24 giờ

Thí nghiệm 2: Quan sát sự phát triển của hoa Bibi trong đĩa Petri trên môi trường

có bổ sung cytokinin (BA) với các nồng độ 0; 5; 10; 20 mg/l sau 24giờ

Thí nghiệm 3: Quan sát sự phát triển của hoa Bibi trong đĩa Petri trên môi trường

có bổ sung gibberellin (GA3) với các nồng độ 0; 10; 20; 50 mg/l sau 24 giờ

Thí nghiệm 4: Quan sát sự phát triển của hoa Bibi trong đĩa Petri trên môi trường

có bổ sung acid abscisic (ABA) với nồng độ 0; 2; 3; 5 mg/l sau 24 giờ

Điều kiện phòng thí nghiệm: nhiệt độ 32,5 ± 20C, ánh sáng 2500 ± 500 lux,

thời gian chiếu sáng 12 giờ/ ngày, độ ẩm 64 ± 5%

Đánh giá hiệu quả xử lý qua một số chỉ tiêu sinh hóa

Hoa được xử lý với chất điều hòa tăng trưởng thực vật sau 24 giờ trong đĩa

Petri, được sử dụng làm tiếp các thí nghiệm:

- Xác định trọng lượng tươi và trọng lượng khô của hoa (theo mục 2.3.3)

- Đo độ dẫn điện của hoa Bibi (theo mục 2.3.5)

- Xác định độ hấp thu sắc tố cực đại (ODmax) (theo mục 2.3.6)

2.3.9.2 Xử lý kéo dài thời gian nở của hoa Bibi trên phát hoa cắt cành

Phát hoa Bibi mua từ chợ về được cắt bỏ gốc 5 cm trong nước và cuống phát

hoa được cắm vào trong bao ni lông (11 cm x 6 cm) chứa 50 ml nước cất hoặc các

dung dịch có bổ sung chất điều hòa tăng trưởng thực vật: IAA (1; 2; 5 mg/l) hay

BA 10 mg/l hoặc GA3 20 mg/l

Nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 phát hoa

Theo dõi thời gian giữ hoa và tỉ lệ hoa ở giai đoạn hoa nở muộn sau 12 giờ, 24

giờ và 36 giờ

Quan sát sự biến đổi hình thái của hoa Bibi tại giai đoạn nở và giai đoạn nở

hoàn toàn sau 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ

Điều kiện phòng thí nghiệm: nhiệt độ 28,5 ± 20

C, ánh sáng 2500 ± 500 lux, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ ngày, độ ẩm 75 ± 5 %

2.3.10 Phân tích số liệu

Số liệu được xử lý bằng chương trình SPSS (Statistical Package for Social

Sciences) phiên bản 16.0 dùng cho Windows Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức

p = 0,05

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 KẾT QUẢ

3.1.1 Quan sát hình thái của hoa Bibi trên phát hoa

3.1.1.1 Các giai đoạn phát triển của hoa Bibi

Phát hoa Bibi phân nhánh theo kiểu xim kép hai ngả, cành mang hoa được kết thúc bởi một hoa và mang hai nhánh ở hai bên Hai nhánh này mỗi nhánh lại kết thúc bởi một hoa và lại mang hai nhánh ở hai bên nữa và cứ tiếp tục như thế (hình 3.1) Hoa Bibi màu trắng, hoa lưỡng tính, 10 nhị và 2 vòi nhụy, có 3 lớp cánh hoa (hình 3.2)

Sự phát triển của hoa được chia thành các giai đoạn:

Giai đoạn nụ hoa non: các cánh hoa được lá đài bao bọc, đầu nụ khéo kín Giai đoạn này được tính từ lúc các nụ hình thành có thể nhìn thấy bằng mắt thường đến trước lúc lá đài đầu tiên mở ra (hình 3.3)

Giai đoạn nụ đang tăng trưởng: các lá đài bắt đầu mở ra, cánh hoa tách ra khỏi

lá đài nhưng vẫn còn xếp vào trong Giai đoạn này bắt đầu tính từ khi lá đài đầu tiên

mở tới trước lúc cánh hoa đầu tiên hé mở ra (hình 3.4)

Giai đoạn hoa vừa nở : những cánh hoa ở lớp ngoài cùng mở ra, 2 đầu nhụy đưa lên cao lộ ra ngoài (hình 3.5)

Giai đoạn hoa nở hoàn toàn, tất cả các cánh hoa mở ra theo hướng từ ngoài vào trong, có thể tạo góc mở 900 với trục hoa (hình 3.6)

Giai đoạn hoa nở muộn: sau khi hoa mở hoàn toàn mép cánh hoa hơi cong xuống, đường kính hoa đạt kích thước tối đa (hình 3.7)

Giai đoạn hoa bắt đầu héo: giai đoạn này bắt đầu từ khi xuất hiện dấu hiệu

trong mờ ở đầu mép cánh hoa (hình 3.8)

Giai đoạn hoa héo hoàn toàn: cánh hoa mất nước nhanh cho đến khi cánh hoa

khô, xoăn và chuyển sang màu vàng (hình 3.9)