Nghiên cứu tách kháng nguyên bề mặt glycoprotein của trypanosoma evansi, ứng dụng trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở trâu bò tại huyện phổ yên tỉnh thái nguyên bằng phản ứng ELISA

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TRẦN ĐỨC HẠNH NGHIÊN CỨU TÁCH KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT GLYCOPROTEIN CỦA TRYPANOSOMA EVANSI, ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH TIÊN MAO TRÙNG Ở TRÂU

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

TRẦN ĐỨC HẠNH

NGHIÊN CỨU TÁCH KHÁNG NGUYÊN BỀ MẶT

GLYCOPROTEIN CỦA TRYPANOSOMA EVANSI,

ỨNG DỤNG TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH TIÊN MAO TRÙNG

Ở TRÂU BÒ TẠI HUYỆN PHỔ YÊN TỈNH THÁI NGUYÊN

1 PGS.TS NGUYỄN QUANG TUYÊN

2 Th.S NGUYỄN THỊ GIANG THANH

THÁI NGUYÊN - 2008

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi trực tiếp thực hiện cùng với sự cộng tác, giúp đỡ của PGS.TS Nguyễn Quang Tuyên và Th.S Nguyễn Thị Giang Thanh tại Viện Thú y Quốc gia Các số liệu, hình ảnh và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ một công trình nghiên cứu nào khác

Tôi xin đảm bảo rằng các thông tin, trích dẫn trong luận văn đã được chỉ

rõ nguồn gốc

Tác giả luận văn

Trần Đức Hạnh

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo trong Khoa Sau đại học - Trường Đại Học Nông Lâm Thái Nguyên, Bộ môn Ký Sinh Trùng - Viện Thú Y Quốc gia cùng các thầy cô giáo đã giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn PGS.TS Nguyễn Quang Tuyên và Ths Nguyễn Thị Giang Thanh đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này

Xin chân thành cảm ơn gia đình, anh em, bạn bè đồng nghiệp đã tạo điều kiện và động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Thái Nguyên, tháng 5 năm 2008

Tác giả luận văn

Trần Đức Hạnh

MỤC LỤC

Phần 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2

2.1 Tiên mao trùng (T Evansi) và bệnh tiên mao trùng 2

2.2 Một số đặc điểm của tiên mao trùng (Trypanosoma evansi) 2

2.3 Bệnh Tiên Mao Trùng (Trypanosomiasis) 9

2.4 Triệu chứng và bệnh tích bệnh Tiên mao trùng 13

2.5 Các phương pháp chẩn đoán bệnh TMT 14

2.5.1 Các phương pháp ký sinh trùng học 14

2.5.2 Các phương pháp huyết thanh học 17

2.5.3 Phương pháp sinh học phân tử (PCR - Polymerase Chain Reaction) 19

2.6 Tình hình nghiên cứu TMT và bệnh TMT trong và ngoài nước 19

2.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 19

2.6.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 22

Phần 3: NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

3.1 Nội dung ng hiên cứu 24

3.2 Đối tượng nghiên cứu 24

3.3 Địa điểm nghiên cứu 25

3.4 Thời gian nghiên cứu 25

3.5 Nguyên liệu 25

3.5.1 Động vật thí nghiệm 25

3.5.2 Nguyên liệu sinh học 25

3.6 Máy và các dụng cụ phòng thí nghiệm 26

3.7 Hoá chất và dung dịch 26

3.8 Phương pháp nghiên cứu 30

3.8.1 Phương pháp lấy mẫu 30

3.8.2 Tiêm truyền TMT qua chuột bạch theo phương pháp thường quy 30

3.8.3 Gây nhiễm bệnh TMT cho bê, nghé trong phòng thí nghiệm 31

3.8.4 Tách TMT từ máu chuột gây nhiễm theo phương pháp của Lanham 31

3.8.5 Tách kháng nguyên bề mặt VSG của TMT 32

3.8.6 Đo protein tổng số sử dụng quang phổ kế có dải bước sóng rộng 32

3.8.7 Phương pháp chạy điện di trên gel Poly Acrylamide 12% .33

3.8.8 Thiết lập quy trình chẩn đoán huyết thanh học ELISA bệnh TMT dùng kháng nguyên bề mặt 34

3.9 Phương pháp xử lý số liệu 34

Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35

4.1 Kết quả nghiên cứu trong phòng thí nghiệm 35

4.1.1 Kết quả tiêm truyền Tiên mao trùng cho động vật thí nghiệm 35

4.1.2 Kết quả tách kháng nguyên bề mặt glycoprotein từ Tiên mao trùng phân lập được 40

4.1.3 Thiết lập phản ứng chẩn đoán miễn dịch học ELISA cho bệnh TMT trên trâu, bò 43

4.2 Kết quả nghiên cứu bệnh tiêm mao trùng ở Phổ Yên - Thái Nguyên 46

4.2.1 Kết quả thu thập mẫu huyết thanh ở địa phương 46

4.2.2 Kết quả chẩn đoán bệnh TMT cho trâu, bò ở huyện Phổ Yên tỉnh Thái Nguyên bằng phương pháp huyết thanh học ELISA 49

4.2.3 Kết quả điều trị bệnh TMT ở trâu bò tại Phổ Yên 55

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 58

5.1 Kết luận 58

5.2 Đề nghị 59

TÀI LIỆU THAM KHẢO 60

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 4.1 Tăng cường, ổn định và nhân giống TMT trên chuột bạch 36

Bảng 4.2 Các triệu chứng lâm sàng xuất hiện ở bê, nghé sau khi gây nhiễm 37

Bảng 4.3 Bảng theo dõi nhiệt độ và sự xuất hiện TMT trong máu bê 38

Bảng 4.4 Bảng theo dõi nhiệt độ và sự xuất hiện TMT trong máu nghé 39

Bảng 4.5 Kết quả tách kháng nguyên bề mặt (VSG) 41

Bảng 4.6 Kết quả đo hàm lượng protein của kháng nguyên bề mặt 42

Bảng 4.7 Xác định độ pha loãng của kháng nguyên, huyết thanh và Conjugate 43

Bảng 4.8 Bảng thiết lập giá trị ngưỡng của bò, trâu 45

Bảng 4.9 Đánh giá mẫu huyết thanh dương và âm tính cuả huyết thanh xét nghiệm 45

Bảng 4.10 Kết quả thu thập mẫu huyết thanh trâu và bò ở các xã thuộc huyện Phổ Yên 47

Bảng 4.11 Đánh giá thể trạng, sức khoẻ của trâu, bò lấy mẫu 48

Bảng 4.12 Kết quả lấy mẫu theo lứa tuổi bê nghé và trâu bò .49

Bảng 4.13 Kết quả chẩn đoán bệnh TMT bằng phương pháp ELISA ở huyện Phổ Yên tỉnh Thái Nguyên 49

Bảng 4.14 Kết quả tỷ lệ nhiễm TMT của từng xã trong huyện Phổ Yên 51

Bảng 4.15 Kết quả tỷ lệ trâu bò ở huyện Phổ Yên nhiễm TMT theo các yếu tố thể trạng 52

Bảng 4.16 Kết quả tỷ lệ nhiễm TMT ở trâu bò thuộc huyện Phổ Yên theo lứa tuổi 53

Bảng 4.17 Kết quả điều trị bệnh TMT ở trâu, bò tại huyện Phổ Yên - Thái Nguyên 55

Bảng 4.18 Kết quả sử dụng thuốc phòng bệnh ký sinh trùng đường máu cho trâu, bò ở Phổ Yên - Thái Nguyên 56

CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

Kinetoplast Doxyribose Nucleic Acid Guide Ribonucleic acid

Glycosyl- phosphatidyl-Ụnositol Phospholipase C

Dithylaminoethyl- 52-cellulose Sodium Dodecyl Sulphate Poly Acrylamine Gel Ọlectrophoresis

Phosphate Saline Buffer Phosphate Saline Buffer - Tween 0.05% Phosphate Saline glucose buffer

Ọnzyme Linked Ụmmunosorbent Assay Food and Agricultre Ặganization

World Health Ặganization Tiên mao trùng

Trypanosoma evansi

Nguyên sinh chất

Phần 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, cùng với sự phát triển của nền kinh tế quốc dân, ngành chăn nuôi nói chung và ngành chăn nuôi trâu bò nói riêng đã có những bước phát triển, đã trở thành ngành sản xuất quan trọng góp phần cung cấp thực phẩm cho xã hội và tác động tích cực nâng cao đời sống cho người dân

Huyện Phổ Yên tỉnh Thái Nguyên ngành chăn nuôi trâu bò đã thực sự tăng trưởng khá mạnh với tốc độ tăng bình quân 7 - 9%/ năm, tổng đàn trâu

bò đạt trên 2,7 vạn con Người dân ở đây chăn nuôi trâu bò ngoài mục đích đáp ứng nhu cầu cày kéo trong sản xuất nông nghiệp, còn cung cấp thực phẩm

có giá trị cho xã hội như thịt, sữa đồng thời cung cấp giống cho các vùng lân cận Để phát triển đµn trâu, bò một cách bền vững, công tác thú y cũng phải được chú trọng thông qua công tác phòng chống bệnh truyền nhiễm cũng như bệnh ký sinh trùng Hiện nay, các bệnh do vi trùng và siêu vi trùng đã được phần nào phòng ngừa bằng các loại vắc xin nhưng bệnh do ký sinh trùng vẫn gặp nhiều khó khăn do không có vắc xin phòng cho nên công tác phòng bệnh mang tính quan trọng, phức tạp hơn dựa trên các yếu tố dịch tễ học, chẩn đoán sớm để hạn chế bệnh xẩy ra gây thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi

Một trong những bệnh ký sinh trùng phổ biến gây thiệt hại cho ngành

chăn nuôi trâu, bò là bệnh tiên mao trùng (Trypanosomasis) gây ra bởi loài

đơn bào Trypanosoma, gia súc mắc bệnh đều suy yếu dần và giảm sức đề kháng, rất dễ mắc các bệnh truyền nhiễm và một số bệnh khác

Đã có nhiều công trình nghiên cứu về bệnh tiên mao trùng (TMT) ở trâu bò trên thế giới và Việt Nam, phần lớn các tác giả đều tập trung nghiên cứu các biện pháp chuẩn đoán phát hiện bệnh sớm để kịp thời đưa ra những phương pháp phòng và trị bệnh hiệu quả Nhưng do TMT có đặc tính luôn

thay đổi kháng nguyên bề mặt để lẩn tránh sự đáp ứng miễn dịch của vật chủ nên đã gây không ít khó khăn cho công tác chẩn đoán bệnh

Thái Nguyên là một tỉnh đa dạng về địa lý bao gồm những vùng đất bằng phẳng, vùng đồi và vùng núi đá, thung lũng và rừng xen kẽ đó là điều kiện thuận lợi cho các loài côn trùng phát triển trong đó có ruồi mòng là vật chủ trung gian truyền bệnh TMT Huyện Phổ Yên thuộc tỉnh Thái Nguyên là một huyện nằm trong vùng dịch tễ của bệnh TMT, qua thực tế theo dõi tình hình dịch bệnh trên đàn trâu bò, chúng tôi thấy bệnh TMT ở trâu bò xảy ra khá phổ biến, gây nhiều thiệt hại cho người chăn nuôi Do vậy chúng tôi đã

tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu tách kháng nguyên bề mặt

glycoprotein của Trypanosoma evansi, ứng dụng trong chẩn đoán bệnh

tiên mao trùng ở trâu bò tại huyện Phổ Yên tỉnh Thái Nguyên bằng phản ứng ELISA"

Mục đích của đề tài

1 Nghiên cứu tách kháng nguyên bề mặt Glycoprotein của chủng T.evansi

2 Xác định thành phần và đặc tính kháng nguyên của kháng nguyên bề

mặt T.evansi

3 Thiết lập quy trình chẩn đoán huyết thanh học ELISA

4 ứng dụng quy trình ELISA trong chẩn đoán bệnh TMT cho trâu, bò

tại huyện Phổ Yên tỉnh Thái Nguyên

5 Điều trị trâu, bò có kháng thể kháng T evansi trong huyết thanh đã

phát hiện

Phần 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 TIấN MAO TRÙNG (T EVANSI) VÀ BỆNH TIấN MAO TRÙNG

* Phõn loại của T evansi

Theo Kashiwazaki, (1998) [40], T evansi được xếp theo hệ thống phõn

Loài: Trypanosoma evansi

2.2 MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA TIấN MAO TRÙNG (TRYPANOSOMA EVANSI) Đặc điểm hỡnh thỏi

Hình 1 Hình thái tiên mao trùng trong máu động vật nhiễm bệnh

T evansi được xếp vào

loại đơn bào, cơ thể chỉ là một

tế bào, chiều dài dao động từ

18 - 34àm, chiều rộng từ 1.5 -

2àm Toàn bộ cơ thể cú hỡnh

suốt chỉ mảnh hoặc hỡnh thoi,

cuối thõn nhọn Tiờn mao trựng

(TMT) cú một roi chạy dọc

theo chiều dài của cơ thể, bắt

nguồn từ thể Kinetoplast và dài

hơn thân khoảng 6 µm (Theo Phạm Sỹ Lăng và Nguyễn Quốc Doanh, 1997) [4]

Trong máu vật chủ T evansi có dạng Slender Trypomastigote và nhân

lên theo kiểu trực phân Đầu tiên Kinetoplast và nhân phân chia trước hình thành một roi mới, sau đó đến nguyên sinh chất (NSC) phân chia Quan sát

khi phân chia, T evansi có kích thước to hơn bình thường với 4 Kinetoplast

và 4 nhân, (theo Trịnh Văn Thịnh và Đỗ Dương Thái), (1982) “Công trình nghiên cứu về ký sinh trùng ở Việt Nam” NXB Nông Nghiệp [25]

Đặc điểm cấu trúc của T evansi

Nhìn chung cấu trúc cơ bản của

T evansi cũng giống như cấu trúc

của những loài tiên mao trùng

2.2) nhân TMT có chứa DNA, hình

bầu dục hoặc hình trứng Nhân

thường nằm ở vị trí trung tâm hoặc

gần vị trí trung tâm của cơ thể Đặc

biệt về phía đầu, TMT còn có

H×nh 2 CÊu tróc tÕ bµo tiªn mao trïng

Kinetoplast chứa DNA (kDNA), từ Kinetoplast có một roi chạy ra phía ngoài

Các loài TM khác nhau thì nhân khác nhau và hầu hết là khác nhau ở chuỗi vòng nhỏ của kDNA

b) Phần nguyên sinh chất

Nguyên sinh chất (NSC), gồm phần nội và phần ngoại nguyên sinh chất Trong NSC có chứa các nội quan như: Ribosome có màu thẫm xen kẽ với các vùng không bào màu sáng, Mitochrondria, Reticulum (lưới nội bào), mạng lưới Golgi và đặc biệt là Kinetoplast

Kinetoplast, nơi roi sinh ra và chứa DNA (Kinetoplast DNA- kDNA) là một đặc điểm rất riêng của TMT Lượng kDNA chiếm khoảng 10-20% DNA của toàn cơ thể bao gồm 2 loại cấu trúc vòng DNA: vòng lớn (maxi circles)

và vòng nhỏ (mini circles)

Vòng nhỏ có kích thước 1Kb và có khoảng 1000 bản sao Bản sao mật

mã di truyền của chuỗi vòng nhỏ mã hoá cho “Guide RNA” có chức năng điều khiển quá trình sao mã và giải mã của maxicircle

Số lượng vòng lớn vào khoảng 20 - 25 và kích thước trung bình của mỗi vòng khoảng 20 Kb tuỳ theo loài Các DNA của maxicircle là giống nhau

và có chứa các gen mã hoá cho các enzyme giúp cho quá trình trao đổi chất

của TMT (Schnaufer, 2002) [45] Nhưng một điều đặc biệt là T evansi lại

không có kDNA maxicircle Điều đó giải thích tại sao trong vòng đời phát

triển của mình, T.evansi không có khả năng nhân lên trong vật chủ trung gian

truyền bệnh

c) Lớp vỏ

Phần ngoài cùng là lớp vỏ có chiều dày khoảng 10 - 15nm, vỏ được chia làm 3 lớp Trong đó, lớp ngoài và lớp trong cùng (lớp tiếp giáp với nguyên sinh chất) dày hơn lớp ở giữa Lớp vỏ ngoài cùng được cấu tạo từ các phân tử Glycoprotein luôn biến đổi (VSG=Variant Surface Glycoprotein) Tiếp giáp với lớp trong cùng là 9 cặp vi ống xếp song song dọc theo chiều dài TMT và

kéo dài thành roi Chính nhờ có sự sắp xếp của các cặp vi ống nên TMT có dạng hình suốt chỉ mảnh và chuyển động được nhờ sự vận động của roi

Cấu trúc kháng nguyên bề mặt và sự biến đổi kháng nguyên bề mặt

Cấu trúc kháng nguyên của loài T evansi nói riêng và các loài TMT thuộc họ Trypanosomidae nói chung là giống nhau và rất phức tạp Kháng

nguyên TMT gồm: kháng nguyên bề mặt (kháng nguyên vỏ) và kháng nguyên thân Trong đó kháng nguyên bề mặt có ý nghĩa quan trọng trong tính chất phức tạp của bệnh TMT đồng thời cũng mang tính kháng nguyên cao được ứng dụng dùng trong chẩn đoán bệnh bằng các phương pháp miễn dịch học Kháng nguyên bề mặt của TMT có bản chất là protein được kết hợp với đường glyco có khả năng tự biến đổi (Variant Glycoprotein Surface-VSG) Lớp kháng nguyên vỏ này bao phủ

toàn bộ bề mặt TMT, có độ dày

khoảng 12-15 nm (theo Dolenson

và Allisons, 1985) [34] Theo Tuner

1982) [47], cho rằng lớp vỏ ngoài

cùng của một TMT có khoảng

1,5.107 phân tử glycoprotein, chiếm

khoảng 5% tổng số lượng protein

của toàn cơ thể

Cấu trúc phân tử của VSG

Kháng nguyên TMT có bản

chất là protein được cấu tạo từ các

phân tử Glycoprotein Mỗi phân tử

Glycoprotein được cấu tạo từ 450-500 axit amin, các axit amin liên kết với nhau tạo thành chuỗi và phân bố thành 4 vùng khác nhau:

H×nh 3 CÊu tróc ph©n tö cña VSG

- Vựng peptit đơn là vựng cú đầu tận cựng là Nitơ (-N) gồm khoảng 20 axit amin của đoạn peptit đơn

- Vựng thay đổi là vựng nằm cạnh vựng peptit đơn cú chứa khoảng 360 axit amin thường xuyờn biến đổi

- Vựng tương đồng chứa khoảng 100 axit amin

- Vựng cuối cựng cú đầu tận là Cacbon (-C) cú khoảng 20 axit amin

cuối cùng Peptit đơn

Hình 4: Cấu trúc phân tử của chuỗi Glycoprotein

Cỏc phõn tử VSG được gắn với màng thõn TMT ở đầu C- Terminal bằng cầu nối Glycosyl - Phosphatidyl- Inosi-tol (GPI) Vị trớ gắn do α- Cacboxyl đảm nhận (Theo Tuner 1982) [47]

Sự biến đổi khỏng nguyờn bề mặt và cơ chế của sự biến đổi

Khỏng nguyờn bề mặt biến đổi tạo thành cỏc type khỏng nguyờn biến đổi (VATs) khỏc nhau đó giỳp cho TMT lẩn trỏnh được hệ thống miễn dịch của vật chủ Con vật mắc bệnh cú triệu chứng sốt hồi quy được thể hiện qua đồ thị hỡnh sin Trong suốt pha lờn (ascending phase), TMT cú type khỏng nguyờn giống nhau (được gọi là homotype)

Hình 5 VAT và sự biến đổi kháng nguyên bề mặt

với sự triệt tiờu về số

lượng TMT của VAT này,

quỏ trỡnh này được biểu

hiện đồ thị hỡnh sine bắt

đầu đi xuống (pha xuống -

descending phase) Tuy

nhiờn, một phần VAT muộn (heterotype) cũn lại sẽ biến đổi và nhõn lờn tạo thành một heterotype mới mà khỏng thể lỳc trước khụng cũn khả năng nhận dạng ra nú Cơ chế đỏp ứng miễn dịch như trờn lại lặp lại với glycoprotein mới Quỏ trỡnh này cứ lặp đi lặp lại theo chu kỳ 10-12 ngày một lần

Hệ thống miễn dịch của vật chủ luụn luụn nhận dạng khỏng nguyờn TMT để sản sinh khỏng thể chống lại, TMT thỡ luụn luụn biến đổi glycoprotein bề mặt và trốn thoỏt khỏi hệ thống miễn dịch của vật chủ Khả năng lẩn trỏnh hệ thống đỏp ứng miễn dịch của vật chủ của TMT dựa vào bộ gen Sự điều hành hoạt động của khoảng 1000 trong bộ gene này tạo ra sự thay “lớp ỏo” (VSG) của TMT Khi khỏng thể đặc hiệu được sản sinh khỏng phõn tử VSG hiện hành, chỳng cựng với bổ thể, opsonin tiờu diệt TMT, ký sinh trựng sẽ tạo VSG mới Hầu hết tiờn mao trựng cú lớp VSG cũ bị tiờu diệt, nhưng những tiờn mao trựng cú ‘lớp ỏo’ VSG mới sẽ phỏt triển Cơ thể vật chủ khụng hề biết trước và cỏc khỏng thể hiện cú khụng cũn tỏc dụng với khỏng nguyờn mới này Cơ thể vật chủ lại phải đỏp ứng để miễn dịch lại với biến chủng này Quỏ trỡnh cứ lặp đi lặp lại như vậy Điều này giải thớch cho

hiện tượng lâm sàng sốt cách nhật theo chu kỳ 10-12 ngày của gia súc mắc bệnh (Theo Tuner 1982) [47]

2.3 BỆNH TIÊN MAO TRÙNG (TRYPANOSOMIASIS)

Nguồn gốc, phân bố và tính thiệt hại của bệnh TMT ở động vật

Năm 1843 được đánh dấu là mốc lịch sử đầu tiên khi Gruby phát hiện

thấy TMT ở trong máu ếch và đặt tên là Trypanosoma sanguinis Từ đó trở đi

một loạt các TMT khác được phát hiện trong máu các loài động vật khác

Trong các loài TMT đã được nghiên cứu thì T evansi luôn luôn được

đánh giá là loài gây bệnh trên diện rộng, gây ra rất nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi nói riêng và nền kinh tế nông nghiệp nói chung

Năm 1880, Evan là người đầu tiên mô tả về một loài TMT gây bệnh có

ở trong máu la, ngựa, lạc đà ở ấn Độ và đã gọi là bệnh TMT hay bệnh Surra

Và đến giờ đây người ta thấy T evansi phân bố hầu hết các nơi trên thế giới,

tập trung nhiều vào các vùng như: Châu á, Châu Phi, Trung Mỹ, Nam Mỹ, Trung Cận Đông

Ở châu Mỹ T evansi làm chết 3 triệu động vật và làm thiệt hại 1-1,2 tỷ

USD mỗi năm (FAO, 2001)

Ở Indonesia, T evansi lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1899 ở trên

trâu và ngựa (Theo A.G Luckins), [30] và đến năm 1996-1999 bằng kỹ thuật chẩn đoán ELISA phát hiện kháng nguyên cho kháng thể đã thấy tỷ lệ nhiễm

ở đây là rất cao gây thiệt hại kinh tế cho ngành chăn nuôi đến 22,4 triệu USD mỗi năm (Theo Davison, 1999) [33]

Ở Thái Lan năm 1949, Colonel Luangsnanruksat phát hiện thấy T evansi ở

13 con la nhập khẩu từ Algeria mà 12 con trong số chúng đã bị chết với các triệu

chứng tương tự như đã thấy ở bệnh Surra (P Indrakamhang) [44]. Và đến năm

1998 theo Kashiwazaki, Y and et al (1998) [40] thì bệnh TMT đã có mặt ở

khắp mọi nơi trên đất nước Thái Lan và có nơi tỷ lệ nhiễm lên đến 52,9% ở

đây bệnh được xác định có ở hầu hết các loài vật nuôi và động vật hoang dại như: trâu, bò, chó, mèo, lạc đà, ngựa Trong đó trâu, bò được xem là cảm nhiễm nhiều hơn cả

Ở Philippin thì bệnh Surra đã xẩy ra ở trên 13 khu vực Theo như báo

cáo của chính phủ năm 1989-1997 thì loài trâu sống ở vùng đầm lầy là có tỷ

lệ nhiễm bệnh cao nhất (3819 trường hợp) sau đó đến ngựa (3430 trường hợp) Tuy vậy tỷ lệ chết cao nhất lại rơi vào ngựa (345 con chết) và ít nhất ở trâu, bò (112con) (Theo M.F.Manuel [43] Các nhà nghiên cứu cũng khẳng định rằng những phát hiện này khác xa với con số thực tế điều này chứng tỏ

rằng ở Philippin TMT cũng gây ra nhiều lo ngại đáng kể

Ở Ấn Độ, năm 1984 người ta phát hiện thấy có 13 lợn chết và khi kiểm

tra bằng cách tiêm truyền chuột bạch thì thấy có 7 con nhiễm T evansi (Theo Gill, B.S., Singh, G., Gill, J.S (1987) [38]

Ở Trung Quốc, Chen Qijun, Seminar Paris, 10:200 (1992) [31] đã phân

lập được 5 loài TMT là T evansi, T equiperdum, T theileri, T gallirum và

T melophagium trong đó T evansi vẫn là loài gây bệnh phổ biến nhất

Tình hình nhiễm T evansi ở Việt Nam

Năm 1886, Blanchard là người đầu tiên phát hiện thấy TMT ở trên những con la nhập vào Bắc Bộ Việt Nam Carougeau (1902), Blin (1903) tìm

thấy T evansi trong máu ngựa ở Nha Trang Rồi đến năm 1924 theo như các

nhà nghiên cứu thì bệnh đã lan toả ra hầu hết các tỉnh Bắc Bộ như Bắc Cạn, Cao Bằng, Lai Châu, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Bắc Ninh, Sơn Tây, Vĩnh Phú (Trịnh Văn Thịnh,1982) [25]

Năm 1962-1971, Phạm Sỹ Lăng (1983) [11] cho biết bệnh TMT đã xuất hiện ở các vùng đồng bằng, trung du, miền núi, ven biển Trâu và bò nhiễm

T evansi nhiều lứa tuổi nhưng tập trung chủ yếu ở các lứa từ 3-8 năm tuổi, tỷ

lệ nhiễm là 16%-18% trong đó trâu nhiễm nhiều hơn bò

Năm 1981, Hồ Thị Thuận cho biết trâu sữa Murrah ở trung tâm trâu sữa

Sông Bé nhiễm T evansi với tỷ lệ 19.04% Sau đó, năm 1991 Phạm Sỹ Lăng, Đào Trọng Đạt (1990 - 1991) [5] thông báo tình hình nhiễm T.evansi ở trâu bò tại

một số vùng địa phương phía Bắc dao động từ 7 - 13%

Lê Ngọc Mỹ và cs (2002) [12] Đã dùng các phản ứng huyết thanh học

để kiểm tra và kết luận trâu ở Việt Nam vẫn nhiễm TMT với tỷ lệ tương đối cao 53.33% trong đó ở các tỉnh miền núi phía Bắc và trung du lại nhiễm cao hơn ở đồng bằng Và cũng theo như Lê Đức Quyết và cs (1995) [20] đăng trên KHKTTY, tập II (số 3) thì ở một số tỉnh miền Nam và Tây Nguyên nhiễm TMT với tỷ lệ 22.12% ở trâu và 6.6% ở bò

Phan Lục và Nguyễn Văn Thọ (1995) [9] Cho rằng tỷ lệ nhiễm TMT ở

một số nơi thuộc các tỉnh phía Bắc là 26.92%

Năm 1999 theo Vương Thị Lan Phương [21] thì dê cũng nhiễm TMT với

tỷ lệ khá cao (25.6%) và bò sữa nhiễm 5.6%

Dịch tễ học bệnh TMT

Vật chủ của T evansi

T evansi có thể gây bệnh cho rất nhiều loài như ngựa, trâu, bò, dê, cừu,

lợn, lừa, lạc đà, và cả các động vật hoang dại như hổ, hươu, nai, [48] Trong đó loài ngựa là loài cảm nhiễm nhất, bệnh thường ở thể cấp tính, con vật chết rất nhanh: trâu, bò thường mắc bệnh ở thể mạn tính hoặc tiềm ẩn Theo kết luận của Phạm Sỹ Lăng (1986) và của Hồ Thị Thuận và cs (1985) thì trâu bò mắc bệnh nhiều ở lứa tuổi từ 6 đến 8 năm Ngoài những động vật

nhiễm T evansi tự nhiên, trong phòng thí nghiệm có thể truyền bệnh TMT

cho các loài động vật nhỏ: chuột trắng, chuột cống trắng, thỏ, chuột lang, chồn, cầy hương, chó, mèo trong đó chuột nhắt trắng và chuột cống trắng

rất mẫn cảm với T evansi (Theo Lapage (1968) G Parasitology of medical and Veterinary, London) [42]

Môi giới trung gian truyền bệnh của T evansi

Vector truyền bệnh TMT rất phong phú trong đó có 7 loài mòng họ

Tabanidae và 3 loài ruồi hút máu họ Stomoxynidae đóng vai trò chủ yếu, theo

Đào Trọng Đạt, Phạm Sỹ Lăng, Công trình nghiên cứu khoa học kỹ thuật,

(1990- 1991) [5] thì trong điều kiện nóng ẩm của Việt Nam ruồi hút máu mang mầm bệnh với tỷ lệ 5.61%-19.34% và mòng với tỷ lệ 3.84%-24.9%

Bệnh chỉ truyền theo phương pháp cơ giới, T evansi không có sự phát triển ở những loài côn trùng hút máu Ví dụ như ở loài Tabanus rubidus, sau khi vào vật chủ trung gian thì T evansi vẫn sống và hoạt động đến giờ thứ 53 trong đó

khoảng từ 1 đến 34 giờ là hoạt động mạnh nhất, nhưng hoạt lực gây bệnh chỉ đến giờ thứ 7 Thời gian xâm nhập vào mòng càng lâu thì tỷ lệ gây bệnh càng

giảm Điều này có thể do số lượng và độc tính của T evansi giảm trong mòng

(Theo Phan Địch Lân (1985) [8]

Ở một số nước nhiệt đới thì ngoài côn trùng người ta cũng có nghĩ tới một số loài nhuyễn thể hút máu có thể là một môi giới truyền bệnh TMT

(theo Trịnh Văn Thịnh và Đỗ Dương Thái (1982) [25]

Mùa mắc bệnh và phát bệnh TMT

Do T evansi không có chu kì phát triển trong vật chủ trung gian truyền

bệnh và thời gian duy trì sức sống trong vật chủ cũng không lâu cho nên mùa mắc bệnh TMT có liên quan chặt chẽ đến mùa côn trùng hoạt động

Trong một năm thì vào mùa hè, bắt đầu từ tháng 5, cao điểm nhất là tháng 6 đến tháng 9 trâu, bò sẽ bị ruồi, mòng hút máu truyền mầm bệnh Tuy vậy vào mùa này do thức ăn có sẵn, thể trạng lại tốt cho nên tỷ lệ phát bệnh lâm sàng thấp Cho đến vụ đông xuân, khi thời tiết trở lạnh, thức ăn thiếu

thốn, lao tác nặng nhọc dẫn đến sức đề kháng thấp, T evansi có điều kiện

phát triển dẫn đến việc trâu, bò bị chết hàng loạt Hiện tượng này cũng thường xẩy ra ở đàn trâu, bò chuyển từ miền núi về đồng bằng vào các vụ đông xuân

hàng năm (theo Trịnh Văn Thịnh (1982), [26]

Cơ chế sinh bệnh TMT

Sau khi xâm nhập vào cơ thể vật chủ, T evansi vào máu sinh sản nhiều bằng cách nhân đôi theo chiều dọc, số lượng T evansi tăng lên gây tắc các mạch máu nhỏ do đó gây ra các niêm mạc bị tụ máu Cũng do T evansi làm

tổn thương vách mạch máu nên huyết dịch xuất ra ngoài gây ra hiện tượng

thuỷ thũng T evansi còn tiết độc tố làm cho hệ thần kinh bị trúng độc, chức

năng điều hoà thân nhiệt bị rối loạn, con vật sốt, run rẩy, bại liệt, cứng chân,

lẫn lộn điên cuồng trước khi chết T evansi còn ngăn chức năng tạo hồng

huyết cầu của lách, tuỷ xương làm cho hồng cầu giảm nhiều, máu nhạt và loãng Mặt khác khi hồng cầu giảm sút, máu thiếu huyết sắc tố nên không hút được O2 nên axit tích lại trong máu, từ đó con vật lại trúng độc axit, khả năng chết lại cao hơn (theo Phạm Sỹ Lăng, 2000) [10]

2.4 TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH BỆNH TIÊN MAO TRÙNG

Triệu chứng bệnh TMT

Triệu chứng cấp tính bệnh TMT

Con vật vẫn béo tốt, đang đi làm đột nhiên bị ngã hoặc không thể đi làm được nữa Sốt rất cao, ở trâu bò là 3905 - 4105, ở ngựa là 410- 420, con vật thở mạnh, con vật sốt theo thể lên xuống, lấy máu kiểm tra thấy có TMT trong khi sốt Sau cơn sốt có hiện tượng bỏ ăn, miệng cắn chặt, nước bọt chảy liên tiếp, đầu rủ xuống, nước mắt, nhử mắt chảy rất nhiều, phân đôi khi nhão và có lẫn máu Trong thời gian bệnh con vật gày đi rất nhiều, nếu không can thiệp kịp

thời gia súc có thể chết sau vài ngày (nguồn Trịnh Văn Thịnh, 1982) [26]

Triệu chứng mạn tính bệnh TMT

Triệu chứng của trâu, bò nhiễm T evansi ở thể mạn tính thường không rõ

ràng, chúng có hiện tượng chung là gầy yếu và chỉ đến khi thời tiết rét, thức

ăn thiếu thốn cùng với công việc nặng nhọc làm sức đề kháng giảm bệnh mới

thể hiện triệu chứng lâm sàng rõ hơn các triệu chứng điển hình: sốt cách nhật,

ỉa chảy, lông xù, da khô, mắt có nhử, hay chảy nước mắt, giác mạc mắt bị viêm, vùng bụng và chân sau bị phù thũng, lông rất dễ bị dụng cầm tay nhổ lông thấy lông dụng ra thành từng mảng, niêm mạc mắt nhợt nhạt thiếu máu, càng về sau con vật càng kiệt sức dần, dễ bị kế phát các bệnh khác (nguồn

Trịnh Văn Thịnh (1982) [26] “Công trình nghiên cứu ký sinh trùng ở Việt

Nam” Nhà xuất bản KH và KT Hà Nội)

Bệnh tích bệnh TMT

Con vật gầy còm, tổ chức dưới da có nước vàng tập trung nhiều ở ức và

cổ Vùng hầu, cằm, bẹn có hiện tượng thuỷ thũng, trong xoang bụng có chứa các ổ dịch màu vàng chanh Niêm mạc ruột non, ruột già có nhiều điểm xuất huyết Ở trâu, bò dạ múi khế thỉnh thoảng có những điểm xuất huyết to bằng đầu tăm Bao tim có dịch màu vàng chanh, mặt ngoài tim có điểm xuất huyết

to bằng đầu kim, tập trung nhiều ở đỉnh tim Màng phổi bị tràn dịch, phổi hơi sưng, trên mặt có nhiều vùng xuất huyết to nhỏ không đều Lá gan sưng có màu đỏ nhạt hoặc màu đỏ sậm tuỳ theo giai đoạn phát triển của bệnh Lá lách hơi sưng, bở, nhũn, trên bề mặt có nhiều điểm tụ huyết to bằng đầu tăm hoặc đầu kim Thịt con vật nhão, ướt, có màu sắc nhợt nhạt (theo Trịnh Văn Thịnh

và Đỗ Dương Thái (1982) [25]

2.5 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH TMT

2.5.1 Các phương pháp ký sinh trùng học

Phương pháp xem tươi

Lấy một giọt máu tươi của động vật nghi nhiễm TMT cho lên phiến kính đậy lamen lên cho máu dàn mỏng và soi dưới kính hiển vi có độ phóng đại 10×40 thấy TMT (nếu có) chuyển động

Phương pháp này có ưu điểm là tiện lợi và chính xác khi bệnh ở thể cấp tính, mỗi khi con vật sốt cao đều có thể phát hiện thấy có TMT Nhược điểm

của nó là khó có thể phát hiện thấy mầm bệnh ở thể mạn tính hoặc khi con vật không sốt cũng khó thấy được ký sinh trùng (theo Phan Lục và Nguyễn Văn

Thọ (1995) [9]

Phương pháp nhuộm Giemsa

Lấy máu ngoại biên của động vật nghi nhiễm đem phiết kính, cố định bằng cồn methol và nhuộm giemsa 3%, soi kính quang học ở độ phóng đại 10×40, thấy hồng cầu bắt màu hồng, TMT bắt màu tím xanh, nhân bắt màu tím đậm

Phương pháp này hiệu quả tương đương với phương pháp xem tươi nhưng thủ tục phức tạp hơn

Phương pháp dung giải hồng cầu sử dụng SDS; Van Meirvence

Lấy 10 µl máu trâu thí nghiệm nhỏ lên phiến kính cùng với 10 µl SDS 1% trong dung dịch Tris-gluco-saline, pH=7.5 Dùng que khuấy đều hỗn hợp này sau đó kiểm tra trên kính hiển vi 10×40 (theo A.G Luckin (1988), Parasitology Today, vol 4, No.5, 1988 [29]

Phương pháp này có hiệu quả thấp nên ngày nay không còn được sử dụng

Phương pháp tập trung (Haematocrit Centrifuge Technique - HCT, Woo và Kauff - 1971)

Lấy máu chống đông cho vào ống Haematocrit, li tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút Lấy ống Haematocrit soi dưới kính hiển vi quang học 10×10 thấy TMT (nếu có) chuyển động ở phần tiếp giáp giữa huyết tương và hồng cầu (do TMT nhẹ hơn hồng cầu và nặng hơn huyết tương)

So với phương pháp xem tươi thì phương pháp tập trung có hiệu quả hơn nhiều Và khi cần ứng dụng nhanh và đại trà với số lượng lớn thì đây sẽ là phương pháp thích hợp Cần chú ý phương pháp này là phải giữ cho máu ở nhiệt độ lạnh và phân tích mẫu ngay sau khi lấy trong vòng 3- 4 giờ (theo A.G Luckin (1988), Parasitology Today, vol 4, No.5, 1988 [29]

Phương pháp tách TMT (MAECT); Sachs, 1984; Lumsden, 1977

Máu của động vật nghi nhiễm TMT được chạy qua cột DEAE 52, rửa bằng PSG pH = 8.0 Phần nước trong được thu vào ống hút Pasteur đã hàn kín đầu đem li tâm lạnh ở tốc độ 2000v/phút trong 20 phút kiểm tra phần đáy ống dưới kính hiển vi 10×10

Phương pháp này có độ nhậy khá cao nhưng phức tạp hơn một số phương pháp kí sinh trùng khác nên cũng không được sử dụng rộng rãi trong thực tiễn

điều tra quy mô lớn (điều tra đại trà), (nguồn Lương Tố Thu (1990- 1991) [29]

Phương pháp tiêm truyền chuột bạch (MI)

Lấy 0.4 ml máu động vật nghi mắc bệnh TMT tiêm vào xoang phúc mạc của chuột bạch Theo dõi trong 1 tháng, 3 ngày kiểm tra 1 lần, TMT (nếu có)

sẽ nhân lên trong máu chuột Lấy máu ở đuôi chuột kiểm tra dưới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 10×40 sẽ thấy TMT

Trong các phương pháp ký sinh trùng thì đây là phương pháp chuẩn có

độ nhậy cao nhất và thường được sử dụng để đánh giá các phương pháp chẩn đoán khác Tuy nhiên ở phương pháp này thời gian theo dõi chuột tương đối dài (30 ngày) nên gây khó khăn khi ta muốn chẩn đoán nhanh với số lượng mẫu lớn (nguồn Lê Ngọc Mỹ, Wicher Holland, Phạm thị Tâm, Nguyễn Thị Giang Thanh, Đoàn hữu Hoàn (1996 - 2000) [19]

* Nhận xét chung về các phương pháp ký sinh trùng học

Theo nghiên cứu của Lê Ngọc Mỹ và các cs (1990-1991) [14], trong các phương pháp kí sinh trùng học để chẩn đoán bệnh TMT thì phương pháp tiêm truyền chuột bạch (MI) có độ nhậy cao nhất 75,9%; li tâm haematocrit (HCT) 64,5% rồi tới MAECT 57,5%, kiểm tra trên kính hiển vi nền đen (DG) 36%

và cuối cùng là phương pháp dung giải TMT bằng SDS 22% Các phương pháp ký sinh trùng học đều có đặc điểm chung là phát hiện được TMT nhưng không triệt để, cho tỉ lệ thấp trên con vật mới nhiễm bệnh dưới 1 tháng Chính

vì vậy có nhiều trường hợp trong thực tế không tìm thấy được TMT trong máu do con vật mới nhiễm bệnh Cho nên xu hướng ngày nay người ta thường tập trung vào các phương pháp huyết thanh học và phương pháp sinh học phân tử

2.5.2 Các phương pháp huyết thanh học

Phương pháp ngưng kết trực tiếp trên phiến kính (SAT)

Phương pháp này ta lấy kháng nguyên là kháng nguyên tươi chuẩn lấy từ

chuột trắng được gây nhiễm T evansi ở mức độ tối đa pha loãng 1/8 với dung

dịch PSG Kháng thể chính là huyết thanh con vật cần chẩn đoán cũng pha loãng 1/8 Trên phiến kính ta lấy một giọt kháng nguyên và một giọt huyết thanh đã pha loãng, trộn đều rồi đậy bằng lamen chờ 5-10 phút, kiểm tra sự ngưng kết trên kính hiển vi phóng đại 10×20 lần Nếu các TMT chụm lại thành đám nhỏ như hình hoa cúc thì kết qủa là dương tính, ngược lại TMT rời rạc phân tán khắp vi trường thì kết quả là âm tính

Đây là phương pháp được sử dụng khá nhiều cho kết quả tương đối đáng

tin cậy cho nên có thể sử dụng trong chẩn đoán đại trà, (nguồn Lương Tố Thu

(1990- 1991) [23], Phương pháp ngưng kết trên bảng (CATT - Card Agglutination Trypanosomiasis Test)

Phương pháp ngưng kết trực tiếp giữa kháng nguyên và kháng thể trên bảng nhựa dùng để phát hiện kháng thể lưu động có trong máu động vật nhiễm bệnh Kháng nguyên dùng trong phản ứng này được nhuộm bằng Commassie Blue sau đó đem đông khô Phương pháp này đơn giản, nhanh,

chính xác, dễ sử dụng trong chẩn đoán đại trà (nguồn Lương Tố Thu (1990-

1991) [23], Phương pháp LATEX (Latex Agglutination Test)

Phương pháp ngưng kết gián tiếp dùng để phát hiện kháng thể lưu động trong máu động vật nhiễm bệnh với nguyên lý: kháng nguyên bề mặt TMT

được gắn lên các hạt Latex (kháng nguyên hữu hình), có nhiều điểm quyết định tính kháng nguyên bề mặt (Epitop Surface) Còn kháng thể đặc hiệu kháng TMT lại có nhiều điểm thụ thể (Receptor) tương ứng và đặc hiệu với các điểm quyết định kháng nguyên Khi kháng nguyên, kháng thể gặp nhau sẽ xẩy ra hiện tượng ngưng kết có thể quan sát bằng mắt thường (theo Lương Tố

Thu (1990 - 1991) [23], Phương pháp miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (IFAT

- Immunofluorescent Antibody Test)

Phương pháp dùng kháng nguyên hoặc kháng thể kháng globulin đã được nhuộm màu bằng thuốc nhuộm huỳnh quang cho kết hợp với kháng thể hoặc kháng nguyên thì phức hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ phát quang khi soi dưới kính hiển vi huỳnh quang Thuốc nhuộm huỳnh quang thường là Fluorescent Isothyociante có màu xanh lục hoặc Romadium màu đỏ gạch Đây là phương pháp huyết thanh học đặc hiệu, chính xác, có độ nhậy cao Điểm yếu của phản ứng này là hoàn toàn phụ thuộc vào chủ quan như cường độ ánh sáng và người đọc phản ứng để đánh giá độ dương tính (theo Touratier, L., 1999 [48]

Phương pháp ELISA (Enzyme Link Immunosorbent Assay)

Phản ứng ELISA dựa trên cơ chế miễn dịch kháng nguyên - kháng thể,

có sử dụng Enzyme và chất chỉ thị màu còn gọi là cơ chất nhằm phát hiện sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể có trong phản ứng

Nguyên lý chung

Kháng nguyên hoặc kháng thể được gắn trên đĩa nhựa (pha rắn); sau đó cho kháng thể hoặc kháng nguyên nghi vào Bước tiếp theo cho conjugate có thành phần kháng nguyên của kháng thể hoặc kháng thể của kháng nguyên có gắn Enzyme Enzyme sẽ tác dụng với cơ chất làm xuất hiện màu của phảm ứng và nhờ đó có sự kết hợp kháng nguyên - kháng thể được phát hiện thông qua máy đọc ELISA ở bước sóng khác nhau thuộc cơ chất đã dùng

Các loại phản ứng miễn dịch ELISA

- Phản ứng ELISA trực tiếp (Direct ELISA)

- Phản ứng ELISA gián tiếp (Indirect ELISA)

- Phản ứng “Bánh mì kẹp chả” (Sandwich ELISA)

- Phản ứng ELISA cạnh tranh (Competitive ELISA)

• Phản ứng cạnh tranh kháng nguyên (Antigen Competitive ELISA)

• Phản ứng cạnh tranh kháng thể (Antibody Competitive ELISA)

2.5.3 Phương pháp sinh học phân tử (PCR - Polymerase Chain Reaction)

Theo Vương Thị Lan Phương (2003) [22] thì phương pháp PCR được

coi là phương pháp hiện đại nhất mới được đưa vào ứng dụng để chẩn đoán bệnh TMT trong những năm gần đây Vào năm 1987, Mullis và Faloona đã thiết lập quy trình phản ứng để ứng dụng trong chẩn đoán bệnh TMT Nguyên lí của phương pháp này là dựa vào primer đặc hiệu để xác định sự

có mặt của DNA của TMT ở trong máu động vật nhiễm bệnh Phương pháp này có ưu điểm đặc trưng đó là độ nhạy và độ chính xác cao Tuy nhiên nó đòi hỏi một trình độ cao, trang thiết bị hiện đại nên hiện nay mới được thử nghiệm ở một số phòng thí nghiệm hiện đại

2.6 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TMT VÀ BỆNH TMT TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC

2.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 1843, được coi là mốc lịch sử của những nghiên cứu về Tiên mao trùng Gruby lần đầu tiên phát hiện thấy tiên mao trùng trong máu ếch, ông

đặt tên là Trypanosoma sanguisis Sau đó, nhiều loài TMT khác lần lượt được

các nhà khoa học phát hiện trong máu của các loài động vật khác có xương

sống (theo Nguyễn Đức Tân và cs (2002) [28]

Đến năm 1880, Griffilt Evans tìm thấy loài TMT gây bệnh trong máu ngựa và lạc đà ở Punjab - Ấn Độ, bệnh do loài này gây ra được gọi chung là

Surra (nguồn Nguyễn Ngọc Hùng 2002) [7]

Năm 1885, Steel phát hiện ra tác nhân gây bệnh Surra có trong máu la ở

Miến Điện Sau khi mô tả đầy đủ về đặc điểm hình thái, cấu trúc và để nhớ công người đầu tiên phát hiện, ông đã đặt tên cho tác nhân gây bệnh là

Spirocheata evansi, sau này đổi thành Trypanosoma evansi (T evansi)

Tiếp đến Brucei (1895), phát hiện một loài TMT khác tên T brucei gây

bệnh Nagana cho bò ở Châu Phi Bệnh có một số đặc điểm, nguyên nhân gây bệnh, triệu chứng, bệnh tích giống với bệnh Surra

Năm 1912, Lavaran và Rosail trong tác phẩm kinh điển nói về TMT và bệnh do TMT gây nên đã mô tả đầy đủ về bệnh lí học của bệnh TMT

Trong khoảng thời gian 1885 - 1920 nhiều bệnh tương tự như bệnh

Surra được tìm thấy ở một số nơi trên thế giới với các tên gọi khác nhau ví

dụ như bệnh “Eldebab” do T.equinum gây ra

Đến nay Richardson (1963) và Lapage (1968), đã ghi nhận được các loài TMT ký sinh và gây bệnh ở động vật có vú và người như sau:

T evansi, Steel 1885 ký sinh ở động vật có vú

T brucei, Plimmer và Bradford 1899 ký sinh ở động vật có vú

T equiperdum, Dofbin 1900 ký sinh ở ngựa, la

T gambiense, Dalton 1902 ký sinh ở người

T congolence, Broden 1904 ký sinh ở động vật có vú

T vivax, Zieman 1905 ký sinh ở động vật có vú

T cruzi, Chagas 1909 ký sinh ở người

T rhodesience, Stephen et Fantham 1910 ký sinh ở người

T simiae ký sinh ở lợn

T lewisi, Kent 1880 ký sinh ở động vật gậm nhấm

T theileri, Laveran 1902 ký sinh ở trâu bò

T melophagium, Fles 1908 ký sinh ở dê, cừu

Trong những năm gần đây, ở khắp nơi trên thế giới có rất nhiều tác giả tập trung nghiên cứu chi tiết về TMT và bệnh TMT, những kết quả đạt được

từ những nghiên cứu đã giúp chúng ta hiểu một cách toàn diện về nguyên nhân gây bệnh TMT Trong số những công trình nghiên cứu đó có một số công trình đáng lưu ý như:

- Nghiên cứu về cấu trúc cơ thể và kháng nguyên TMT của Ligard (1902), Rudzinsk và Vickerman (1971)… Thành quả từ những nghiên cứu đó được coi là nền tảng cơ bản cho các nghiên cứu tiếp theo

- Bệnh được lan truyền và yếu tố nào quyết định sự lan truyền, đã được giải thích từ kết quả nghiên cứu về vật chủ trung gian của Pease (1897), Reger (1901), Leese (1909)…

Các nhà khoa học còn nghiên cứu và đưa ra các phương pháp chẩn đoán bệnh tốt nhất giúp cho việc chẩn đoán bệnh được nhanh và chính xác, như:

- Kỹ thuật ly tâm Heamatocrit của Woo (1907); Lumsden, Kimber (1977); Vanmeirvenne và Magnus (1978);

- Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang gián tiếp và kỹ thuật ELISA của Luckins (1977);

- Nghiên cứu và ứng dụng phương pháp PCR của Mullis và Faloona (1987)

Trong những năm gần đây, rất nhiều công trình nghiên cứu về gen DNA của TMT như: Borst, Van der Poeg (1982), Hammers và Bajyana Songa (1992), Artama và cộng sự (1992)… được công bố (theo A.G Luckin (1988), Parasitology Today, vol 4, No.5, (1988) [29]

Và hàng loạt những công trình nghiên cứu sâu, chi tiết về sự ảnh hưởng

của bệnh TMT đến đáp ứng miễn dịch của vật chủ như: Công trình nghiên cứu của Olssont, Bankhiet (1991); Mansfield (1994); Taylor, Willians (1996); Onah, Hopkin, Luckins (1997-1999) cũng lần lượt được công bố tiếp đó (nguồn Schnaufer, A., Domingo, G.J Stuart, K., (2002) [45]

Tất cả những đóng góp trên đã giúp cho việc nghiên cứu, phòng và trị bệnh TMT đạt các kết tốt hơn, góp phần giải quyết dịch bệnh TMT trên thế giới

2.6.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, bệnh TMT do T evansi được phát hiện đầu tiên và sớm

nhất trong các bệnh do đơn bào gây ra cho gia súc ở nước ta

Lần đầu tiên Blanchard đã phát hiện và quan sát bệnh TMT ở những con

la nhập vào Bắc Bộ (1886) và kế đó bệnh đã được phát hiện ở nhiều nơi trong nước ở hầu hết các tỉnh Bắc Bộ, Thái Nguyên, Bắc Cạn, Cao Bằng, Bắc Giang, Bắc Ninh, Hà Tây, Nam Định, Ninh Bình, Hà Nam, Vĩnh Phúc

Chính tình hình trên đã thu hút được sự quan tâm, chú ý của các nhà nghiên cứu từ đó dẫn đến hàng loạt các công trình nghiên cứu được ra đời, trong đó có một số nghiên cứu đáng được quan tâm như:

Các công trình nghiên cứu về dịch tễ học và vật chủ trung gian truyền bệnh của bệnh TMT: Đoàn Văn Phúc (1965), Phạm Sỹ Lăng (1965), Phạm Sỹ Lăng và Phan Địch Lân (1974 - 1984), Hồ thị Thuận (1981), Phan Lục, Nguyễn Văn Thọ, Hà Viết Lượng, Vương Xuân Thạch (1995 - 1998), Vương Thị Lan Phương (2003)

Các công trình nghiên cứu về quy trình phòng bệnh và phác đồ diều trị: Phạm Văn Khuê (1963), Đoàn Văn Phúc (1965), Phạm Sỹ Lăng, Nguyễn Quốc Doanh (1995), Nguyễn Quốc Doanh, Lương Tố Thu, Lê Ngọc Mỹ, Phạm Sỹ Lăng (1996), Lê Ngọc Mỹ và cs (1997), Vương Xuân Thạch (2000), Lê Ngọc Mỹ và cs (2002)

Các công trình nghiên cứu về phương pháp chẩn đoán bệnh TMT:

* Quy trình chẩn đoán bằng phản ứng ngưng kết (SAT - Serum Agglutination test) dùng để phát hiện nhanh kháng thể chống TMT, Đoàn Văn Phúc và cs, 1986 - 1990

* Kết quả nghiên cứu 4 phương pháp huyết thanh miễn dịch để phát hiện

kháng thể kháng Trypanosoma evansi ở trâu Việt Nam, Lương Tố Thu, 1991 [23]

* Sử dụng phản ứng ngưng kết để khảo sát dịch tễ của bệnh TMT, Lê Ngọc Vinh, 1992

* Nghiên cứu chế tạo conjugate cho phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp để khảo sát dịch tễ của bệnh, Đoàn Văn Phúc và Lương Tố Thu, 1994

* Ứng dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật trên thế giới, sử dụng phản ứng ELISA phát hiện kháng nguyên TMT để khảo sát dịch tễ học bệnh TMT,

Lê Ngọc Mỹ, 1995

* Nghiên cứu chế kháng nguyên hoà tan dùng trong chẩn đoán huyết thanh học chẩn đoán bệnh TMT, Lê Ngọc Mỹ và cs, 1995, 2000, 2002 [12], [13], [14], [16]

* Nghiên cứu sự biến đổi kháng nguyên của TMT thu nhập ở các tỉnh phía Bắc Việt Nam, Lê Ngọc Mỹ và cs [15]

* Nghiên cứu về phương pháp bảo quản giống, Nguyễn Quốc Doanh

(1999) [2]

Phần 3 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

- Phân lập, ổn định và giữ giống tiên mao trùng phân lập được trên chuột tại phòng thí nghiệm

Tiêm truyền chủng phân lập được nhiều lần qua chuột bạch, theo dõi sự xuất hiện tiên mao trùng và đậm độ tiên mao trùng trong máu chuột

- Gây nhiễm động vật thí nghiệm (bê, nghé dưới một năm tuổi) với

chủng phân lập được Lấy huyết thanh trước và sau gây nhiễm một tuần một

lần làm huyết thanh dương chuẩn

- Tách và đánh giá kháng nguyên bề mặt Glycoprotein của TMT phân lập được

- Thiết lập quy trình chẩn đoán huyết thanh học ELISA bằng kháng nguyên bề mặt tự chế tạo

- Ứng dụng chẩn đoán bệnh TMT ngoài thực địa

- Điều trị trâu bò mắc bệnh TMT

3.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Đề tài xác định 5 đối tượng nghiên cứu chính, có tính tuần tự như sau:

a Trâu bò nhiễm tiên mao trùng tại huyện Phổ Yên - Thái Nguyên

b Bê nghé gây bệnh trong phòng thí nghiệm

c Chuột bạch gây bệnh TMT trong phòng thí nghiệm

d Chủng T evansi phân lập được từ trâu địa phương

e Glycoprotein, thành phần chủ yếu của màng tế bào T evansi

3.3 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU

- Các thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Ký sinh trùng, Viện Thú Y Quốc Gia, Hà Nội

- Huyện Phổ Yên - Thái Nguyên là vùng núi, chăn nuôi trâu, bò, dê rất phổ biến Theo báo cáo của trạm Thú y huyện Phổ Yên, bệnh tiên mao trùng

đã từng gây đổ ngã nhiều trâu bò Cũng có nhiều báo cáo khoa học về bệnh TMT, huyện này đã được xác định nằm trong vùng dịch tễ bệnh

3.4 THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

- Bê, nghé khoẻ mạnh dưới một năm tuổi, khỏe mạnh chưa mắc bệnh TMT

- Giống ký sinh trùng: T evansi được thu thập từ trâu bò nhiễm bệnh,

được nhân giống qua tiêm truyền chuột bạch Giống được bảo quản trong dung dịch PSG/Glycerin với tỷ lệ 2:1 ở nhiệt độ - 800C hoặc trong nitơ lỏng

dùng để gây nhiễm trong phòng thí nghiệm

3.5.2 Nguyên liệu sinh học

Huyết thanh

- Huyết thanh của trâu, bò ở huyện Phổ Yên - Thái Nguyên

- Huyết thanh của bê, nghé gây nhiễm bệnh TMT thực nghiệm được thu thập trước và sau khi gây nhiễm TMT

Các chế phẩm sinh học - Conjugate (kháng kháng thể gắn enzyme)

Các kháng kháng thể trâu bò bao gồm Goat Anti- bovine IgG (H+L)- HRP conjugate và Anti- Rabit IgG (Affiniti isolated HRP Conjugated Raised

in sheep), của hãng Sigma

Protein ladder

Hỗn hợp protein chuẩn, bao gồm dãy các protein đã biết trọng lượng phân tử (Protein ladder) dùng để xác định trọng lượng phân tử của protein của hãng Sigma

Đĩa ELISA (Nunc, Maxisorf) của hãng Nagene

3.6 THIẾT BỊ VÀ CÁC DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM

Máy sử dụng:

Máy ly tâm lạnh, loại ly tâm bàn và ly tâm đứng, tốc độ 1000-14000 Vòng/phút

Votex, kính hiển vi, khuấy từ, máy lắc

Bộ điện di và bộ Blotter của hãng BioRad

Máy đọc ELISA, máy ủ ấm lắc của hãng BioTek

Máy đo quang phổ, có các dải bước sóng rộng

Tủ ấm và bể ấm (Warm water bath), cân phân tích

Tủ lạnh âm sâu: -200C và - 800C, tủ lạnh 4-80C

Dụng cụ:

Đĩa ELISA (Nunc, Maxisorf) của hãng Nagene

Micropipette chính xác và đầu tips chuyên dụng loại 10 µl, 100 µl, 200µl, 1000 µl Phiến kính, lamen (Đức, Trung Quốc)

Eppendorf loại thông thường và loại đặc biệt, dùng được trong điều kiện nitơ lỏng

Burret, ống đong, cốc đong, giấy lọc, kéo cong…

Bơm tiêm, seringe, kim tiêm các cỡ…

3.7 HOÁ CHẤT VÀ DUNG DỊCH

Hoá chất:

Poly-acrylamide, Bis-acrylamide, AmoniumPersulphate (APS) và TEMED TMB trong DMSO, thuốc nhuộm Commassie Blue, DEAE-

Cellulose (DEAE-52), Methanol, H2O2 (Trung Quốc), Ethanol, Acetic acid, Glucose (Việt Nam), Casein, Glyxerin, Glycine, Sodium Doecyl Sulfate, Tris-HCl, Tween-20 (Merk), NaH2PO4.H2O, Na2HPO4.2H2O, K2HPO4, NaCl, KCl, Heparin (Đức)

Các dung dịch dùng trong nghiên cứu

0.2 M DTT (dùng DTT: Dithiothreitol - 1M) 2 ml

Chia nhỏ vào mỗi ống 0.5 ml, bảo quản ở 40C

SDS (Sodium Doecyl Sulfate) 10%

Sodium Doecyl Sulfate 10 g

Bảo quản ở nhiệt độ phòng

Giữ dung dịch ở nhiệt độ phòng

Dung dịch nhuộm (Stain solution)

Commassie blue 0,1 g

Destaining solution 100 ml

Giữ dung dịch trong lọ tối màu, tránh ánh sáng và ở nhiệt độ phòng

Dung dịch dùng cho phản ứng ELISA:

Sodium acetate cystric acid (pH=6)

Sodium acetate (khan) 8.2g

H2O (nước cất) 900 ml Cytric acid 1 M (19,2 g cytric khan / 100 ml H20) 1 ml

TMB trong DMSO

TMB (Working solution)

(10mg TMB trong dd DMSẶ 1ml) 1ml (0.1 M Sodium acetate/ cytric acid buffer PH = 6 (40C) ) 99 ml

H202 (30%) 15µl

3.8 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.8.1 Phương pháp lấy mẫu

Chọn 11 xã ngẫu nhiên trong huyện Phổ Yên đó là xã Tân Phú, Đông Cao, Thuận Thành, Đắc Sơn, Minh Đức, Tiên Phong, Hồng Tiến, Nam Tiến, Tân Hương, Đồng Tiến và Phúc Thuận Từ các xã trên chọn ngẫu nhiên mỗi thôn 7 - 10 con trâu bò, mỗi xã 40 - 50 con, tiến hành lấy máu theo kỹ thuật lấy máu tĩnh mạch thường quy, gia súc sau khi được cố định trong gióng, dùng bông thấm cồn 700C sát trùng sạch da phía ngoài chỗ lấy máu Dùng xilanh 5 và kim 18G (dùng chỉ 1 lần không dùng lại) lấy 5ml máu tĩnh mạch

cổ hoặc đuôi Cho máu vào ống týp và ghi rõ ký hiệu mẫu thể trạng trâu bò, tên chủ hộ, địa chỉ ngày lấy mẫu Để nghiêng ống máu để tăng diện tích bề mặt tăng khả năng tiết huyết thanh Bảo quản ở ngăn mát 40C trong 48 tiếng Sau đó chuyển các mẫu xuống Bộ môn ký sinh trùng Viện Thú y Quốc Gia tiến hành ly tâm týp mẫu máu với tốc độ 5000v/phút trong 15 phút, dùng pipet 1000µl chắt huyết thanh cho vào týp eppendorf, ghi ký hiệu huyết thanh Bảo quản huyết thanh ở tủ lạnh âm (-300C) đến khi dùng

3.8.2 Tiêm truyền TMT qua chuột bạch theo phương pháp thường quy

Chuột bạch là loài mẫn cảm nhất với T evansi, được dùng làm động vật

trong phòng thí nghiệm Lấy 0.2 ml- 0.4 ml máu đã xác định có TMT đang bảo quản trong Nitơ lỏng hoặc trong tủ - 800C, tiêm vào xoang phúc mạc của chuột bạch TMT sẽ nhanh chóng nhân lên trong máu chuột Kiểm tra nồng độ TMT lên trong máu chuột dưới kính hiển vi theo phương pháp ước lượng nhanh

Đếm TMT bằng phương pháp ước lượng nhanh (hình 6)

Máu của động vật gây nhiễm TMT được nhỏ lên phiến kính, đậy lamen

và quan sát dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 10 x 40 Tổng số TMT được ước lượng nhanh theo công thức (trong đó x là một hệ số chuẩn đã được tính sẵn)

Công thức tính đậm độ tiên mao trùng

Hình 6 Phương pháp ước lượng nhanh TMT

3.8.3 Gõy nhiễm bệnh TMT cho bờ, nghộ trong phũng thớ nghiệm

Giống TMT bảo quản ở -800C được lấy ra tiờm truyền qua chuột bạch, kiểm tra mỏu chuột thấy mật độ TMT cao, giết chuột lấy mỏu, đếm số Pha loóng mật độ TMT bằng dung dịch PSG và tiờm vào tĩnh mạch cổ cho bờ nghộ với liều 105 TMT/ml mỏu Theo dừi nhiệt độ và kiểm tra sự xuất hiện của TMT trong mỏu nghộ và lấy huyết thanh trước và sau gõy nhiễm 1 lần/tuần bảo quản (-300C) cho tới khi sử dụng

3.8.4 Tỏch TMT từ mỏu chuột gõy nhiễm theo phương phỏp của Lanham

Chuột được gõy nhiễm T evansi và kiểm tra hàng ngày cho tới khi kiểm

tra mỏu chuột gõy nhiễm đạt lượng 107 TMT/1ml thỡ thu toàn bộ mỏu chuột, cho chạy qua cột DEAE -52 tỏch TMT khỏi cỏc thành phần của mỏu

Cỏc bước tiến hành tỏch TMT:

Bước 1: Chuẩn bị cột gel DEAE-52: Gel được pha trong dung dịch PSG,

sau đú điều chỉnh pH của huyễn dịch gel bằng dung dịch acid H3PO4 5% cho đến khi pH=8.0