Sử dụng công nghệ tế bào thực vật trong cải biến di truyền tế bào chất ở một số cây họ cà

Mục đích nghiên cứu của luận án Sử dụng một cách có hệ thống công nghệ tế bào thực vật để nghiên cứu cải biến đặc tính di truyền tế bào chất chủ yếu ở lục lạp, cũng như một số đặc điểm s

|

BO GIAO DUC VA BAO TAO _ TRUNG TÂM KHOA HỌC TỰ NHIÊN VÀ |

CONG NGHE QUOC GIA

VIEN CONG NGHE SINH HOC NGHIÊM NGỌC MINH

SU DUNG CONG NGHE TE BAO THUC VAT TRONG CẢI BIẾN DI TRUYỂN TẾ BẢO CHẤT

Công trình được hoàn thành tại: Viện Công nghệ Sinh học, Trưng tam Khoa

học tự nhiên và Công nghệ quốc gia

Người hướng dẫn khoa học:

1 PGS TS Lé Thị Muội

2 PTS Nguyễn Đức Thành

Phản biện]: PGS PTS Nguyễn Quang Thạch

Phan bién 2: GS PTS Vi Van Vu

Phan bién3: GS TS Lé Don Dién

Luận án sẽ được bảo vệ tại hội đồng chấm luận án cấp nhà nước họp tại: Viện Công nghệ sinh học Trung tâm KHTN á: CNQG

Vào hồi giờ ngay tháng nam 1999

Có thể fìm hiểu luận án tại thư viện:

+ Thư viện quốc gia

+ Viện Công nghệ Sinh học

+ Phòng Đi truyền tế bào thực vật, Viện CNSH

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đẻ tài

Hàng năm trên thế giới và ở Việt nam, số lượng giống cây trồng bị thoái hoá, giảm năng suất bị thiệt hại do sâu bệnh cũng như sự thay đối bất lợi của điều kiện ngoại cảnh ngày một gia tăng Vì vậy việc cải tạo và nâng cao phẩm chất của cây trồng, đồng thời tạo ra những cây trồng mới có khả năng chống

chịu sâu bệnh bằng công nghệ tế bào thực vật là một việc làm cần thiết và

cấp bách hiện nay

Việc sử dụng công nghệ tế bào thực vật như dung hợp protoplast, chuyển gen đã được nhiều nước trên thế giới cũng như ở Việt nam quan tâm chú ý Tuy nhiên những nghiên cứu này chủ yếu chỉ tập chung vào việc cải tạo các đặc tính đi truyền trong nhân Việc nghiên cứu di truyền tế bào chất mặc dù

đã có một số ít phòng thí nghiệm quan tâm tới nhưng số lượng các công bổ còn rất hạn chế và chưa được tập trưng một cách có hệ thống Hơn nữa nhiều đặc điểm có giá trị cả về lý thuyết cũng như thực tiễn như kháng thuốc kháng

sinh kháng độc tố nấm chống chịu sâu bệnh đã được xác định là các đặc

điểm di truyền tế bào chất Do đó việc sử dụng công nghệ tế bào thực vật một cách có hệ thống trong việc cải biến di truyền tế bào chất ở thực vật mang một

ý nghĩa quan trọng trong cả hai hướng nghiên cứu cơ bản cũng như ứng dụng Đặc biệt ở Việt nam hướng nghiên cứu này còn ít được quan tâm nên nội dung nghiên cứu của chúng tôi là hoàn toàn cần thiết và phù hợp

2 Mục đích nghiên cứu của luận án

Sử dụng một cách có hệ thống công nghệ tế bào thực vật để nghiên cứu cải biến đặc tính di truyền tế bào chất (chủ yếu ở lục lạp), cũng như một số đặc điểm sinh hoá của các dòng lai tế bào chất và chuyển gen mang các kiểu gen luc lạp khác nhau ở cây họ cà nhằm phục vụ nghiên cứu và cải biến giống cây trồng,

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Một số loài cây thuộc họ ca (Solanaceae) nhu Nicotiana tabacum (N tabacum), Nicotiana plumbaginifolia (N plumbaginifolia), Solanum nigrum (S nigrum) va mét s6 dong N tabacum mang cdc kiểu gen lục lạp khác nhau

đã được chúng tôi sử dụng để nghiên cứu trong luận văn này

4 Điểm mới và ý nghĩa của luận án

- Lần đầu tiên ở Việt nam sử dụng có hệ thống công nghệ tế bào frực vật

để biến đổi di truyền tế bào chất (di truyền lue lạp) ở cây thuốc lá Đặc biệt

việc chuyển thành công một đoạn ADN lục lạp (LpADN) ngoại lai tt S nig-

ru (thuộc họ phụ Solanotdeae) vào cây thuốc lá N phưnbagimjfolia (thuộc

họ phụ Cesoideae) bằng kỹ thuật chuyển gen trực tiếp vào protoplast nhờ xử

lý với polyethylen giyeol (PEG) đã góp phần khảng định những thành tựu mới

về chuyển gen lục lạp ở Việt nam cũng như trên thế giới

- Đây là công trình nghiên cứu đầu tiên có hệ thống về sự thay đổi một số

đặc điểm sinh hoá (hàm lượng nicotn chlorophyll, đường khử và protein tổng

số) ở những đòng thuốc lá mang các kiểu gen lục lạp khác nhau

5 Bố cục của luận án

Luận án gồm tổng cộng 120 trang, trong đó bao gồm: Phần mở đầu 3

trang Tổng quan tài liệu 30 trang (gồm l bảng) Nguyên liệu phương pháp l3 trang (gồm 2 hình và 2 bảng) Kết quả và thảo luận 50 trang (gồm 24 hình và

§ bảng) Kết luận và kiến nghị 2 trang Tài liệu tham khảo 22 trang có 180 tài liệu (gềm 8 tài liệu tiếng Việt nam và Ï72 tài liệu tiếng Anh)

NOI DUNG LUAN AN

Chương 1: Tổng quan tài liệu

truyền tế bào chất được bắt đầu từ tảo đơn bào Chlamydomonas Cau tric va

sự biểu hiện của LpADN đã được bắt đầu nghiên cứu bởi Sager và cộng sự (1963) Bản đồ lý học đầu tiên của LpADN được thiết lập từ cây ngó vào năm

1976, sau đó tiếp tục được xây dựng ở thuốc lá, cỏ gan gà lúa Hệ gen lục lạp chứa trung bình khoảng 120 kb đủ để mã hoá cho 120 gen Về cơ bản hệ gen lục lạp hoạt động một cách riêng biệt và có chứa ADN Tiêng Các LpADN này mang các thông tin di truyền mã hoá cho việc tổng hợp các protein riêng của mình

Thìn chung các nghiên cứu chỉ tiết về mặt cấu trúc cũng như chức nàng hoạt động và biểu hiện của hệ gen lục lạp (đặc biệt là ở thuốc lá) đã được tìm hiểu khá ti mỉ và cho đến nay đã có nhiều tác giả công bố về thành rựu này

142 Nuôi cấy và dung hop tế bào trần (protoplast)

Protoplast là phản nằm trong thành tế bào có khả năng co nguyên sinh và

có thể tách rời khỏi thành tế bào bằng phương pháp cơ học hoặc enzym học (Cooking 1972 1960) Protoplast được bao bọc bởi màng nguyên sinh nó có thể tái tạo lại thành tế bào mới và phân chia Protoplast có thể được tách từ nhiều bộ phận, cơ quan của cây Nhờ có những đặc điểm khá đặc biệt mà protoplast đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu chọn dòng tế bào thực vật, dung hop protoplast, bién nạp di truyền

Bắt đầu từ những nghiên cứu tạo ra cây thuốc lá hoàn chỉnh đầu tiên từ Protolast cla Takebe (1971) cho đến nay nhiều loài thực vật (cả cây một lá mầm và hai lá mầm) đã được tạo ra từ việc tách và nuôi cấy protoplast

Phương pháp dung hợp protoplast thường được sử dụng rộng rãi hiện nay

là phương pháp của Kao và Mixchaylux (1974) Nhờ kỹ thuật dung hợp, người

ta có thé tao ra những tổ hợp lai xôma cũng như lai tế bào chất bất kỳ theo ý muến Nhiêu cây lai xôma đã được tạo ra ở các cây trồng có ý nghĩa kinh tế như khoai tây, cà chua lúa

1.3 Cải biến di truyền lục lạp

Chọn lọc đột biến lục lap trong điểu kiện í vo những tính kháng kháng sinh, kháng chất diệt cô ở một số đối tượng thuộc họ cà (Solanaceae)

đã được nhiều tác giả thông báo Điều này có ý nghĩa rất lớn trong biến đổi di truyền lục lạp Hơn nữa nhiều đặc điểm đi truyền có lợi được mã hoá bởi gen

lục lạp, do đó tìm hiểu và nghiên cứu đột biến lục lạp sẽ giúp cho chúng ta sử dụng có hiệu trong nghiên cứu cơ bản cũng như cải tạo giống cây trồng

Trên cơ sở kỹ thuật dung hợp protoplasL nhiều nhà nghiên cứu đã tiến hành chuyển lục lạp nguyên vẹn hoặc chuyển lục lạp bằng tái t6 hop LpADN

để tạo ra những cây lai tế bào chất mang các kiểu gen lục lạp khác nhau Đặc biệt việc tạo cây lai tế bào chất mang LpADN tái tổ hợp đã mang một ý nghĩa rất lớn, góp phần khắc phục được tính bất hợp giữa hệ gen nhân và hệ gen lục

lap ở các tổ hợp lai xa về mặt phản loại

Bên cạnh kỹ thuật dung hợp protoplast việc sử dụng một số phương

pháp chuyển gen vào lục lạp để tạo các dòng chuyển gen mang các đoạn gen

ngoại lai trong hệ gen lục lạp của mình cũng đã được một số tác giá thông báo (O” Neill và cộng sự, 1993; Spörlein và cộng sự, 1901 ) Những phương pháp

chuyển gen đã giúp các nhà nghiên cứu có thể áp dụng tạo ra các cây chuyển

gen Tnang các gen ngoại lai quy định một số đặc tinh di truyền tế bào chất có

lợi trong một thời gian ngắn Đồng thời việc tạo ra các cây lai tế bào chất cũng như cây chuyển gen mang các kiểu gen lục lạp mới sẽ góp phần cải biến một

số đặc điểm di truyền lục lạp ở cây trồng

1.4 Phân tích cây dụng hợp và cây chuyển gen lục lap

Cho đến nay sau bước đầu chơn trên môi trường có tác nhân chọn lọc như kháng thuốc kháng sinh người ta đã tiếp tục nghiên cứu phán tích được số phận của các tổ hợp lục lạp cũng như các gen lục lap ngoại lai trong tế bào cây chủ nhờ một số kỹ thuật phân tử như phân tích enzym cắt giới hạn lai Southern hoặc phản ứng chuỗi polymeraza (PCR) Các kỹ thuật này đã giúp cho các nhà nghiên cứu chúng mình được chính xác hơn sự có mặt của các

gen ngoại lai, đồng thời ầm hiểu kha năng hợp nhất và hoạt động của chúng trong hệ gen của cây chủ

Tóm lại trên cơ sở những những phân tích của phần tổng quan, chúng tôi

đã đặt ra mục tiêu và nội dung nghiên cứu phù hợp để góp phản cải biến di truyền tế bào chất (chủ yếu ở lục lạp) ở thuốc lá (là đại diện điển hình của cây

họ cà) nhằm phục vụ cho nghiên cứu và đặt cơ sở áp dụng trong cải tạo cây trồng

Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp

2.1 Nguyên liệu

- Loài Solanum nigrum (S nigrum) mang d6t biến lục lạp kháng cả hai

loại streptomycin vA spectinomycin

- Loai N plumbaginifolia man cam v6i streptomycin va spectinomycin

- Dong Pertit havana (PH) (thuộc loài N rabacum) có mầu xanh bình thường mẫn cảm với streptomycin và spectinomycin

- Dong Turkish samsun (thuộc loài N tabacum) bình thường

- Dòng §#A/5 (thuộc loài M /bacum) bị bạch: tang do đột biến lục lap,

chi phát triển ở nơi thiếu ánh sáng trong điều kién in vitro

- Dòng 57 (thuộc loài M /abacwm) bị đột biến lục lạp, mẫn cảm với ánh

sáng chi phát triển trong điều kién in vitro

- Các dòng LS.SalT.2, LS.SalI.3, LS.Sal3.!, là những dòng ! $7 chứa lục

lạp của Salpiglosis sinuata (S sinuata), c6 lá xanh bình thường

- Hai dong LS.tub/ va LS.tub3, 1a hai dong LSJ chita LpADN tai tổ hợp cua LS} va Solanum tuberosum (S tuberosum), cé 14 xanh binh thường

- Plasmid pSSH! mang doan LpADN cta S nigrum chita hai gen khéng streptomycin và spectinomycin và được thiết kế phù hợp cho chuyển gen vào

lục lạp

- Hai mồi (primer) CPS và CPC được tổng hợp tại viện Cóng nghệ Sinh học dựa trên thiết kế của Dr Kavanagh A.T thuộc khoa Di truyền trường

téng hop Dublin II, Ireland Hai mỗi này được sử dụng đặc hiệu cho nghiên cứu hệ gen lục lạp của S nigrum

2.2 Phuong pháp nghiên cứu

2.2.1 Tách protoplast

Protoplast tách từ phiến lá của các cây trong điểu kiện vô trùng theo

Menczel va cong su, 1981

2.2.2 Tao cay lai t& bao chat (TBC) bang dung hop

- Dung hợp protoplast tiến hành theo Kao và Michaylux (1974) được Menczel và cộng sự cải tiến năm 198]

- Tach chọn sản phẩm dung hợp và tái sinh cây được tiến hành tương tự như mô tả của Nguyễn Đức Thành ,1989

- Lục lạp được tách theo Bookjans và cộng sự, 1984, và LpADN được tách làm sạch theo quy trình của Sambrook và cộng sự, 1989,

- LpADN duoc phan tích bằng cách sử dụng các enzym cất giới hạn Các doạn LpADN sau khi cắt được phân lập trên điện di bản mỏng (0.5 % agaroza) với dòng điện 80 mA, sau đó nhuộm với ethidium bromide và quan sát, chụp ảnh dưới ánh sáng của tia cực tím

2.2.3 Phương pháp chuyển gen (biến nạp) trực tiếp vào protoplast

nhờ xt ly voi polyethylen glycol (PEG)

- Tach va lam sach plasmid pSSH1 theo phuong phdp cia Sambrook và cộng sự, 1989

- Chuyển gen vào protoplast, nuôi cấy và chọn lọc sản phẩm được thực

hiện theo như mô tả của O` Neill và cộng sự, 1993

- Phân tích LpADN của cây chuyển gen bằng kỹ thuật phản ứng chuỗi

polymeraza (PCR) Sản phẩm PCR được quan sát trên điện di đồ sau khi chạy điện đi trên gel agaroza (1%)

2.2.4 Kiểm tra tính kháng kháng sinh

Tính kháng kháng sinh của những cây dung hợp và cây chuyển gen được kiểm tra bằng phương pháp thử mảnh lá và thử khả năng nảy mầm của hạt trên moi trường chọn lọc như đã được mô tá bởi Nguyễn Đức Thành (1989)

2.2.6 Phương pháp phần tích nhiễm sắc thể (NST)

Nhiễm sắc thể được quan sất ở giai đoạn trung kỳ trong những tế bào đỉnh sinh trưởng và được đếm và chụp ảnh trên kính hiển vi Olympus (Nhat Bản) với độ phóng đại 1500 lần

2.2.7 Phương pháp xác định hàm lượng Hicotin

Nicotin được tách từ lá của các dòng có cùng độ tuổi và hàm lượng nico-

tin được xác định theo phương pháp của Willits và cộng sự năm 1950

2.2.8 Phương pháp xác định hàm lượng chlorophyll

Chlorophyll được tách từ lá thứ bốn (tính từ ngọn trở xuống) của các đồng có cùng độ tuổi (45 ngày), được nuôi dưỡng trong điều kiện ánh sáng nhu nhau (2500 lux, 25°C) Ham luong chlorophyll trong mau được xác định theo Lichtenthaler năm 1987

2.2.9 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử

Hàm lượng đường khử trong mẫu lá được tách và xác định theo phương pháp khử và chuẩn độ của Bertran (được mê tả bởi Tret’jacova, 1982)

2.2.10 Phuong pháp xác định hàm lượng protein tổng số

Hàm lượng protein tổng số trong lá được xác địh theo nguyên lý của phương pháp Kjeldhal, tiến hành trên máy Tecator (Thụy Điển) tại phòng phân tích Viện Kinh tế kỹ thuật thuốc lá

Các số liệu thí nghiệm được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học Sai số của trung binh mau va t - test (simple sample test) được tính toán bằng chương trình WINKSVER.4.I.c trên máy vi tính

Chương 3: Kết quả và thảo luận

3.1 Chuyển lục lap bang dung hop protoplast

3.1.1 Tạo và chọn dòng lai TBC

Đề tiến hành các thí nghiệm dung hợp protoplast nhằm mục đích chuyển lục lạp giữa các loài cây khác họ phụ, chúng tôi đã sử dụng cây S nigrum (mang đột biến lục lạp kháng streptomycin và spectinomycin) đã bị chiếu xạ giết nhân bằng Co'° để dùng lim cay cho luc lap, cay N tabacum 1 cay nhận luc lap (man cam véi streptomycin va spectinomycin)

Sau 6 đến 7 tuần nuôi sản phẩm dung hợp và chọn lọc trên môi trường có chứa Ig/l spectinomycin, chúng tôi đã nhận được 13 cụm tế bào (colonies) phát triển tốt có màu xanh từ 6,8 x10* cum tế bào dung hợp Các mô này được tiêp tục chọn lọc trên các môi trường có chứa streptomycin và có đồng thời cả hai loaj streptomycin va spectinomycin Kết quả được trình bày trong bảng 1

Bảng 1: Kết quả tạo các cụm té bào kháng thuốc bằng

dung hop protoplast

Protaplast | Protoplast | Tổng sế Kháng Kháng Kháng spectino-

cho nhân ene ho TBC Spectinom | streptomy | mycin và strep- ycin (1 g/l) | cin (ig/l) P repromy | my! tomycin sme

3.1.2 Một số đặc điểm hình thái, di truyền và số lượng

nhiễm sắc thé (NST) cia cde dong lai tế bào chất Trong thí nghiệm này, các cây lai (còn gọi là dòng lai) tái sinh rừ các mô tương ứng được gọi là thế hệ Rạ, hạt của Rạ nảy mầm sẽ tạo thành thế hệ R, Mỗi một dồng mô chúng tôi chỉ chọn một chối tái sinh cây và gọi là một dòng

lai Như vậy chúng tói đã tái sinh được 9 dòng lai Các dòng lai này đã được

nhân ra trong điều kiện ¡¡ wiro để theo dõi hình thái lá, khả năng phát triển và

tiến hành đếm số lượng nhiễm sắc thể của chúng Một số cây được trồng ra

nhà kính để theo dõi khả nang ra hoa kết quả và thu nhận hạt để kiểm tra tính

kháng kháng sinh của chúng qua 3 thế hệ Ry R,, Ry Kết quả theo đõi về hình

thái lá và số lượng nhiễm sắc thể được trình bày ở bảng 2

Bảng 2: Đặc điểm hình thái lá và số lượng NST ở những dòng

“lai TBC giita S nigrum (SNig) và N tabacum (PH) nuôi cáy in vitro

Snig + PH-4.1 Không bình thường 2n=72

Qua bảng 2 chúng ta thấy có 5 dòng lai hoàn toàn giống với cây N

tabacum binh thường cả về hình thái cũng như số lượng NST (2n=48) Tuy

nhiên có 4 dòng có hình thái lá và số lượng NST không bình thường (2n=72) Theo chúng tôi, hiện tượng này có thể là do ảnh hưởng của quá trình tự đa bội hoá gây ra trong nuôi cấy mô tế bào, Quan sát và theo dõi quá trình sinh trưởng và phát triển cũng như thời gian ra hoa kết quả của 5 đồng lai bình thường ngoài nhà lưới, chúng tôi thấy chúng hoàn toàn tương tự với cây đối chứng (hình 1) Bon dong còn lại mặc dù có phát triển và ra hoa nhưng khả năng tạo hạt rất kém

3.1.3 Nghiên cứu đặc điểm di truyén luc lap kháng spectinomycin va

streptomycin cua cdc dong lai té bao chat

Trong nghiên cứu này, hai phương pháp thử mảnh lá và thử khả năng nảy

mầm của hạt trên mỏi trường chọn lọc đã được chúng tôi sử dụng để kiểm tra

tính kháng kháng sinh của những dòng lai TBC kháng đồng thời với ca hai loai khang sinh (S.nig + PH-1.1, S.nig + PH-2.1 S.nig + PH-45)

Kết quả thử mảnh lá (ở 3 thế hệ Rạ, R,, R;) trên mói trường chọn lọc (có

cả hai loại kháng sinh) đã cho thấy rừ những mảnh lá của cây lai TBC xuất hiện những chổi nhỏ có mầu xanh còn các mảnh lá của cây đối chứng không tạo chổi, chuyển màu trắng xám và bị chết

Hình 1: Cây lai TBC giữa

S nigrum và N tabacwm (1) và

cây N tabacum bình thường (2)

Kết quả kiểm tra khả năng nảy mầm của hạt (ở 3 thế hé Ro, Rj Ry) trén

môi trường chọn lọc được trình bày ở bảng 3 Kết quả cho thấy hạt ở thế hệ R„

có một số hạt nảy mầm màu xanh một số hạt nảy mám bị bạch tạng Điều này

có thể đã có sự phan ly trong quá trình phân chia tế bào Đối với hạt R, và R; hoàn toàn nảy mầm có màu xanh, chứng tỏ đã có sự ổn định nhất định tính

kháng thuốc kháng sinh trong thế sau Để có kết luận chỉ tiết hơn, theo chúng

10

tôi cần phải có những nghiên cứu tiếp theo (đặc biệt là những phân tích về sinh học phân tử) Các hạt khóng nảy mảm có thể là đo bị lép hoặc chưa già Đảng 3: Khẩ năng nảy mầm của hạt các đồng lai TBC và đổi chứng

trên môi trường chọn lọc

i Hat cua R,

PH (đối chứng) 500 0 (0%) 410 (82%) 90 (18%) Snig + PH-4.5 500 317 (63.4%) 48 (9.6%) 135 (27%) Snig + PH-1.] 500 292 (58,4%) 57 (11.4%) |151 (30/25) Snig + PH-2.] 500 279 (55.8%) | 102 (20.4%) | 119 (23.8%)

2 Hat cia R,

PH (đốt chứng) 500 0 (0%) 471 (942%) |29 (5,8%) Snig + PH-4.5 500 463 (926%) 0 (0%) 37 (74) Snig + PH-I.] 500 452 (90.4%) 0 (0%) 48 (9,6%) Snig + PH-2.} 500 439 (87.8%) 0 (0%) 61 (12.2%)

3 Hạt của R;

PH (đối chứng) 500 0 (0%) 464 (92.8%) | 36 (7.2%)

Snig + PH-I.] 500 446 (89,2%) 0 (0%) 34 (10,8%) Snig + PH-2.] 500 443 (88.6% 0 (0%) 357 (114%)

Những kết quả nhận được từ thí nghiệm kiểm tra mảnh lá và khả năng nảy mắm của hạt trên mới trường chọn lọc đã chứng tỏ những cây lai tế bào chất đã mang đặc điểm lục lạp (kháng streptomycin và spectinomycin) ngoai

lai ổn định

3.1.4 Phản tích LDADN ở một số đòng lai TRC bằng enzym

cắt giới hạn

Trong thí nghiệm này chúng tôi đã sử dụng 3 loại enzym cắt giới hạn là

Sail, PVull va Smal dé phan tích LDADN của 3 dong lai TBC kháng với cả hai loại kháng sinh và các dòng dùng trong dung hợp

Kết quả so sánh điện đi để LpADN của các dòng lai với điện di đồ LpADN cia S nigrum va N tabacum cho thay c6 su kbéc phau Khi cat với enzym Smal cdc đoạn cắt giới hạn (băng) của các dòng lai giống với các băng của cay N tabacum So sánh mẫu điện di đồ LpADN của các dòng lai với bố

11