Nghiên cứu đánh giá đặc điểm nông sinh học của các dòng cà chua chống chịu bệnh sương mai chọn tạo bằng chỉ thị phân tử

ĐẠI HỌC THÁI NGUYấN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NễNG LÂM NGUYễN THị ĐàO Tờn đề tài: Nghiên cứu đánh giá đặc điểm nông sinh học của các dòng cà chua chống chịu bệnh sương mai chọn tạo bằng chỉ thị

ĐẠI HỌC THÁI NGUYấN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NễNG LÂM

NGUYễN THị ĐàO

Tờn đề tài:

Nghiên cứu đánh giá đặc điểm nông sinh học của các dòng cà chua chống chịu bệnh sương mai chọn tạo bằng chỉ thị phân tử

KhóA LUậN TốT NGHIệP ĐạI HọC

Hệ đào tạo : Chớnh quy Chuyờn ngành : Cụng nghệ sinh học

Khoa : CNSH-CNTP Khoỏ học : 2010-2014 Giảng viờn hướng dẫn: TS Trần Ngọc Hựng

Bộ mụn CNSH Viện nghiờn cứu Rau Quả

TS Nguyễn Văn Duy

Khoa CNSH-CNTP, trường Đại học Nụng Lõm Thỏi Nguyờn

Thỏi Nguyờn, năm 2014

LỜI CẢM ƠN

Trước hết,em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ts.Trần Ngọc Trưởng bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Nghiên cứu Rau Quả Việt Nam đã tận tình giúp đở em trong suốt thời gian thực tập và TS Nguyễn Văn Duy- Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình hướng dẫn và tạo điều kiện cho em trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận

Hùng-Em xin cảm ơn tất cả các cán bộ,công nhân viên chức và các nhà nghiên cứu sinh làm việc tại phòng thí nghiêm của bộ môn Công nghệ Sinh học , Viện Nghiên cứu Rau Quả Việt Nam đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ và động viên em trong suốt thời gian thực tập vừa qua

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn của mình đến tập thể thầy cô trong khoa Công nghệ Sinh học Thầy cô đã tận tình giảng dạy, giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu

Cuối cùng, em xin gửi tới người thân cùng bạn bè, những người đã luôn quan tâm ủng hộ và là chỗ dựa cho em trong suốt thời gian em làm khóa luận này, cũng như trong cuộc sống

Xin trân trọng cám ơn!

Thái Nguyên, tháng 6 năm 2014

Sinh viên

DANH MỤC CÁC BẢNG

trang

Bảng 1 Diện tích và sản lượng cà chua trên thế giới (1000ha – tấn)[17] 4

Bảng 2: Diện tích, năng suất và sản lượng cà chua của các châu lục trên thế giới năm 2011[18] 5

Bảng 3.: Những nước có sản lượng cà chua cao nhất năm 2011 [18] 6

Bảng 4: Diện tích, năng suất, sản lượng cà chua của Việt Nam từ năm 2004 đến năm 2008 [7] 7

Bảng 5: Tính kháng bệnh sương mai của các dòng cà chua 28

Bảng 6: Kiểu gene Ph3 của các dòng cà chua 32

Bảng 7: Đặc điểm quả của các dòng cà chua trong vụ đông xuân 33

Bảng 8: Một số đặc tính sinh trưởng của các dòng cà chua trong vụ đông xuân 34

Bảng 9: Khả năng đậu quả của các dòng cà chua trong vụ xuân hè 35

DANH MỤC CÁC HÌNH

trang

Hình1: Bệnh sương mai hại cà chua 10

Hình 2: Quá trình sâm nhập của nấm sương mai vào : A- Giống nhiễm bệnh, B và C giống kháng bệnh (I-V là giai đoạn nẩy mầm của bào tử động, VI- xâm nhập, VII tạo bọc bào tử) [35,36] 11

Hình 3: Hình thái bộ phận sinh sản của nấm sương mai : Bọc bào tử động (sporangia), bào tử động (zoospore), Oospore (tính từ trái qua phải) 12

Hình 4: Bản đồ liên kết các gene (QTL) liên quan đến tính kháng bệnh sương mai của cà chua: LB-1 và LB-2 – QTL kháng bệnh sương mai (Frary và cs, 1998); Ph1, Ph2, Ph3- gene kháng bệnh sương mai[38] 14

Hình 5 Mối quan hệ giữa các chi trong loài Solanum [35] 15

Hình 6 Biểu hiện của (A) chỉ thị đồng trội, (B) chỉ thị trội (P1, P2 – bố mẹ, F1 = P1 x P2)[47] 17

Hình 7 : Vị trí của gene Ph3 trong bản đồ chỉ thị phân tử RFLP tại cánh tay dài của nhiễm sắc thể số 9 [38] 19

Hình 8 : Ảnh điện di của chỉ thị SCAR phát triển từ chỉ thị AFLP (L87) [46] 19

Hình 9: Bản đồ liên kết gene kháng bệnh sương mai và chỉ thị phân tử TOM236 trên nhiễm sắc thể số 9 của cà chua [43] 20

Hình 10: Quá trình phân lập nấm sương mai 23

Hình 11 : Phương pháp lây bệnh sương mai nhân tạo 24

Hình 12: Kiểm tra DNA chiết từ lá cà chua 25

Hình13: Đánh giá tính kháng bệnh sương mai bằng phương pháp lây bệnh trên lá tách rời 29

Hình14 : Ảnh điện di trên gel agarose các mẫu giống cà chua 30

DANH MỤC CÁC TỪ,THUẬT NGỮ VIẾT TẮT

Từ, thuật ngữ viết tắt Nghĩa đầy đủ của các từ thuật ngữ viết tắt

SCAR Sequence- Characterized Amplified Region

MỤC LỤC

trang

Phần 1: MỞ ĐẦU 1

1.1.Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 3

1.3 Yêu cầu của đề tài 3

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 3

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 3

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 3

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1.Tình hình sản xuất cà chua trong giai đoạn hiện nay 4

2.1.1.Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới 4

2.1.2 Ở Việt Nam 6

2.2 Bệnh sương mai hại cà chua 9

2.3 Chọn tạo giống cà chua chống chịu bệnh sương mai 12

2.4.Lập bản đồ và chọn giống bằng chỉ thị phân tử 16

2.5 Chỉ thị phân tử trong chọn giống chống chịu bệnh sương mai 18

2.6 Chọn tạo giống cà chua kháng bệnh sương mai bằng chỉ thị phân tử tại Việt nam 20

Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Mẫu dòng/giống cà chua 22

3.2.Nấm bệnh sương mai 22

3.3 Đánh giá tính kháng bệnh sương mai 23

3.4.Xác định kiểu allele gene Ph3 của mẫu giống cà chua 25

3.4.1 Ly chích DNA 25

3.4.2.Xác định kiểu allele của gene Ph3 25

3.5 Khảo sát chọn lọc dòng có tính trạng nông học (năng suất, chất lượng )

tốt 26

Phần 4: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 28

4.1.Đánh giá tính kháng bệnh của các mẫu dòng giống cà chua 28

4.2 Xác định kiểu gene Ph3 của các dòng cà chua bằng chỉ thị phân tử 30

4.3.Đặc điểm nông sinh học các dòng cà chua trong vụ đông xuân 33

4.4.Đặc điểm nông sinh học các dòng cà chua vụ xuân hè 35

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 37

5.1 Kết luận 37

5.2 Kiến nghị 37

TÀI LIỆU THAM KHẢO 38

Phần 1

MỞ ĐẦU 1.1.Đặt vấn đề

Cà chua (Solanum lycopersicum L.) thuộc họ cà (Solanaceae) cùng với

các cây: thuốc lá, khoai tây, ớt, cà tím… có nguồn gốc ở miền Trung, Nam

Mỹ và Nam bắc Mỹ Ngày nay cà chua đã được sản xuất ở hầu hết các nước trên toàn thế giới với hàng nghìn giống khác nhau, đa dạng về mầu sắc, dạng quả, dạng hình sinh trưởng…Cà chua được sử dụng dưới nhiều hình thức khác nhau như ăn tươi, làm Salat, nước uống Sản phẩm chế biến cũng có nhiều dạng như đóng hộp quả bóc vỏ, cô đặc, nước sốt cà chua, mứt cà chua

Cà chua là loại rau có giá trị dinh dưỡng cao, chứa nhiều glucid, axit hữu cơ,

và là nguồn cung cấp chất chống ô xy hóa quan trọng như Lycopen, Phenolic, Vitamin C.[2]

Chọn tạo giống cà chua được bắt đầu thực hiện ở châu Âu (Italia) khoảng 200 năm trước Ở Mỹ chọn tạo giống cà chua được thực hiện vào những năm 70 của thể kỷ 19 [21],[22] Nhờ chọn giống đã đưa năng suất của

cà chua ở Mỹ tăng từ 10,1 tấn/ha trong những năm 20 của thế kỷ 20 đến 72,4 tấn trong những năm 90 và đến năm 2004 là 102 tấn/ha [13]

Mặc dù chọn tạo giống cà chua theo phương pháp truyền thống đã mang lại thành tựu to lớn nhưng cần nhiều thời gian Công nghệ chỉ thị phân

tử trong chọn tạo giống giúp xác định chính xác gene cần chọn và rút ngắn quá trình tạo giống Cà chua là một trong những cây trồng đầu tiên được ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn giống[23],[24] Từ những năm 1980, chỉ thị phân tử đã được sử dụng như công cụ cơ bản trong chọn tạo giống cà chua Đến nay khoảng 40 gene liên quan đến tính kháng bệnh chính đã được lập trên bản đồ phân tử của cà chua [ 19],[20] Công nghệ chỉ thị phân tử DNA đã được sử dụng trong các chương trình tạo giống cà chua thương mại từ những năm 90[25]

Bệnh sương mai (late blight) gây hại bởi nấm Phytophthora infestans

là một trong những bệnh gây hại hủy diệt ở hầu hết các vùng cà chua và khoai tây trên toàn thế giới[4] Bệnh có thể hại trong mọi thời gian sinh trưởng của

cây [21] Nấm bệnh hại nhiều bộ phận của cà chua: thân, lá, quả và hạt [11],[12] Bệnh có thể tiền ẩn trong đất, hạt giống, và phát tán được trong không khí Ở nước ta, vụ đông xuân là thời kỳ hội tụ nhiều yếu tố môi trường (nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng ) rất thuận lợi cho bệnh sương mai phát triển Bệnh gây hại nghiêm trọng và có ảnh hưởng lớn tới năng suất (giảm 60- 70%)

và phẩm chất trên cà chua, khoai tây ở một số vùng Hà Nội, Hải Phòng, Lào Cai, Đà Lạt [10] Bệnh nặng từ tháng 1 – tháng 3 ở đồng bằng Bắc bộ và trong mùa mưa ở các vùng cao có khí hậu ôn hòa: Mộc châu- Sơn la, Sapa- Lào cai, Đà lạt –Lâm đồng Để hạn chế bệnh, kỹ thuật phổ biến nhất đang được nông dân áp dụng là phun thuốc trừ bệnh với 13-15 lần phun/ vụ cà chua Tuy nhiên, hiệu quả phun thuốc hóa học rất hạn chế do nhiều mẫu nấm sương mai có khả năng kháng metalaxyl, hoạt chất chính trong các thuốc trị bệnh sương mai.Với đặc thù này sản xuất cà chua luôn tiềm ẩn tính thiếu ổn định và nguy cơ không an toàn vệ sinh thực phẩm cao [3]

Những năm qua, trong nhiều chương trình, dự án chọn tạo giống rau, các cơ quan thuộc Bộ Nông nghiệp & PTNT, trường đại học của Việt nam đã đưa ra một số giống cà chua mới vào sản xuất Giống cà chua phục vụ chế biến PT18 (Viện nghiên cứu rau quả), Giống C95, VT3 ( Viện cây lương thực

& cây thực phẩm), các giống cà chua lai F1 : FM 20, FM29, lai số 4, lai số 9 (Viện nghiên cứu rau quả), HT21, HT144 (trường đại học nông nghiệp Hà nội) So với các giống cà chua truyền thống ( cà chua Ba lan, cà chua Pháp,

cà chua Hồng lan ) các giống mới tạo ra thể hiện vượt trội về năng suất và chất lượng Các giống mới được chọn tạo đều áp dụng công nghệ truyền thống (conventional breeding) và chỉ chú ý đến biển hiện năng suất, chất lượng quả và tính chống chịu bệnh đồng ruộng [9]

Trước thực trạng trên, Viện nghiên cứu đã thực hiện chương trình tạo giống cà chua chống chịu bệnh sương mai bằng chỉ thị từ năm 2009 Qua đó, một số dòng cà chua đã được tạo ra Để tiếp tục chương trình chọn giống này,

chúng tôi xin được thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đánh giá đặc điểm nông sinh học của các dòng cà chua chống chịu bệnh sương mai chọn tạo bằng chỉ thị phân tử”

1.2 Mục đích nghiên cứu

Xác định được các dòng cà chua mang gene Ph3 đồng hợp tử, chống

chịu bệnh sương mai, và thích hợp mùa vụ cụ thể (đông xuân hoặc xuân hè)

1.3 Yêu cầu của đề tài

Để đạt mục đích trên, đề tài có các yêu cầu sau:

-Nghiên cứu kiểu gene và kiểu hình liên quan đến tính kháng bệnh sương mai của các dòng cà chua

-Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học trong mùa vụ cụ thể của các dòng

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1.Tình hình sản xuất cà chua trong giai đoạn hiện nay

2.1.1.Tình hình sản xuất cà chua trên thế giới

Trong 3 năm liên tiếp 2006-2008 diện tích trồng cà chua trên thế giới liên tục tăng từ 4,6 triệu ha lên 5,2 triệu ha nhưng sản lượng ổn định khoảng

130 triệu tấn, điều đó chứng tỏ rằng năng suất cà chua trong thời gian trên không tăng, nguyên nhân của hiện tượng này có thể do các yếu tố thời tiết bất thuận hoặc do dịch bệnh Châu Á là châu lục có diện tích và sản lượng cà chua lớn nhất (trên 60% của thế giới) (FAO) (Bảng 1) [2]

Bảng 1 Diện tích và sản lượng cà chua trên thế giới (1000ha – tấn)[17]

Châu lục

Diện tích

Sản lượng

Diện tích Sản

lượng

Diện tích Sản

Italia, Thổ Nhĩ Kỳ, Cuba (60-70kg/ người/năm), Hàn Quốc, Nhật bản chỉ tiêu thụ 9-10kg/người/năm.[3]

Theo Tổ chức Nông Lương Thế giới (FAO), năm 1999, trên thế giới có

158 nước trồng cà chua với diện tích 4.100.264 ha Cũng theo FAO, diện tích sản lượng năng xuất của cà chua năm 2009 trên thế giới như sau[17] :

Theo FAO, 2009: Diện tích: 4.544.525 (ha)

Năng suất: 339.719 (Hg/ha)

Sản lượng (tấn)

Khoảng 150 triệu tấn cà chua đã được sản xuất trên thế giới trong năm

2009 Trung Quốc là nước sản xuất cà chua lớn nhất, chiếm khoảng một phần

tư sản lượng toàn cầu, tiếp theo là Hoa Kỳ và Ấn Độ Các khu vực chế biến tại California chiếm 90% lượng sản xuất ở Mỹ và 35% lượng sản xuất thế giới Trung Quốc vẫn đứng đầu về sản xuất cà chua trong những năm tiếp theo Dưới đây là năm quốc gia có sản lượng cà chua cao nhất trong năm

2011 [18]

Bảng 3.: Những nước có sản lượng cà chua cao nhất năm 2011 [18]

STT Tên nước Sản lượng (tấn)

Cà chua là một trong những loại rau cho hiệu quả kinh tế cao và là mặt hàng xuất khẩu của nhiều nước trên thế giới Lượng cà chua trao đổi trên thị trường thế giới năm 1999 là 30,7 triệu tấn, trong đó cà chua ăn tươi chỉ từ 5-7% Từ năm 2003 đến năm 2007 khối lượng cà chua xuất khẩu trên thế giới tăng 30% Mexico là nước đứng đầu trong xuất khẩu cà chua, năm 2007 khối lượng xuất khẩu của nước này đạt 1,1 triệu tấn, chiếm hơn 50% khối lượng xuất khẩu trên toàn thế giới

2.1.2 Ở Việt Nam

Ở Việt Nam, cây cà chua được xếp vào các loại rau có giá trị kinh tế cao, diện tích trồng cà chua lên đến chục ngàn ha, tập trung chủ yếu ở đồng bằng và trung du phía Bắc Hiện nay có một số giống chịu nhiệt mới lai tạo chọn lọc có thể trồng tại miền Trung, Tây Nguyên và Nam Bộ nên diện tích ngày càng được mở rộng Nhiều giống cà chua lai ghép chất lượng tốt được phát triển mạnh ở Đà Lạt, Lâm Đồng Một số giống cà chua chất lượng đã được xuất khẩu ra thị trường thế giới Cà chua là cây du nhập vào Việt Nam mới được hơn 100 năm nhưng đã trở thành một loại rau phổ biến và được sử dụng ngày càng rộng rãi Cà chua ở nước ta được trồng chủ yếu vào vụ đông với diện tích khoảng 6800-7300 ha và thường tập chung ở các tỉnh thuộc đồng

bằng và trung du Bắc Bộ ( Hà Nội, Hải Dương, Vĩnh Phúc…), còn ở miền Nam tập trung ở các tỉnh An Giang, Tiền Giang, Lâm Đồng [1]

Trong điều tra của TS Phạm Đồng Quảng và cs, hiện nay cả nước có khoảng 115 giống cà chua được gieo trồng, trong đó có 10 giống được gieo trồng với diện tích lớn 6259 ha, chiếm 55% diện tích cả nước Giống M386 được trồng nhiều nhất khoảng 1432 ha, tiếp theo là các giống cà chua pháp, VL200, TN002, Red Crown [6], [5]

Diện tích trồng trọt cà chua không ngừng được tăng lên, đặc biệt từ năm 1996 đến năm 2001, diện tích trồng cà chua nước ta tăng nhanh từ 7500

ha lên 17,834 ha nhưng năng suất lại không ổn định Hiện tại diện tích trồng

cà chua của Việt Nam dao động từ 20-26 nghìn ha nhưng năng suất vẫn còn quá thấp, so với năng suất trung bình trên thế giới thì năng suất cà chua của Việt Nam chỉ đạt khoảng 60-65% [7],[ 1]

Năng xuất cà chua nước ta trong những năm gần đây tăng lên đáng kể Năm 2008, năng xuất cà chua của cả nước là 216 tạ/ha bằng 87,1% năng suất trên thế giới (247,996 tạ/ha) Vì vậy sản lượng cả nước đã tăng rõ rệt (từ

Theo thống kê diện tích trồng cà chua của Việt nam năm 2010 là 21784

ha, năm 2011 là 23083 ha với sản lượng tương ứng là 550.000 tấn và 590.000 tấn, đạt năng suất bình quân trên 25 tấn/ha Nhìn tổng thể theo các miền của đất nước, các tỉnh phía Bắc có diện tích cà chua lớn nhất (khoảng 9000 ha ~

10000 ha), tiếp đến là các tỉnh miền Trung (7000 ha ~ 8000 ha), các tỉnh phía Nam chỉ đạt 4000 ~ 5000ha Nếu xét theo vùng sinh thái thì Đồng bằng sông Hồng và khu vực Tây Nguyên có diện tích trồng cà chua lớn nhất, mỗi vùng đạt trên 7000ha/ năm Các tỉnh có diện tích trồng cà chua đạt trên 1000ha/ năm là Hà Nội, Hải Dương, Hải Phòng, Nam định, đặc biệt riêng Lâm đồng đạt khoảng 6000ha/năm, đây cũng là tỉnh đạt năng suất cà chua cao nhất cả nước (41,9 tấn/ha – năm 2011)

Mặc dù liên tục tăng trong nhiều năm qua (1996 đạt 15,74 tấn/ha, năm

2005 đạt 19,78 tấn/ha và hiện nay là trên 25 tấn/ha) nhưng năng suất cà chua của Việt nam còn thấp dưới ngưỡng trung bình của thế giới Về cơ bản sản xuất cà chua của nước ta chỉ cung cấp tiêu dùng nội địa, vào một số thời điểm còn nhập khẩu từ Trung Quốc Mỗi năm một lượng nhỏ cà chua (khoảng vài ngàn tấn) được các công ty (công ty Hội Vũ, công ty cổ phần chế biến thực phẩm chất lượng cao Hải Hưng ) chế biến xuất khẩu [9]

Năm 2011 công ty Syngenta đã điều tra 600 nông hộ sản xuất cà chua ở

cả 3 miền (bắc, trung, nam) về chi phí vật tư cho thấy khoảng 30% chi phí giành cho thuốc sâu bệnh (trong đó thuốc trừ bệnh chiếm 2/3), mức chi này tương đương với tiền mua phân bón Điều đó phản ánh mức độ nguy hiểm của dịch bệnh đang diễn ra ở các vùng sản xuất cà chua của nước ta

Nhiệt độ thích hợp nhất để cà chua sinh trưởng là 22-240C nên ở các tỉnh phía Bắc của nước ta cà chua được trồng trong 3 vụ: [8]

-Vụ sớm: gieo hạt cuối tháng 7, đầu tháng 8, trồng cuối tháng 8 – đầu tháng

9 Vụ này cà chua được trồng trên đất cao, thoát nước tốt, với các giống có đặc điểm chính là chịu nhiệt và chống chịu bệnh xoăn vàng lá do virut gây ra

-Vụ chính: Gieo hạt đầu tháng 9 đến đầu tháng 10, trồng đầu tháng 10 đến đầu tháng 11 Vụ này có diện tích lớn và có tiềm năng mở rộng trên đất sau thu hoạch lúa mùa sớm Cà chua trong vụ này đạt năng suất và chất lượng

cao nhất Nhiều giống thích hợp trồng trong vụ chính Vào giai đoạn thu hoạch ( tháng 1- tháng 2) thường bị bệnh sương mai hại nặng

-Vụ muộn: gieo hạt tháng 11 đến giữa tháng 12, trồng tháng 12 đến cuối tháng 1 Trong vụ này, giai đoạn đầu vụ rất thích hợp cho bệnh sương mai phát triển

-Vụ xuân hè: Gieo hạt đầu tháng 2, trồng cuối tháng 2 đến đầu tháng 3 Bệnh sương mai có thể xuất hiện ở đầu vụ, cuối vụ thường bị bệnh xoăn vàng

lá Giống trồng trong vụ này có khả năng chịu nhiệt tốt sẽ cho năng suất cao

Ở các vùng cao nguyên, khí hậu mát mẻ quanh năm (Sapa, Đà lạt, Mộc châu ) cà chua có thể trồng trong nhiều thời vụ, nhưng trong mùa mưa rất dễ

bị bệnh sương mai

2.2 Bệnh sương mai hại cà chua

Bệnh sương mai (late blight) gây hại bởi nấm Phytophthora infestans

là một trong những bệnh gây hại hủy diệt ở hầu hết các vùng cà chua và khoai tây trên toàn thế giới [16] Bệnh có thể hại trong mọi thời gian sinh trưởng của Nấm bệnh hại nhiều bộ phận của cà chua: thân, lá, quả và hạt[ 15] Bệnh

có thể tiền ẩn trong đất, hạt giống, và phát tán được trong không khí Lý do để khẳng định mức độ nguy hiểm của bệnh này là:(1) bệnh có thể hủy hoại toàn

bộ cà chua chỉ trong vài ngày khi thấy xuất hiện trên đồng ruộng; (2) nấm bệnh thường tồn tại với lượng rất thấp trên đồng ruộng do đó rất khó phát hiện, thông thường khi thấy bệnh xuất hiện là thời điểm quá muộn để phun thuốc phòng trừ, đồng thời hầu hết các isolate của nấm bệnh đều kháng thuốc Metalaxyl, loại thuốc được coi là hiệu quả nhất đối với bệnh này; (3) mỗi vết bệnh sương mai có thể sản sinh ra đến 300.000 bào tử 1 ngày làm cho bệnh phát tán rất nhanh; (4) Chu kỳ sinh sản vô tính của nấm bệnh từ khi xâm nhập vào mô ký chủ đến khi tạo thành bào tử phát tán ra môi trường chưa đến 5 ngày[26] Hiện tại bệnh này thường được dùng thuốc hóa học để phòng trừ Thời gian phun thuốc dựa vào các bản tin dự báo thời tiết[28],[29] Mặc dù đã

áp dụng biện pháp phòng trừ nghiêm ngặt nhưng thiệt hại do bệnh gây ra vẫn rất đáng kể Do thay đổi độc tính của nấm nên hiệu quả phòng trừ bằng thuốc hóa học ngày càng ít tác dụng [26],[27]

Hình1: Bệnh sương mai hại cà chua

(A- hại trên lá, B- hại trên thân, C- hại trên quả)

Về dạng giới tính, nấm sương mai được chia làm 2 loại A1 và A2 Sinh sản hữu tính chỉ xuất hiện khi có cả 2 loại giới tính Loại hình sinh sản này tạo

ra Oospore cho phép nấm tồn tại lâu trong đất dù không xuất hiện cây ký chủ,

và có thể tạo ra tính độc rất nguy hiểm [25],[31] Bệnh sương mai hại trên cả

cà chua và khoai tây Trước những năm 80, phần lớn các giống khoai tây của trồng tại Việt nam được nhập từ châu Âu, và chúng đều rất mẫn cảm với bệnh sương mai Nhưng trong nhiều năm gần đây việc giao lưu giống đặc biệt là giống khoai tây được thiết lập với Trung Quốc Giống khoai tây nhập khẩu từ Trung Quốc chiếm 99% lượng giống nhập khẩu năm 2002 [32] Tuy nhiên hệ thống kiểm dịch với củ giống khoai tây nhập khẩu hầu như không được chú ý, nên giống nhập khẩu từ Trung Quốc nhiễm rất nhiều nấm bệnh [33],[34] Nghiên cứu đầu tiên về nấm sương mai tại Việt nam được báo cáo năm

C

1967[9] Bệnh sương mai trở thành dịch hại nguy hiểm trên cà chua và khoai tây,

đã làm thất thu từ 5-50% [15] Do thiếu giống chống chịu với bệnh sương mai, nông dân thường dùng mancozeb, zineb, boocdo (Cu), metalaxyl để phòng trừ dịch bệnh Trong điều kiện mưa nhiều, ẩm độ cao, áp lực bệnh lớn nên thuốc thường được phun với liều lượng cao, tần suất lớn (5-7 ngày/lần) [15]

Le và cs (2008) đã thu thập 597 mẫu nấm sương mai trên cà chua và khoai tây của 9 tỉnh ở Việt nam cho thấy quần thể nấm sương mai ở Việt nam thuộc dạng cũ (Old population- dạng giới tính A1), nhưng tính kháng metalaxyl không đồng nhất, các mẫu phân lập ở Lâm đồng có tính kháng cao hơn

Hình 2: Quá trình sâm nhập của nấm sương mai vào : A- Giống nhiễm bệnh, B và C giống kháng bệnh (I-V là giai đoạn nẩy mầm của bào tử

động, VI- xâm nhập, VII tạo bọc bào tử) [35],[36]

Để thực hiện được quá trình xâm nhiễm, nấm sương mai cần tiếp xúc với tế bào sống của cây ký chủ Trong điều kiện ẩm độ cao, nhiệt độ thấp, bào

tử động (zoospore) sẽ nẩy mầm bắt đầu thực hiện quá trình xâm nhiễm Đôi khi quá trình xâm nhiễm có thể bắt đầu từ bọc bào tử động (sporangia) Tuy nhiên tùy thuộc tính kháng bệnh của ký chủ sẽ ảnh hưởng tới hình thành bọc bào tử động Các giống kháng bệnh sẽ không hình thành bọc bào tử động, trái lại các giống nhiễm bệnh sẽ tạo ra nhiều bọc bào tử, chúng sẽ phát tán để tiếp tục quá trình xâm nhiễm mới [35],[36] (Hình 2) Ở vùng nhiệt đới và Á nhiệt đới phát tán bệnh bằng bọc bào tử động trong không khí nguy hiểm hơn nhiều

so với dịch bệnh từ tàn dư cây trồng và ký chủ [14] Ngoài phụ thuộc vào kiểu gene của ký chủ, tính kháng bệnh sương mai còn phụ thuộc vào tuổi lá Các lá già mẫn cảm với bệnh sương mai hơn lá non, nhưng tuổi cây ảnh hưởng không rõ đến mức độ kháng bệnh [37]

Hình 3: Hình thái bộ phận sinh sản của nấm sương mai : Bọc bào tử động (sporangia), bào tử động (zoospore), Oospore (tính từ trái qua phải) 2.3 Chọn tạo giống cà chua chống chịu bệnh sương mai

Các nỗ lực tạo giống cà chua kháng bệnh sương mai đã được thực hiện

khoảng trên 50 năm trước , kết quả là xác định được 2 gene kháng Ph1 và

Ph2 [38],[39] Theo đó, gene Ph1 là gene trội có nguồn gốc từ nhóm cà chua Lycopersicon pimpinellifolium, kháng chuyên tính với chủng nấm Race 0

[40].Gene Ph1 đã được đưa vào các giống cà chua ăn tươi: New Yorker, và cà

chua chế biến: Nova

Ph2 là gene trội không hoàn toàn, cũng được tìm thấy trong nhóm cà

chua L Pimpinellifolium[ 29]Mức độ thể hiện của gene Ph2 còn bị chi phối bởi các yếu tố khác [ 42].Gene Ph2 được xác định có trong các giống cà chua

West Virginia 63, Legened, Centennial, Caline, Macline, Pieraline, Heline,

Fline, Piline, Pieralbo, Heinz 1706, Campbell 28, Flora Dade, Earlymech và Europeel [38],[41] Nghiên cứu tại trung tâm rau châu Á (AVRDC) đã phát

hiện ra trong mẫu giống L3708, thuộc nhóm L pimpinellifolium có chứa nguồn gene mới (Ph3) kháng bệnh sương mai [41] Gene Ph-3 trên nhiễm sắc thể 9 [19], kháng tốt với chủng Pi -16, trong khi đó gene Ph-1 và Ph-2 không

thể hiện tính kháng với chủng này

Tính kháng bệnh sương mai còn được tìm thấy ở mẫu cà chua dại

LA1033 (L.hirutum) [27] Tuy nhiên nhóm cà chua này có đặc điểm tự bất

hợp nên gặp khó khăn khi lai với giống cà chua trồng trọt Các gene và QTL kháng bệnh sương mai đã được lập bản đồ liên kết trên các nhiễm sắc thể khác nhau (Hình 4)

Hình 4: Bản đồ liên kết các gene (QTL) liên quan đến tính kháng bệnh sương mai của cà chua: LB-1 và LB-2 – QTL kháng bệnh sương mai

(Frary và cs, 1998); Ph1, Ph2, Ph3- gene kháng bệnh sương mai[38]

Tính kháng bệnh sương mai cũng được xác định liên quan đến một số

QTLs Dựa trên tổ hợp lai từ loài Solanum lycopersicum x Solanum

habrochaites, các QTL kháng bệnh đã được xác định trên tất cả 12 nhiễm sắc

thể Sáu QTL của BC-E (quần thể lai lại Solanum lycopersicum ) là lb1a, lb2a, lb3, lb4, lb5, lb11b và hai QTL của BC-H (quần thể lai lại với Solanum

habrochaites) là lb5ab và lb6ab đã được phát hiện QTL lb4 được lập bản đồ

trên NST số 4 gần chỉ thị TG609 với khoảng cách là 6,9 cM QTL lb5b nằm giữa TG69a và TG413 trên NST số 5, có vị trí gần nhất TG23, và QTL lb11b lập bản đồ trên NST số 11 giữa CT182 và TG147 [36,40] Mặc dù mẫu giống

thuộc loài Solanum habrochaites có tính kháng bệnh sương mai nhưng do

khác biệt di truyền rất lớn (quả chín xanh, sinh trưởng vô hạn, bất tự tương

hợp ) với Solanum lycopersicum (cà chua trồng) nên không được sử dụng trong các chương trình tạo giống (hình 5) [43] đã xác định được gene Ph4

trên nhiễm sắc thể số 2 liên quan đến tính kháng bệnh sương mai từ mẫu

giống thuộc nhóm S.pimpinellifolium

Hình 5 Mối quan hệ giữa các chi trong loài Solanum [35]

2.4.Lập bản đồ và chọn giống bằng chỉ thị phân tử

Các tính trạng được biểu hiện và di truyền theo định luật Menden đều

có thể được sử dụng như chỉ thị Tùy theo mức độ phát triển của khoa học mà khái niệm về chỉ thị ngày càng được mở rộng

Chỉ thị kiểu hình: Thời kỳ đầu, các nhà chọn giống đã sử dụng các kiểu hình liên quan với nhau và được xem như chỉ thị kiểu hình để chọn giống Sax (1923) đã xác định mối quan hệ giữa kích thước hạt và sắc tố vỏ hạt đậu rau

Phaseolus vulgaris, nhờ đó có thể chọn giống có kích thước hạt mong muốn

thông qua sắc tố vỏ hạt Dạng chỉ thị kiểu hình này để lập bản đồ và chọn giống trong nhiều thập kỷ Sử dụng chỉ thị kiểu hình trong nghiên cứu gene và chọn giống sẽ gặp một số khó khăn như tính trội, tương tác các hiệu ứng (trội x trội, cộng x trội, ) [44] Chỉ thị isozyme: Để khắc phục khó khăn khi dùng chỉ thị kiểu hình, các chỉ thị isozyme đã được nghiên cứu trong những năm 70 và đầu những năm 80 Trong giai đoạn này chỉ thị isozyme được dùng để lập bản đồ Charles và

cs đã tìm được mối liên kết giữa tính kháng bệnh tuyến trùng rễ và dạng Isozyme acid phosphatase, Aps-1 Mặc dù có rất nhiều thuận lợi hỗ trợ chọn giống nhưng chỉ thị này rất hạn chế về số lượng và thường không có tính đa hình cao trong nhóm kiểu gene có quan hệ họ hàng

Chỉ thị phân tử (Chỉ thị DNA): Vào những năm 80 và đầu những năm

90 nhiều hạn chế của chỉ thị kiểu hình và chỉ thị isozyme đã được khắc phục nhờ công nghệ chỉ thị DNA, đây được xem như mở ra kỷ nguyên mới cho nghiên cứu về di truyền – chọn giống Chỉ thị DNA xuất phát từ vùng nhỏ đặc trưng của DNA tạo ra tính đa hình giữa các cá thể trong cùng loài hoặc giữa các loài Trong hai thập kỷ qua hàng loạt dạng chỉ thị phân tử đã được phát triển Trong số các loài cây trồng, cà chua được phát triển rất nhiều chỉ thị phân tử Hiện tại có trên 1000 chỉ thị RFLP, 148 chỉ thị SSR, 77 chỉ thị CAPS

đã được lập bản đồ trên 12 nhiễm sắc thể của cà chua Phát triển và sử dụng chỉ thị dựa trên phản ứng PCR (PCR- based marker) ngày càng tăng do thuận tiện sử dụng, rẻ, nhanh hơn các chỉ thị truyền thống khác (RFLP, AFLP)

Tùy theo bản chất và kiểu biểu hiện mà chỉ thị DNA được chia thành một số nhóm: hybridization - based marker, PCR - based marker, DNA

sequence - based marker Chỉ thị DNA có thể tạo ra sự khác biệt giữa các kiểu gene thông qua điện di và nhuộm với hóa chất (ethidium bromide hoặc bạc) hoặc phát hiện bằng phóng xạ hoặc các probe đã đánh dấu màu Chỉ thị DNA

có tác dụng nếu chúng phân biệt giữa các cá thể của cùng một loài hay khác loài Các chỉ thị này gọi là chỉ thị đa hình, trong khi những chỉ thị không phân biệt được các kiểu gene gọi là chỉ thị đơn hình Mặt khác, chỉ thị đa hình còn được chia ra 2 nhóm là chỉ thị đồng trội và chỉ thị trội Chỉ đồng trội cho thấy sự khác biệt được các kiểu gene đồng hợp tử và dị hợp tử, trong khi đó chỉ thị trội chỉ cho biết có gene quan tâm hay không Chỉ thị đồng trội mới có

ý nghĩa trong chọn giống ở quần thể phân ly (Hình 6)

dụng trong bất kỳ quần thể nào trong loài Lycopersicon spp

Chọn giống bằng chỉ thị phân tử là chọn lọc tính trạng dựa trên biểu hiện của chỉ thị liên kết với tính trạng, nghĩa là chỉ thị liên kết được sử dụng