Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp gamma polyglutamic acid từ đồ uống boz

Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới khả năng sinh tổng hợp gamma polyglutamic acid của vi khuẩn .... Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới k

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khoá học : 2010 - 2014

Thái Nguyên, 2014

PHÂN LẬP VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP

TỪ ĐỒ UỐNG BOZA

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Công nghệ Sinh học

Khoá học : 2010 - 2014 Giảng viên hướng dẫn : 1 ThS Bùi Tuấn Hà

2 TS Dương Văn Cường

Khoa CNSH - CNTP trường ĐHNL Thái Nguyên

Thái Nguyên, 2014

Thực tập là quá trình học tập để cho mỗi sinh viên vận dụng những kiến thức, lý luận đã được học trên ghế nhà trường vào thực tiễn, tạo cho sinh viên làm quen những phương pháp làm việc, kỹ năng công tác Đây là giai đoạn không thể thiếu được đối với mỗi sinh viên trong quá trình học tập

Trong suốt quá trình thực tập tại phòng Công Nghệ Vi Sinh, khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên, Tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ ban chủ nhiệm khoa Công nghệ sinh học & Công nghệ thực phẩm, thầy cô hướng dẫn, bạn bè và gia đình

Trước hết tôi xin chân thành cảm ơn ThS Bùi Tuấn Hà, giảng viên

khoa Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên lời cảm ơn sâu sắc nhất Thầy đã tạo điều kiện, trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực tập và hoàn thành khóa luận này

Tôi xin cảm ơn chân thành tới TS Dương Văn Cường, các bạn trong

nhóm nghiên cứu và cán bộ phòng thí nghiệm Công nghệ vi sinh, khoa Công nghệ sinh học – Công nghệ thực phẩm trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã luôn động viên và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực tập và giúp

đỡ tôi hoàn thành khóa luận này

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc của mình tới gia đình và bạn

bè những người đã luôn động viên, giúp đỡ và là điểm tựa tinh thần giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn !

Thái Nguyên, ngày 18 tháng 08 năm 2014

Sinh viên

Nguyễn Thị Phương

Từ, cụm từ viết tắt Nguyên gốc tiếng anh Nghĩa

kháng nguyên

nucleocapsid γ-PGA Gamma Polyglutamic Acid

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 2

1.3 Yêu cầu 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN 3

2.1 Gamma-Polyglutamic acid 3

2.1.1 Công thức phân tử 3

2.1.2 Tính chất vật lý 4

2.1.3 Ứng dụng của gamma-polyglutamic acid 5

2.1.3.1 Ứng dụng trong y học 5

2.1.3.2 Ứng dụng trong ngành công nghệ thực phẩm 7

2.1.3.3.Ứng dụng trong công nghệ mỹ phẩm 8

2.1.3.4 Ứng dụng trong xử lí môi trường 8

2.1.3.5 Ứng dụng trong ngành chăn nuôi 9

2.1.3.6 Trong lĩnh vực nông nghiệp 10

2.1.4 Phương pháp kết tủa và tinh sạch acid gamma-polyglutamic 11

2.2 Vi khuẩn tổng hợp gamma-polyglutamic acid 13

2.2.1 Đặc điểm phân loại của vi khuẩn Bacillus 13

2.2.2 Tổ chức di truyền của vi khuẩn Bacillus tổng hợp gamma-polyglutamic acid 14

2.2.3 Quá trình tổng hợp γ-PGA trong vi khuẩn 15

2.3 Boza - nguồn phân lập vi khuẩn Bacillus 17

2.4 Tình hình nghiên cứu gamma-polyglutamic acid trong nước và ngoài nước 19

PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN

CỨU 23

3.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 23

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 23

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 23

3.3 Hóa chất và thiết bị sử dụng 23

3.3.1 Hóa chất 23

3.3.2 Thiết bị sử dụng 24

3.3.3 Các môi trường sử dụng 24

3.4 Nội dung nghiên cứu 24

3.5 Phương pháp nghiên cứu 25

3.5.1 Phương pháp phân lập 25

3.5.2 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái của vi khuẩn 25

3.5.2.1 Hình thái khuẩn lạc 25

3.5.2.2 Hình thái tế bào 25

3.5.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh hóa của vi khuẩn 25

3.5.3.1 Thử nghiệm khả năng sinh Catalase 25

3.5.3.2 Thử nghiệm khả năng sinh oxydase 26

3.5.3.3 Thử nghiệm khả năng lên men đường glucose 26

3.5.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy tới khả năng sinh tổng hợp gamma polyglutamic acid của vi khuẩn 26

3.5.4.1 Phương pháp xác định hàm lượng gamma polyglutamic acid trong dịch nuôi cấy 26

3.5.4.2 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới khả năng tổng hợp gamma polyglutamic acid của vi khuẩn 27

3.5.4.4 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon tới khả năng

tổng hợp gamma polyglutamic acid 27

3.5.5 Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 28

3.5.6 Phương pháp nhân giống vi khuẩn 28

3.6 Phương pháp sử lý số liệu 28

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn có hoạt tính sinh tổng hợp gamma polyglutamic acid từ mẫu đồ uống lên men Boza 29

4.2 Kết quả nghiên cứu đặc điểm vi khuẩn sinh tổng hợp gammma polyglutamic acid từ mẫu đồ uống lên men Boza 29

4.2.1 Kết quả nghiên cứu hình thái của vi khuẩn BL4 29

4.2.2 Kết quả nghiên cứu đặc tính sinh hóa của vi khuẩn BL4 30

4.3 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố lên quá trình tổng hợp gamma polyglutamic acid 31

4.3.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy tới quá trình sinh tổng hợp gamma polyglutamic acid của chủng BL4 31

3.3.2 Ảnh hưởng của pH ban đầu của môi trường tới khả năng tổng hợp gamma polyglutamic acid của vi khuẩn BL4 33

3.3.3 Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sinh tổng hợp gamma polyglutamic acid của vi khuẩn BL4 34

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 36

5.1 Kết luận 36

5.2 Kiến nghị 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

Tiếng việt 37

Tiếng anh 37

Bảng 2.1 Tính chất vật lý, hóa học của gamma-polyglutamic acid 4

Bảng 2.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của phân bón chứa γ-PGA tới 2 giống sắn KM140 và KM 94 10

Bảng 3.1: Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 23

Bảng 3.2: Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 24

Bảng 4.1: Kết quả phân lập vi khuẩn tổng hợp γ-PGA từ Boza 29

Bảng 4.2: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc vi khuẩn BL4 30

Bảng 4.3: Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn BL4 31

Bảng 4.4: Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh γ-PGA của chủng BL4 32

Bảng 4.5: Ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh tổng hợp gamma polyglutamic của vi khuẩn BL4 33

Bảng 4.6: Ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sự tổng hợp gamma polyglutamic của vi khuẩn BL4 35

Hình 2.1: Công thức cấu tạo của gamma-polyglutamic acid 3

Hình 2.2: Kết quả sử dụng phân bón γ-PGA và không sử dụng phân bón γ-PGA 11

Hình 2.3: Sơ đồ phục hồi và tinh sạch poly γ-glutamic acid 12

Hình 2.4: Hình thái tế bào vi khuẩn Bacillus 14

Hình 2.5: Tổng hợp γ-PGA dưới sự tham gia của các gen tương ứng ở mỗi chủng Bacillus 15

Hình 2.6: Con đường tổng hợp γ-PGA trong Bacillus subtilis IFO 3335 17

Hình 2.7: Sản phẩm Boza 17

Hình 4.1: Hình thái tế bào vi khuẩn BL4 30

Hình 4.2: Biểu đồ ảnh hưởng thời gian nuôi cấy tới quá trình sinh tổng hợp gamma polyglutamic của vi khuẩn BL4 32

Hình 4.3: Biểu đồ ảnh hưởng của pH tới khả năng sinh gamma polyglutamic của vi khuẩn BL4 34

Hình 4.4: Biểu đồ ảnh hưởng của nguồn cacbon tới sự tổng hợp gamma polyglutamic acid của vi khuẩn BL4 35

và các lĩnh vực khác (Shih et al 2001)

γ-PGA được tổng hợp từ một số loài vi khuẩn (tất cả vi khuẩn gram

dương), trong đó chủ yếu là chủng vi khuẩn Bacillus được phân lập từ sản phẩm lên men truyền thống như: vi khuẩn Bacillus subtilis (Bacillus subtilis

Natto) được phân lập từ natto ở Nhật Bản (Shih et al 2001), Thua-nao từ Thái

Lan, chungkookjang từ Hàn Quốc

Bên cạnh các sản phẩm lên men kể trên, một loại sản phẩm lên men truyền thống đang được quan tâm tới khả năng có thể phân lập được các chủng Bacillus có hoạt lực sinh γ-PGA cao đó là Boza

Boza được biết đến là một loại đồ uống lên men truyền thống được làm

từ lúa mì hoặc kê, có độ nhớt và nồng độ cồn thấp, thường là từ 0,5% – 1 %,

có vị ngọt và chua, đây là một sản phẩm lành tính và giàu dinh dưỡng Trong boza có chứa hỗn hợp vi khuẩn lactic và nấm men có lợi cho sức khỏe như:

Lactobacillus brevis subsp lactis, Leuconostoc citreum, Lactobacillus brevis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paraplantarum, Enterococcus faecium, Lactobacillus graminis, Leuconostoc mesenteroides, Pediococcus pentosaceus, Lactobacillus rhamnosus, Pediococcus sp và Lactobacillus

paracasei, Bacillus subtilis (Kivanc et al 2011) Hệ vi sinh vật trong Boza lên

men tạo các sản phẩm giàu dinh dưỡng, trong đó chủng vi khuẩn Bacillus có khả năng tổng hợp γ-PGA

Với nhu cầu ngày càng cao về γ-PGA, các nhà nghiên cứu không ngừng tìm kiếm và chọn lọc ra các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA với hiệu suất cao từ tự nhiên Xuất phát từ vấn đề trên, để phân lập và

đánh giá khả năng sinh tổng hợp γ-PGA của vi khuẩn Bacillus trong đồ uống Boza, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Phân lập vi khuẩn có khả năng sinh

tổng hợp gamma-polyglutamic acid từ đồ uống Boza’’

1.2 Mục đích nghiên cứu

- Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp γ-PGA từ Boza

- Nghiên cứu điều kiện: pH, thời gian, môi trường nuôi cấy thích hợp

để vi khuẩn tổng hợp γ-PGA cao nhất

1.3 Yêu cầu

- Phân lập được các chủng vi khuẩn Bacillus từ Boza

- Đánh giá được ảnh hưởng của pH, thời gian, môi trường nuôi cấy tới khả năng sinh tổng hợp γ-PGA của vi khuẩn

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

PHẦN 2 TỔNG QUAN

α-Hình 2.1: Công thức cấu tạo của gamma-polyglutamic acid

Tỷ lệ L-D-glutamate phụ thuộc vào nhiều yếu tố: loài, điều kiện nuôi

cấy γ-PGA của chủng Bacillus subtilis (Natto) có tỷ lệ 50-80% là dạng

D-glutamate và 20-50% là L-D-glutamate (Kubota et al 1993) Nhiều yếu tố cũng ảnh hưởng đến mức độ trùng hợp của phân tử γ-PGA Nồng độ của Mn2+

có thể ảnh hưởng đến cấu hình của axit glutamic trong γ-PGA được tổng hợp bởi

Bacillus subtilis Khi môi trường có nồng độ Mn2+ cao thì trong γ-PGA có đồng phân dạng D-glutamate >80%, môi trường có nồng độ Mn2+

thấp thì PGA có đồng phân dạng D-glutamate 40% (Thorne et al 1958)

γ-2.1.2 Tính chất vật lý

Công thức cấu tạo

khác nhau

Tính chất vật lí

- Là một polymer tự nhiên

- Tinh thể màu trắng, không màu, không mùi, không vị

- có khả năng phân hủy sinh học

- Hòa tan trong nước

- Không độc và có thể ăn được

- Có khả năng dẫn diện

Tính chất hóa học

- không bị enzyme protease phân hủy

- Có phản ứng được với kim loại để tạo muối

2.1.3 Ứng dụng của gamma-polyglutamic acid

Ngày nay con người có nhu cầu hướng tới sử dụng các hợp chất có nguồn gốc từ tự nhiên do nó có ưu điểm là an toàn với sức khỏe và thân thiện

nhắm tối ưu hóa các phương pháp sản xuất với quy trình ít tốn kém, nâng cao năng suất, hạ giá thành sản phẩm và sử dụng nguồn cơ chất đơn giản, dễ kiếm

để có thể sử dụng rộng rãi trong ngành công nghiệp thực phẩm, hóa mỹ phẩm,

y học, xử lý nước thải, sản phẩm vệ sinh, nông nghiệp, chăn nuôi và các lĩnh vực khác

2.1.3.1 Ứng dụng trong y học

γ-PGA được sử dụng trong liệu pháp gen, thuốc điều trị ung thư và các sản phẩm da nhân tạo để chữa bỏng, γ-PGA còn được dùng tạo ra các màng tổng hợp để chống lại sự bám hút chặt giữa tế bào bình thường với lớp mô bị tổn thương do tai nạn hay quá trình phẫu thuật ( Furuta et al 2000)

a) Chất vận chuyển thuốc

γ-PGA được quan tâm về khả năng vận chuyển thuốc do có tính tương thích sinh học và phân hủy sinh học Trong chuỗi peptide của γ-PGA có nhóm carboxyl tạo điểm gắn cho hóa trị liệu, do đó khiến thuốc hòa tan nhiều hơn

và dễ dàng kiểm soát hơn Liên kết γ-PGA và thuốc có thể xâm nhập vào vị trí khối u và giải phóng thuốc, sau đó γ-PGA bị phân hủy thành acid glutamic

có thể thâm nhập vào quá trình trao đổi chất của tế bào và được bài tiết qua thận (Li et al, 1998)

Enzym là chất xúc tác sinh học thường dễ bị ảnh hưởng bởi các tác nhân môi trường trong đó có các tia phóng xạ (Dengyi et al.,1993; Saha et al.,1995) Để giảm thiểu các tác nhân và nâng cao hiệu quả sử dụng enzym Enzym thường được kết hợp với các chất gắn, hay các hợp chất bảo vệ khác nhau để tránh khỏi các tác nhân gây ảnh hưởng tới hoạt tính enzyme Mỗi loại

hợp chất dùng để gắn enzym đều có những ưu và nhược điểm riêng (Dengyi

et al.,1993; Saha et al.,1995) Hiện nay γ-PGA đang được nghiên cứu để gắn vào enzym do chúng có ưu điểm là có thể phân hủy sinh học, không ảnh hưởng tới môi trường)(Miyachi et al.,1996; Sakamoto et al.,1997) Ở Việt Nam chưa có nhiều các nghiên cứu về ảnh hưởng của các tia bức xạ đến enzym, cũng như vai trò của γ-PGA trong việc bảo vệ hoạt tính enzym chống lại các tác nhân do các tia bức xạ gây nên

c) Chất mang gen chuyển

Dekie và cộng sự năm 2000 đã chỉ ra rằng liên kết giữa DNA và γ-PGA tương đối ổn định đối với albumin huyết thanh γ-PGA dễ dàng tạo ra các liên kết với DNA, kết quả là điện tích bề mặt và kích thước của DNA giảm như vậy có thể bảo vệ DNA không bị phân hủy bởi enzyme Dnase γ-PGA mang gen chuyển giúp cho DNA không bị phân hủy và tăng hiệu quả chuyển gene (Dekie et al 2000)

d) Chất phụ tá vaccine

Năm 2006, Sung và cộng sự đã đánh giá rằng γ-PGA như một chất phụ

tá cho vaccine, người ta đã phát hiện ra tổ hợp các thành phần gây miễn dịch

chứa γ-PGA cho 1 đáp ứng miễn dịch chống lại S epiderrnidis,

staphylococcus và các loài liên quan γ-PGA được chỉ ra có khả năng kích

thích cơ thể sinh kháng thể cao thậm trí khi được sử dụng với một kháng nguyên có tính gây miễn dịch yếu Các phân tử γ-PGA có khả năng phân hủy sinh học là các thể mang vận chuyển rất tốt vaccine tới các khối u, chúng có thể phát tán các protein kháng nguyên tới các tế bào trình diện kháng nguyên (APCs) và đưa ra các đáp ứng miễn dịch hiệu lực dựa trên các kháng nguyên đặc hiệu của tế bào lympho T Kháng nguyên được chấp nhận bởi các tế bào trình diện kháng nguyên còn được tăng cường bằng sự liên kết với các phân

tử polyme (Sung et al 2006) Vaccine này có ưu điểm là khi tiêm dưới da không tạo vết sưng tại vị trí tiêm như các vaccine thông thường khác (Uto et

al 2009)

2.1.3.2 Ứng dụng trong ngành công nghệ thực phẩm

Các nhà nghiên cứu đã chứng minh được γ-PGA có thể ứng dụng làm chất bảo quản đông lạnh mà không gây ảnh hưởng tới sức khỏe do đặc tính của γ-PGA là một polyme sinh học không gây độc cho người, γ- PGA còn sử dụng làm chất ổn định mà không làm ảnh hưởng tới chất lượng sản phẩm cũng như tới sức khỏe con người Năm 2000, Sakai và cộng sự cho rằng việc

bổ sung PGA vào đồ uống để làm giảm vị đắng của một số đồ uống (chứa acid amin, peptide, quinine, cafeine…),và làm tăng vị ngon của đồ uống (Sakai et al.2000)

Ngoài ra, khi bổ sung γ-PGA còn có khả năng liên kết với một số ion hóa trị 2 như Mn2+ ( ổn định thần kinh), Cu2+ (thúc đẩy sự hấp thu và sử dụng sắt để tạo thành hemoglobin và hồng cầu), Mg2+ (tác dụng ức chế các phản ứng thần kinh và cơ)…tạo muối tan giúp cơ thể tăng tốc độ hấp thụ các chất và khoáng chất trong ruột non giúp cho cơ thể hấp thụ tối các chất dinh dưỡng cung cấp khoáng chất cho cơ thể (Tanimoto et al., 1995 )

Tanimoto và cộng sự năm 2007 đã chứng minh ngay cả phụ nữ sau mãn kinh khi dùng γ-PGA còn giúp cho cơ thể hấp thụ canxi tốt qua ruột non

giúp ngăn cản quá trình hình thành calcium phosphate không tan, tình trạng thiếu canxi trong máu hỗ trợ chứng mất chất khoáng ở trong xương, loãng xương, còi xương và thiếu Ca tăng trưởng (Tanimoto et al, 2007.)

bì dưới da mà không làm ảnh hưởng đến sự cân bằng của da γ-PGA còn giúp phục hồi tóc sau quá trình tẩy màu tóc và nhuộm tóc bằng cách tăng khả năng giữ ẩm và hình thành một hàng rào bảo vệ giúp tóc giữ được màu (Ben-Zur and Goldman, 2007)

γ-PGA còn làm ức chế enzyme hyaluronidase giúp acid hyaluronic không bị phân hủy, cùng với collagen là những thành phần thiết yếu của da γ-

PGA có khả năng hấp thụ nước nên nó có tác dụng làm ẩm da, sáng da, làm

đầy nếp nhăn và chống lão hóa, tăng độ đàn hồi da cao hơn collagen γ-PGA giúp tăng liên kết với vitamin C và vitamin E có trong thành phần của mỹ

phẩm do γ-PGA dễ dàng hòa tan trong nước và được ion hóa Dung dịch ion hóa γ-PGA được đưa vào sâu dưới da bằng công nghệ điện chuyển ion (Shih

et al 2001)

2.1.3.4 Ứng dụng trong xử lí môi trường

Trong quá trình xử lí nước, các phương pháp loại bỏ và tách tạp chất như kết tủa, tuyển nổi và lọc đều là quá trình tách chất rắn ra khỏi chất lỏng

Trong phương pháp tách các kết tủa ra khỏi chất lỏng, thì các chất kết tủa đóng vai trò quan trọng trong quá trình loại bỏ các tạp chất làm giảm thời gian

xử lí Tuy nhiên các chất kết tủa thu được sau quá trình xử lí môi trường hiện nay có chứa các thành phần độc hại gây ảnh hưởng tới sức khỏe như nhôm sunfat là nguyên nhân gây ra bệnh Alzheimer, polyalumin clorua (PAC) và một số polyme tổng hợp như polyacrylamid thì monome của nó có độc tố mạnh gây ảnh hưởng tới sức khỏe và môi trường (Nguyễn Hương 2005)

Vượt trội hơn những chất kết tủa thông thường trên, γ-PGA được coi là một chất kết tủa sinh học vì nó có thể kết tủa thành từng mảng gồm các hợp

chất hữu cơ và vô cơ γ-PGA có khả năng liên kết với kim loại (kim loại nặng,

chất phóng xạ) để tạo kết tủa điều đó thuận lợi cho việc cô lập các kim loại không cho phát tán rộng ra môi trường hơn nữa γ-PGA còn có tính chất phân hủy sinh học nên rất thân thiện với môi trường (Sung et al 2005)

Do đó, các nhà khoa học đã nghiên cứu γ-PGA như một chất kết tủa có bản chất sinh học có thể thay thế những chất kết tủa thông thường γ-PGA có khả năng kết tuả cao tùy vào trọng lượng phân tử của nó, hơn nữa γ-PGA hoàn toàn không độc nên rất phù hợp cho quá trình xử lý Hiện nay các nhà

khoa học đang tiếp tục nghiên cứu khả năng ứng dụng và phát triển của nó đối với các lĩnh vực xử lý nước, kể cả tinh chế nước và xử lý nước thải (Nguyễn Hương 2005)

2.1.3.5 Ứng dụng trong ngành chăn nuôi

γ-PGA được sử dụng nhiều trong ngành sản xuất thức ăn gia súc bởi có những tính năng như tăng cường khả năng thấp thụ canxi, photpho của gia súc,

gia cầm, giúp tăng chất lượng và trọng lượng cho thịt, xương, tăng sản lượng

trứng, làm giảm lượng chất béo không cần thiết của vật nuôi giúp cho ngành

chăn nuôi đạt hiệu quả cao nhất (Shih et al., 2001; Tanimoto et al., 2007)

2.1.3.6 Trong lĩnh vực nông nghiệp

Năm 2007, King và cộng sự đã nghiên cứu một loại phân bón chứa PGA giúp cho cây trồng phát triển bộ rễ, nâng cao khả năng hấp thụ dinh dưỡng, giúp cây tăng trưởng nhanh, tán lá phát triển mạnh, quả lớn, tăng sản lượng và chất lượng γ-PGA được sử dụng làm phân bón và cải tạo đất, bảo quản hạt giống, kiểm soát độ ẩm làm tăng chất lượng và sản lượng cho nông sản (King et al 2007)

γ-Kết quả rõ rệt khi sử dụng phân bón chứa γ-PGA và không sử dụng phân

bón chứa γ-PGA của 2 giống sắn

Bảng 2.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của phân bón chứa γ-PGA tới

2 giống sắn KM140 và KM 94

Giống

Số cây khảo sát

Trọng lượng trung bình của củ

Tỉ lệ % trọng lượng của củ trên cây bón PGAvà không bón PGA Bón PGA

Không bón PGA

Bón PGA

Không bón PGA

Hình 2.2: Kết quả sử dụng phân bón γ-PGA và không sử dụng phân bón γ-PGA

( Hình A: -PGA không sử dụng phân bón chứa γ-PGA, +PGA sử dụng phân bón chứa γ-PGA; hình B: bên trái sử dụng phân bón chứa γ-PGA, bên phải không

sử dụng phân bón chứa γ-PGA)

Năm 2010, Bhavik Manocha và Argyrios Margaritis, đưa ra phương

pháp để kết tủa, tinh sạch và xác định γ-PGA theo hai con đường khác nhau là phương pháp kết tủa γ-PGA bằng dung dịch ethanol (sơ đồ B) và bằng dung dịch CuSO4 (sơ đồ A)

B

A

Hình 2.3: Sơ đồ phục hồi và tinh sạch poly γ-glutamic acid

(Manocha et al 2010)

(Phương pháp kết tủa γ-PGA bằng dung dịch đồng sunfat (A), Phương pháp

kết tủa γ-PGA bằng dung dịch ethanol (B))

Theo phương pháp của Bhavik Manocha và Argyrios Margaritis (2010)

cho thấy hiệu quả của phương pháp kết tủa bằng đồng sunfat (85%) hơn hẳn phương pháp kết tủa bằng ethanol (82%) Vì phương pháp etthanol kết tủa lượng protein là 48%, trong khi ở đồng sulfate chỉ có 3% protein điều đó chứng

tỏ rằng phương pháp kết tủa bằng đồng sulfate tinh sạch tốt hơn, không bị lẫn tạp so với phương pháp kết tủa ethanol (Manocha and Margaritis 2010)

2.2 Vi khuẩn tổng hợp gamma-polyglutamic acid

2.2.1 Đặc điểm phân loại của vi khuẩn Bacillus

Các nghiên cứu về vi khuẩn có khả năng tổng hợp γ-PGA là trực khuẩn

gram dương thuộc chủng Bacillus Bacillus là những vi khuẩn gram dương Thuộc chi Bacillaceae, có nội bào tử hình ovan có khuynh hướng phình ra ở một đầu Bacillus được phân biệt với các loài vi khuẩn sinh nội bào tử khác

bằng hình dạng tế bào hình que, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kị

kí không bắt buộc Tế bào Bacillus có thể đơn hoặc chuỗi và chuyển động bằng tiên mao Chính nhờ khả năng sinh bào tử mà vi khuẩn Bacillus có khả

chống chịu được những điều kiện bất lợi như môi trường có nhiệt độ cao ở suối nước nóng, nhiệt độ thấp ở bắc cực, những nơi có nồng độ muối cao như

ở mỏ muối hay ở nơi có nồng độ kháng sinh cao… (Tô Minh Châu, 2001)

Tất cả các loài thuộc chi Bacillus đều có khả năng dị dưỡng và hoại

sinh nhờ sử dụng các hợp chất hữu cơ đa dạng như đường, acid amin, acid hữu cơ…Một vài loài có thể lên men carbohydrat tạo thành glycerol và

butanediol; một vài loài như Bacillus megaterium thì không cần chất hữu cơ

để sinh trưởng, một vài loài khác thì cần acid amin, vitamin B Hầu hết đều là

loài ưa nhiệt với nhiệt độ tối ưu là 65oC (Rosovitz et al 1998)

Đa số vi khuẩn Bacillus sinh trưởng ở pH7, một số phù hợp với pH=

9-10 như Bacillus alcalophillus, hay có loại phù hợp với pH=2–6 như Bacillus

acidocaldrius

Bacillus có khả năng sản sinh enzyme ngoại bào (amylase, protease,

cellulase…), do đó chúng được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, bảo vệ môi trường Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, maltose,

saccharose, xylose Bacillus là vi khuẩn gam dương, dương tính với thử

nghiệm catalase, sử dụng khí oxy làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất, nitrate (-), di động (+), hiếu khí (+) và âm tính với thử nghiệm sinh indol

Hình 2.4: Hình thái tế bào vi khuẩn Bacillus

2.2.2 Tổ chức di truyền của vi khuẩn Bacillus tổng hợp polyglutamic acid

gamma-Một số nhà khoa học đã chứng minh chỉ có một vài vi khuẩn, chủ yếu

là chủng vi khuẩn Bacillus như B subtilis 168, B subtilis natto, B

licheniformis, B anthracis và S epidermidis là có gen để tổng hợp nên

γ-PGA, trong đó có 2 loài B anthracis và B subtilis có gen đặc trưng mã hóa

để tổng hợp lên polyglutamate

Vi khuẩn B anthracis, có 4 gen capB, capC, CapA và CapE , mã hóa cho 1 chuỗi peptide gồm 47 amino acid để tổng hợp polyglutamate (Candela et

al, 2005a.)

Vi khuẩn B subtilis có 3 gen liên quan tới sự tổng hợp polyglutamate

đó là pgsB, pgsC và pgsAA (Ashiuchi et al.,1999)

Hình 2.5: Tổng hợp γ-PGA dưới sự tham gia của các gen

tương ứng ở mỗi chủng Bacillus

γ-PGA được tổng hợp dưới dạng tự do hay dưới dạng liên kết tùy thuộc

vào gen tổng hợp (Candela et al , 2005a)

- Nếu PGA được sinh ra và kết hợp với bề mặt vi khuẩn và tạo thành một lớp vỏ bao quanh vi khuẩn (gồm γ-PGA và liên kết hóa trị liên kết với

peptidoglycan) thì gen tổng hợp PGA là gen cap

- Nếu PGA được sinh dưới dạng tự do thì gen tổng hợp γ-PGA là gen pgs

2.2.3 Quá trình tổng hợp γ-PGA trong vi khuẩn

Năm 2007 Shi và cộng sự nghiên cứu và xác định các enzyme tham gia vào con đường tổng hợp sinh hóa làm tăng hàm lượng γ-PGA (Shi et al 2007)

Con đường để tổng hợp γ-PGA là từ L-glutamic acid, acid citric và

ammonium sulfate trong B.subtilis IFO 3335 (Kunioka et al., 1997), vì lượng

L-glutamic acid rất ít nên nó có thể được coi như là L-glutamic acid được tổng hợp từ acid citric thông qua acid isocitric và acid 2-oxoglutaric trong chu trình TCA Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng bước quan trọng trong quá tình là