1 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM NGUYỄN THỊ HOÀ Tên đề tài: NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG TÁI SINH CỦA GIỐNG GIẢO CỔ LAM Gynostemma pentaphyllum B
Trang 11
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
NGUYỄN THỊ HOÀ
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG TÁI SINH CỦA GIỐNG GIẢO CỔ LAM
(Gynostemma pentaphyllum ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Thái Nguyên, năm 2014
Trang 22
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM
NGUYỄN THỊ HOÀ
Tên đề tài:
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG TÁI SINH CỦA GIỐNG GIẢO CỔ LAM
(Gynostemma pentaphyllum ) BẰNG PHƯƠNG PHÁP IN VITRO
KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
Thời gian thực hiện : Từ 12/2013 đến 05/2014
Thái Nguyên, năm 2014
Trang 33
LỜI CẢM ƠN
Được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa
Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm trong thời gian thực tập tốt
nghiệp em đã thực hiện đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tái sinh giống Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum ) bằng phương pháp in vitro”
Sau 6 tháng thực tập tại phòng thí nghiệm nuôi cấy mô Khoa Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm đến nay em đã hoàn thành xong đề tài của mình Để đạt được kết quả như ngày hôm nay em xin chân thành cảm ơn Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa cùng các thầy cô giáo trong
bộ môn đã tạo điều kiện giúp đỡ em trong suốt thời gian qua
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy giáo PGS.TS Ngô Xuân Bình và Ths Dương Hữu Lộc đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn em trong thời gian thực hiện đề tài
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với những đóng góp và hướng dẫn quý báu của Ks Lã Văn Hiền trong quá trình thực hiện và hoàn thành
khóa luận
Cuối cùng, em xin chân thành cảm ơn toàn thể gia đình, bạn bè đã hết lòng động viên, giúp đỡ tạo điều kiện về vật chất và tinh thần cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu
Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài không thể tránh khỏi những sai sót Em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô
và các bạn để đề tài của em được hoàn thiện hơn
Em xin chân thành cảm ơn!
Thái Nguyên, tháng 6 năm 2014
Sinh viên thực hiện
Nguyễn Thị Hòa
Trang 4LSD : Least Significant Difference Test
Trang 66
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cây và quả giảo cổ lam 4
Hình 2.2 Cấu trúc hóa học của Flavononit và Saponin 6
Hình 4.1 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến khả năng tạo vật liệu vô trùng (sau 7 ngày nuôi cấy) 26
Hình 4.2.Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ BA đến cảm ứng chồi Giảo cổ lam ( sau 10 ngày nuôi cấy ) 28
Hình 4.3 Kết quả cảm ứng chồi giảo cổ lam trên môi trường nuôi cấy bổ sung BA sau (10 ngày nuôi cấy) 28
Hình 4.4 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh (sau 30 ngày nuôi cấy) 30
Hình 4.5 Kết quả nhân nhanh chồi Giảo cổ lam trên môi trường BA kết hợp NAA (sau 30 ngày nuôi cấy) 31
Hình 4.6 Biểu đồ thể hiện kết quả ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng kéo dài chồi Giảo cổ lam (sau 20 ngày nuôi cấy) 32
Hình 4.7 Kết quả kéo dài chồi trên môi trường bổ sung GA3 sau (20 ngày nuôi cấy)
32
Hình 4.8 Biểu đồ thể hiện ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ của Giảo
cổ lam (sau 15 ngày nuôi cấy) 33
Hình 4.9 Kết quả tạo rễ trên môi trường bổ sung IBA (sau 15 ngày nuôi cấy) 34
Trang 77
MỤC LỤC
Trang
PHẦN 1 MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích nghiên cứu 2
1.3 Yêu cầu của đề tài 2
1.4 Ý nghĩa của đề tài 2
PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Giới thiệu chung về Giảo cổ lam 3
2.1.1 Nguồn gốc và phân loại 3
2.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây giảo cổ lam 4
2.1.3 Giá trị của cây giảo cổ lam 5
2.1.4 Vị trí của giảo cổ lam trong hệ thống cây dược liệu 5
2.2 Nghiên cứu về giá trị y học của giảo cổ lam 6
2.2.1 Thành phần hóa học và tác dụng 6
2.2.2 Các nghiên cứu tác dụng tới sinh lý sức khỏe của Giảo cổ lam 9
2.3 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống thực vật 10
2.3.1 Tính toàn năng của tế bào 10
2.3.2 Tính phân hóa và phản phân hóa của tế bào 10
2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật 11
2.4.1 Vật liệu nuôi cấy 11
2.4.2 Điều kiện nuôi cấy 11
2.4.3 Môi trường dinh dưỡng 11
2.5 Phương pháp nhân giống thực vật 12
2.5.1 Phương pháp nhân giống truyền thống 12
2.5.2 Phương pháp hiện đại 13
2.6 Tình hình sản suất và sử dụng dược liệu trên thế giới và Việt Nam 14
Trang 88
2.6.1 Tình hình sản suất và sử dụng dược liệu trên thế giới 14
2.6.2 Tình hình sản suất và sử dụng dược liệu ở Việt Nam 15
2.7 Nghiên cứu nhân giống giảo cổ lam bằng nuôi cấy mô tế bào 16
PHẦN 3: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
3.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu 18
3.1.1 Vật liệu 18
3.1.2 Hóa chất và thiết bị sử dụng 18
3.2 Điều kiện thí nghiệm 18
3.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 19
3.4 Nội dung nghiên cứu 19
3.5 Phương pháp nghiên cứu 19
3.6 Phương pháp thu thập, xử lý số liệu và chỉ tiêu đánh giá 23
3.6.1 Thu thập số liệu 23
3.6.2 Các chỉ tiêu theo dõi 23
3.6.3 Phương pháp xử lý số liệu 24
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25
4.1 Kết quả ảnh hưởng của hóa chất và thời gian khử trùng đến hiệu quả vô trùng vật liệu nuôi cấy 25
4.2 Kết quả ảnh hưởng của BA đến cảm ứng chồi Giảo cổ lam 27
4.3 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh giống Giảo cổ lam 29
4.4 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng kéo dài chồi 31
4.5 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ của Giảo cổ lam 33
PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35
5.1 Kết luận 35
5.2 Kiến nghị 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO 36
Trang 91
PHẦN 1
MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề
Giảo cổ lam có danh pháp khoa học là Gynostemma pentaphyllum thuộc họ
Bầu bí (Cucurbitaceae), cây được phân bố ở các khu vực có độ cao 200 - 2000m
trong các khu rừng thưa và ẩm ở Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ và một số nước châu Á Ở nước ta Giảo cổ lam được tìm thấy tại Lào Cai, Hà Giang, Cao Bằng, Tuyên Quang và một số địa phương khác [26]
Giảo cổ lam là loại thảo dược có những đặc tính quý, trong cây chứa các hợp chất thuộc nhóm flavonoid và nhóm saponin có tác dụng điều hòa huyết áp, tăng cường hệ thống miễn dịch, làm giảm hàm lượng colesterol, và nâng cao khả năng chịu đựng của cơ thể [24] Vì vậy Giảo cổ lam đã được sử dụng làm rau ăn hay chế biến thành các sản phẩm như trà có tác dụng trong bảo vệ và nâng cao sức khỏe cho con người
Do nhu cầu sử dụng ngày càng cao Giảo cổ lam đã bị khai thác một cách qua mức làm giảm số lượng loài, nguồn gen trong tự nhiên Theo sách đỏ Việt Nam Giảo cổ lam đã được xếp trong thang bậc phân hạng IUCN 1994 sách đỏ VN: EN A1a,c,d [24] Nhưng việc nhân giống Giảo cổ lam trong tự nhiên còn có nhiều hạn chế: hệ số nhân chưa cao, phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên do đó việc tìm ra phương pháp nhân giống có hiệu quả đã và đang được nhiều nhà khoa học tiến hành nghiên cứu (Trần Đức Thiện và cs, 2010) [24], Anchalee Jala và cs, 2012 [28] Một trong những phương pháp được lựa chọn hiện nay là phương pháp nuôi cấy mô tế bào
Xuất phát từ tình hình thực tiễn đó, tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tái sinh giống Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum ) bằng phương pháp in vitro”
Trang 102
1.2 Mục đích nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng tái sinh cây giảo cổ lam
1.3 Yêu cầu của đề tài
Xác định một số yếu tố ảnh hưởng đến khả năng tái sinh:
- Nghiên cứu được ảnh hưởng của thời gian chất khử trùng NaClO 1%, HgCl2 0,1% đến khả năng tái sinh
- Nghiên cứu được ảnh hưởng của nông độ BA đến cảm ứng chồi
- Nghiên cứu được ảnh hưởng của nồng độ BA kết hợp với NAA đến khả năng nhân nhanh chồi
- Nghiên cứu được ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng kéo dài chồi
- Nghiên cứu được ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ
1.4 Ý nghĩa của đề tài
- Ý nghĩa trong khoa học
+ Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học và nghiên cứu khoa học
+ Biết được phương pháp nghiên cứu vấn đề khoa học, xử lý, phân tích số liệu, biết cách trình bày một bài báo khoa học
- Ý nghĩa thực tiễn
Xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến nuối cấy, làm tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo
Trang 113
PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về giảo cổ lam
2.1.1 Nguồn gốc và phân loại
Giảo cổ lam (Gynostemma pentaphyllum) có nguồn gốc từ các vùng núi của miền nam Trung Quốc, Nhật Bản và Đông Nam Á [5] Gynostemma pentaphyllum
phân bố ở độ cao từ 300 – 3000 m so với mực nước biển ở các vùng đồng bằng, sườn dốc và tán cây trên núi Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, Hàn Quốc, Thái Lan, Việt Nam [4] Tại Việt Nam cây mọc trong rừng, rừng thưa ở nhiều nơi như Lào Cai, Lặng Sơn, Cao Bằng, Hòa Bình, Bắc Kạn [8]
Giảo cổ lam là một cây leo sống nhiều năm thuộc chi Gynostemma, họ
Cucurbitaceae [15] Theo các tài liệu phân lợi thực vật chuẩn như “Thực vật chí
Đông Dương” và các tác phẩm “ Cây cỏ Việt Nam” của Viện Khoa học Việt Nam công bố cây giảo cổ lam thuộc chi Gynostemma, nằm trong họ bầu bí -
Cucurbitaceae Vị trí của giảo cổ lam trong hệ thống phân loại học như sau:
Loài: Gynostemma pentaphyllum (Thunb) Makino
- Loài Giảo cổ lam 3 lá: Gynostemma laxum (Wall.) Cogn
- Loài Giảo cổ lam 5 lá: Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino
- Loài Giảo cổ lam 7 lá: Gynostemma pubescens (Gagnep) C.Y.Wu
- Loài Giảo cổ lam 9 lá: Gynostemma sp
Trang 124
2.1.2 Đặc điểm thực vật học của cây giảo cổ lam
2.1.2.1 Đặc điểm thực vật của chi Gynostemma
Cây thân thảo, mảnh, thân leo, sống lâu năm Lá kép, ít lá đơn, lá khía răng cưa Tua cuốn chẻ đôi khi có tua cuốn đơn Cụm hoa khác gốc, dạng chùy mảnh, dài nhất là đối với hoa đực Hoa nhỏ, màu trắng hoặc lục nhạt, cuống hoa có đốt Đài hoa hình bánh xe, chia 5 thùy, ngắn Tràng hình bánh xe, hơi hàn liền phần gốc tráng, có đầu nhọn Nhị 5 ở phần gốc chỉ nhị hàn liền thành cột Bao phấn 1 ô, nhưng nhìn có vẻ như 2 ô Nhụy bầu hình cầu nhỏ, 2 - 3 ngăn, 2 - 3 vòi nhụy với vòi nhụy chia 2 - 3 đầu nhọn Quả hình câu lớn hạt đậu, không mở, 2 - 3 hạt hình trứng hơi dẹp 2 bên hoặc có 3 góc Hạt sùi [8]
2.1.2.2 Đặc điểm thực vật học của loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino
Cây thảo mọc leo yếu, không lông vòi đơn Lá kép có cuống dài 3 - 4 cm, phiến do 5 - 7 lá chét với mép có răng cưa dài 3 - 9 cm, công 1,5 - 3 cm Hoa dạng chùy thòng Hoa nhỏ, hình sao, ống bao phấn rất ngắn, cánh hoa rời nhau cao 2,5
mm, nhị 5, bao phấn dính thành đía, bầu có 3 vòi nhụy Quả khô, tròn, đường kính 5
- 9 mm, màu đen, hạt 2 - 3 treo, to 4 mm
Hoa tháng 7 - 8 Quả tháng 9 - 10 [8]
Hình 2.1 Cây và quả giảo cổ lam
Trang 135
2.1.3 Giá trị của cây giảo cổ lam
Việc sử dụng giảo cổ lam đã có một lịch sử khoảng 500 năm, với hầu hết những
tài liệu từ Trung Quốc Cuốn sách Thuốc dùng cho nạn đói xuất bản vào thời nhà Minh
(1368 - 1644) đã hướng dẫn sử dụng giảo cổ lam như một loại rau [17] Thầy thuốc nổi tiếng Lý Thời Trân (1578) sau này đã sử dụng giảo cổ lam chữa bênh tiểu ra máu, phù
và sưng đau họng, nóng và phù nề cổ, chữa các khối u và làm lành vết thương [17]
Theo Thuốc cổ truyền Trung Quốc cơ bản, giảo cổ lam có vị đắng, tính ôn
trung, bổ âm và trợ dương và là thuốc dùng tăng sức đề kháng với vi khuẩn và các tác nhân gây viêm [15] Giảo cổ lam được dùng trong các bệnh tăng lipid máu, đánh trống ngực, chứng chóng mặt, đau đầu, ù tai, chứng tự ra mồ hôi, cơ thể suy nhược, các chứng bệnh tâm tỳ khí kém, đàm huyết ứ trệ [16] Do đó giảo cổ lam đã được đưa vào hầu hết các từ điển thảo dược Trung Quốc dùng để giải độc, làm thuốc ho, chứa trống ngực, các triệu chứng mệt mỏi, viêm phế quản cấp và mãn tính [16]
Theo Phạm Hoàng Hộ (1999) [10] và Võ Văn Chi (2013) [15] giảo cổ lam
có vị đắng tính hàn, có tác dụng tiêu viêm, giải độc, chữa ho và long đờm
Theo tài liệu Cây thuốc phòng trị bệnh ung thư, dược liệu giảo cổ lam có tác
dụng hạ huyết áp, hạ mỡ trong máu, tăng cường sức khỏe, chống não suy, kháng ung thư Trị ung thư, viêm dạ dày ruột, cao huyết áp, lipid máu cao, bệnh mạch vành, bệnh béo phì, trúng gió, sỏi mật, loét dạ dày, tiểu đường [13]
2.1.4 Vị trí của giảo cổ lam trong hệ thống cây dược liệu
Trong sách đỏ Việt Nam 2007, giảo cổ lam với tên Việt Nam chính là Dần
toòng, tên khoa học Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino 1902 Do bị khai
thác quá mức lấy nguyên liệu làm thuốc, giảo cổ lam đã được xếp trong thang bậc phân hạng IUCN 1994 sách đỏ VN: EN A1a,c [24]
Trang 14Hình 2.2 Cấu trúc hóa học của Flavononit và Saponin
2.2.1.2 Tác dụng và công dụng của giảo cổ lam
- Tác dụng dược lý
Các đặc tính dược lý của giảo cổ lam hầu hết đều thuộc về saponin, thành phần này đã trở thành mục tiêu nghiên cứu của các nhà nghiên cứu dược học tại Trung Quốc [11] Tính chất đa tác dụng của loài cây này đã được đặt tên là cất trường sinh - “the immortality herb” [17]
Saponin
Trang 157
- Tác dụng đến chuyển hóa lipit và đường huyết
Tác dụng của giảo cổ lam đến chuyển hóa lipid đã được nghiên cứu rộng rãi Tác dụng hạ lipid đã được nghiên cứu khi dùng nước sắc của giảo cổ lam cùng với hai loại dược liệu khác Hỗn hợp này làm giảm đáng kể nồng độ triglycerid và cholesterol trong huyết tương thỏ và chim cút [33]
Tác dụng trên đường huyết: Phân đoạn saponin của giảo cổ lam (liều 1mg/kg) đã làm giảm đáng kể lượng đường trong máu khi điều trị trong 2 tuần chuột cống đã được kích thích tăng đường huyêt bằng Streptozocin ( STZ) [33]
Người ta tìm ra phanosid (một saponin dammaran) từ giảo cổ lam kích thích giải phóng insunin từ tụy chuột cống cô lập Cho chuột cống uống phanosid (liều 40
và 80mg/ml) đã cải thiện được sự dung nạp đường và năng lượng insulin trong huyết thanh trong bệnh cảnh tăng đường huyết [30]
Với dịch chiết gypenosid (100 và 200 mg/kg) dùng qua đường uống trong 2 tháng đã ngăn chặn được bệnh tăng đường huyết ở chuột cống lão hóa và cải thiện được khả năng dung nạp đường ở chuột cống lão hóa nuôi bằng glucose (2g/kg) [30]
Trong một số nghiên cứu gần đâu, gypenosid (250mg/kg) làm giảm sự tăng kích thích tăng glucose ngoại sinh trên chuột béo phì đái đường Zucker do cải thiện được sự nhạy cảm của receptor insulin [30]
- Tác dụng đến tim mạch
Giảo cổ lam có thể ảnh hưởng tới hoạt động của tim mạch [69] Trong nghiên cứu do Circosta và cộng sự năm 2005 dịch chiết nước của giảo cổ lam (2,5
;5 và 10mg/kg tiêm tĩnh mạch) có thể bảo vệ được lợn với chúng loạn nhịp tim [29]
Gypenosid toàn phần (100mg/kg) tiêm phúc mạc thỏ giảm phạm vi nhồi máu
cơ tim gây bởi sự co thắt mạch vành Trên chuột cống, liều tương tự làm giảm lượng propandial trong co thắt mạch cơ tim và bảo vệ men superoxide dismutase và phosphocreatine kinase cơ tim Trong cơ tim chuột cô lập, gypenosid (50, 100 và
200 µg/ml) cho thấy tác dụng bảo vệ cơ tim bằng cách hạn chế thiệt hại do sự thiếu glucose và oxygen đồng thời cũng ức chế việc giải phóng men creatine phosphatkinase và lactate dehydrogenase (LDH) [16]
Trang 168
Gypenosid toàn phần (liều 5 và 10mg/kg tiêm tĩnh mạch) làm tăng cường sự lưu thông mạch vành trên chó đã gây tê Do làm giảm áp lực máu, nhịp tim, điện tim, độ bền mạch ngoại vi, động mạch não và động mạch vành [30] Với liều gypenosid toàn phần tiêm tĩnh mạch cóc đã hạn chế sự giảm sóng T trên ECG sau khi kích thích tuyến yên Liều gypenosid toàn phần (25mg/kg tiêm phúc mạc) làm giảm nguy cơ nhồi máu cơ tim (thời gian thiếu máu cục bộ 24 giờ) trong co thắt mạch vành ở chuột cống và gây giảm rõ rệt protein kinase (CPK) huyết tương và lactate dehydrogenase (thời gian thiếu máu là 6 và 10 giờ) [14] Thuốc vi hạt chứa saponin của giảo cổ lam dùng cho bệnh tim mạch hay bệnh trên mạch máu não được sáng chế và đưa vào sử dụng [30]
- Tác dụng đến hệ thần kinh trung ương
Gypenosid toàn phần (50 mg/kg) tiêm tĩnh mạch có tác dụng bảo vệ não khi
bị thiếu máu do thắt hai động mạch cảnh Thí nghiệm thiếu máu não sau 60 phút, kết quả điện não đồ cho thấy cải thiện rõ rệt với thỏ không dùng thuốc Các hoạt tính của men protein kinase và lactate dehydrogenase cũng thấy giảm trong tĩnh mạch não vả cải thiện được mức độ thay đổi hình thái trong phần não bị thiếu máu cục bộ [31]
Cao giảo cổ lam (450 mg/kg) có tác động ức chế những hoạt động tự phát
của chuột nhắt khi quan sát tác dụng giảm đâu của chuột khi đang ở trên tấm kính kim loại nóng [16]
Giảo cổ lam làm hạn chế sự loạn trí nhớ gây bởi anisodine ( sử dụng test platformjumpig) cải thiện rõ rệt chấn thương AND và RNA trong vỏ não thuộc vùng cá ngựa ở chứng tâm thần phân liệt trên chuột cống [31] Với liều 40mg/kg gypenosid chống lại sự thiếu máu cụ bộ phá hủy cấu trúc cá ngựa ở chuột cống do hạn chế sự phá hủy neuron thần kinh, làm giảm hoạt tính men superoxide dismutase, men ATPase, lượng malondialhehyd và làm hạn chế sự thay đổi siêu cấu trúc trong vùng cá ngựa [16] Với não chuột cống bị tổn thương do thiếu máu gypenosid liều 100mg/kg hạn chế rõ rệt sự phá hủy AND và ARN [16]
- Tác động đến chức năng miễn dịch và chống khối u
Giảo cổ lam làm tăng đáp ứng miễn dịch tế bào khi chiếu xạ hoặc gây độc tế bào bằng hóa chất cyclophosphamid Với liều gypenosid toàn phần (400mg/kg) đưa
Trang 172.2.2 Các nghiên cứu tác dụng tới sinh lý sức khỏe của Giảo cổ lam
2.2.2.1 Các kết quả nghiên cứu trong nước
Do phát hiện nhiều hợp chất mới có hoạt tính sinh dược cao có trong giảo cổ lam nên nhiều nhà khoa học trong nước quan tâm nghiên cứu Các công trình nghiên cứu hóa học của tác giả Viện Dược liệu Phạm Thanh Kỳ và cộng sự (2002) [18] đã chứng minh dịch chiết từ dược liệu Giảo Cổ Lam có nhóm hợp chất saponin phong phú tương tự như saponin của nhân sâm (panax ginseng) và một lượng flavonoid Các tác giả khác Nguyễn Tiến Dẫn (1999)[11] và Ngô Quốc Luật (2008) [20] còn chứng minh được hàm lượng saponin và flavonoid dao động từ 0,01 đến 0,36%
2.2.2.2 Các nghiên cứu trên thế giới
Các nghiên cứu phát hiện ra tác dụng dược lý của giảo cổ lam được thực hiện nhiều ở Trung Quốc, Mỹ, Đức, Italia Có thể liệt kê một số nghiên cứu:
- GS Tan H, Liu Z.L, Liu MJ chứng minh giảo cổ lam có tác dụng kìm hãm
sự tích tụ tiểu cầu, làm tan cục máu đông, chống huyết khối, tăng cường lưu thông máu lên não [9]
- Lin, J.M, và cộng sự chứng minh giảo cổ lam có tác dụng chống viêm gan, chứng cao huyết áp và chống ung thư …[9]
Trang 1810
2.3 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào trong nhân giống thực vật
2.3.1 Tính toàn năng của tế bào
Năm 1902, lần đầu tiên nhà thực vật học người Đức Haberlandt đã đưa ra quan niệm: “Mỗi tế bào bất kì (đã biệt hóa) lấy từ cơ thể thực vật đều có khả năng tiềm tàng để có thể phát triển thành một cơ thể hoàn chỉnh” Theo quan niệm của sinh học hiện đại thì: “Tất cả mọi tế bào của một cơ thể đều chứa bộ gene y hệt nhau, do đó tất cả các tế bào của một cơ thể có tiềm năng tổng hợp những kiểu protein
- enzym giống hệt nhau và nếu được nuôi trong môi trường thích hợp đều có thể phát triển thành cây nguyên vẹn đặc trưng cho loài cụ thể và ra hoa, kết trái bình thường Khả năng đó của tế bào được gọi là tính toàn năng của tế bào thực vật” [22]
Tính toàn năng của tế bào chính mà Haberlandt đã đưa chính là cơ sở lí luận của nuôi cấy mô tế bào thực vật Cho đến nay, con người đã hoàn toàn chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ [22]
Tính toàn năng của tế bào nuôi cấy mô biểu hiện qua 3 giai đoạn: Tế bào phản phân hóa với sự phát sinh tế bào khả biến, sự định hướng phân hóa tế bào và
sự phát sinh hình thái, phát triển cơ quan
2.3.2 Tính phân hóa và phản phân hóa của tế bào
Theo PGS.TS Nguyễn Quang Thạch: Cơ thể thực vật trưởng thành là một chỉnh thể thống nhất bao gồm nhiều cơ quan chức năng khác nhau Tuy nhiên, tất cả các loại tế bào đó đều bắt nguồn từ một tế bào đầu tiên (tế bào hợp tử) Ở giai đoạn đầu, tế bào hợp tử tiếp tục phân chia hình thành nhiều tế bào phôi sinh chưa mang chức năng riêng biệt (chuyên hóa)
Sau đó từ các tế bào phôi sinh này chúng tiếp tục được biến đổi thành các tế bào chuyên hóa đặc hiệu cho các mô, cơ quan khác nhau của cơ thế
Tế bào phôi sinh -> Tế bào dãn -> Tế bào phân hóa có chức năng riêng biệt
Tuy nhiên, khi tế bào đã phân hóa thành các tế bào có chức năng chuyên hóa, chúng không hoàn toàn mất khả năng phân chia của mình Trong trường hợp cần thiết, ở điều kiện thích hợp, chúng lại có thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân
Trang 1911
chia mạnh mẽ cho ra các tế bào mới có khả năng tái sinh thành cây hoàn chỉnh Quá trình này gọi là quá trình phản phân hóa tế bào, ngược lại với phân hóa tế bào
2.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.4.1 Vật liệu nuôi cấy
Vật liệu nuôi cấy là nguồn nguyên liệu khởi đầu cho quá trình nhân giống in
vitro Do đó, việc lựa chọn vật liệu nuôi cấy thích hợp là cần thiết Đối với cây giảo
cổ lam, vật liệu khởi đầu cho nhân giống vô tính in vitro đoạn thân non chứa mắt ngủ Các vật liệu này cần được đảm bảo vô trùng trước khi tiến hành nuôi cấy in
vitro Phương pháp vô trùng vật liệu thông dụng nhất hiện nay là sử dụng các chất
hóa học Đối với các thí nghiệm nuôi cấy giảo cổ lam in vitro, tôi sử dụng đoạn thân
non chứa mắt ngủ đã qua khử trùng bằng cồn 70% và HgCl2 0,1%, NaClO 1,0% để
phục vụ cho việc nhân giống in vitro
2.4.2 Điều kiện nuôi cấy
Điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái của tế bào và mô
trong quá trình nuôi cấy in vitro Trong đó, ánh sáng, nhiệt độ và độ ẩm là ba điều
kiện có vai trò quan trọng nhất Hiện nay, trong các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô người ta thường bố trí thời gian chiếu sáng thích hợp từ 12-18 giờ/ngày, cường độ ánh sáng từ 2000-2500 lux, nhiệt độ từ 250C-270C, ẩm độ từ 70-75% để tạo điều kiện thích hợp cho mô nuôi cấy phát triển [22]
2.4.3 Môi trường dinh dưỡng
Môi trường dinh dưỡng là điều kiện cần thiết và là yếu tố quyết định đến quá
trình phân hóa và phản phân hóa của tế bào Hầu hết các môi trường dinh dưỡng sử
dụng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật bao gồm các thành phần chính sau:
- Nguồn cacbon: là yếu tố quan trọng hàng đầu đối với sự sinh trưởng và phát triển của mô nuôi cấy, được bổ sung vào môi trường dưới dạng đường đã hòa tan Hiện
nay, trong nuôi cấy in vitro người ta thường sử dụng đường saccarose, một số trường
hợp có thể sử dụng glucose và fructose thay thế [22]
- Muối khoáng đa lượng, vi lượng: các nguyên tố khoáng đa lượng là một trong những thành phần thiết yếu cần cho việc cung cấp nguyên liệu để tế bào, mô thực vật xây dựng nên thành phần cấu trúc của mình Đặc biệt, nó có vai trò quan
Trang 2012
trọng tham gia vào thành phần axit nucleic, axit amin, tham gia cấu tạo màng tế bào, [22] Bên cạnh khoáng đa lượng, khoáng vi lượng có vai trò kích thích sự hoạt động của nhiều enzyme và xúc tác cho các phản ứng sinh hóa xảy ra trong tế bào
- Các vitamin: Trong quá trình nuôi cấy in vitro, các vitamin cần được sung vào
môi trường với nồng độ thích hợp Đặc biệt là các vitamin nhóm B như: B1, B2,B3, B5,
B6 Trong đó, B1 đượcxem là vitamin quan trọng nhất cho sự phát triển của thực vật [22]
- Các chất điều hòa sinh trưởng: Trong môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật, các chất điều hòa sinh trưởng có vai trò kích thích sự phát triển của mô nuôi cấy theo ý muốn Đối với các thí nghiệm nghiên cứu trên đối tượng cây giảo cổ lam tôi
sử dụng các chất điều hòa sinh trưởng sau: BA (6-Benzylaminnopurine), GA3(gibberellic acid), IBA (β - Indol butyric acid), NAA (α -Napthalene acetic acid) để điều khiển sự phát sinh hình thái và tái sinh cây giảo cổ lam hoàn chỉnh
- Agar: Đây cũng là một trong những thành phần có vai trò cung cấp dinh
dưỡng cho mô nuôi cấy Đặc biệt, trong nuôi cấy tĩnh agar có tác dụng làm rắn hóa môi trường nuôi cấy Nồng độ agar thường dùng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật là từ 0,4-0,8% [22]
- pH: Là yếu tố quan trọng ảnh hưởng rất rõ đến khả năng duy trì trao đổi các chất trong tế bào Thông thường trong môi trường nuôi cấy pH thích hợp nhất là 5,6-5,8 [22]
2.5 Phương pháp nhân giống thực vật
2.5.1 Phương pháp nhân giống truyền thống
2.5.1.1 Nhân giống bằng hạt
Nguyên lý dựa trên quá trình tạo cây con từ hạt, hạt được hình thành do sự thụ tinh của tế bào hạt phấn và tế bào noãn, cây mới mọc mang đặc tính của cả bố
và mẹ hoặc nghiêng hẳn về bố hoặc mẹ
Chất lượng hạt giống: Thu hoạch để lấy hạt giống tốt nhất vào thời điểm quả
đã chuyển sang màu xanh đen Khối lượng 1000 hạt khô đạt 6,3 g, với độ ẩm hạt là 10,97% [19]
Trang 2113
2.5.1.2 Nhân giống bằng cách giâm cành
Phương pháp này dựa trên khả năng hình thành rễ phụ (rễ bất định) của các đoạn cành đã cắt rời khỏi thân mẹ (hoặc các đoạn rễ)
Nguyên tắc chung là chọn những cành lưng chừng tán, ngoài bìa tán và những cành ở cấp cành cao (những cành không mang hoa, quả và những cành ổn định sinh trưởng chưa lâu) [23]
Thời gian sinh trưởng của giảo cổ lam là 160 ngày, trong đó thời gian ra rễ, mầm và nhánh là khoảng 30 - 39 ngày Sử dụng cành hom bánh tẻ để nhân giống cây con là tốt nhất, cũng có thể tận dụng cả hom già, chỉ cần để lại hom 3 - 4 mắt là hợp lý
và đỡ tốn nguyên liệu Thời gian phù hợp để tiến hành giâm hom là từ tháng 2 đến tháng 4
Nếu áp dụng phương pháp vô tính (giâm cành hom) để nhân giống cây con, nhanh có hiệu quả, tuy nhiên nếu vận chuyển đi xa để phát triển vùng trồng thì bất tiện hơn so với hạt đi gieo [19]
2.5.2 Phương pháp hiện đại
Thông thường Gynostemma pentaphyllum có thể được nhân giống bằng gieo
trồng bằng hạt, giâm hom hai phương pháp này phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên …do
đó việc tiềm ra phương pháp nhân giống có hiệu quả đã và đang được nhiều nhà khoa học tiến hành nghiên cứu (Trần Đức Thiện và cs, 2010; Anchalee Jala và cs, 2012) [24], [28] Một trong những phương pháp được lựa chọn hiện nay là phương pháp
nuôi cấy mô tế bào Việc nghiên cứu nhân giống vô tính in vitro mở ra một hướng
mới cho việc nhân, giữ giống cây Giảo cổ lam
- Ưu điểm của nhân giống vô tính in vitro:
+ Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành được số lượng
lớn cây giống trong thời gian ngắn từ một mô, cơ quan của cây với một kích thước nhỏ khoảng 0,1-10mm
+ Hoàn toàn tiến hành trong môi trường vô trùng nên cây giống tạo được sẽ không bị nhiễm bệnh, sử dụng vật liệu sạch virus và có khả năng nhân nhanh giống sạch bệnh virus
Trang 2214
+ Hoàn toàn chủ động điều chỉnh các tác nhân, điều chỉnh khả năng tái sinh của cây
- Tuy nhiên, phương pháp nhân giống vô tính in vitro cũng có hạn chế như:
+ Mặc dù có hệ số nhân giống lớn nhưng cây giống tạo ra có kích thước nhỏ
và đôi khi xuất hiện dạng cây không mong muốn
+ Cây nhân giống in vitro được cung cấp nguồn hydrocacbon nhân tạo nên khả năng tự tổng hợp các hợp chất hữu cơ kém Đồng thời, cây giống in vitro được
nuôi dưỡng trong bình thủy tinh hoặc bình nhựa nên độ ẩm không khí thường bão hòa Do đó, khi trồng ra điều kiện tự nhiên cây thường bị mất cân bằng nước, gây
hiện tượng cây bị héo và chết [23] Vì vậy, trước khi chuyển cây từ điều kiện in
vitro ra điều kiện tự nhiên cần phải trải qua giai đoạn huấn luyện để cây quen dần
với điều kiện bên ngoài có độ ẩm không khí thấp và ánh sáng mạnh
2.6 Tình hình sản suất và sử dụng dược liệu trên thế giới và Việt Nam
2.6.1 Tình hình sản suất và sử dụng dược liệu trên thế giới
Cây thuốc được sử dụng ở các nước trên thế giới từ rất lâu đời, cây thuốc là nguồn dược liệu để chế ra các loại thuốc mà các loại thuốc này chiếm 30% tổng giá trị thuốc trên toàn thế giới Nhu cầu sử dụng thuốc thảo mộc và dược liệu là rất lớn Trong những năm gần đây thị trường thế giới về dược liệu diễn ra rất sôi động Theo Tewari nghiên cứu về cây thuốc từ thảo mộc, sản phẩm y tế, dược phẩm, chất phụ gia dược phẩm và mỹ phẩm ngày càng tăng Thị trường chiếm 60 tỷ USD/năm
và tăng với tỷ lệ 7% riêng với thị trường thuốc thảo mộc đạt 20,3 tỷ USD, trên thực
tế năm 2003 tăng gần 10% so với năm 2000 [6], [7]
Theo tài liệu của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) năm 1985, trong tổng số khoảng 250.000 loài thực vật bậc thấp cũng như bậc cao đã biết, khoảng 20.000 loài được sử dụng làm thuốc ở mức độ khác nhau Trong đó, Ấn Độ được biết trên 6000 loài; Trung Quốc trên 5000 loài; riêng về thực vật có hoa ở một vài nước Đông
Nam Á đã có tới 2000 loài là cây thuốc [26]
Năm 2004, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) đã có tài liệu hướng dẫn thực hành
nông nghiệp tốt đối với cây thuốc (Guidelines on good agricultural and collection
practices for medicinal plants) Tài liệu đã đưa ra những hướng dẫn cụ thể từ chọn
Trang 2315
cây thuốc, chọn vùng trồng trọt thích hợp, kỹ thuật trồng, chăm sóc, thu hoạch và bảo quản sau thu hoạch Đây là một hướng dẫn và là thước đo chất lượng sản phẩm dược liệu khi trở thành sản phẩm hàng hóa trên Thế giới Trung Quốc và Nhật Bản
là hai nước đã dựa trên tài liệu hướng dẫn này để xây dựng khung quy định chung cho sản xuất cây dược liệu, nhằm đưa cây dược liệu và các sản phẩm dược liệu trở thành sản phẩm hàng hóa trên toàn Thế giới
Trong vài thập kỷ gần đây, các nước trên thế giới đã đẩy mạnh việc nghiên cứu các chế phẩm mới từ cây thuốc Ở Mỹ, 25% các đơn thuốc được pha chế tại các cửa hàng dược gồm các chất chiết từ cây cỏ, 13% từ các loài vi sinh và 3% từ động vật với nhu cầu hàng tỷ USD/ năm Ở Trung Quốc, có 940 xí nghiệp và xưởng sản xuất thuốc từ cây cỏ với 6266 mặt hàng; doanh thu các thuốc từ cây cỏ chiếm 33,1% thị trường thuốc năm 1995; tổng giá trị xuất khẩu dược liệu và thuốc cổ truyền từ năm 1997 đạt 600 triệu USD Hiện nay, Trung Quốc có chủ trương đầu tư mạnh cho công tác nghiên cứu dược liệu, đã tự túc được khoảng 90% nhu cầu thuốc trong nước, trong đó thuốc sản xuất từ nguồn gốc thực vật chiếm ưu thế [25]
Như vậy, con người đã nghiên cứu về các loại cây thuốc từ rất lâu đời Ban đầu, những nghiên cứu về cây thuốc chỉ dừng lại ở mức mô tả các đặc điểm và cách
sử dụng theo kinh nghiệm cổ truyền Ngày nay, khi khoa học kỹ thuật phát triển, đã
có nhiều nghiên cứu sâu hơn về hoạt chất chính có tác dụng trong cây thuốc, tạo sự tin tưởng cho người bệnh khi sử dụng các sản phẩm thuốc có nguồn gốc từ cây cỏ
2.6.2 Tình hình sản suất và sử dụng dược liệu ở Việt Nam
Việt Nam nằm trong vành đai khí hậu nhiệt đới gió mùa, nước ta có nguồn tài nguyên thực vật vô cùng phong phú và đa dạng Theo GS.TS Phạm Hoàng Hộ
và GS.TS Nguyễn Nghĩa Thìn, số lượng thực vật bậc cao có mạch đã thống kê được
ở nước ta khoảng 10.500 loài, dự đoán khoảng 12.000 loài Trong đó các loài cây được sử dụng làm thuốc khoảng trên 3900 loài thuộc 307 họ thực vật [26]
Qua quá trình nghiên cứu tính cho đến nay đã có hơn 3.800 loài thực vật được dùng làm thuốc, một số cây thuốc quý đã được nhân dân trồng trọt và trở lên quen thuộc Ngoài sự phong phú về chủng loại, nguồn dược liệu Việt Nam còn có giá trị to lớn khi được sử dụng rộng rãi trong cộng đồng để chữa nhiều chứng bệnh khác nhau, dưới dạng độc vị hoặc phối hợp với nhau để tạo nêu các bài thuốc bổ đã
Trang 2416
tồn tại và lưu truyền qua nhiều thế hệ Nhiều loại thuốc được chiết xuất từ dược liệu Việt Nam như Rutin, D.strophantin, berberin, palmatin, astermisin…bên cạnh đó sản phẩm từ tinh dầu được sử dụng rộng rãi trong nước và xuất khẩu ra nhiều nước trên thế giới Xu hướng đi sâu nghiên cứu xác minh các kinh nghiệm từ y học cổ truyến và tìm kiếm các hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao để làm thuốc từ dược liệu ngày càng được quan tâm [27], [1], [12]
Ở Việt nam, Viện dược liệu kết hợp với Trung tâm Sâm và Dược liệu TP.HCM cùng các địa phương cho thấy: đến năm 2005 trong cả nước có tất cả 3,948 loài cây thuốc thuộc 1,572 chi và 307 họ thực vật vượt qua con số 3,200 loài trong “Từ điển cây thuốc Việt Nam” [9]
2.7 Nghiên cứu nhân giống giảo cổ lam bằng nuôi cấy mô tế bào
Thông thường giảo cổ lam có thể được nhân giống bằng gieo trồng hạt cao,
phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên …do đó việc tiềm ra phương pháp nhân giống có hiệu quả đã và đang được nhiều nhà khoa học tiến hành nghiên cứu (Trần Đức Thiện và cs, 2010; Anchalee Jala và cs, 2012) [24],[28] Một trong những phương pháp được lựa chọn hiện nay là phương pháp nuôi cấy mô tế bào Việc nghiên cứu
nhân giống vô tính in vitro mở ra một hướng mới cho việc nhân, giữ giống cây giảo
cổ lam
- Ưu điểm của nhân giống vô tính in vitro:
+ Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành được số lượng
lớn cây giống trong thời gian ngắn từ một mô, cơ quan của cây với một kích thước nhỏ khoảng 0,1-10mm
+ Hoàn toàn tiến hành trong môi trường vô trùng nên cây giống tạo được sẽ không bị nhiễm bệnh, sử dụng vật liệu sạch virus và có khả năng nhân nhanh giống sạch bệnh virus
+ Hoàn toàn chủ động điều chỉnh các tác nhân, điều chỉnh khả năng tái sinh của cây
- Tuy nhiên, phương pháp nhân giống vô tính in vitro cũng có hạn chế như:
+ Mặc dù có hệ số nhân giống lớn nhưng cây giống tạo ra có kích thước nhỏ
và đôi khi xuất hiện dạng cây không mong muốn
Trang 25hiện tượng cây bị héo và chết [23] Vì vậy, trước khi chuyển cây từ điều kiện in
vitro ra điều kiện tự nhiên cần phải trải qua giai đoạn huấn luyện để cây quen dần
với điều kiện bên ngoài có độ ẩm không khí thấp và ánh sáng mạnh
Trang 2618
PHẦN 3 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Vật liệu, hóa chất và thiết bị nghiên cứu
3.1.1 Vật liệu
Sử dụng nguồn vật liệu là giống giảo cổ lam 5 lá (Gynostemma pentaphyllum
(Thunb.) Makino), thu thập từ Ngân Sơn - Bắc Kạn Được trồng tại vườn lan khoa CNSH - CNTP
3.1.2 Hóa chất và thiết bị sử dụng
- Các muối đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần của môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962); các chất kích thích sinh trưởng: BAP (Duchefa), IAA (Trung quốc), GA3 (Duchefa), IBA (Duchefa), NAA (Trung Quốc)
- Các thiết bị thí nghiệm chính dùng cho nghiên cứu bao gồm: Cân điện tử (Olhous- Vietlabcu) (Mỹ), nồi hấp khử trùng ALP (Nhật Bản), tủ sấy Memmert (Đức), tủ cấy vô trùng cấp II Airtech (Hàn Quốc), máy chuẩn pH Hanna HI2210 (Đức), lò vi sóng Sanyo (Nhật Bản), tủ lạnh Sanyo (Nhật bản), micropipette,
Ngoài ra còn có các trang thiết bị khác của phòng thí nghiệm khoa Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm
3.2 Điều kiện thí nghiệm
- Thí nghiệm được tiến hành trong phong nuôi cấy mô tế bào thực vật
- Môi trường nuôi cấy: Môi trường cơ bản MS bổ sung các chất khác nhau tùy theo từng thí nghiệm, pH 5,6 - 5,8
- Môi trường được hấp khử trùng ở 121oC trong thời gian 20 phút
- Nhiệt độ phòng nuôi: 25 ± 1o
- Thời gian nuôi cấy chiếu sáng: 16h sáng/ngày + 8h tối/ngày
- Cường độ chiếu sáng 2000 - 2500 lux
Trang 2719
3.3 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật, Khoa CNSH - CNTP,
Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
- Thời gian nghiên cứu: Từ 12/2013 đến 06/2014
3.4 Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng NaOCl 1%, HgCl20,1% đến khả năng tạo vật liệu vô trùng
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BA đến cảm ứng chồi
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NAA đến khả năng nhân nhanh chồi
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ GA3 đến khả năng kéo dài chồi
- Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IBA đến khả năng ra rễ
3.5 Phương pháp nghiên cứu
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử trùng bằng dung dịch NaClO 1%, HgCl 2 0,1% đến khả năng tạo vật liệu vô trùng
- Cách tiến hành:
Khử trùng sơ bộ: Các mẫu khi loại bỏ các phần không cần thiết, mẫu được rửa bằng nước xà phòng loãng và tráng sạch dưới vòi nước Mẫu được cắt rồi đưa vào trong box cấy khử trùng
Khử trùng bằng cồn 70o trong 1 phút, tráng bằng nước cất khử trùng 3-4 lần Sau đó khử trùng bằng NaClO 1,0% hoặc HgCl2 0,1% trong 7 phút, tráng bằng nước cất khử trùng 5-7 lần Đưa mẫu ra đĩa peptri có đặt giấy thấm để mẫu ráo nước Dùng dao số 11 cắt mẫu kích thước khoảng 2-3 cm chứa phần mắt ngủ để nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung thêm agar 5 g/l + sacarose 30 g/l, mỗi bình cấy 1 mẫu rồi đưa vào phòng nuôi cấy
