Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý, lâm sàng ở trâu gây nhiễm trypanosoma evansi và ứng dụng KIT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trên đàn trâu, bò tại thái nguyên

Ứng dụng KIT huyết thanh trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò ở một số địa phương của huyện Đồng Hỷ tỉnh Thái Nguyên .... Tỷ lệ phát hiện trâu nhiễm tiên mao trùng bằng một số

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

BÒ TẠI THÁI NGUYÊN”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

Hệ đào tạo : Chính quy

Chuyên ngành : Thú y

Khoa : Chăn nuôi thú y

Khóa học : 2009 - 2014 Giảng viên hướng dẫn : TS Mai Anh Khoa

Thái Nguyên, tháng 11 năm 2013

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình học tập và thực tập tốt nghiệp em luôn nhận được

sự quan tâm, hướng dẫn và giúp đỡ tận tình của các thầy, cô giáo trong Khoa Chăn nuôi Thú y cùng với sự giúp đỡ của bạn bè và đồng nghiệp

Lời đầu tiên em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban giám hiệu nhà trường, Ban chủ nhiệm khoa và các thầy, cô giáo, cán bộ Khoa Chăn nuôi Thú y - Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình giúp đỡ em trong suốt thời gian học tập tại trường

Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn sâu sắc tới cô giáo GS.TS Nguyễn Thị Kim Lan, cô giáo Th.s Nguyễn Thị Bích Đào và cô giáo Th.s Đỗ Thị Vân Giang đã trực tiếp giúp đỡ, hướng dẫn em hoàn thành khóa luận này

Em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, bạn

bè và đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên, khích lệ em hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp này

Cuối cùng em xin kính chúc các thầy, cô và cán bộ công nhân viên của Khoa của trường luôn mạnh khỏe, thành đạt và hạnh phúc

Em xin trân thành cám ơn !

Thái Nguyên ngày 25 tháng 11 năm 2013

Sinh viên

Lê Văn Điệp

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 4.1 Thời gian T evansi bắt đầu xuất hiện và thời gian trâu gây nhiễm có

biểu hiện lâm sàng 31

Bảng 4.2 Diễn biến thân nhiệt của trâu gây nhiễm 32

Bảng 4.3 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu ở trâu gây nhiễm 38

Bảng 4.4 Sự thay đổi một số chỉ tiêu sinh lý máu trâu sau gây nhiễm 39

Bảng 4.5 Bệnh tích đại thể chủ yếu của trâu bị bệnh tiên mao trùng do

gây nhiễm 40

Bảng 4.6 Tỷ lệ nhiễm T evansi ở trâu, bò trên một số địa phương của huyện Đồng Hỷ tỉnh Thái Nguyên 42

Bảng 4.7 Tỷ lệ phát hiện của KIT CATT trong số mẫu huyết thanh (+) 43

Bảng 4.8 Tỷ lệ phát hiện của KIT ELISA trong số mẫu huyết thanh (+) 44

Bảng 4.9 Tỷ lệ trâu nhiễm tiên mao trùng qua ứng dụng KIT CATT và KIT ELISA chẩn đoán 45

Bảng 4.10 So sánh khả năng phát hiện tiên mao trùng của KIT CATT và KIT ELISA với phương pháp tiêm truyền chuột bạch 46

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1: Cấu tạo của Trypanosoma 5

Hình 4.1: Đồ thị diễn biến thân nhiệt của trâu gây nhiễm 1 33

Hình 4.2: Đồ thị diễn biến thân nhiệt của trâu gây nhiễm 2 33

Hình 4.3: Đồ thị diễn biến thân nhiệt của trâu gây nhiễm 3 34

Hình 4.4: Đồ thị diễn biến thân nhiệt của trâu đối chứng 1 34

Hình 4.5: Đồ thị diễn biến thân nhiệt của trâu đối chứng 2 35

Hình 4.6: Đồ thị diễn biến thân nhiệt của trâu đối chứng 3 35

Hình 4.7: Đồ thị so sánh diễn biến thân nhiệt của trâu ở lô gây nhiễm và

lô đối chứng 36

CÁC CHỮ VIẾT TẮT

cs : Cộng sự CATT : Card Agglutination Trypanosomiasis Tet ELISA : Enzym - Linked Immunosobent Assay

HE : Hematoxilin - Eosin kADN : Kinettopplast Acid Nucleic Deoxyribose LATEX : Latex Agglutination Tet

NSC : Nguyên sinh chất Nxb : Nhà xuất bản TMT : Tiên mao trùng

Tr : Trang

T : Trypanosoma

PBS : Dung dịch muối đệm photphat

µ : micro

MỤC LỤC

Trang

Phần 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

1.3.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Cơ sở khoa học của đề tài 3

2.1.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại tiên mao trùng 3

2.1.1.1 Phân loại tiên mao trùng ký sinh ở gia súc nhai lại 3

2.1.1.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo của tiên mao trùng 4

2.1.1.3 Cấu trúc kháng nguyên của tiên mao trùng Trypanosoma evansi 5

2.1.2 Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng 7

2.1.2.1 Phân bố của bệnh 7

2.1.2.2 Vật chủ và vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng 8

2.1.2.3 Tuổi vật chủ, mùa mắc bệnh 10

2.1.3 Đặc điểm bệnh lý và lâm sàng của bệnh 10

2.1.3.1 Đặc điểm bệnh lý 10

2.1.3.2 Triệu chứng lâm sàng của bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò 11

2.1.3.3 Bệnh tích của bệnh tiên mao trùng 13

2.1.4 Những phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng 13

2.1.4.1 Chẩn đoán lâm sàng 13

2.1.4.2 Chẩn đoán thí nghiệm 13

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước 19

2.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 20

Phần 3: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

3.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 23

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 23

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 23

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 24

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu 24

3.2.2 Thời gian nghiên cứu: 3/06/2013 đến ngày 18/11/2013 24

3.3 Nội dung nghiên cứu 24

3.3.1 Đặc tính gây bệnh của T evansi trên trâu gây nhiễm 24

3.3.2 Ứng dụng KIT huyết thanh trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò tại huyện Đồng Hỷ tỉnh Thái Nguyên 24

3.3.2.1 Thiết lập phương pháp 24

3.3.2.2 Ứng dụng KIT huyết thanh trong chẩn đoán bệnh do T evansi gây ra trên đàn trâu, bò ở huyện Đồng Hỷ tỉnh Thái Nguyên 24

3.4 Phương pháp nghiên cứu 25

3.4.1 Phương pháp lấy mẫu 25

3.4.2 Phương pháp phát hiện tiên mao trùng trong mẫu 25

3.4.2.1 Phương pháp xem tươi (Direct smear) 25

3.4.2.2 Phương pháp nhuộm Giemsa tiêu bản máu khô (Ramanovsky) 25

3.4.2.3 Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm 26

3.4.3 Phương pháp đếm tiên mao trùng trong máu động vật gây nhiễm và xác định liều gây nhiễm 26

3.4.3.1 Phương pháp xác định số tiên mao trùng/ml máu chuột bạch 26

3.4.3.2 Phương pháp xác định liều gây nhiễm 27

3.4.4 Gây nhiễm T evansi cho trâu thí nghiệm 27

3.4.5 Phương pháp xác định các chỉ tiêu theo dõi ở trâu 27

3.4.5.1.Phương pháp xác định thời gian T evansi bắt đầu xuất hiện trong máu trâu gây nhiễm 27

3.4.5.2 Phương pháp theo dõi thân nhiệt và triệu chứng lâm sàng 27

3.4.5.3 Phương pháp mổ khám bệnh tích 28

3.4.5.4 Phương pháp làm tiêu bản vi thể 28

3.4.6 Phương pháp so sánh khả năng phát hiện tiên mao trùng của KIT chẩn đoán với phương pháp tiêm truyền chuột bạch 28

3.4.7 Các bước thực hiện phản ứng CATT 28

3.4.8 Các bước thực hiện phản ứng ELISA 28

3.5 Phương pháp xử lý số liệu 29

Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 Đặc tính gây bệnh của T evansi trên trâu gây nhiễm 31

4.1.1 Thời gian T evansi bắt đầu xuất hiện và thời gian trâu gây nhiễm có biểu hiện lâm sàng 31

4.1.2 Diễn biến thân nhiệt của trâu gây nhiễm 32

4.1.3 Triệu chứng lâm sàng chủ yếu của trâu sau gây nhiễm 38

4.1.4 Sự thay đổi một số chỉ tiêu máu ở trâu gây nhiễm 39

4.1.5 Bệnh tích đại thể chủ yếu của trâu bị bệnh tiên mao trùng do

gây nhiễm 40

4.1.6 Biến đổi vi thể ở một số nội quan của trâu bệnh do gây nhiễm 41

4.2 Ứng dụng KIT huyết thanh trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò ở một số địa phương của huyện Đồng Hỷ tỉnh Thái Nguyên 42

4.2.1 Tỷ lệ nhiễm T evansi ở trâu, bò trên một số địa phương của huyện Đồng Hỷ tỉnh Thái Nguyên 42

4.2.2 Tỷ lệ phát hiện của KIT CATT trong số mẫu huyết thanh (+) 43

4.2.3 Tỷ lệ phát hiện của KIT ELISA trong số mẫu huyết thanh (+) 44

4.2.4 Tỷ lệ phát hiện trâu nhiễm tiên mao trùng bằng một số phương pháp chẩn đoán 45

4.2.5 So sánh khả năng phát hiện tiên mao trùng của KIT CATT và KIT ELISA với phương pháp tiêm truyền chuột bạch 45

Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 47

5.1 Kết luận 47

5.2 Tồn tại 47

5.3 Đề nghị 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

I Tài liệu tiếng việt 49

II Tài liệu tiếng Anh 51

Theo số liệu của Phạm Sỹ Lăng (1982) [9], Phan Địch Lân (2004) [11], Phan Văn Chinh (2006) [2], bệnh tiên mao trùng xuất hiện ở nhiều vùng trên cả nước, với tỷ lệ mắc khá cao: trên trâu là 13 - 30%, trên bò là 7 - 14%, trong đó tỷ lệ gia súc chết/gia súc mắc lên tới 6,3 - 20%

Cũng theo báo cáo của các tác giả trên, tỷ lệ mắc Trypanosoma evansi

ở gia súc vùng núi và trung du cao hơn các vùng đồng bằng và ven biển Trong khi đó, ở nước ta, chăn nuôi gia súc nhai lại để cung cấp sức kéo, thịt, sữa lại tập trung chủ yếu ở các tỉnh miền núi và trung du - là các vùng có điều kiện tự nhiên thích hợp cho sự phát triển chăn nuôi gia súc nhai lại, nhưng cơ sở hạ tầng phục vụ công tác chẩn đoán và điều trị tại địa phương còn yếu kém; dẫn tới hệ quả là bệnh tiên mao trùng trở nên phổ biến hơn, nghiêm trọng hơn và gây thiệt hại lớn hơn Tỉnh Thái Nguyên cũng là một trong những tỉnh miền núi có tỷ lệ trâu, bò có khả năng bị mắc bệnh tiên mao trùng cao

Hiện nay nước ta đã sử dụng nhiều phương pháp chẩn đoán bệnh tiên mao trùng như: phương pháp chẩn đoán truyền thống, phương pháp chẩn đoán huyết thanh học, phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử Trong đó, phương

pháp chẩn đoán huyết thanh học được đánh giá là có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho kết quả nhanh và có khả năng chẩn đoán với số lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn

Từ những năm 1964 - 2006 các tác giả Trịnh Văn Thịnh, Đoàn Văn Phúc, Phan Địch Lân, Phạm Sỹ Lăng, Lê Ngọc Mỹ, Lương Tố Thu, Vương Thị Lan Phương, Phan Văn Chinh… đã nghiên cứu về bệnh tiên mao trùng ở vùng đồng bằng và ven biển Tuy nhiên, những nghiên cứu về bệnh tiên mao trùng ở miền núi còn rất hạn chế, vì vậy chưa có biện pháp chẩn đoán và phòng trị bệnh hiệu quả cao

Để có cơ sở khoa học đề xuất biện pháp chẩn đoán lâm sàng và chẩn đoán huyết thanh học góp phần giải quyết những khó khăn trong công tác chẩn đoán và chủ động phòng chống bệnh, chúng tôi thực hiện đề tài:

“Nghiên cứu đặc điểm bệnh lý, lâm sàng ở trâu gây nhiễm Trypanosoma evansi và ứng dụng KIT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trên đàn trâu, bò tại Thái Nguyên”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Xác định đặc điểm bệnh lý, lâm sàng của bệnh tiên mao trùng gây ra trên trâu

Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT huyết thanh học ứng dụng trong chẩn đoán nhanh bệnh tiên mao trùng cho trâu, bò ở tỉnh Thái Nguyên

1.3 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài

1.3.1 Ý nghĩa khoa học

Kết quả của đề tài là những thông tin khoa học về đặc điểm bệnh lý và lâm sàng bệnh tiên mao trùng ở trâu gây nhiễm Về khả năng ứng dụng, quy trình sử dụng và hiệu quả của KIT huyết thanh học trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng cho trâu, bò

1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn

Đề tài giúp các cơ quan thú y và người chăn nuôi áp dụng biện pháp chẩn đoán nhanh bệnh tiên mao trùng, từ đó có biện pháp phòng chống nhằm

hạn chế tỷ lệ nhiễm và thiệt hại do T evansi gây ra; góp phần nâng cao năng

suất chăn nuôi; thúc đẩy ngành chăn nuôi trâu, bò phát triển

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Cơ sở khoa học của đề tài

Bệnh tiên mao trùng được Blanchard (1888) phát hiện đầu tiên ở Việt Nam Sau đó, bệnh được xác định là phổ biến ở hầu hết các tỉnh thành trong

cả nước Bệnh do loài tiên mao trùng Trypanosoma evansi gây ra Trâu, bò,

ngựa mắc bệnh dễ chết hoặc thiếu máu, suy nhược, giảm hoặc mất khả năng sinh sản và sức sản xuất

2.1.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc và phân loại tiên mao trùng

2.1.1.1 Phân loại tiên mao trùng ký sinh ở gia súc nhai lại

Theo Levine et al (1980) (dẫn theo Lương Văn Huấn và cs, 1997) [5], vị

trí của tiên mao trùng trong hệ thống phân loại nguyên bào (Protozoa) như sau:

Ngành Sarcomastigophora

Phân ngành Mastigophora

Lớp Zoomastigophorasida

Bộ Kinetoplastorida Phân bộ Trypanosomatorida

Họ Trypanosomatidae Donein, 1901 Giống Trypanosoma Gruby, 1843 Giống phụ Megatrypanum Hoare, 1964

Loài Trypanosoma (M) theileria Giống phụ Herpetosoma Donein, 1901

Loài Trypanosoma (H) leisi Giống phụ Schizotrypanum Chagas, 1909

Loài Trypanosoma (S) cruzi Giống phụ Duttonella Chalmers, 1918

Loài Trypanosoma (D) vivax Loài Trvpanosoma (D) uniform Giống phụ Nalmomonas Hoare, 1964

Loài Trypanosoma (N) congolense Loài Trypanosoma (N) siminae

Loài Trypanosoma (N) vanhogi Giống phụ Trypanozoon Liihe, 1906

Loài Trypanosoma (T) brucei Loài Trypanosoma (T) gambience Loài Trypanosoma (T) rhodesiense Loài Trypanosoma (T) equiperdum Giống phụ Pycnomonas Hoare, 1964

Loài Trypanosoma (P) suis Giống phụ Trypanosoma Gruby, 1843

Loài Trypanosoma evansi (Steel, 1885)

Trong các loài tiên mao trùng trên, có 7 loài được tổ chức dịch tễ quốc tế

(OIE) thông báo là có khả năng gây bệnh cho người và động vật có vú, đó là: T brucei, T congolense, T cruzi, T evansi, T gambiense, T siminae, T vivax 2.1.1.2 Đặc điểm hình thái, cấu tạo của tiên mao trùng

Tiên mao trùng T evansi được xếp vào loại đơn hình thái, cơ thể chỉ là

một tế bào, có kích thước nhỏ, chiều dài 18 - 34 µm (trung bình là 25 µm), chiều rộng 1,5 - 2 µm Cơ thể có hình suốt chỉ mảnh hoặc hình thoi, cuối thân

nhọn Nhìn chung, cấu trúc cơ bản của T evansi cũng giống như cấu trúc của các loài tiên mao trùng khác thuộc họ Trypanosomatidae Cấu trúc từ ngoài

vào trong được chia thành 3 phần chính:

- Vỏ: ngoài cùng là lớp vỏ dày 10 - 15 nm, vỏ được chia làm 3 lớp (lớp ngoài và lớp trong cùng tiếp giáp với nguyên sinh chất dầy hơn lớp giữa) Lớp

vỏ ngoài cùng được cấu tạo từ các phân tử glycoprotein luôn biến đổi (Vanant Glycoprotein Surface - VGS) Tiếp giáp với lớp trong cùng là 9 cặp vi ống xếp song song dọc theo chiều dài thân tiên mao trùng Chính nhờ sự sắp xếp của các cặp vi ống nên tiên mao trùng có dạng hình suốt chỉ mảnh (Hoare,

1972 [30]; Phạm Sỹ Lăng, 1982 [9]; Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [4])

- Nguyên sinh chất: gồm lớp trong và lớp ngoài Trong nguyên sinh chất có chứa các nội quan: ribosome có màu thẫm xen kẽ vùng không bào màu sáng, kinetoplast (thể cơ động), mitochrondno, reticulum (lưới nội bào) và mạng lưới golgi

- Nhân: nhân tiên mao trùng có chứa ADN, hình bầu dục hoặc hình trứng

Nhân thường nằm ở vị trí trung tâm hoặc gần vị trí trung tâm cơ thể Ngoài nhân,

về phía cuối thân còn có thể kinetoplast chứa ADN (KADN) Từ kinetoplast có một roi chạy vòng quanh thân lên đầu và ra phía ngoài cơ thể thành một roi tự

do Roi của tiên mao trùng có lớp vỏ ngoài cùng giống lớp vỏ của thân Trong roi có 9 cặp vi ống ở xung quanh và một cặp ở trung tâm, xếp song song dọc chiều dài roi (Hoare, 1972 [30]; Nguyễn Quốc Doanh, 1999 [4])

Hình 2.1: Cấu tạo của Trypanosoma

A - roi trước; B - Các khung tế bào phức tạp tiềm ẩn; C - Nhân; D - Ty thể;

E - Các kinetoplast (bộ gen ti thể); F - Thể đặc; G - Túi roi; H - Phần thân chính; I - Golgi; J - Lưới nội sinh chất K - Màng nhấp nhô L - Tập tin đính kèm của roi vào màng nhấp nhô M - Chỗ tiếp xúc roi với thân (Dẫn theo Nguyễn Thị Kim Lan, 2011 [8])

2.1.1.3 Cấu trúc kháng nguyên của tiên mao trùng Trypanosoma evansi

Kháng nguyên của T evansi gồm hai loại: kháng nguyên ổn định

(kháng nguyên không biến đổi) và kháng nguyên biến đổi

* Kháng nguyên ổn định (kháng nguyên không biến đổi)

Phần lớn các thành phần kháng nguyên tiên mao trùng không biến đổi trong quá trình sống ký sinh Bằng phương pháp điện di miễn dịch huyết

thanh thỏ tối miễn dịch với T evansi Có ba loại kháng nguyên không biến

đổi ở màng nguyên sinh chất tế bào (ISG: Invanant Surface Glycoprotein): ISG 65, ISG 75 và ISG 100 Do cấu trúc không gian ba chiều và đặc tính ưa nước, các loại này không kết hợp với kháng thể của vật chủ

* Kháng nguyên biến đổi

Về kháng nguyên biến đổi, cần đề cập đến sự biến đổi lớp vỏ bề mặt VSG (Variant Surface Glycoprotein), những quan điểm mới về sự xuất hiện kháng nguyên biến đổi của tiên mao trùng và cơ chế di truyền của kháng nguyên biến đổi

Nhờ kháng thể đặc hiệu được đánh dấu mà Vickerman và Luckins (1988) [39] đã phát hiện ra sự biến đổi của lớp kháng nguyên bề mặt Lớp áo

bề mặt của tiên mao trùng có thành phần là glycoprotein bao phủ toàn bộ bề mặt tế bào bằng một lớp phân tử giống nhau (mỗi tiên mao trùng có 107 phân tử) Lớp áo bề mặt này kích thích cơ thể vật chủ tạo ra kháng thể đặc hiệu với từng type kháng nguyên biến đổi VAT (Variable Antigen Type) Chỉ có kháng nguyên biến đổi mới có khả năng kích thích vật chủ tạo miền dịch chủ động Người ta ước lượng rằng, một con tiên mao trùng có ít nhất vài trăm hoặc vài nghìn VSG, nghĩa là 5 - 10% số gen của tiên mao trùng cung cấp cho kháng nguyên bề mặt này

Nhiều tác giả nghiên cứu về miễn dịch học cho rằng, tiên mao trùng biến đổi kháng nguyên bề mặt để né tránh miễn dịch đặc hiệu của vật chủ Những quan điểm này là hoàn toàn mới để lý luận về sự xuất hiện kháng nguyên biến đổi của tiên mao trùng Như vậy, quan điểm về sự biến đổi kháng nguyên lớp vỏ của tiên mao trùng cho đến nay vẫn chưa thống nhất

* Cơ chế di truyền của kháng nguyên biến đổi

Khi kháng thể đặc hiệu kết hợp với phân tử của kháng nguyên bề mặt (VSG), làm tiêu tan tiên mao trùng thì đó cũng là nguyên nhân chính thúc đẩy

sự hoạt hoá của gen Kết quả là các phân tử kháng nguyên VSG được thay đổi hoàn toàn bằng các phân tử VSG mới Lúc này, kháng thể đặc hiệu lúc trước

đã không còn tác dụng đối với kháng nguyên mới này

Theo Barry và Tumer (1991) [25], Vanhamme và cs (1995) [38], các VSG được mã hoá nhờ các gen chuyên biệt Từ kho chứa hàng nghìn gen

khác nhau, một gen VSG được hoạt hoá một cách chọn lọc, dẫn đến tổng hợp

ra một loại kháng nguyên VSG Mỗi bên VSG mới tạo ra một loại kháng nguyên VSG mới Trong bộ gen của tiên mao trùng tồn tại một số lớn gen VSG, các gen này sử dụng nhiều cơ chế sắp xếp khác nhau, do vậy tiên mao trùng đã tạo ra nhiều VSG khác nhau ở gia súc bị bệnh mãn tính Cơ chế biến đổi kháng nguyên theo 2 cách: cách thứ nhất là, sử dụng lần lượt các điểm biểu hiện trên (expression side) khác nhau, không có sự sắp xếp của ADN Các điểm biểu hiện khác nhau sẽ mang các gen VSG khác nhau, sự luân phiên này dẫn đến sự thay đổi type kháng nguyên Cơ chế này quan sát được chủ yếu ở giai đoạn đầu của quá trình cảm nhiễm Có lẽ ở giai đoạn đầu này chưa

có đáp ứng miễn dịch của vật chủ đối với VSG, chính điều này không gây ra một cản trở hoạt hoá tự nhiên của các điểm biểu hiện gen này Cách thứ hai

là, tập hợp lại các đoạn ADN khác nhau để tái tổ hợp gen, mà việc tái tổ hợp này cho phép thay thế hoàn toàn hoặc từng phần gen; hoặc việc thay thế diễn

ra dựa vào sự chuyển đổi gen chứ không phải dựa vào tái tổ hợp gen Trường hợp này được diễn giải như sau: một gen hoạt hoá được thay thế bằng bản sao chép của một gen khác Do có sự thay thế một phần của gen nên đã tạo ra loại gen phức hợp và đặc trưng

2.1.2 Dịch tễ học bệnh tiên mao trùng

2.1.2.1 Phân bố của bệnh

Bệnh tiên mao trùng phân bố rất rộng, từ phía Tây sang phía Đông bán cầu Phía Tây bán cầu thuộc châu Mỹ, phía Đông bán cầu trải dài từ châu Phi cho đến Philippine

Theo Davison (1999) [27] bệnh phổ biến ở trâu, bò, ngựa các nước nhiệt đới ở châu Phi,châu Á và Nam Mỹ

Ở châu Phi, bệnh trải dài từ Tây sang Đông, phía Bắc qua vùng sa mạc Sahara, dọc theo bờ biển Atlantique Địa trung hải

Bệnh tiên mao trùng xảy ra với tên gọi "bệnh Surra” ở Ả rập Saudi,

Yêmen, Sultanate, Ả Rập thống nhất, Thổ Nhĩ Kỳ, Israel, Syrie, Afganistan, Pakistan

Ở châu Á, bệnh xuất hiện ở Trung Á (thuộc Liên Xô cũ), Ấn Độ, Malaysia, bán đảo Đông Dương, Trung Quốc, Indonexia, Philippine

Ở châu Âu, bệnh xuất hiện ở Bungaria (nay đã được thanh toán), hiện chỉ còn ở vùng Volga và Nam Capcase (Liên Xô cũ)

Ở châu Mỹ, bệnh xuất hiện ở Trung Mỹ, Nam Mỹ, đặc biệt phổ biến ở Brazil, Mexico, Venezuela, Colombia

Châu Úc cũng đã được xác định là có bệnh tiên mao trùng (Reid, 2002 [34]; Losos G T., 1972 [31]) cho rằng, bệnh tiên mao trùng phổ biến nhất ở châu Á và châu Phi, từ Ấn Độ đến Srilanca, Trung Quốc, Indonexia, Thái Lan, Lào, Camphuchia, Iran, Philippine

Ở Việt Nam, bệnh tiên mao trùng thấy ở hầu hết các vùng sinh thái khác nhau: miền núi, trung du, đồng bằng, ven biển Theo Phạm Sỹ Lăng (1982) [9], bệnh tiên mao trùng có ở tất cả các tỉnh miền Bắc (Bắc Kạn, Lạng Sơn, Tuyên Quang, Thái Nguyên, Ninh Bình, Hà Tây) Trâu, bò nhiễm bệnh với tỷ lệ cao và thay đổi giữa các vùng khác nhau (trâu, bò ở đồng bằng nhiễm tiên mao trùng cao hơn vùng trung du và miền núi, đặc biệt ở trâu, bò

có nguồn gốc từ miền núi chuyển xuống vùng đồng bằng)

2.1.2.2 Vật chủ và vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng

Trong tự nhiên, tiên mao trùng ký sinh ở hầu hết các loài thú nuôi và thú hoang, thấy nhiều hơn ở trâu, bò, ngựa, trâu bò rừng, hươu, nai, hổ, báo,

sư tử, chó, mèo, lạc đà, voi thỏ, chuột cống, chuột lang, chuột bạch , nhưng không ký sinh ở người

Sự lây truyền tiên mao trùng từ trâu, bò ốm sang trâu, bò khoẻ là nhờ

các loài ruồi hút máu (thuộc họ phụ Stomoxydinae) và các loài mòng hút máu (thuộc họ Tabanidae) Ruồi và mòng hút máu của gia súc bị bệnh, hút luôn cả

tiên mao trùng vào vòi hút, sau đó lại hút máu gia súc khoẻ, trong khi hút máu

sẽ truyền tiên mao trùng từ vòi hút vào máu con vật khoẻ Sự lây truyền này mang tính chất cơ học Như vậy, ruồi và mòng hút máu là những vật môi giới truyền bệnh tiên mao trùng quan trọng

Theo Phan Địch Lân (1974) [10], Phan Địch Lân (1994, 2004) [11], phần lớn các loài mòng tập trung ở khu vực miền núi và trung du Trong 53 loài mòng thì có tới 44 loài phân bố ở vùng rừng núi có độ cao dưới 1 000 mét so với mặt nước biển, càng lên cao số loài càng ít dần (độ cao trên 1 000 mét chỉ có 26 loài) Ở vùng trung du (rừng thưa, độ cao không quá 500 mét so

với mặt nước biển có 27 loài; vùng đồi trọc chỉ có 9 - 11 loài; vùng rừng núi ven biển phát hiện chỉ có 8 loài Những loài mòng phổ biến ở tất cả các vùng

là: Tabanus rubidus, T striatus, Chrysops dispar, Chrysozoma assamensis

Những loài mòng chỉ gặp ở vùng núi là: Tabanus flavistriatus, T fumifer, Chrysops vander Miền Bắc nước ta có 4 loài ruồi hút máu, 2 loài phổ biến ở tất cả các vùng là Stomoxys calcitrans và Liperosis exigua; 2 loài chỉ thấy ở những vùng sinh cảnh đặc biệt: loài Bdellolarynx sanguinolentus (chỉ xuất hiện ở vùng có độ cao dưới 1.000mét), loài Stomoxys indica (chỉ thấy ở

vùng núi Cẩm Thuỷ - Thanh Hoá)

Phan Địch Lân (1994, 2004) [11] cho biết, kiểm tra ở nhiều địa điểm

thấy hai loài mòng T rubidus và T striatus mang tiên mao trùng với tỷ lệ 15,2% và 14,0%; ruồi hút máu Stomoxys calcitrans mang tiên mao trùng với tỷ

lệ 12,5% Ở những vùng đang có bệnh tiên mao trùng, kiểm tra ruồi và mòng hút máu dễ dàng tìm thấy tiên mao trùng Sau khi theo máu vào vòi hút ruồi và mòng, tiên mao trùng vẫn sống đến giờ thứ 53, thời gian hoạt động mạnh nhất

là từ giờ thứ nhất đến giờ thứ 34 trung bình là 24giờ Sự hoạt động của tiên mao trùng yếu dần từ giờ thứ 35 đến 42 Từ 46 - 53 giờ thì tiên mao trùng ngừng hoạt động

Hình thái tiên mao trùng khi ở trong vòi ruồi, mòng biến đổi theo thời gian: từ 1 - 34 giờ có hình thái, kích thước bình thường; 35 - 45 giờ; tiên mao trùng có hình dạng thay đổi, tăng kích thước chiều rộng và thô dần; 46 -

53 giờ; tiên mao trùng trương to, duỗi thẳng, mất khả năng di động và ngừng hẳn hoạt động

Thực nghiệm đã chứng minh khả năng gây bệnh của tiên mao trùng sau

khi xâm nhập vào mòng Tabanus rubidus như sau: Thời gian từ giờ thứ 1 đến

thứ 5, tiên mao trùng có khả năng gây bệnh và làm chết chuột bạch tương tự như khi truyền thẳng máu có tiên mao trùng cho chuột; từ giờ thứ 6 đến thứ 7 chỉ còn 30% số chuột thí nghiệm phát bệnh, thời gian gây bệnh kéo dài và thời gian chết của chuột cũng dài Điều này có thể giải thích là do độc lực của tiên mao trùng giảm dần và số lượng tiên mao trùng còn hoạt lực gây bệnh

cũng giảm dần sau khi chúng xâm nhập vào mòng Tabanus rubidus

2.1.2.3 Tuổi vật chủ, mùa mắc bệnh

Trâu, bò và các loài gia súc khác ở mọi lứa tuổi đều nhiễm tiên mao trùng và đều phát bệnh, có thể dẫn đến tử vong hoặc suy nhược, thiếu máu, giảm sức đề kháng, giảm khả năng sinh đẻ và sức sản xuất

Phan Địch Lân (1994, 2004) [11] đã tổng hợp kết quả điều tra 3.172 trâu ở các tỉnh đồng bằng: Trâu dưới 3 năm tuổi nhiễm thấp nhất (3,2 - 6,l %), trâu 3 - 5 tuổi nhiễm cao hơn (6 - 12,7%), trâu 6 - 8 tuổi nhiễm cao nhất (12,9

- 14,8%), trâu trên 9 năm tuổi tỷ lệ nhiễm giảm thấp hơn trâu 3 - 8 năm tuổi

Theo Phan Văn Chinh (2006) [2], tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng cao nhất ở

4 - 8 năm tuổi (trâu: 12,71%; bò: 5,77%), thấp nhất là trâu, bò dưới 3 năm tuổi (6,92% và 2,31%) Mùa lây lan bệnh thường xảy ra trong các tháng nóng

ẩm, mưa nhiều (từ tháng 4 đến tháng 9) Thời gian này điều kiện sinh thái thuận lợi cho các loài ruồi, mòng phát triển, hoạt động mạnh Hút máu súc vật

và truyền tiên mao trùng

Theo Luckins (1988) [32], sự xuất hiện lượng lớn ruồi, mòng trong mùa mưa nóng ẩm luôn có liên quan đến tình hình dịch tễ bệnh tiên mao trùng

ở trâu, bò, dê, lạc đà Từ cuối mùa thu, mùa đông và đầu mùa xuân, trâu bò nhiễm tiên mao trùng phải sống trong điều kiện thời tiết lạnh, thiếu thức ăn nên sức đề kháng giảm, bệnh thường phát ra vào thời gian này và trâu bò bị

đổ ngã hàng loạt Tiên mao trùng có sức đề kháng yếu, dễ chết khi tiếp xúc với nước cất, cồn và thuốc sát trùng

2.1.3 Đặc điểm bệnh lý và lâm sàng của bệnh

2.1.3.1 Đặc điểm bệnh lý

Khi ruồi trâu, mòng đốt, hút máu và truyền tiên mao trùng vào trâu, bò, ngựa, tiên mao trùng xâm nhập vào da, gây ra vết viêm trên mặt da Ta có thể quan sát được phản ứng viêm ở da của thỏ, cừu, dê và bò gây nhiễm thực nghiệm tiên mao trùng, kích thước chỗ viêm phụ thuộc vào số lượng tiên mao trùng được tiêm truyền (ước chừng khoảng 108 tiên mao trùng có thể gây viêm da - ở vị trí tiêm truyền), một số lượng lớn tiên mao trùng phát triển ở tại chỗ viêm này

Vào máu, tiên mao trùng nhân lên theo cấp số nhân ở trong máu, trong bạch huyết và ở trong các mô khác của cơ thể vật chủ theo cách phân chia

theo chiều dọc Số lượng tiên mao trùng trong máu không phải lúc nào cũng như nhau Mật độ tiên mao trùng thay đổi theo ngày Biểu đồ sóng tiên mao trùng cho thấy, xen kẽ giữa những sóng tiên mao trùng mạnh là những đợt sóng yếu Mỗi đợt sóng tiên mao trùng bắt đầu bằng sự tăng số lượng tiên mao trùng trong máu, sau đó giảm và khó phát hiện thấy tiên mao trùng Mỗi đợt tiên mao trùng tăng lên trong máu là biểu hiện sự xuất hiện một quần thể tiên mao trùng có tính kháng nguyên bề mặt mới, quần thể này có thể tiếp tục sinh sản và tồn tại một thời gian cho đến khi cơ thể xuất hiện kháng thể đặc hiệu với chúng

Tiên mao trùng phát triển nhanh trong máu, tiêu thụ Glucose và các chất đạm, chất béo và khoáng chất trong máu ký chủ bằng phương thức thẩm thấu qua bề mặt cơ thể để duy trì hoạt động và sinh sản Ở súc vật bị bệnh, trong 1 ml máu có thể có 10.000 - 30.000 tiên mao trùng Với số lượng nhiều như vậy, tiên mao trùng chiếm đoạt dinh dưỡng nhiều, làm cho súc vật bệnh gây còm, thiếu máu và mất dần khả năng sản xuất sữa, thịt, mất dần khả năng sinh sản và giảm sức đề kháng với các bệnh khác

Sống trong máu vật chủ, tiên mao trùng còn tạo ra độc tố Trypanotoxin,

độc tố này gồm: độc tố do tiên mao trùng tiết ra qua màng thân trong quá trình sống và độc tố do xác chết của tiên mao trùng phân huỷ trong máu sau

15 - 30 ngày Độc tố của tiên mao trùng tác động lên hệ thần kinh trung ương làm rối loạn trung khu điều hoà thân nhiệt, gây sốt cao và gián đoạn (lúc sốt, lúc hết sốt xen kẽ nhau) Khi sốt thường có rối loạn về thần kinh (kêu rống, run rẩy, ngã vật xuống) Độc tố cũng phá huỷ hồng cầu, ức chế cơ quan tạo máu làm cho vật chủ thiếu máu và suy nhược dần Độc tố còn tác động tới bộ máy tiêu hoá, gây rối loạn tiêu hoá, làm con vật ỉa chảy Hội chứng tiêu chảy thường xảy ra khi xuất hiện tiên mao trùng trong máu con vật bệnh

Khi tăng lên với số lượng lớn trong máu, tiên mao trùng còn làm tắc các mao mạch, làm tăng tính thấm thành mạch, dần dần tạo ra các ổ thuỷ thũng chất keo vàng dưới da

2.1.3.2 Triệu chứng lâm sàng của bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò

Trâu, bò bị bệnh thể hiện các triệu chứng lâm sàng chủ yếu như sau:

- Sốt cao và gián đoạn: sau 14 - 30 ngày bị ruồi, mòng hút máu truyền

tiên mao trùng, trâu bò thường đột ngột lên cơn sốt (40 - 41,70C) kéo dài 2 - 4 ngày rồi giảm, thời gian sau nhiệt độ lại tăng lên Thời gian gián đoạn giữa hai cơn sốt dài hay ngắn tuỳ theo thể trọng con vật Khi sốt, kiểm tra máu thường thấy tiên mao trùng

- Hội chứng thần kinh: ở một số trâu, bò khi lên cơn sốt còn thể hiện hội chứng thần kinh như điên loạn, mắt đỏ ngầu, húc đầu vào tường, chạy vòng quanh kêu rống lên Trường hợp nhẹ thấy run rẩy từng cơn, mắt trợn ngược rồi đổ ngã vật xuống, sùi bọt mép giống như trâu bị cảm nắng Sau 20 -

30 phút con vật lại đứng dậy đi lại được Những trâu bò mắc bệnh có triệu chứng lâm sàng như trên thường là mắc bệnh ở thể cấp tính

Trâu, bò bị bệnh mạn tính thường kéo dài, cơ thể suy yếu, liệt hai chân sau, nằm tư thế quỳ và không đi lại được Mặc dù nằm liệt nhưng vẫn ăn và nhai lại cho đến khi sắp chết

- Phù thũng dưới da: phù thũng thường thấy ở vùng thấp của cơ thể như

ở bốn chân (từ khớp khuỷu trở xuống), phần yếm, ngực, bộ phận sinh dục

- Viêm giác mạc và kết mạc mắt: triệu chứng này thấy ở hầu hết trâu,

bò bệnh Mắt có dử trắng hay vàng, chảy liên tục, nếu nặng thì mắt sưng đỏ ngầu Khi khỏi bệnh, mắt có màng trắng (củi nhãn) kẻo che kín giác mạc

- Hội chứng tiêu hoá: một số trâu, bò bệnh bị ỉa chảy nặng, phân lỏng, màu vàng, sau chuyển màu xám, có lẫn bọt và chất nhầy Các đợt ỉa chảy tiếp theo những cơn sốt cách quãng Ỉa chảy trong bệnh tiên mao trùng thường dai dẳng và con vật vẫn ăn được

- Gầy yếu, suy nhược: ở thể bệnh cấp tính trâu, bò gầy sút nhanh, chỉ sau 7 - 14 ngày từ khi phát bệnh con vật đã gầy rộc, mắt trũng sâu Nếu bệnh kéo dài thì con vật gầy xơ xác, lông dựng ngược, da khô nhăn nheo, niêm mạc mắt nhợt nhạt, lông dễ rụng, dần dần suy nhược cơ thể nặng, mất khả năng cày kéo và sinh sản Nếu gặp điều kiện bất lợi như thiếu ăn, rét mướt thì trâu,

bò dễ chết Trong thực tế, có khoảng 3% trâu bệnh ở thể ẩn vẫn béo khoẻ, làm việc bình thường khi được chăm sóc nuôi dưỡng tốt

Tình trạng thiếu máu thể hiện rõ trong bệnh do T evansi gây ra Theo

Davison (1999) [27], số lượng hồng cầu và hàm lượng huyết sắc tố giảm, số lượng bạch cầu tăng, thành phần bạch cầu thay đổi: bạch cầu lymphô, bạch

cầu ái toan tăng nhưng bạch cầu trung tính giảm, protein tổng số và Albumin giảm rõ rệt

2.1.3.3 Bệnh tích của bệnh tiên mao trùng

Trâu, bò bị bệnh tiên mao trùng khi chết gầy xơ xác, mổ khám thấy có những biến đổi bệnh tích đại thể rõ rệt ở hệ tuần hoàn và hô hấp: tim nhão, xoang bao tim tích nước vàng; phổi xung huyết và tụ máu từng đám nhỏ; gan sưng to, nhạt màu; lách sưng, mềm nhũn và nhạt màu; hạch lâm ba sưng và có

tụ máu trong hạch; cơ nhão, màu nhợt nhạt, nhát cắt rỉ nước; xoang ngực và xoang bụng tích dịch màu vàng nhạt; có những đám keo nhầy vàng dưới vùng

2.1.4.2 Chẩn đoán thí nghiệm

Có nhiều phương pháp chẩn đoán tiên mao trùng trong phòng thí nghiệm, mục đích là phát hiện tiên mao trùng trong máu gia súc Tùy từng trường hợp bệnh, tuỳ điều kiện mà có thể làm cùng lúc một số phương pháp hoặc lựa chọn một phương pháp phù hợp và có độ chính xác cao

* Phương pháp phát hiện tiên mao trùng trực tiếp:

Muốn phát hiện tiên mao trùng trực tiếp, có thể áp dụng những phương pháp sau:

- Phương pháp xem tươi (Direct smear)

Khi bệnh súc sốt, T evansi thường xuất hiện trong mao quản ngoại vi;

vì vậy, nên lấy máu vùng ngoại vi để xem tươi Cho 1 giọt máu nhỏ lên phiến

kính đã có sẵn 1 giọt Natri citrat 3,8%; dùng góc của la men khuấy đều, đậy la men lên để máu dàn theo la men thành một lớp mỏng Soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 10 và 10 x 20) để phát hiện tiên mao trùng sống

- Phương pháp nhuộm Giemsa tiêu bản máu khô (Romanovsky)

+ Phương pháp giọt dầy: Đặt 1 giọt máu to vào giữa phiến kính, dùng một góc của đầu một phiến kính khác ria tròn giọt máu với đường kính khoảng 1 - 1,25 cm Để khô tự nhiên trong khoảng 1 giờ, rồi cố định bằng cồn Methanol, nhuộm Giemsa (Pha giemsa mẹ với nước cất theo tỷ lệ 1:9) trong

25 phút Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ, để khô rồi soi dưới kính hiển

vi (độ phóng đại 10 x 100)

Phương pháp này có nhược điểm là dễ làm tổn thương tiên mao trùng,

do đó khó phân biệt được các loài khác nhau trong trường hợp nhiễm nhiều loài tiên mao trùng cùng một lúc

+ Phương pháp giọt mỏng: Đặt 1 giọt máu cách 1 đầu phiến kính 2 cm, dùng la men ria máu thành một lớp mỏng Để khô, cố định bằng cồn Methanol trong 2 phút Nhuộm Giemsa trong 25 phút (Pha giemsa mẹ với nước cất theo tỷ lệ 1:9) Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ, để khô, soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 100)

Ưu điểm của phương pháp giọt mỏng là có thể phân biệt được hình thái các loài tiên mao trùng khác nhau

+ Phương pháp làm tan hồng cầu: dung dịch SDS (Sodium Dodecyl Sulfat) là chất làm tan hồng cầu Nhờ dung dịch SDS, tiên mao trùng dễ dàng được phát hiện trong máu Dung dịch SDS rất độc nên tránh tiếp xúc với da

và tránh hút bằng pipet Dung dịch SDS dễ bảo quản ở nhiệt độ thường trong nhiều tháng

* Phương pháp tập trung tiên mao trùng:

Người ta đã sử dụng phương pháp ly tâm tập trung tiên mao trùng bằng ống Haematocrit hoặc tách tiên mao trùng bằng gen DEAE - cellulose

- Phương pháp ly tâm tập trung bằng ống Haematocrit (Woo, 1971 [41]): cho máu động vật nghi mắc bệnh vào ống Haematocrit, một đầu ống được bịt kín bằng chất dẻo matit, một đầu ống để hở Ly âm với tốc độ 14.000 vòng/phút trong 5 phút Sau đó kiểm tra sự tập trung của tiên mao trùng tại vị

trí tiếp giáp giữa huyết tương và hồng cầu (độ phóng đại 10 x 10)

Phương pháp này đơn giản, phát hiện tiên mao trùng tốt hơn phương pháp xem tươi và nhuộm Giemsa Song, tỷ lệ phát hiện chưa cao

Với ống Haematocrit trên, có thể thực hiện phương pháp Darkground: dùng cưa y tế cắt ống ở vị trí tiên mao trùng tập trung (ranh giới giữa huyết tương và hồng cầu), nhỏ 1 giọt huyết tương lên phiến kính, đậy la men và kiểm tra dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 40)

* Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm:

Đây là phương pháp phổ biến, hiệu quả, chính xác và thường được ứng dụng nhiều để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở Việt Nam Phương pháp này

có ưu điểm là chính xác, do trực tiếp phát hiện thấy tiên mao trùng sau khi nhân chúng lên trong động vật thí nghiệm mẫn cảm Song, nhược điểm của phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm là khi cần chẩn đoán nhanh, với

số lượng nhiều và thời gian ngắn thì phương pháp này không thể đáp ứng được (Lê Ngọc Mỹ, 1994 [14]; Đoàn Văn Phúc và cs, 1994 [17])

* Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học:

Bằng phương pháp huyết thanh học, có thể phát hiện kháng thể hoặc kháng nguyên tiên mao trùng Đây là các phương pháp huyết thanh học đặc hiệu

- Các phương pháp phát hiện kháng thể kháng tiên mao trùng

Khi tiên mao trùng ký sinh, cơ thể vật chủ sinh ra kháng thể đặc hiệu chống lại tiên mao trùng Những phương pháp sau cho phép phát hiện kháng thể kháng tiên mao trùng trong máu vật chủ:

+ Phương pháp ngưng kết trên phiến kính (SAT: Slice Agglutination Test): hoà tan 1 giọt huyết thanh gia súc nghi mắc bệnh vào 1 giọt nước muối sinh lý trên phiến kính, sau đó cho 1 giọt máu chuột bạch có nhiều tiên mao trùng vào, trộn đều, đậy la men và soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 20 hoặc 10 x 40) Nếu thấy ngưng kết hình hoa cúc là (+) và ngược lại là (-) Phương pháp này đơn giản, dễ làm và có thể áp dụng trên diện rộng

+ Phương pháp LATEX (Latex Agglutination Test)

LATEX là phương pháp được dùng để phát hiện kháng thể lưu động có trong máu của gia súc mắc bệnh tiên mao trùng

Nguyên lý của phương pháp LATEX: khi kháng nguyên bề mặt T

evansi gắn lên các hạt latex kết hợp với kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao

trùng ở trên bản nhựa, thì sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên với kháng thể Hiện tượng ngưng kết có thể quan sát được bằng mắt thường,

và được giải thích là do kháng nguyên bề mặt tiên mao trùng được gắn lên các hạt latex là loại kháng nguyên hữu hình, có nhiều điểm quyết định tính kháng nguyên bề mặt (epitop surface) Còn kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng lại có nhiều điểm thụ thể (receptor) tương ứng, đặc hiệu với các điểm quyết định của kháng nguyên Do đó, khi kháng nguyên tiên mao trùng gặp kháng thể đặc hiệu kháng tiên mao trùng, sẽ có hiện tượng một phân tử kháng thể đặc hiệu liên kết với nhiều phân tử kháng nguyên và ngược lại Kết quả là các hạt latex cùng với kháng nguyên chụm lại, tạo thành đám ngưng kết có thể quan sát bằng mắt thường Kháng nguyên dùng cho phản ứng là kháng

nguyên bề mặt được tinh chế từ chủng T evansi không nhuộm màu

Phương pháp này có thể ứng dụng trong kiểm tra dịch tễ và có thể ứng dụng ở cơ sở Tuy nhiên tỷ lệ phát hiện bệnh không cao do phương pháp này cho kết quả dương tính cả khi con vật khỏi bệnh nhưng vẫn còn kháng thể tồn tại trong huyết thanh; mặt khác, đối với những súc vật mới nhiễm bệnh TMT trong huyết thanh chưa có kháng thể nên khi kiểm tra bằng phương pháp LATEX sẽ cho kết quả âm tính

+ Phương pháp CATT (Card Agglutination Test for Trypanosomiasis) Đây là phương pháp ngưng kết trực tiếp giữa kháng nguyên và kháng thể trên bản nhựa, được dùng để phát hiện kháng thể lưu động trong máu động vật nhiễm bệnh

Nguyên lý: kháng nguyên TMT đã được nhuộm màu kết hợp với kháng thể tạo thành những đám kết tủa li ti màu xanh

Cách tiến hành: dùng ống hút 2,5 ml dung dịch buffer cho vào lọ kháng nguyên chuẩn đã được nhuộm màu (CATT reagent), lắc đều Cho vào lọ kháng nguyên đối chứng (đối chứng dương, đối chứng âm) mỗi lọ 0,5 ml dung dịch buffer, lắc đều Dùng micropipette pha loãng huyết thanh theo tỷ lệ cần chẩn đoán (1/8) Cho các mẫu huyết thanh cần chẩn đoán đã được pha loãng lần lượt vào các vòng tròn của bản CATT, cho kháng nguyên đối chứng vào hai vòng tròn khác của bản, mỗi loại 1 giọt (tương đương 45µl) Sau đó

cho vào tất cả các vòng tròn trên bản CATT 1 giọt kháng nguyên chuẩn Dùng que nhựa trộn đều Cuối cùng cho lên máy lắc 5 phút (60 - 70 lần/ phút) và đánh giá kết quả

+ Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp IFAT (Indirect Fluorescent Antibody Test) Phản ứng này là phản ứng huyết thanh học đặc hiệu có độ nhạy cao, được ứng dụng rộng rãi trong phòng thí nghiệm và thực địa Ngoài việc được dùng làm phản ứng chuẩn để so sánh với các phương pháp huyết thanh khác, phương pháp IFAT còn được dùng trong nghiên cứu các dòng kháng nguyên, phát hiện kháng thể (Luckins, 1988 [32]; Davison,

1999 [27])

Trong phương pháp IFAT, huyết thanh dương chuẩn được lấy từ trâu

bò mắc bệnh tiên mao trùng, huyết thanh âm chuẩn được lấy từ trâu bò khoẻ mạnh, huyết thanh cần chẩn đoán là huyết thanh lấy từ gia súc nghi mắc bệnh

Ứng dụng phương pháp này ở Việt Nam, Lương Tố Thu và cs (1994) [31] đã chế tạo conjugate huỳnh quang trên thỏ kháng IgG của bò để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng Độ pha loãng của conjugate tự chế sử dụng cho phản ứng là 1/8 và huyết thanh chuẩn pha loãng ớ 1/40 Theo Lương Tố Thu

và Lê Ngọc Mỹ (1996) [22], độ nhậy của phương pháp IFAT là 71,25%

Để tinh chế kháng nguyên T evansi dùng trong phản ứng miễn dịch

huỳnh quang gián tiếp để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò, Vương Thị

Lan Phương (2004) [18] đã nghiên cứu kháng nguyên bề mặt T evansi phân

lập từ trâu, bò ở 6 tỉnh phía Bắc Việt Nam và cho biết: đã thu được 6 mẫu tiên mao trùng từ 6 tỉnh, tiến hành phân dòng, phân VAT (Variable Antigenic Type) và thu được 26 VAT thuộc 6 kho kháng nguyên khác nhau Bằng phản ứng dung giải miễn dịch và phương pháp thấm miễn dịch, tác giả đã xác định

được sự thay đổi kháng nguyên bề mặt của T evansi: đa số các VAT của các

kho kháng nguyên khác nhau là khác nhau, chỉ có 8 VAT/26 VAI có hiệu giá kháng thể đơn giá đặc hiệu, có phản ứng chéo với các VAT của các kho kháng nguyên khác Các VAT trội xuất hiện sớm trong 4 tuần lễ đầu nhiễm bệnh, có tính kháng nguyên mạnh có thể nghiên cứu ứng dụng chế kháng nguyên chẩn đoán Từ đó, tác giả đã tinh chế kháng nguyên theo phương pháp tách tiên mao trùng để dùng trong phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, chẩn đoán

bệnh tiên mao trùng cho độ nhạy và độ đặc hiệu cao

+ Phương pháp ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay)

Phương pháp ELISA là một trong những phương pháp hiện đại nhất được ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng

Nguyên lý: dùng kháng thể hoặc kháng thể kháng Globulin (kháng kháng thể) có mang một enzym (phosphatase hoặc Peroxydase) được gắn trên mảnh Fc, cho kết hợp trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên Sau đó, cho

cơ chất sinh màu vào, cơ chất sẽ kết hợp với enzym và bị enzym phân huỷ tạo nên màu So sánh với màu của quang phổ kế sẽ định lượng được mức độ của phản ứng

Phương pháp ELISA hiện đang được sử dụng rộng rãi ở các nước trên thế giới Ở Việt Nam, Lê Ngọc Mỹ và cs (1994) [15] đã bước đầu chế kháng nguyên tiên mao trùng và ứng dụng để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở nước ta

* Các phương pháp phát hiện kháng nguyên tiên mao trùng

- Phương pháp ELISA kháng nguyên (Ag - ELISA)

Đây là phương pháp sử dụng phản ứng ELISA kháng nguyên để phát hiện kháng nguyên lưu động trong máu của gia súc nhiễm bệnh Phản ứng dựa trên kháng thể đơn dòng đặc hiệu với tiên mao trùng Lê Ngọc Mỹ và cs (1994) [15] đã bước đầu ứng dụng phương pháp này để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở Việt Nam Tuy nhiên, theo cơ quan năng lượng nguyên tử thế giới (IAEA) (1997), phương pháp ELISA kháng nguyên có độ nhậy kém hơn

so với các phương pháp phát hiện tiên mao trùng cổ điển Vì vậy, phương pháp này đã không được phổ biến trong thời gian hiện tại và tương lai (IAEA

đã không sản xuất đĩa Ag - ELISA cho nhiều nước trên thế giới)

- Phản ứng Suratex:

Phản ứng Suratex là phản ứng ngưng kết giữa các hạt latex được gắn kháng thể đơn dòng với kháng nguyên lưu động trong máu động vật nhiễm tiên mao trùng (Tamarit 2010 [35]) Phản ứng này hiện đang được thử nghiệm và đánh giá ở thực địa

- Phương pháp phát hiện ADN của tiên mao trùng bằng phản ứng PCR (plymerase Chain Reaction):

PRC là phương pháp hiện đại nhất, mới được đưa vào ứng dụng để

chẩn đoán bệnh tiên mao trùng trong những năm gần đây

Nguyên lý: dựa vào phản ứng chuỗi Polymerase để xác định sự có mặt của gen ADN của tiên mao trùng trong máu động vật nhiễm bệnh

Phương pháp PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi có trình độ kỹ thuật cao, trang thiết bị hiện đại nên hiện nay mới được tiến hành tại một số phòng thí nghiệm hiện đại

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước và ngoài nước

2.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Hồ Văn Nam (1963) [16] và Trịnh Văn Thịnh (1982) [20] cho biết trâu

bị bệnh thể cấp tính có triệu chứng sốt cao, bỏ ăn, điên loạn, chết nhanh Trâu nhiễm bệnh thể mãn tính thường sốt gián đoạn, gầy còm, thiếu máu kéo dài, viêm giác mạc, phù thũng ở bụng, liệt chân sau, chết do kiệt sức Đối với bệnh tiên mao trùng bò, những biểu hiện lâm sàng gần giống trâu, ít thấy các triệu chứng cấp tính, con vật có triệu chứng sốt gián đoạn, chậm chạp, hạch lâm ba trước đùi sưng, một số con thủy thũng ở vùng hàm, vùng cổ nhưng không đau, gần chết thì bại liệt

Lê Ngọc Mỹ và cs (1994) [15] đã điều tra tình hình nhiễm tiên mao trùng ở trâu, bò Việt Nam Kết quả cho thấy, trâu bò nhiễm tiên mao trùng với

tỷ lệ cao (21,27%), trong đó trâu, bò nuôi ở các tỉnh miền núi phía Bắc nhiễm

T evansi cao hơn ở đồng bằng

Phan Lục và Nguyễn Văn Thọ (1995) [12] cho biết: tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng của bò của một số địa phương miền Bắc là 5,9%

Theo Hà Viết Lượng (1998) [13], tỷ lệ bò nhiễm tiên mao trùng ở các tỉnh miền Trung là 8,99%

Theo Phạm Chiến và cs (1999) [1], trâu ở một số tỉnh miền Nam và Tây Nguyên nhiễm tiên mao trùng là 22,12%; bò là 6,6 - 10,3%

Nguyễn Đăng Khải (1995) [6] đã tổng hợp báo cáo của các chi cục thú

y các tỉnh miền Bắc cho thấy, số trâu, bò bị thiệt hại do bệnh tiên mao trùng như sau: Từ năm 1960 - 1965 số gia súc mắc bệnh là 1776, chết 520 con; từ năm 1979 - 1983 số gia súc ốm là 4629, chết 3243 con; từ năm 1984 - 1988

số gia súc ốm là 4028, chết 3710 con; bình quan số trâu, bò hàng năm trong thời gian này ở miền Bắc là 1871362 trâu và 894453 bò

Hồ Thị Thuận, Phan Hoàng Dũng (1996) [23] đã điều tra tình hình

nhiễm T evansi ở một số đàn bò sữa các tỉnh phía Nam như An Phước (Đồng

Nai), Đức Trọng (Lâm Đồng), Tân Thắng và các hộ chăn nuôi ở thành phố

Hồ Chí Minh, các hộ chăn nuôi gia đình ở huyện Đức Hòa (Long An), Bến Cát (Sông Bé) bằng phương pháp MI và ELISA, thấy: tỷ lệ nhiễm trung bình

là 7,97% Nhưng chỉ có trâu, bò ở Bến Cát nhiễm 9,98%; ở An Phước là 12,60%; Lâm Đồng là 2,09%; còn ở các nơi khác không có

Nguyễn Quốc Doanh (1998) [3] đã nghiên cứu về một số đặc điểm sinh

học của T evansi, bệnh học do chúng gây ra Quy trình bảo quản và sử dụng giống T evansi để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng

Vương Thị Lan Phương (2004) [18] đã tiến hành nghiên cứu về kháng

nguyên bề mặt T evansi phân lập từ miền Bắc Việt Nam, để chẩn đoán bệnh

tiên mao trùng bằng phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp

Về công tác chẩn đoán bệnh, ngoài các phương pháp cổ điển thường dùng trước đây (soi tươi, nhuộm giemsa, tiêm truyền động vật thí nghiệm) thì các phản ứng huyết thanh học như ứng ngưng kết, phương pháp huỳnh quang gián tiếp, phương pháp ELISA …có độ chính xác cao trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng

2.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Với những tiến bộ về dụng cụ quang học, những thiết bị để chẩn đoán … lĩnh vực nghiên cứu về động vật đơn bào đã có những thành tựu rất lớn Donne năm 1836 mô tả trùng roi âm đạo Laverau năm 1880 là người đầu tiên phát

hiện được ký sinh trùng sốt rét trong máu người Evans phát hiện T evansi

trong máu la và lạc đà vào năm 1880 ở Punjab ( Ấn Độ) Năm 1885, Steel phát hiện ký sinh trùng này trong máu la ở Miến Điện, mô tả đặc điểm hình

thái và đặt tên là T evansi Blanchard (1886) tìm thấy T evansi trong máu la

nhập nội vào Bắc Bộ Việt Nam và mô tả thể bệnh ở la, ngựa và bò…

Smith và Kilborme năm 1893 đã nghiên cứu về vai trò của ve mòng trong truyền bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò

Lavara và Rosail năm 1912 trong tác phẩm kinh điển nói về tiên mao trùng và bệnh do tiên mao trùng gây ra đã mô tả đầy đủ về bệnh lý học của bệnh tiên mao trùng

Ligard (1902), Rudrrink và Wiekerrman đã có những công trình nghiên cứu về cơ thể và kháng nguyên tiên mao trùng

Chen Qijun (1992) [26] cho biết: T evansi gây bệnh cho hầu hết các

loài động vật như trâu, bò, ngựa, la, chó… ở Trung Quốc

Payne RC và cs ( 1992) [33] đã nghiên cứu khả năng tăng khối lượng

trên 9 bê Holstein Friesian nhiễm T evansi do gây nhiễm Sau gây nhiễm hàng tuần kiểm tra khối lượng cơ thể bê Kết quả cho thấy nhiễm T evansi

ảnh hưởng nghiêm trọng đến khả năng tăng trọng của bê

Diall O và cs (1993) [28] đã nghiên cứu về dịch tễ học do Trypanosoma

sp gây ra ở lạc đà tại Mali Kết quả cho thấy: trong 305 mẫu kiểm tra tại Sahel có

29 mẫu dương tính; chiếm tỷ lệ 9,5% Trong 627 mẫu kiểm tra tại Tombouctou và Gao có 28 mẫu dương tính; chiếm tỷ lệ 4,5%

Tỷ lệ nhiễm theo đàn là 55% ở Tây Sahel, 68% ở Tombouctou và Gao;

ở một số đàn tỷ lệ nhiễm vượt quá 50%

Wuyts N và cs (1994) [40] cho biết: Tại Đông Nam Á, bệnh tiên mao

trùng do Trypanosoma evansi là một trong những bệnh gây thiệt hại lớn về

kinh tế cho người chăn nuôi vì nó ảnh hưởng đến sức khỏe của trâu, bò và lợn Các triệu chứng trong giai đoạn cấp tính gồm sảy thai, rối loạn hệ thống thần kinh trung ương và thậm chí là tử vong; nhiễm bệnh thể mãn tính ảnh hưởng lớn đến khả năng lao tác và năng suất của vật nuôi

Theo Aquino LP và cs (1999) [24] : chó nhiễm T evansi có triệu chứng

sốt gián đoạn, niêm mạc nhợt nhạt, phù nề, con vật gầy yếu và có thể sờ thấy các hạch bạch huyết sưng to

Ul Hasan M và cs (2006) [36] đã tiến hành một nghiên cứu nhanh để

xác định tỷ lệ nhiễm Trypanosoma evansi ở những loài mẫn cảm tại Punjab

(Pakistan) 170 ngựa và 150 lạc đà đã kiểm tra được bằng phương pháp huyết thanh học phát hiện có 6 lạc đà ( chiếm 4%) và phương pháp xác định ký sinh

trùng phát hiện 5 lạc đà ( chiếm 3,3%) nhiễm T evansi; không phát hiện ngựa

phương pháp TESA- blot có độ nhạy và độ đặc hiệu 100%; TESA - ELISA có

độ nhạy 100% và độ đặc hiệu 94,1%; epimaastigotes - ELISA có độ nhạy 100% và độ đặc hiệu 49,4%

Tamarit A và cs ( 2010) [35] cho biết: Một đợt bùng phát bệnh do

Trypanosoma evansi xảy ra ở Trung Tây Ban Nha được phát hiện Các ổ dịch

xảy ra ở trang trại ngựa, lừa và lạc đà Bằng phương pháp soi tươi đã xác định

được 76% lạc đà, 35% lừa và 2% ngựa nhiễm Trypanosoma evansi Các loài động vật đã được cách ly và điều trị bằng Cymelarsan với liều 0,5mg/kg Sau

thời gian điều trị, kiểm tra lại máu của số động vật này đều cho kết quả âm

tính với T evansi

Hari F M và cs (2011) [29] đã lựa chọn ngẫu nhiên 300 con lạc đà (

200 lạc đà đực 4 - 6 tuổi và 100 lạc đà cái 10 - 15 năm tuổi) để xác định tỷ lệ

nhiễm do T evansi Các phương pháp chẩn đoán gồm chẩn đoán lâm sàng,

nhuộm giemsa tiêu bản máu và ELISA Phương pháp nhuộm giemsa phát

hiện 6% lạc đà đực và 9% lạc đà cái nhiễm T evansi Phương pháp ELISA phát hiện 8% lạc đà đực và 24% lạc đà cái nhiễm T evansi Kết quả cho thấy

phương pháp chẩn đoán ELISA có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn phương pháp nhuộm giemsa

Phần 3 ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Bệnh tiên mao trùng do Trypanosoma evansi gây trên trâu

- KIT huyết thanh học để chẩn đoán bệnh tiên mao trùng theo nguyên

lý CATT và theo nguyên lý của phản ứng ELISA

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu

- Tiên mao trùng (Trypanosoma evansi): Được phân lập từ trâu, bò mắc

bệnh tiên mao trùng tại một số tỉnh miền núi phía Bắc và được giữ giống trong động vật thí nghiệm (dùng để gây bệnh nhân tạo cho trâu)

- Trâu khoẻ mạnh: 6 con, khối lượng 120 - 130 kg/con

- Mẫu bệnh phẩm (gan, lách, phổi, ruột, tim, thận, cơ, dịch hoàn) của trâu mắc bệnh tiên mao trùng do gây nhiễm

- Mẫu huyết thanh của trâu, bò nghi bị bệnh tiên mao trùng ở một số địa phương của tỉnh Thái Nguyên

- Hai loại KIT chẩn đoán bệnh tiên mao trùng theo nguyên lý phản ứng CATT và nguyên lý phản ứng ELISA

- Chuột bạch khoẻ mạnh, khối lượng 18 - 20 gam/con

* Hoá chất sử dụng trong nghiên cứu:

- Lamen

- Kim chích máu

- Tube tráng chất chống đông máu

- Xilanh 1 ml, 3 ml, 5 ml và kim tiêm các loại

- Chuồng nuôi động vật thí nghiệm (trâu, chuột bạch)

- Một số hóa chất và dụng cụ khác

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.2.1 Địa điểm nghiên cứu

- Địa điểm xét nghiệm mẫu: Phòng thí nghiệm khoa chăn nuôi thú y Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

- Địa phương triển khai lấy mẫu và ứng dụng: Huyện Đồng Hỷ - tỉnh Thái Nguyên

3.2.2 Thời gian nghiên cứu: 3/06/2013 đến ngày 18/11/2013

3.3 Nội dung nghiên cứu

3.3.1 Đặc tính gây bệnh của T evansi trên trâu gây nhiễm

- Thời gian xuất hiện T evansi trên trâu gây nhiễm

- Diễn biến thân nhiệt của trâu gây nhiễm

- Diễn biến lâm sàng ở trâu gây nhiễm

- Sự thay đổi một số chỉ tiêu máu ở trâu gây nhiễm

- Bệnh tích đại thể của trâu gây nhiễm

- Biến đổi vi thể ở một số nội quan của trâu bị bệnh do gây nhiễm

3.3.2 Ứng dụng KIT huyết thanh trong chẩn đoán bệnh tiên mao trùng ở trâu, bò tại huyện Đồng Hỷ tỉnh Thái Nguyên

3.3.2.1 Thiết lập phương pháp

- Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT CATT

- Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT ELISA

- So sánh khả năng phát hiện tiên mao trùng của KIT chẩn đoán với phương pháp tiêm truyền chuột bạch

3.3.2.2 Ứng dụng KIT huyết thanh trong chẩn đoán bệnh do T evansi gây ra trên đàn trâu, bò ở huyện Đồng Hỷ tỉnh Thái Nguyên

- Xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng trên trâu, bò nuôi tại Đồng Hỷ - Thái Nguyên bằng KIT CATT

- Xác định tỷ lệ nhiễm tiên mao trùng cho trâu, bò nuôi tại Đồng Hỷ - Thái Nguyên bằng KIT ELISA

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp lấy mẫu

Phương pháp lấy mẫu máu

Sát trùng cổ trâu, bò bằng cồn 700 Dùng kim trích máu vô trùng chọc ngang một tĩnh mạch cổ, cho máu chảy vào ống Tube không có tráng chất chống đông, ghi ký hiệu mẫu; tên chủ hộ; địa chỉ; ngày lấy mẫu

Phương pháp lấy mẫu huyết thanh

Lấy mẫu máu cần kiểm tra cho vào ống nghiệm, để nghiêng ống nghiệm sao cho diện tích bề mặt máu rộng tối đa Cố định ống nghiệm cho đến khi máu đông, dựng thẳng ống nghiệm lên để ở nhiệt độ thường hoặc trong tủ ấm 370C, khi thấy ra nhiều huyết thanh thì bỏ ống nghiệm vào tủ lạnh

ở nhiệt độ 4 - 60

C trong 2 - 3 tiếng để máu co lại và chắt lấy huyết thanh Sau khi chắt được huyết thanh, lấy huyết thanh ly tâm 1000 vòng/ phút để loại bỏ hồng cầu Bảo quản huyết thanh ở 200C

3.4.2 Phương pháp phát hiện tiên mao trùng trong mẫu

3.4.2.1 Phương pháp xem tươi (Direct smear)

T evansi là loại ký sinh trùng sống trong máu và trong tổ chức, trong

trường hợp mật độ ký sinh trùng trong máu thấp, tiên mao trùng sống ở trong

các vi mạch nhỏ Vì vậy có thể lấy máu ngoại vi để tìm T evansi

Cho 1 giọt máu tươi lên phiến kính đã có sẵn 1 giọt dung dịch EDTA 1%; Đặt 1 lamen lên giọt máu để dàn máu thành một lớp mỏng, sau đó soi dưới kính

hiển vi (10x20 hoặc 10x40) để phát hiện T evansi đang di động trên tiêu bản

Kết quả:

Dương tính: Thấy tiên mao trùng di động trong huyết tương

Âm tính: Chỉ nhìn thấy hồng cầu

3.4.2.2 Phương pháp nhuộm Giemsa tiêu bản máu khô (Ramanovsky)

Đặt một giọt máu cách 1 đầu phiến kính 2 cm, dùng lamen dàn máu thành một lớp mỏng Để khô, cố định bằng cồn Methanol trong 2 phút Nhuộm Giemsa trong 25 phút (Pha dung dịch giemsa mẹ với nước cất theo tỷ

lệ 1:9) Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ, soi dưới kính hiển vi (độ phóng

đại 10x100), quan sát tìm T evansi

Kết quả: Dương tính khi tìm thấy tiên mao trùng bắt màu xanh tím, nhân bắt màu tím đậm hoặc xanh thẫm Tiên mao trùng có một nhân chính và một nhân phụ, roi Hồng cầu bắt màu hồng đều

3.4.2.3 Phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm

Dùng máu tươi của trâu, bò tiêm trực tiếp cho chuột bạch (không sử dụng chất chống đông) Mỗi chuột tiêm 0,2 ml máu vào phúc mạc Theo dõi biểu hiện của chuột thí nghiệm sau tiêm truyền Mỗi ngày kiểm tra máu chuột thí nghiệm 1 lần để phát hiện tiên mao trùng bằng phương pháp soi tiêu bản máu tươi

3.4.3 Phương pháp đếm tiên mao trùng trong máu động vật gây nhiễm và xác định liều gây nhiễm

3.4.3.1 Phương pháp xác định số tiên mao trùng/ml máu chuột bạch

Tiêm truyền máu trâu có tiên mao trùng vào phúc mạc chuột bạch Khi máu chuột bạch có khoảng >100 tiên mao trùng/vi trường thì tiến hành đếm

số lượng tiên mao trùng trên buồng đếm Neubauer Các bước cụ thể như sau:

+ Dùng ống pha loãng bạch cầu hút máu đuôi chuột đến vạch 0,5 rồi hút nước muối sinh lý 0,9% đến vạch 11 (như vậy, máu được pha loãng 20 lần)

+ Bịt kín 2 đầu ống hút bằng ngón cái và ngón giữa rồi lắc ống trộn theo hình số 8 ít nhất trong 1 phút để tiên mao trùng được trộn đều trong dung dịch

+ Buồng đếm được làm sạch và khô Đậy lamen lên 2 khu vực có kẻ ô đếm Đặt buồng đếm lên mặt phẳng, lắc lại ống trộn bạch cầu và bỏ đi vài giọt đầu, sau đó nhỏ dung dịch vào khe buồng đếm (chỗ lamen đậy lên), máu pha loãng theo mao dẫn lan khắp các ô đếm

+ Hơ nhanh buồng đếm trên ngọn lửa đèn cồn trong vài giây cho tiên mao trùng yếu đi (hạn chế sự di chuyển của tiên mao trùng)

+ Đưa buồng đếm lên kính hiển vi và đếm toàn bộ số tiên mao trùng trong 4 ô nhỏ ở 4 góc và 1 ô chính giữa trong khu vực đếm hồng cầu (độ phóng đại 400 lần)

* Số tiên mao trùng trong 1 ml máu được tính bằng công thức

Số TMT/ml máu = 5.a.n.100

(a là tổng số TMT được đếm trong 5 ô của buồng đếm, n là hệ số pha loãng)