Nghiên cứu quá trình kết tinh stevioside từ dịch chiết cây cỏ ngọt

Trong lần thực tập tốt nghiệp này, được sự đồng ý của Được sự nhất trí của Ban giám hiệu nhà trường và Ban chủ nhiệm khoa CNSH-CNTP, tôi đã tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu quá trình kết

LÀNH VĂN DUY

Tên đề tài:

“NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH KẾT TINH STEVIOSIDE

TỪ DỊCH CHIẾT CÂY CỎ NGỌT”

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC

viên nói chung, thực tập tốt nghiệp là một kỳ thực tập rất đặc biệt và có ý nghĩa rất lớn, bởi đây là lần tiếp xúc với thực tế cuối cùng trước khi bước vào thực tế Trong lần thực tập tốt nghiệp này, được sự đồng ý của Được sự nhất trí của Ban giám hiệu

nhà trường và Ban chủ nhiệm khoa CNSH-CNTP, tôi đã tiến hành đề tài: “ Nghiên

cứu quá trình kết tinh stevioside từ dịch chiết cây cỏ ngọt tại bộ môn Quá trình – Thiết bị Công nghệ Hóa học trường đại học Bách Khoa Hà Nội” Nhờ sự giúp đỡ

và tạo điều kiện tận tình của thầy Trần Văn Chí , trường ĐHNL Thái Nguyên và cô Phùng Thị Anh Minh trường ĐHBK Hà Nội, cùng toàn thể các thầy cô của bộ môn Quá trình – Thiết bị Công nghệ Hóa học, tôi đã có cơ hội nghiên cứu, vận dụng,

ứng dụng, thực hành một phần những kiến thức đã học được một cách khoa học, đồng bộ, hệ thống giúp tôi rèn luyện, phát triển và hoàn thiện những kỹ năng, phẩm

chất của người kỹ sư tương lai tôi chân thành gửi lời cảm ơn tới thầy Trần Văn Chí,

cô Phùng Thị Anh Minh và ban chủ nhiệm khoa CNSH-CNTP trường đại học Nông Lâm Thái nguyên, toàn thể thầy cô của bộ môn Quá trình – Thiết bị Công nghệ Hóa học trường đại học Bách Khoa Hà Nội trong việc tạo điều kiện giúp đỡ rất lớn chúng em trong đợt thực tập này

Thái Nguyên, ngày 12 tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Lành Văn Duy

Phần 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích nghiên cứu 2

1.3 Yêu cầu 2

1.4.1 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

1.4.2 Ý nghĩa khoa học 2

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

Phần 2 :TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2 Cây cỏ ngọt 3

2.1 Giới thiệu chung 3

2.2 Phân loại khoa học [1] 3

2.3 Phân loại theo loài 3

2.4 Nguồn gốc cây cỏ ngọt 3

2.5 Mô tả cây 4

2.6 Thành phần hóa học của cây cỏ ngọt 4

2.7 Thành phần axit amin. 5

2.8 Hàm lượng khoáng chất 6

2.9 Chất diệp lục (A và B), carotenoids trong cỏ ngọt [11] 7

2.10 Các chất tạo ngọt chính trong cây cỏ ngọt [1] 7

2.10.1 Stevioside 7

2.10.2 Steviol 8

2.10.3 Steviolbioside 9

2.10.4 Rebaudioside A 9

2.10.5 Rebaudioside B 9

2.10.6 Rebaudioside C ( Dulcoside-B) 9

2.10.7 Rebaudioside D 10

2.10.8.Dulcosides A 10

2.11 Tính chất lý hóa: [10] 10

2.12 Kết tinh 12

2.12.1 Khái niệm 12

2.12.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình kết tinh 14

2.12.6 Ứng dụng và tình hình sản xuất của đường stevioside 14

Phần 3 : ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 17

3.1.1 Đối tượng 17

3.1.2 Phạm vi nghiên cứu 17

3.1.3 Hóa chất – Chất chuẩn 17

3.1.4 Dụng cụ chính và thiết bị 17

3.1.5 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 18

3.1.6 Nội dung và phương pháp nghiên cứu 18

Phần 4 : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 Sắc ký và đường chẩn của stevioside chuẩn. 31

4.2 Đánh giá hàm lượng stevioside trong cỏ ngọt 32

4.3 Hàm lượng trung bình Stevioside sau khi kết tinh đối với từng phương pháp 33

4.4 Hiệu suất kết tinh đối với từng phương pháp 36

4.4.1 Hàm lượng Stevioside sau khi kết tinh đối với từng phương pháp 36

4.5 Đánh giá chất lượng cảm quan đối với từng phương pháp 36

4.5.1 Nhận xét về cảm quan qua mắt thường. 36

4.5.2 Phương pháp kết tinh bằng kêt tinh lạnh 36

4.5.3 Phương pháp kết tinh thả mầm tinh thể 37

4.5.4 Phương pháp sấy cô đặc. 38

4.5.5 Phương pháp sấy phun 38

4.6 Đánh giá chất lượng cảm quan bằng hội đồng đánh giá 39

PHẦN 5 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40

TÀI LIỆU THAM KHẢO 41

Bảng 2.1: Thành phần của cỏ ngọt.[11] 5

Bảng 2.2 : Thành phần axit amin của cỏ ngọt [11] 6

Bảng 2.3 : Thành phần khoáng của cỏ ngọt [11] 7

Bảng 2.4 : Thành phần chất màu của cỏ ngọt 7

Bảng 3.1: Hệ số trọng lượng đánh giá cảm quan 28

Bảng 3.2: Thang điểm đánh giá cảm quan 29

Bảng 3.3: Thang điểm đánh giá chất lượng 30

Bảng 4.1: hàm lượng stevioside kết tinh bằng phương pháp kết tinh bằng phương pháp kết tinh lạnh 33

Bảng 4.2: hàm lượng stevioside kết tinh bằng phương pháp thả mầm tinh thể 34

Bảng 4.3: hàm lượng stevioside kết tinh bằng phương pháp cô đặc sấy 35

Bảng 4.5: hiệu suất kết tinh của các phương pháp 36

Bảng 4.6 đánh giá chất lượng cảm quan 39

Hình 2.2: Cấu trúc hóa học Stevioside 8

Hình 1.3: steviol 8

Hình 2.4: Steviolbioside 9

Hình 2.5: Sự ổn định và tỷ lệ giảm stevioside ở nhiệt độ cao trong 1 giờ 10

Hình 2.6: Hàm lượng Stevioside trong khoảng pH 1-10 nhiệt độ từ 60 đến 80oC trong 1 và 2 giờ 11

Hình 2.7: Tỷ lệ giảm của stevioside trong dung dịch axit hữu cơ Độ hòa tan.[1] 12

Hình 3.1 Kết tinh bằng ethanol 21

Hình 3.2: sơ đồ kết tinh bằng phương pháp thả mầm tinh thể 23

Hình 3.3: sơ đồ kết tinh bằng phương pháp cô đặc và sấy 25

Hình 3.4:.Sơ đồ kết tinh bột stevioside bằng phương pháp sấy phun 27

Hình 4.1 : Sắc ký đồ của Stevioside chuẩn 31

Hình 4.2: Đường chuẩn của Stevioside chuẩn 31

Hình 4.3: Sắc ký đồ chiết Shoxlet từ cỏ ngọt 32

Hình 4.4 : Sắc ký đồ trích ly từ cỏ ngọt 33

Hình 4.5:Stevioside kết tinh bằng ethanol 37

Hình 4.6: Stevioside kết tinh bằng thả mầm tinh thể 37

Hình 4.7: Stevioside kết tinh bằng phương pháp sấy cô đặc 38

Hình 4.8: Stevioside kết tinh bằng phương pháp sấy phun 38

Hiện nay trên thị trường đã có rất nhiều sản phẩm hóa học tạo vị ngọt có thể

dùng để thay thế đường (saccharin, sodirn cyclamate, acesulfame potassium, phổ

biến nhất là chất aspartame) Những chất này không có tính chất dinh dưỡng, đặc

biệt là có vị ngọt cao gấp cả trăm lần so với đường nhung lại cho rất ít calorie chỉ có khoảng 2,2 calo cho mỗi gói nhỏ trong khi chỉ cần một muỗng cà phê đường sinh ra tới 16 calo Các chất hóa học này được sử dụng nhiều trong các ngành công nghệp chế biến thực phẩm đồ ăn, nước giải khát và có thể được con người sử dụng hằng ngày Chúng rất rẻ tiền và tiện nhưng là chất hóa học nên người ta rất e ngại rằng chúng sẽ ảnh hưởng đến sức khỏe nếu sử dụng lâu dài

Qua một số nghiên cứu về tác hại của đường hóa học thì saccharin đã bị cấm

sử dụng ở một nghiệm cho thấy nó tạo ung thư bàng quang ở loài chuột

Đối với những người mắc bệnh phenylketonuria thì không nên dùng aspatame Đây là bệnh di truyền rất hiếm thấy, trong đó vì sự lệch lạc của một gene không thể sản xuất được một enzyeme khử bỏ chất phenylalanine Khi ăn vào aspartame sẽ phân thành aspartid acid và phenylalanine, chất này tích tụ trong não

sẽ gây tổn hại cho hệ thần kinh trung ương và có thể dẫn đến tử vong.[8]

Trước các nguy hại này của các chât hóa học, tâm lý chung của người tiêu dùng là tìm ra các sản phẩm từ thiên nhiên Trong nhóm những chất tạo vị ngọt

thiên nhiên , cây Cỏ ngọt càng ngày càng được nhiều người chú ý đến nhất là nhóm chất stevioside có trong cây cỏ ngọt, Đặc tính quan trọng là cây cỏ ngọt có hàm lượng đường rất cao và là nguyên liêu sạch có thể làm ngọt các loại thức ăn và đồ uống mà không gây độc hại cho người vì vậy có thể tay thế đường hóa học Để biết

được quá trình stevioside kết tinh thế nào tôi tiến hành “Nghiên cứu quá trình kết

tinh stevioside từ dịch chiết cây cỏ ngọt”

1.2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu được phương pháp phù hợp cho việc kết tinh đường stevioside

1.3 Yêu cầu

- xác định sắc ký và đường chuẩn stevioside

- xác định hàm lượng stevioside có trong cây cỏ ngọt

- xác địnhhàm lượng stevioside có trong dịch chiết cây cỏ ngọt

- Tìm ra phương pháp tối ưu và hiệu quả trong 4 phương pháp sau

- Kết tinh bằng kết tinh lạnh

- Kết tinh bằng thả mầm tinh thể

- Kết tinh bằng cô đặc và sấy khô

- Kết tinh bằng máy sấy phun

- Kết tinh được sản phẩm stevioside và ứng dụng vào sản xuất công nghiệp tăng hiệu quả lớn nhất khi kết tinh stevioside

1.4.1 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

1.4.2 Ý nghĩa khoa học

- Thực hiện đề tài giúp sinh viên có thể bổ sung kiến thức thực tiễn quan trọng cho lý thuyết đã học, có thêm kinh nghiệm nghiên cứ khoa học

- Biết được phương pháp nghên cứu một vẫn đề khoa học, xử lý và phân tích

số liệu, cách trình bày một báo cáo khoa học

- Kết tinh được stevioside từ dịch cây cỏ ngọt, có thể thay thế đường hóa học

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

- Đường này có thể dùng thay thế đường mía và đường hóa học

- Đề suất công nghệ sản xuất đường stevioside từ dịch cây cỏ ngọt

- Trong công nghiệp thực phẩm, stevioside làm tăng độ ngọt mà không làm tăng năng lượng của thực phẩm

- Đây là sản phẩm tự nhiên hoàn toàn, phù hợp với sức khỏe của con người

Phần 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2 Cây cỏ ngọt

2.1 Giới thiệu chung

Tên thường gọi: Cỏ ngọt hay cỏ đường, cỏ mật, cỏ cúc;

Tên khoa học: Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley;

Tên đồng nghĩa: Eupatorium rebaudianum Bert [1];

2.2 Phân loại khoa học [1]

2.3 Phân loại theo loài

Cỏ ngọt có khoảng 240 loài có nguồn gốc từ vùng Nam Mỹ, Trung Mỹ, Mexico và một vài tiểu bang miền nam Hoa Kỳ

Một số loài cỏ ngọt tiêu biểu sau:

Tuy nhiên các nhà khoa học đã khảo sát trên 184 loài cỏ ngọt thì có khoảng

18 loài có thể tạo vị ngọt nhưng chất ngọt trong 18 loài này stevia ribaudiana là loài cho chất ngọt nhiều nhất [1]

2.4 Nguồn gốc cây cỏ ngọt

Có nguồn gốc từ thung lũng Rio Monday nằm ở đông bắc Panama Trung Mỹ Vào thế kỉ 16, các thủy thủ người Tây Ba Nha đã từng đề cập đến loại thảo mộc này nhưng đến năm 1888 các nhà thực vật học người Paraguay là Mises Santiago Bertoni mới phân loại và chính thức đặt tên gọi là Stevia rebaudianoa Bertoni

Từ ngàn năm nay thổ dân Gurani người Paraguay đã dùng loại thảo mộc này làm dịu ngọt các loại thức ăn, nước uống có tính đắng và cũng để trị một số bệnh béo phì,tim mạch, cao huyết áp.[7]

2.5 Mô tả cây

Cây thảo nhỏ, sống nhiều năm, cao 0,5-0,6m, có khi đến 1m Thân cứng mọc thẳng, có rãnh dọc và nhiều lông mịn, ít phân nhánh Lá mọc đôi, hình mác hoặc hình bầu dục, gốc thuôn, đầu tù hoặc hơi nhọn, dài 5-7cm, rộng 1-1,5cm, có 3 gân, 4-6 đôi răng nhọn ở phân nửa về phía đầu lá, hai mặt có lông trắng mịn, nhấm lá thấy có vị ngọt rất đậm, cuống lá rất ngắn Hoa lưỡng tính, tụ họp thành đầu trắng ở ngọn thân Quả bé, không có mào lông, hạt không có hột nhũ

Mùa hoa: tháng 5-9

Bộ phận dùng: Phần trên mặt đất của cây cỏ ngọt.[1]

Hình 2.1 : Cây Cỏ ngọt (Stevia rebaudiana (Bertoni) Hemsley)

2.6 Thành phần hóa học của cây cỏ ngọt

Cỏ ngọt bao gồm carbohydrate (61,93% dw – trọng lượng khô), protein (11,41% dw), chất xơ thô (15,52% dw), khoáng chất (K, 21,15; Ca, 17,7; Na, 14,93;

Mg, 3,26 và Cu, 0,73; Mn, 2,89; Fe, 5,89 và Zn, 1,26 mg/100g dw) và các axit amin

Bảng 2.2 : Thành phần axit amin của cỏ ngọt [11]

Amino axit thiết yếu Amino axit không thiết yếu

Tên

Hàm lượng(g/100g)

Tên

Hàm lượng (g/100g)

là vi chất dinh dưỡng chống oxy hóa và do đó, sự hiện diện của chúng có thể thúc

đẩy hệ thống miễn dịch và phòng chống các bệnh Sắt là một yếu tố cần thiết cho

tổng hợp hemoglobin Lượng sắt cao trong lá Stevia rất hữu ích trong việc duy trì mức huyết cầu tố bình thường trong cơ thể Hơn nữa, lá Stevia cũng có thể được sử

dụng để chống thiếu sắt, thiếu máu và rối loạn dinh dưỡng [11]

Bảng 2.3 : Thành phần khoáng của cỏ ngọt [11]

Khoáng vĩ mô Hàm lượng(mg/100g) Khoáng vi

lượng

Hàm lượng(mg/100g)

Nồng độ mg/100g

% giảm của chất màu khi phơi khô

Hình 2.2: Cấu trúc hóa học Stevioside

- Stevioside là tinh thể hình kim, điểm nóng chảy 202-204°C, ít tan trong cồn

- Độ ngọt gấp 110- 270 (300) lần đường sucurose Vì vậy nó cho ta cảm giác rất ngọt, không tạo caloric và ổn định ở nhiệt độ cao 198°C, nhưng không trở nên

đậm màu hay tạo Caramen đặc

Steviol là thành phần không đường của glusides, nó là cơ sở để xây dựng nên các phân tử đường khác

Vd: stevioside và rebaudioside A

2.10.3 Steviolbioside

Hình 2.4: Steviolbioside

- Là chất có hàm lượng rất nhỏ trong cây cỏ ngọt

- Bên cạnh Stevioside, số lượng ít hơn nhưng ngọt hơn stevioside 1,2-1,5 lần

2.10.4 Rebaudioside A

- Rebaudioside A là chất kết tinh không màu, điểm nóng chảy là 242-2440C,

có độ ngọt rất cao bằng 130-320 lần đường surcose

- Hàm lượng: 2-4% lượng chất khô

2.10.5 Rebaudioside B

- Rebaudioside B là chất kết tinh không màu, điểm nóng chảy 193-1950C

- Hàm lượng rất nhỏ vào khoảng 0,03- 0,07% hàm lượng chất khô

2.10.6 Rebaudioside C ( Dulcoside-B)

- Công thức cấu tạo: R1 là G, R2 là G(G) Rh

- Rebaudioside C có điểm nóng chảy là 235-2380C Nó ngọt gấp 40-60 lần Sucrose

- Hàm lượng 1-2% trọng lượng chất khô

- Độ ngọt gấp 300 lần so với độ ngọt của đường mía

- Tính tan: 1 gram tan trong 800 ml nước cất tan trong Dixane, tan ít trong alcohol

- Sự ổn định của stevioside ở nhiệt độ cao [10]

Hình 2.5: Sự ổn định và tỷ lệ giảm stevioside ở nhiệt độ cao trong 1 giờ

Giữ stevioside rắn ở nhiệt độ cao trong 1 giờ cho thấy sự ổn định tốt lên đến

thì sự phân hủy xảy ra gần như hoàn toàn Điều đó cho thấy Stevioside không phù hợp với các quá trình cần có nhiệt độ cao như nướng

Hình 2.6: Hàm lượng Stevioside trong khoảng pH 1-10 nhiệt độ từ 60 đến 80oC

trong 1 và 2 giờ

Trong dung dịch nước stevioside là khá ổn định qua một loạt các giá trị pH và nhiệt độ Khảo sát các nhiệt độ khác nhau trong phạm vi pH 2-10 trên 2 giờ, thực tế

khoảng 5%, ở pH =1 Stevioside bị giảm đáng kể

- Sự ổn định của stevioside trong các axit hữu cơ [10]

Sự ổn định của stevioside ở nhiệt độ phòng trong dung dịch các axit hữu cơ (10 g / l), axit axetic, axit citric và axit tartaric trong khoảng thời gian lên đến 4 tháng cho thấy sự phân hủy của các chất làm ngọt giảm tại giá trị pH thấp hơn Trong 10 g / l dung dịch axit axetic (pH 2.6), acid citric (pH 2.1) và axit tartaric (pH 2.1), độ giảm stevioside là 2; 22 và 33% đã được quan sát sau 4 tháng bảo quản Vậy chất ngọt Stevia trong dung dịch nước ổn định trong điều kiện có tính axit và trung tính nhưng thực phẩm ở nhiệt độ hơi cao không ổn định trong điều kiện kiềm Cũng stevioside có vẻ là tương đối ổn định trong chất

Hình 2.7: Tỷ lệ giảm của stevioside trong dung dịch axit hữu cơ Độ hòa tan.[1]

Một số nghiên cứu trong lĩnh vực này cho thấy chất ngọt Stevia hòa tan cao trong methanol và ít hòa tan trong nước Một số nghiên cứu khác lại chỉ ra rằng, các chất làm ngọt Stevia là ít tan trong hexan, không hòa tan trong aceton, cloroform và ether Theo báo cáo nghiên cứu của bộ môn Hoá hữu cơ thì 1 gram tan trong 800ml nước Tan trong Dioxane Tan ít trong alcohol Các kết quả khác nhau này là do các chất làm ngọt Stevia bao gồm một số hợp chất tạo ngọt khác nhau và tính tan của chúng trong các dung môi là khác nhau

2.12 Kết tinh

2.12.1 Khái niệm

Nếu giả thiết các phần tử cấu tạo nên vật chất là các nguyên tử, ion hoặc phân

tử, thì tinh thể là trạng thái mà ở đó, các phần tử sắp xếp trong không gian tạo nên một quy luật nào đó Về mặt hình học, các phần tử cấu tạo được xem như những chất điểm, quy luật của những chất điểm này là tính đối xứng và hoàn toàn trong không gian tinh thể Do vậy, tinh thể thường nhận một hình thái nhất định dưới dạng một đa diện nào đó

Khi làm nguội từ từ một dung dịch bão hòa hay một chất lỏng, chuyển động nhiệt của các hạt giảm, những phân tử, nguyên tử hay ion tập hợp lại và phân bố,

sắp xếp thành mạng lưới không gian với một cấu trúc xác định Khi đó ta có một tinh thể, hay quá trình này gọi là quá trình kết tinh

Trong thực tế, các chất rắn tinh thể được tạo thành từ nhiều tinh thể rất nhỏ (khoảng 10 – 20 µm) định hướng khác nhau Các chất rắn như vậy gọi là đa tinh thể Với những tinh thể tạo nên chất rắn như một tinh thể duy nhất được gọi là đơn tinh thể [9]

2.12.2 Cơ sở lý thuyết của quá trình kết tinh

Khi dung dịch bão hòa ở một nhiệt độ cao được để nguội dần thì độ tan sẽ giảm dẫn đến hiện tượng kết tinh và ta thu được tinh thể Hình dạng, màu sắc, kích cỡ của tinh thể thu được phụ thuộc vào bản chất của chất đem hòa tan thành dung dịch, nhiệt độ trong quá trình làm nguội, thời gian và điều kiện nuôi mầm tinh thể [9]

2.12.3 Tính chất

Tính bất đẳng hướng của tinh thể: Trong tinh thể, các đơn vị cấu trúc liên kết với nhau bằng những liên kết hóa học và được phân bố một cách tuần hoàn theo những quy luật nhất định tạo thành một mạng lưới không gian đều đặn, mặc dù chúng có thể đẳng hướng với một vài tính chất nào đó

Tính bất đẳng hướng thể hiện ở chỗ nhiều tính chất vật lý như độ bền cơ học,

sự khúc xạ ánh sáng, tính dẫn nhiệt, tính dẫn điện, độ cứng, tốc độ hòa tan,

- Tính định vị nhất định trong vùng không gian tinh thể: Ở nhiệt độ thường, các phân tử dao động quanh vị trí cân bằng với một biên độ nhất định, nhưng nhiệt

độ càng tăng, biên độ dao động càng lớn

- Mỗi tinh thể trong quá trình kết tinh phụ thuộc vào các yếu tố sau:

+ Tính đối xứng: Thông thường một chất có thành phần hóa học càng đơn giản thì mạng lưới tinh thể có tính đối xứng càng cao

+ Tỷ lệ giữa bán kính các loại hạt trong mạng lưới

+ Lực tương tác giữa các hạt (bao gồm độ mạnh, tính định hướng của các mối liên kết giữa các hạt)

+ Điều kiện bên ngoài (nhiệt độ, áp suất, ), đôi khi cũng ảnh hưởng đến cấu trúc của tinh thể [9]

2.12.4 Ứng dụng của quá trình kết tinh

Tách chất lỏng hóa chất rắn, trong đó sẽ xảy ra quá trình chuyển đổi chất tan trong dung dịch lỏng vào trong pha rắn mà ở đó tinh thể hình thành ở dạng tinh sạch nhất.[9]

2.12.5 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình kết tinh

Nhiêt độ: làm nguội dung dịch diễn ra càng chậm thì các bạn sẽ càng thu được tinh thể có kắch thước lớn

Kắch thước tinh thể của một chất tuỳ thuộc quá trình hình thành tinh thể diễn biến nhanh hay chậm, tốc độ kết tinh càng nhỏ, tinh thể có kắch thước càng lớn Hóa chất để tạo thành mầm tinh thể [9]

2.12.6 Ứng dụng và tình hình sản xuất của đường stevioside

3.3.6.1 Ứng dụng và triển vọng của stevioside

Stevioside được biết đến như là một chất ngọt tự nhiên không chứa nhiều năng lượng, được được sử dụng rộng rãi trong thực phẩm, thức uống, thuốc men và hóa chất hàng ngày, trong tất cả các sản phẩm đýờng, các stevioside có thể đýợc sử dụng để thay thế các loại đýờng Hiện nay, chủ yếu là stevioside đýợc sử dụng trong

đồ uống và thuốc, đặc biệt là trong nýớc giải khát, cũng đýợc sử dụng trong thực phẩm đông lạnh, đồ hộp, các loại kẹo trái cây, gia vị, rýợu vang, kẹo cao su và kem đánh rãng

Vì stevioside không cung cấp nhiều năng lượng như các loại đường, nên stevioside thắch hợp cho những người bị béo phì và những người bị bệnh tiểu

đường Tuy nhiên, stevioside không phải là một loại thuốc mà chỉ là một loại thực

phẩm chức năng giành cho những người ăn kiêng Giá trị năng lượng của stevioside thay đổi tùy theo các điều kiện cụ thể như quá trình điều chế và sự bảo quản cũng như các hiệu ứng của nó với các vitamin, các chất có trong cơ thể như vitamin C, axit thiamin, riboflavin, pyridoxin, nicotinic, các axit hữu cơ như axit axetic, axit citric, axit tartaric, và axit photphoricẦ

Ở nhiều nước như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn QuốcẦ stevioside được sử dụng

nhiều làm chất ngọt thay thế như một phụ gia trong thực phẩm, nhưng ở các nước

phương Tây và Bắc Mỹ thì giá trị của stevioside chưa được công nhận và chỉ được dùng như một loại thực phẩm chức năng giành cho những người bị bệnh béo phì

Do còn có nhiều tranh cãi về tác dụng của stevioside nên mặc dù đã được biết

đến từ lâu nhưng ngày nay stevioside vẫn tiếp tục được nghiên cứu và mở ra nhiều

hướng ứng dụng mới như một loại thuốc chữa bệnh tiểu đường [12]

- Tình hình sản xuất trên thế giới

Cỏ ngọt được rất nhiều hãng công nghệ, nhiều phòng thí nghiệm kể cả ở Việt Nam chú ý đến Trong khoảng trên dưới 500 bản báo cáo, bên cạnh một số lớn các bài khảo cứu thuần túy, phân tích và xác định cấu tạo, những năm gần đây còn có một số lớn bàn về các phương cách chiết xuất, làm tinh khiết, những ứng dụng chất ngọt vào kỹ nghệ, đặc biệt khoảng một trăm văn bằng sáng chế mà trong đó ba phần

tư là của Nhật Bản Trong số 184 cây stevia đã được khảo sát, 18 loại cho chất ngọt nhưng không có loại nào cho chất ngọt nhiều bằng Stevia rebaudiana Ngày nay, người ta thường dùng nước để chiết xuất chất ngọt trong cây, nhưng cũng thấy có nhiều trường hợp dùng rượu (methanol, ethanol hay butanol) pha lẫn với nước Còn

có một phương pháp chiết xuất dùng CO2 lỏng ở trạng thái siêu tới hạn (supercritic) tạo ra những sản phẩm rất sạch sau khi xử lý khoan quay, ly tâm và lọc qua màng lọc, cột trao đổi ion,… Để loại trừ dư vị, ngoài cách dùng màng lọc bán thấm (semipermeable), những phương pháp đề nghị có thể chia làm hai loại : sử dụng hoặc sắc ký hoặc kim loại, khoáng chất Cột sắc ký thường là silicagel, amberlite, duolite zeolite (đủ cỡ), các chất trùng hợp metaphenylenediamin formaldehyd hay styren divinylbenzyl,… Kim loại, khoáng chất được dùng là Al,

Fe, Ca dưới các thể oxid, chlorid, sulfat, carbonat, thường thấy nhất là calcium dihydroxid Năng suất chiết xuất nằm trong vòng 5-7% nhưng cũng có văn bằng

đưa ra số 11-26%

Những năm gần đây, cỏ ngọt được trồng thành cây công nghiệp ở các nước Brazin, Hàn Quốc, Đài Loan Để thử tăng năng suất chất ngọt, đã thấy có dùng enzym của Aspergillus oryzae biến hoá stevioside ra thành rebaudioside A vì chất này ngọt hơn Bên Nhật Bản, hãng Toyo Sugar refining bán một chất ngọt mang tên

Stevia, ngọt hơn 150 lần saccharose với ít nhiều dư vị : chất này được dùng trong canh, cháo, sirô, nước chấm Công ty Toyo Soda dùng một enzym khác, glycosyl transferase, cho tác dụng trực tiếp lên stevia và tinh bột đem lại một chất chỉ ngọt hơn 120 lần saccharose nhưng mất được phần lớn dư vị Từ 1983, hãng Jefco cho biết đã dùng một phương pháp chiết xuất rất hiện đại và có hiệu quả để chế biến một chất ngọt hơn 300 lần saccharose, loại bỏ được mọi bất tiện lúc ban đầu của steviosid : vị đắng, ít ổn định Để cạnh tranh với công ty này, hãng Tama Biochemical dùng phương pháp cấy mô để cho tăng số lượng stevioside trong cây

Có thể thấy, những nghiên cứu trên thế giới để tinh chế cỏ ngọt đã tương đối hoàn thiện, mang lại những sản phẩm có độ tinh khiết cao, tuy nhiên, vì tính kinh tế nên những phương pháp này chưa thể áp dụng tại Việt Nam [6]

- Tình hình sản xuất ở Việt Nam

Tính đến thời điểm hiện tại, người dân Việt Nam vẫn quen sử dụng cỏ ngọt như một thứ đồ uống, cỏ ngọt thường được trồng và xuất khẩu ở dạng thô, chưa qua chế biến, mang lại hiệu quả kinh tế thấp Gần đây, có một số đề tài nghiên cứu về tinh chế Stevioside, tuy nhiên, hầu hết chúng đều có chung nhược điểm là phức tạp,

độ tinh khiết thấp, giá thành sản xuất cao, khó có thể áp dụng rộng rãi trong công

nghiệp Trên thị trường hiện nay những sản phẩm từ cỏ ngọt hầu hết là ở dạng chè túi lọc, chưa tận dụng hết được nguồn nguyên liệu sẵn có Vừa qua, một đề tài sản xuất Stevioside từ cỏ ngọt của Sở Khoa học và Công nghệ Hà Nội đã được nghiệm thu, nhưng do những chi phí sản xuất cao nên vẫn chưa thể đưa ra sản xuất đại trà Yêu cầu hiện nay là đơn giản hóa quá trình sản xuất và giảm giá thành sản phẩm để

có thể đưa những sản phẩm trong phòng thí nghiệm ra quy mô lớn hơn [6]

Phần 3

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng

Cỏ ngọt được công ty chè Hiệp Khánh trồng và thu hoạch, phơi khô và bảo

quản trong túi nilon

Cân phân tích OHAUS - Đức

Bình ổn nhiệt HH-2(Trung Quốc)

Máy khuấy JJ-1(Trung Quốc)

Thiết bị cất quay chân không Heidolph - Đức

Bơm hút chân không MZ 2C NT - Đức

Bộ lọc hút chân không

máy sấy phun BF-06-D-44 (Đức)

Tủ lạnh, máy sấy, tủ nung, bếp điện có khả năng điều chỉnh nhiệt độ

Máy cất nước GFL - Đức

Bể siêu âm Elma S900H - Đức

3.1.5 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tài được thục hiện tại bộ môn Quá trình – Thiết bị Công nghệ Hóa học

trường đại học Bách Khoa Hà Nội

Thời gian tiến hành từ tháng 11/2013 đến tháng 6/ 2014

3.1.6 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

4.1.6.1 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Đánh giá hàm lượng stevioside có trong cỏ ngọt và dịch sau khi

trích ly

- Xác định sắc ký đồ và đường chuẩn của stevioside chuẩn

- Nghiên cứu và xác định hàm lượng stevioside có trong cỏ ngọt

- Nghiên cứu và đánh giá hàm lượng stevioside trong dịch trích ly

Nội dung 2: các thí nghiệm kết tinh stevioside có trong cỏ ngọt

- Nghiên cứu phương pháp kết tinh stevioside (75%, 80%, 85%, 90%, 95%) bằng phương pháp kết tinh lạnh

- Nghiên cứu phương pháp kết tinh stevioside (75%, 80%, 85%, 90%, 95%) bằng phương pháp thả mầm tinh thể

- Nghiên cứu phương pháp kết tinh stevioside (75%, 80%, 85%, 90%, 95%)

4.1.6.2 Phương pháp nghiên cứu

Tiến hành xác định hàm lượng đường stevioside bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPCL) theo phương pháp Abou –Arab et al (2010) trên hệ thống thiết bị Alliance của hãng Waters, Mỹ của viện dinh dưỡng quốc gia, Bộ Y tế

- Phân tích hàm lượng và hiệu suất tinh chế bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp hay sắc ký lỏng hiệu năng cao(HPLC) với các điều kiện như sau :

được pha nước tới nồng độ 500mg/l, lấy độ hấp thụ quang của tạp chất ở

250nm, vì các yếu tố khác không đổi, nên độ hấp thụ quang tỷ lệ với nồng độ tạp chất trong dung dịch

Phương pháp 1: Xác định sắc ký đồ và đường chuẩn của stevioside chuẩn

Thực hiện: Pha 10g stevioside chuẩn (hàm lượng >98%) của mỹ bổ sung 100ml nước cất và lắc đều sau đó đem vào máy siêu âm trong 30 phút có khuấy trộn

và lọc lại bằng giấy lọc 0,45 µm, sau đó đem đi phân tích trên máy sắc ký lỏng cao

áp HPCL

Phương pháp 2: Xác định hàm lượng stevioside có trong cỏ ngọt

Thực hiện: : cân 10g mẫu bột lá cỏ ngọt đã được sấy khô và nghiền mịn vào bình nón, bổ sung 100ml nước cất và lắc đều sau đó đem vào máy siêu âm trong 30 phút có khuấy trộn, sau đó đem đi phân tích trên máy sắc ký lỏng cao áp HPCL Thí nghiệm 3: Đánh giá hàm lượng stevioside trong dịch trích ly

Thực hiện: cân 10g mẫu bột lá cỏ ngọt đã được sấy khô và nghiền mịn vào bình nón, bổ sung 100ml nước cất và lắc đều sau đó đem vào máy siêu âm trong 30 phút có khuấy trộn và lọc lại bằng giấy lọc 0,45 µm, sau đó đem đi phân tích trên máy sắc ký lỏng cao áp HPCL

Phương pháp 3: Nghiên cứu phương pháp kết tinh stevioside bằng phương pháp kết tinh lạnh

* Thuyết minh sơ đồ:

Cỏ ngọt khô được nghiền mịn và trích ly với nước cất với tỉ lệ 1:10 trong 30 phút Dịch thô được thu lại, lọc sơ, và lọc hút chân không Dịch thu được sẽ xử lý với axid citric và đưa về pH=3,trong điều kiện khuấy đảo liên tục trong 30 phút ở

chân không, dịch sau khi loại kết tủa được hấp phụ bằng than hoạt tính, các chất màu sẽ được hấp phụ, dịch sau khi hấp phụ ta lọc lại bằng máy lọc chân không và giấy lọc và đưa pH lại bằng 7, dịch cỏ ngọt sau khi được xử lý được đem đi cô quay

đạt tới nồng độ nhất định, hòa stevioside trong methanol với tỉ lệ 1/5, để kết tinh ở

lạnh Rồi sấy và đem đi nghiền sẽ được bột chiết phẩm stevioside

Thí nghiệm nghiên cứu nghiên cứu phương pháp kết tinh stevioside bằng ethanol gồm 5 mẫu, 5 lần nhắc lại (25 lần nhắc lại)

Gồm Các mẫu: 75%, 80%, 85%, 90%, 95%

Chỉ tiêu nghiên cứu: hàm lượng stevioside sau khi kết tinh ở các nồng độ khác nhau của phương pháp kết tinh bằng ethanol

Đư a pH=10,5, Khu ấ y liên t ụ c 30 phút, ở t0 = 550C Làm l ạ nh v ề nhi ệ t độ phòng, L ọ c k ế t t ủ a b ằ ng gi ấ y l ọ c Khu ấ y liên t ụ c trong 30 phút, ở t0 = 700C

Phương pháp 4: phương pháp kết tinh stevioside bằng mầm tinh thể

Thuyết minh sơ đồ:

Cỏ ngọt khô được nghiền mịn và trích ly với nước cất với tỉ lệ 1:10 trong 30 phút Dịch thô được thu lại, lọc sơ, và lọc hút chân không dịch thu được sẽ xử lý với axid citric và đưa về pH=3, trong điều kiện khuấy đảo liên tục trong 30 phút ở

chân không, dịch sau khi loại kết tủa được hấp phụ bằng than hoạt tính, các chất màu sẽ được hấp phụ, dịch sau khi hấp phụ ta lọc lại bằng máy lọc chân không và giấy lọc và đưa pH lại bằng 7, dịch cỏ ngọt sau khi được xử lý được đem đi cô quay

đạt tới nồng độ nhất định, hòa stevioside trong methanol vừa đủ, thả mầm tinh thể ,

để kết tinh ở lạnh Rồi sấy, đem đi nghiền sẽ được bột chiết phẩm stevioside

- Thí nghiệm nghiên cứu nghiên cứu phương pháp kết tinh stevioside bằng ethanol gồm 5 mẫu, 5 lần nhắc lại (25 lần nhắc lại)

- Gồm Các mẫu: 75%, 80%, 85%, 90%, 95%

- Chỉ tiêu nghiên cứu: hàm lượng stevioside sau khi kết tinh ở các nồng độ khác nhau của phương pháp thả mầm tinh thể

Trung hòa b ằ ng axid citric v ề pH=7 Làm l ạ nh v ề nhi ệ t độ phòng, l ọ c k ế t t ủ a

Đư a pH=10,5, Khu ấ y liên t ụ c 30 phút, ở t0 = 550C Ca(OH)2

Làm l ạ nh v ề nhi ệ t độ phòng, L ọ c k ế t t ủ a b ằ ng gi ấ y l ọ c

Khu ấ y liên t ụ c trong 30 phút, ở t0 = 700C

Cô đặ c v ề 25% th ể tích

Bã

L ọ c Trích ly v ớ i n ướ c c ấ t

Phương pháp 5: kết tinh stevioside bằng phương pháp cô đặc và sấy

Thuyết minh sơ đồ:

Cỏ ngọt khô được nghiền mịn và trích ly với nước cất với tỉ lệ 1:10 trong 30 phút Dịch thô được thu lại, lọc sơ, và lọc hút chân không dịch thu được sẽ xử lý với axid citric và đưa về pH=3,trong điều kiện khuấy đảo liên tục trong 30 phút ở

chân không, dịch sau khi loại kết tủa được hấp phụ bằng than hoạt tính, các chất màu sẽ được hấp phụ, dịch sau khi hấp phụ ta lọc lại bằng máy lọc chân không và giấy lọc và đưa pH lại bằng 7, dịch cỏ ngọt sau khi được xử lý được đem đi cô quay

đạt tới nồng độ nhất định Rồi sấy , nghiền mịn sẽ được bột chiết phẩm stevioside

- Thí nghiệm nghiên cứu nghiên cứu phương pháp kết tinh stevioside bằng ethanol gồm 5 mẫu, 5 lần nhắc lại (25 lần nhắc lại)

- Gồm Các mẫu: 75%, 80%, 85%, 90%, 95%

- Chỉ tiêu nghiên cứu: hàm lượng stevioside sau khi kết tinh ở các nồng độ khác nhau của phương pháp cô đặc sấy

Giai đ o ạ n tinh ch ế

Hình 3.3: sơ đồ kết tinh bằng phương pháp cô đặc và sấy

C ỏ ng ọ t khô

Bã, axit amin

Trung hòa b ằ ng axid citric v ề pH=7 Làm l ạ nh v ề nhi ệ t độ phòng, l ọ c k ế t t ủ a Ca(OH)2 Đư a pH=10,5, Khu ấ y liên t ụ c 30 phút, ở t0 = 550C

Làm l ạ nh v ề nhi ệ t độ phòng, L ọ c k ế t t ủ a b ằ ng gi ấ y l ọ c Khu ấ y liên t ụ c trong 30 phút, ở t0 = 700C

Cô đặ c v ề 25% th ể tích

L ọ c Trích ly v ớ i n ướ c c ấ t

Phương pháp 6: kết tinh stevioside bằng phương pháp sấy phun

Thuyết minh sơ đồ:

Cỏ ngọt khô được loại bỏ tạp chất và nhiền mịn.và trích ly với nước cất với tỉ

lệ 1:10 trong 30 phút Dịch thô được thu lại, lọc sơ, và lọc bằng phương pháp lọc hút chân không dịch thu được sẽ xử lý với axid citric và đưa về pH=3, trong điều

nhiệt độ phòng lọc kết tủa bằng giấy lọc, hút chân không rồi được sử lý bằng

để kết tủa amino axit, loại bỏ kết tủa bằng phương pháp lọc chân không, dịch sau

khi loại kết tủa được hấp phụ bằng than hoạt tính, các chất màu sẽ được hấp phụ, dịch sau khi hấp phụ ta lọc lại bằng máy lọc chân không và giấy lọc và đưa pH lại bằng 7, dịch cỏ ngọt sau khi được sủ lý được đem đi cô quay đạt tới nồng độ nhất

định, và tiến hành đưa đi sấy phun sẽ được bột chiết phẩm stevioside

- Thí nghiệm nghiên cứu nghiên cứu phương pháp kết tinh stevioside bằng ethanol gồm 5 mẫu, 5 lần nhắc lại (25 lần nhắc lại)

- Gồm Các mẫu: 75%, 80%, 85%, 90%, 95%

- Chỉ tiêu nghiên cứu: hàm lượng stevioside sau khi kết tinh ở các nồng độ khác nhau của phương pháp sấy phun