Nghiên cứu điều kiện thủy phân nấm men bia bằng protease thương phẩm thu peptide có hoạt tính chống oxi hóa

Một trong những tác dụng quan trọng nhất của peptide là khả năng chống oxy hóa, ngăn ngừa tác hại của các gốc tự do sinh ra từ hoạt động trao đổi chất trong cơ thể.. - Nghiên cứu được qu

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

TRƯƠNG MẠNH HÙNG

Tên đề tài:

Nghiªn cøu ®iÒu kiÖn thñy ph©n nÊm men bia b»ng protease th−¬ng phÈm thu peptide cã ho¹t tÝnh chèng oxi hãa

KhãA LUËN TèT NGHIÖP §¹I HäC

Hệ đào tạo : Chính quy Chuyên ngành : Công nghệ Thực phẩm Khoa : CNSH-CNTP

Khoá học : 2010-2014

Thái Nguyên, năm 2014

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM

TRƯƠNG MẠNH HÙNG

Tên đề tài:

Nghiªn cøu ®iÒu kiÖn thñy ph©n nÊm men bia b»ng protease th−¬ng phÈm thu peptide cã ho¹t tÝnh chèng oxi hãa

KhãA LUËN TèT NGHIÖP §¹I HäC

Chuyên ngành : Công nghệ Thực phẩm

Khoa : CNSH-CNTP Khoá học : 2010-2014 Giảng viên hướng dẫn : TS Hoàng Thị Lệ Hằng

Viện Nghiên cứu Rau quả Hà Nội

ThS Phạm Thị Vinh

Khoa CNSH - CNTP, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên

Thái Nguyên, năm 2014

LỜI CẢM ƠN

Trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp tại Trung tâm Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm Hà Nội - Sở Khoa học và công nghệ Hà Nội, để hoàn thành được đợt thực tập tốt nghiệp ngoài sự nỗ lực của bản thân tôi đã nhận được sự giúp đỡ hết sức tận tình của các thầy cô trong khoa CNSH & CNTP cùng toàn thể các cô chú, anh chị cán bộ trong Trung tâm Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm Hà Nội

Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới ThS Phạm Thị Thu Hiền - Trung tâm Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm Hà Nội đã tạo điều kiện cho tôi được thực tập và tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành tốt bản khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy Lưu Hồng Sơn - Giảng viên khoa CNSH & CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã tận tình chỉ bảo

và giúp đỡ tôi làm khóa luận này

Đồng cảm ơn các thầy cô trong khoa CNSH & CNTP, Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập Cảm ơn các cô chú, anh chị cán bộ trong Trung tâm Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm Hà Nội đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập ở đó

Cuối cùng tôi xin cảm ơn gia đình tôi và các bạn bè của tôi đã giúp đỡ

và động viên tôi rất nhiều những lúc tôi gặp khó khăn

Do thời gian và kiến thức còn hạn chế nên báo cáo tốt nghiệp của tôi không thể tránh khỏi những thiếu sót Kính mong các quý thầy cô trong khoa CNSH & CNTP Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên thông cảm và đóng góp ý kiến giúp cho báo cáo tốt nghiệp của tôi được hoàn thiện hơn

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, ngày 6 tháng 06 năm 2014

Sinh viên

Trương Mạnh Hùng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần của bã men bia (%) 4

Bảng 2.2: Thành phần chất khô của bã men bia (%) 4

Bảng 2.3: Ứng dụng protease trong công nghiệp 20

Bảng 3.1: Thành phần gel điện di 31

Bảng 4.1: Một số thông số cơ bản của bã nấm men bia sau rửa đắng 33

Bảng 4.2: Tỷ lệ chết của tế bào nấm men ở các nhiệt độ khác nhau 34

Bảng 4.3: Đường chuẩn tyrosine 35

Bảng 4.4: Đường chuẩn glutamic 37

Bảng 4.5: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme Flavourzyme đến khả năng thuỷ phân protein nấm men 39

Bảng 4.6: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme Neutrase đến khả năng thuỷ phân protein nấm men 41

Bảng 4.7: So sánh khả năng thuỷ phân của Flavourzyme và Neutrase 43

Bảng 4.8: Kết quả xác định khả năng ức chế gốc tự do 46

DANH MỤC CÁC HÌNH, BIỂU ĐỒ

Hình 2.1: Nấm men Saccharomyces Cerevisiae 3

Hình 2.2: Sự tạo thành liên kết peptide 5

Hình 2.3: Cấu trúc của pentanpeptide seryl-glycyl-tyrosyl-alanyl-neucine 6

Hình 2.4: Sự tạo phức màu xanh da trời đậm trong phản ứng Biure 7

Hình 2.5: Cấu trúc vitamin C 8

Hình 2.6: Cấu trúc vitamin E 9

Hình 2.7: Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của protease 16

Hình 2.8: Sơ đồ phân loại protease 18

Hình 2.9: Sơ đồ thu nhận và tinh sạch ACEIPS từ dịch thủy phân casein 24

Hình 4.1: Biểu đồ thành phần hóa học của bã nấm men bia sau khi rửa đắng 33

Hình 4.2: Hình ảnh vi trường kiểm tra tỷ lệ chết của nấm men 35

Hình 4.3: Đồ thị đường chuẩn tyrosine 36

Hình 4.4: Đường chuẩn glutamic 38

Hình 4.5: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme Flavourzyme đến khả năng thuỷ phân protein nấm men 40

Hình 4.6: Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme Neutrase đến khả năng thuỷ phân protein nấm men 42

Hình 4.7: So sánh khả năng thuỷ phân của Flavourzyme và Neutrase 44

Hình 4.8: Kết quả điện di peptide từ dịch thủy phân 45

Hình 4.9: Sơ đồ quy trình công nghệ thủy phân nấm men bia bằng protease thương phẩm thu dịch peptide kỹ thuật có hoạt tính chống oxi hóa 47

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

TTHĐ Trung tâm hoạt động

DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

BHT Butylated hydroxytoluen

BHA Butylate hydroxyanisole

TBHQ Tertbutyl hydroquinone

EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid

KTĐ Khô tuyệt đối

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

PAGE Polyacrylamide Gel Electrophoresis

TCA TriCloroacetic Acid

SGYAL Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu

ACE Angiotensin I Converting Enzyme

MỤC LỤC

PHẦN 1: MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 2

1.3 Yêu cầu của đề tài 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 2

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Tổng quan về nấm men bia 3

2.1.1 Tìm hiểu chung về bã men bia 3

2.1.2 Thành phần hóa học và dinh dưỡng của bã men bia 4

2.2 Tổng quan về peptide có hoạt tính chống oxi hóa 5

2.2.1 Khái niệm peptide 5

2.2.2 Quá trình tạo thành liên kết peptide 5

2.2.3 Cách gọi tên và phân loại peptide 5

2.2.4 Tính chất của peptide 6

2.2.5 Peptide có hoạt tính chống oxi hóa 7

2.3 Tổng quan về protease 15

2.3.1 Giới thiệu chung 15

2.3.2 Phân loại protease 18

2.3.3 Cơ chế hoạt động protease 19

2.3.4 Ứng dụng 20

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 21

2.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 21

2.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 22

PHẦN 3: ĐỐI TƯỢNG, PHẠM VI VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

3.1 Đối tượng (vật liệu) và phạm vi nghiên cứu 26

3.2 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 26

3.3 Địa điểm và thời gian tiến hành nghiên cứu 27

3.3.1 Địa điểm nghiên cứu 27

3.3.2.Thời gian nghiên cứu 27

3.4 Nội dung nghiên cứu 27

3.4.1 Đánh giá chất lượng bã nấm men bia 27

3.4.2 Xác định tỷ lệ nấm men chết 27

3.4.3 Xác định hoạt độ enzyme protease 27

3.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm enzyme Neutrase và enzyme Flavourzyme 27

3.4.5 Xác định peptide bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide-SDS (SDS-PAGE) 27

3.4.6 Xác định hoạt tính chống oxi hóa của chế phẩm peptide chức năng 27

3.4.7 Viết sơ đồ quy trình công nghệ thủy phân nấm men bia bằng protease thương phẩm thu peptide có hoạt tính chống oxi hóa 27

3.5 Phương pháp nghiên cứu 27

3.5.1 Xác định tỷ lệ nấm men chết bằng phương pháp theo dõi vi trường 27

3.5.2 Xác định hoạt độ protease (theo phương pháp Anson cải tiến) 28

3.5.3 Phương pháp ninhydrin xác định hàm lượng acid amin 29

3.5.4 Xác định hàm lượng peptide tổng bằng OPA 30

3.5.5 Xác định peptide bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide-SDS (SDS-PAGE) (theo HOEFER) 30

3.5.6 Xác định hoạt tính chống oxi hóa bằng phương pháp β-carotene/ Linoleate (Shaikhan et al, 1995) 32

3.5.7 Phương pháp xử lý số liệu 32

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

4.1 Đánh giá chất lượng bã nấm men bia 33

4.2 Xác định tỷ lệ nấm men chết 34

4.3 Xác định hoạt độ enzyme protease 35

4.3.1 Xây dựng đường chuẩn tyzosine 35

4.3.2 Xác định hoạt độ enzyme protease trong chế phẩm Flavourzyme 37

4.3.3 Xác định hoạt độ enzyme protease trong chế phẩm Neutrase 0,8L 37

4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thuỷ phân protein nấm men bằng chế phẩm enzyme Neutrase và enzyme Flavourzyme 37

4.4.1 Xây dựng đường chuẩn glutamic 37

4.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme Flavourzyme đến khả năng thuỷ phân protein nấm men 39

4.4.3 Ảnh hưởng của nồng độ chế phẩm enzyme Neutrase đến khả năng thuỷ phân protein nấm men 41

4.4.4 So sánh hiệu quả thuỷ phân bằng chế phẩm enzyme Neutrase với chế phẩm

enzyme Flavourzyme 43

4.5 Xác định peptide bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide-SDS (SDS-PAGE) 44

4.6 Xác định hoạt tính chống oxi hóa của chế phẩm peptide chức năng 46

4.7 Hoàn thiện quy trình thủy phân, tinh sạch nấm men bia bằng protease thương phẩm thu peptide có hoạt tính chống oxi hóa 47

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50

5.1 Kết luận 50

5.2 Kiến nghị 50

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHẦN 1

MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Peptide là những protein thường có cấu trúc đoạn ngắn khoảng từ hai đến vài chục amino acid nối với nhau, có khối lượng phân tử thường dưới 6.000 Dalton Mặc dù có cấu trúc nhỏ nhưng nhiều peptide có vai trò khá quan trọng trong hoạt động trao đổi chất của cơ thể Nó có tác dụng trong cả y học, công nghệ thực phẩm và các ngành khác Một trong những tác dụng quan trọng nhất của peptide là khả năng chống oxy hóa, ngăn ngừa tác hại của các gốc tự do sinh ra từ hoạt động trao đổi chất trong cơ thể

Chất chống oxi hóa có thể có mặt trong các loại trái cây và rau quả, thảo dược, trứng, sữa Tuy vậy, hàm lượng của chúng biến động rất khác nhau trong các loại thực phẩm và thường đi kèm với nhiều chất khác Do vậy nhu cầu đặt ra

là phải tạo ra một sản phẩm giàu các peptide loại này để có thể bổ sung một cách

có kiểm soát với những đối tượng có nhu cầu Qua tìm hiểu có thể thấy được bã men bia với hàm lượng protein dồi dào chính là một trong số các nguồn cung cấp peptide chống oxi hóa tiềm năng

Ngày nay công nghệ sản xuất và thị trường tiêu thụ bia ngày càng phát triển, sản lượng bia được tạo ra với số lượng lớn, kéo theo lượng bã men bia thải

ra cũng tăng Ở Việt Nam, nấm men bia thu được từ các nhà máy bia rất lớn Ước tính trung bình cứ 1000 lít bia thu được 1,5 kg nấm men khô, trong đó chứa khoảng 700g protein [19,2] Năm 2005 sản lượng bia của cả nước đạt 1,5 tỷ lít, tương ứng với 18 triệu tấn sinh khối nấm men thải ra Đến năm 2010 sản lượng bia của cả nước đạt 2,5 tỷ lít và bã men thải ra là 30 triệu tấn [2] Như vậy, lượng protein có chất lượng cao từ nấm men thải ra của quá trình sản xuất bia nếu tận dụng được là không nhỏ Việc nghiên cứu chế biến và sử dụng nấm men còn rất ít

và hiện nay ở Việt Nam có một nghịch lý là nấm men thải ra từ các nhà máy bia một phần nhỏ được bán cho các hộ chăn nuôi gia súc sử dụng làm thức ăn trực tiếp, còn lại được thải ra ngoài môi trường gây ô nhiễm môi trường

Xuất phát từ tình hình thực tế trên, để giảm bớt gánh nặng ô nhiễm cho môi trường đồng thời có thể nghiên cứu tạo ra một sản phẩm chức năng có ứng dụng

cao chúng tôi quyết định thực hiện đề tài: “Nghiên cứu điều kiện thủy phân nấm

men bia bằng protease thương phẩm thu peptide có hoạt tính chống oxi hóa”

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Tối ưu điều kiện thủy phân nấm men bia bằng protease thương phẩm thu peptide có hoạt tính chống oxi hóa

Tạo ra và thử nghiệm chế phẩm peptide có hoạt tính chống oxi hóa

1.3 Yêu cầu của đề tài

- Xác định được tỷ lệ nấm men chết và chọn phuơng pháp phá tế bào

phù hợp

- Nghiên cứu được quy trình thủy phân, tinh sạch protein bã nấm men thu một số peptide có hoạt tính chống oxi hóa

- Xác định được hoạt tính chống oxi hóa của chế phẩm peptide chức năng

- Viết được sơ đồ quy trình công nghệ thủy phân nấm men bia bằng protease thương phẩm thu peptide có hoạt tính chống oxi hóa

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

Kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần bổ sung cơ sở khoa học về peptide

có hoạt tính chống oxi hóa từ nấm men bia, mở rộng ứng dụng thực phẩm chức năng nhằm cải thiện sức khỏe cho người tiêu dùng

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Sau khi thu nhận được peptide có hoạt tính chống oxi hóa từ nấm men bia

sẽ làm nền tảng nghiên cứu ứng dụng vào trong sản xuất thực phẩm chức năng ở quy mô lớn phục vụ nhu cầu thiết yếu của thị trường và người tiêu dùng Cũng trên cơ sở đó giúp giảm ô nhiễm môi trường

PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về nấm men bia

2.1.1 Tìm hiểu chung về bã men bia

Nấm men bia là một phế phẩm của sản xuất, được nằm lại trong các thùng lên men, các hầm chứa sau khi lên men chính và lên men phụ [5]

Nấm men thuộc nhóm cơ thể đơn bào, chúng phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, đặc biệt có nhiều ở vùng đất trồng nho và các nơi trồng hoa quả Nhiều loài nấm men có khả năng lên men rượu Từ lâu người ta đã biết sử dụng nấm men để sản xuất rượu bia Nấm men sinh sôi nhanh, tế bào lại chứa nhiều vitamin, acid amin không thay thế, hàm lượng protein chiếm tới 50% trọng lượng khô của tế bào, nên nhiều loại nấm men còn được sử dụng để sản xuất protein Ngoài ra nấm men còn được sử dụng trong công nghệ sản xuất bánh mì [11]

Nấm men dùng trong sản xuất bia thường là các chủng thuộc giống Saccharomyces, chúng có khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng trong môi trường nước mạch nha như các loại đường hoà tan, các hợp chất nitơ (các amino acid, peptide), vitamin và các nguyên tố vi lượng…qua màng tế bào Sau đó, hàng loạt các phản ứng sinh hóa mà đặc trưng là quá trình trao đổi chất để chuyển hoá các chất này thành những dạng cần thiết cho quá trình phát triển và lên men của nấm men được tiến hành Bã men bia chứa rất nhiều tế bào nấm men và trong tế bào nấm men lại chứa rất nhiều các chất dinh dưỡng có giá trị nổi bật như protein và vitamin nhóm B Hàm lượng protein của nấm men dao động trong khoảng từ 40 - 60% vật chất khô tế bào [11]

Hình 2.1: Nấm men Saccharomyces Cerevisiae

Ngày nay công nghệ sản xuất và thị trường tiêu thụ bia ngày càng phát triển, sản lượng bia được tạo ra với số lượng lớn, kéo theo lượng bã men bia được thải ra ngày càng tăng, do đó nó sẽ là nguồn nguyên liệu lý tưởng được khai thác trong tương lai không xa

2.1.2 Thành phần hóa học và dinh dưỡng của bã men bia

Thành phần hóa học và dinh dưỡng của nấm men phụ thuộc vào chủng giống, môi trường, trạng thái sinh lý cũng như điều kiện nuôi cấy

Bảng 2.1: Thành phần của bã men bia (%) [5]

Chất hòa tan không chứa nitơ 25-30

Nhiệt lượng tính bằng cal/g 4560-4840

Men bia có phức hợp có chứa rất nhiều vitamine nhóm B, vitamine E, vitamine H, acid panthonic, acid nicotinic (vitamine PP), biotin, inozit Ngoài ra, trong men bia còn chứa glutathione điều chỉnh qua trình oxi hóa và khử hàng loạt các chất khác giúp cho việc bình thường hóa việc trao đổi chất trong cơ thể sống Mặt khác nấm men bia giàu vitamin và glutathione hơn nấm men bánh mì [20]

Protein và các chất chứa nitơ khác chiếm 50 - 70% vật chất khô và nấm men bia, 90% tổng số nitơ nằm trong các protein, khoảng 10% tổng lượng nitơ có trong bia là các amino acid (lysine, tyrosine) Trong tro của nấm men

bia chứa khoảng 50% H3PO4, 30% K, còn lại là Ca, Mg và các chất khác Mặt khác, trong chất hữu cơ của tế bào nấm men bia thì protein có giá trị nhất

Tính chất của protein nấm men bia gần giống như protein nguồn gốc động vật Protein của nấm men bia chứa khoảng 20 acid amin, trong đó có đầy đủ các acid amin thiết yếu

2.2 Tổng quan về peptide có hoạt tính chống oxi hóa

2.2.1 Khái niệm peptide

Peptide là những protein thường có cấu trúc đoạn ngắn khoảng từ hai đến vài chục amino acid nối với nhau, có khối lượng phân tử thường dưới 6.000 Dalton Chúng có thể được tổng hợp trong tự nhiên hoặc được hình thành do thủy phân protein Mặc dù có cấu trúc nhỏ nhưng nhiều peptide có vai trò khá quan trọng trong hoạt động trao đổi chất của cơ thể

2.2.2 Quá trình tạo thành liên kết peptide

Liên kết peptide (-CO-NH-) được tạo thành do phản ứng kết hợp giữa nhóm α-cacboxil của một amino acid này với nhóm α-amino của một amino acid khác, loại đi một phân tử nước (phản ứng ngưng tụ) [1] Khi thủy phân

đến cùng các peptide thì thu được hỗn hợp có từ 2 đến 50 phân tử α-amino acid Vậy peptide là những hợp chất chứa từ 2 đến 50 gốc α-amino acid liên

kết với nhau bằng các liên kết peptide Peptide có vai trò quan trọng trong sự sống: Một số peptide là hoocmon điều hòa nội tiết, một số peptide là kháng sinh của vi sinh vật, peptide là cơ sở tạo nên protein

Hình 2.2: Sự tạo thành liên kết peptide

2.2.3 Cách gọi tên và phân loại peptide

Căn cứ vào số amino acid trong peptide để gọi tên của peptide và cách gọi tên các peptide theo gốc amino acid bằng cách đọc tên amino acid đầu

tiên lần lượt đến amino acid cuối cùng Trừ amino acid cuối cùng còn tất cả đuôi của các amino acid đều bị thay đổi bằng đuôi -yl [1]

Hình 2.3: Cấu trúc của pentanpeptide seryl-glycyl-tyrosyl-alanyl-neucine

Người ta cũng có thể dùng ký hiệu viết tắt 3 chữ hoặc 1 chữ theo thứ tự các amino acid để biểu thị thành phần và thứ tự các amino acid trong chuỗi ví

dụ pentapeptide ở trên (Hình 2.3), có thể viết Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu hoặc SGYAL Thông thường người ta viết amino acid đầu N tận cùng phía bên trái

và amino acid đầu C tận cùng phía bên phải và cũng có thể ghi rõ đầu nào của chuỗi peptide là đầu N-tận cùng hay đầu C tận cùng và như vậy cũng pentapeptide ở trên có thể viết H2N-Leu hay Leu-COOH Trong trường hợp

có những amino acid ở đoạn nào trong chuỗi peptide chưa xác định được rõ người ta có thể để các amino acid đó trong ngoặc chẳng hạn Ala-Ser-Gly-(Ala, Leu, Val) [25]

2.2.4 Tính chất của peptide

Peptide có tính chất hóa lý không khác nhiều so với amino acid vì đều chứa nhóm -NH2 và nhóm -COOH tự do Sự sai khác chủ yếu là do bên R của gốc amino acid tham gia trong chuỗi peptide Chính sự khác nhau giữa các mạch bên R, khác về số lượng và loại amino acid trong peptide làm cho điểm đẳng điện, khối lượng cũng khác nhau

Peptide tham gia các phản ứng đặc trưng của nhóm -NH2 và nhóm - COOH

Tính lưỡng tính

H2N-R-COOH + H+ H3N+-R-COOH

H2N-R-COOH + OH- H2N-R-COO- + H2O

Tạo phức chất với este

H2N-R-COOH + R’OH khí HCl bão hòa H2N-R-COO R’ + H2O Sản phẩm tạo ra ở dạng muối, lấy sản phẩm cho tác dụng với ammoniac để tái tạo nhóm chức amin (-NH2) [12]

Ngoài phản ứng của nhóm -NH2 và -COOH đầu tận cùng, các gốc R của peptide cũng cho những phản ứng màu đặc trưng của các amino acid tự

do tương ứng Một trong những phản ứng màu đặc trưng nhất cho liên kết peptide đó là phản ứng biure, phản ứng này không xảy ra với amino acid tự

do Trong môi trường kiềm mạnh, liên kết peptide phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất màu tím đỏ và có khả năng hấp thụ cực đại ở bước sóng 540nm Đây là phản ứng được sử dụng rộng rãi để định lượng protein Phương pháp xác định protein theo Lowry cũng dựa trên nguyên tắc của phản ứng này bằng cách thêm thuốc thử Folin-Ciocalteau để làm tăng độ nhạy của phản ứng sau khi đã thực hiện phản ứng biure, đồng thời dựa vào các gốc Tyr, Trp nhờ thuốc thử đó để tạo phức màu xanh da trời

Hình 2.4: Sự tạo phức màu xanh da trời đậm trong phản ứng Biure

2.2.5 Peptide có hoạt tính chống oxi hóa

Chất chống oxi hóa

Chất chống oxi hóa là một loại hóa chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxi hóa chất khác Chất chống oxi hóa ngăn quá trình phá hủy này

bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxi hóa bằng cách oxi hóa chính chúng [25,25] Để làm vậy người ta hay dùng các chất khử như: Thiol, protease hay polyphenol làm chất chống oxi hóa

Theo nguồn gốc tạo thành thì chất chống oxi hóa gồm hai nhóm chính:

•Chất chống oxi hóa tự nhiên:

Các chất béo không no trong mô sinh học tương đối bền Nguyên nhân

là do trong mô sinh học có chứa các chất chống oxi hóa cũng như các enzyme ngăn ngừa hiện tượng oxi hóa

Acid ascorbic (vitamin C):

Vitamin C hay ascorbic acid là chất đinh dưỡng chủ yếu cho động vật bậc cao và các loài khác Sự hiện diện của ascrobate có vai trò quan trọng cho những phản ứng trao đổi chất cho động vật, cây trồng và hoạt động bên trong của cơ thể con người Nó được biết đến như vitamin mà sự thiếu hụt của nó là nguyên nhân

gây ra bệnh scorbus (do thiếu vitamin C trong cuộc sống hàng ngày)

Vitamin C có hoạt chất chống oxi hóa khi nó làm giảm oxi hóa chất như hydrogen peroxyde Ngoài ra, nó cũng sẽ làm giảm các ion kim loại tạo

ra các gốc tự do thông qua các phản ứng Fenton [21]

2Fe3+ + ascorbate 2Fe2+ + Dehydroascorbate 2Fe2+ 2H2O2 2Fe3+ + 2OH + 2OH-

Hình 2.5: Cấu trúc vitamin C

Tocopherol (vitamin E):

Vitamin E là tên gọi chung cho một bộ tám tocopherols liên quan và tocotrienols, đó là vitamin tan trong chất béo có tính chất chống oxi hóa

Trong đó, hình thức δ-tocopherol là các chất chống oxi hóa quan trọng nhất hòa tan trong chất béo, nó có khả năng bảo vệ màng tế bào khỏi quá trình oxi hóa bằng cách phản ứng với các gốc lipid được sản sinh trong phản ứng dây truyền Từ đó, loại bỏ các gốc tự do trung gian và ngăn ngừa các phản ứng lan truyền diễn ra liên tục

Vitamin E được tách ra trong quá trình tinh luyện dầu Vitamin E có nhiều trong dầu đậu nành, ngũ cốc…

Có hoạt tính chống oxi hóa cao ở nồng độ thấp

Có thể tập trung được trên bề mặt pha dầu

Bên trong các điều kiện kỹ thuật của quá trình chế biến thực phẩm

Các chất chống oxi hóa tổng hợp thường được sử dụng là: BHT (Butylated hydroxytoluen), BHA (Butylate hydroxyanisole), TBHQ (Tertbutyl hydroquinone), tocopherol tổng hợp, dodecyl gallate, propyl gallate, ascorbyl palmitate,…

BHT (Butylated hydroxytoluen)

Còn được gọi là 3,5-di-tert-butyl-4-hydroxytoluen; tertbutyphenol; 2,6-di-tert-butyl-para-cresol BHT được tạo thành phản ứng của p-cresol (4-methylphenol) với isobutylen (2-methylpropene) xúc tác bởi acid sulfuric

methyl-di-Công thức phân tử: C15H24

Bột màu trắng

BHT ngăn ngừa oxi hóa chất béo Nó được sử dụng để bảo quản thực phẩm có mùi, màu sắc và hương vị Nhiều vật liệu đóng gói kết hợp BHT Nó cũng được bổ sung trực tiếp để rút ngắn ngũ cốc và các loại thực phẩm khác

có chứa chất béo và dầu

BHA (Butylate hydroxyanisole)

BHA là hỗn hợp của các đồng phân 3-tert-butyl-4-hydroxyanisole và tert-butyl-4-hydroxyanisole

2-Công thức phân tử: C11H16O2

Màu trắng hoặc hơi vàng

Mùi thơm đặc trưng

BHA thường được sử dụng để giữ chất béo khỏi bị ôi

BHA được tìm thấy trong bơ, thịt, ngũ cốc, kẹo cao su, đồ nướng, thực phẩm snack, khoai tây khử nước và bia Nó cũng được tìm thấy trong thức ăn động vật, bao bì thực phẩm, mỹ phẩm, sản phẩm cao su và các sản phẩm dầu khí

BHT và BHA có gậy hại hay không?

Nghiên cứu cho thấy: Các tính chất hóa học làm cho BHA và BHT bảo quản tốt thực phẩm và cũng có thể ảnh hưởng đến sức khỏe con người Các đặc tính oxi hóa hoặc chất chuyển hóa của BHA và BHT có thể góp phần vào việc gây ung thư

Tuy nhiên các phản ứng tương tự có thể có tác dụng chống oxi hóa Có bằng chứng cho thấy nếu như cơ thể một người nào đó gặp khó khăn trong chuyển hóa BHA và BHT, sẽ dẫn đến những thay đổi về sức khỏe và hành vi

BHA và BHT cũng có thể kháng virus và kháng khuẩn Một số nghiên cứu đang được tiến hành liên quan đến việc sử dụng BHT trong điều trị herpes simplex và AIDS

TBHQ (Tertbutyl hydroquinone)

TBHQ là một chất chống oxi hóa được dùng rộng rãi trong thực phẩm,

mỹ phẩm, cao su, đặc biệt là trong bảo quản các loại dầu và chất béo Nó còn được sử dụng như một chất ổn định để hạn chế sự trùng hợp tự động của các peroxyt hữu cơ

TBHQ là một tinh thể rắn, màu trắng có mùi đặc trưng, không tan trong nước nhưng hòa tan trong rượu và ete

•Cơ chế hoạt động chống oxi hóa

Sự hình thành các gốc tự do

Các gốc tự do (OH, O2, NO,…) phát sinh dưới tác dụng của tia UV, bức xạ ion hóa, ô nhiễm không khí, hút thuốc, trao đổi chất, sự cháy, căng thẳng,… Các gốc tự do là nguyên nhân gây tổn thương tế bào, protein, acid nucleic, ADN… và dẫn tới các căn bệnh nguy hiểm như ung thư, lão hóa, tiểu đường, tim mạch… Do đó, để tránh sự gây hại của các gốc tự do thì phải loại

bỏ chúng bằng cách sử dụng các chất chống oxi hóa bổ sung hay được sử dụng như: Vitamin A, Vitamin C, Vitamin E, polyphenol,…

Sự chống oxi hóa

Sự khử gốc tự do của chất chống oxi hóa, trong đó các electron không ghép đôi của gốc tự do sẽ được nhận electron của chất chống oxi hóa để tạo thành các electron ghép đôi bền vững

Có nhiều chỉ tiêu để đánh giá quá trình chống oxi hóa, trong đó mỗi chỉ tiêu thể hiện một khía cạnh của hoạt động chống oxi hóa, như vậy nhiều chỉ tiêu sẽ phản ánh một quá trình chống oxi hóa tổng thể

•Một số chỉ tiêu thường được sử dụng để đánh giá quá trình chống oxi hóa như sau:

Hoạt động quét gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)

Cơ chế của hoạt động quét gốc tự do DPPH là sự ghép đôi hydro và đình chỉ quá trình oxi hóa bằng sự chuyển các gốc tự do sang trạng thái ổn

định hơn Như vậy, khi có mặt của chất chống oxi hóa nó sẽ khử gốc tự do DPPH và làm cho dung dịch bị giảm màu sắc, do đó độ hấp thụ của dung dịch

sẽ giảm đi [25]

Z. + AH = ZH + A .(1) Trong đó: Z.: là gốc tự do DPPH

AH: là chất chống oxi hóa

Hoạt động khử ion Fe 3+

Cơ chế của hoạt động khử ion Fe3+ là sự ghép đôi electron và đình chỉ phản ứng oxi hóa dây chuyền bằng sự khử dạng oxi hóa thành dạng tự do Nguồn gốc chính của gốc tự do hydroxyl là phản ứng Haber-Weiss, trong đó gốc tự do superoxide khử Fe3+ thành Fe2+, sau đó nó xúc tác cho phản ứng Fenton giữa Fe2+ và H2O2 Như vậy, khi có mặt của chất chống oxi hóa nó sẽ khử gốc tự do superoxide nên hạn chế sự khử Fe3+ thành Fe2+ và làm cho dung dịch giữ màu sắc, do đó độ hấp thụ của dung dịch sẽ tăng lên [25]

O 2- + Fe3+ = O2 + Fe2+ (2)

Fe2+ + H2O2 = Fe3+ + OH- + OH (3)

Hoạt động quét gốc H 2 O 2

Hydroperocid có thể làm tăng sự hình thành gốc tự do hydroxyl trong

tế bào và gây độc Nguồn gốc của gốc tự do hydroxyl là phản ứng Fenton giữa Fe2+ và H2O2 [25]

Fe2+ + H2O2 = Fe3+ + OH- + OH (4)

Hoạt động chuyển ion Fe 2+

Nguồn gốc của các gốc tự do hydroxyl là phản ứng Fenton giữa Fe2+ và

H2O2 Như vậy, khi có mặt của chất chống oxi hóa sẽ hạn chế sự chuyển Fe2+ thành Fe3+ nên màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt hơn, do đó độ hấp thụ sẽ giảm đi [25]

Fe2+ + H2O2 = Fe3+ + OH- + OH (5)

Chất chống oxi hóa là chất dinh dưỡng có tác dụng giảm tác hại của oxi hóa (các gốc tự do) trên các tế bào cơ thể Như chúng ta đều biết, các tế bào

cơ thể cần cung cấp oxi cho sự tăng trưởng và năng lượng Các tế bào cơ thể

sử dụng oxi để tạo ra năng lượng, duy trì sự sống và các gốc tự do được hình thành như một sản phẩm phụ Chất chống oxi hóa sẽ loại bỏ các gốc tự do để ngăn ngừa bệnh tật trong cơ thể và giúp tăng tuổi thọ cho con người

Trong lĩnh vực sức khỏe hiện nay, người ta nói đến nhiều tác hại của chất chống oxi hóa, phản ứng oxi hóa và nhấn mạnh sự cần thiết sử dụng chất chống oxi hóa để bảo vệ, duy trì sức khỏe Chất chống oxi hóa được tìm thấy nhiều trong các loại trái cây và rau quả, thảo dược, trứng sữa… Nhiều nghiên cứu đã chứng minh lợi ích của chúng đối với sức khỏe trên nhiều mặt

•Một số chất chống oxi hóa điển hình

Flavonoid: Các chất chống oxi hóa này đóng một vai trò quan trọng

trong việc tăng cường sức khỏe tâm thần khi có tuổi tác Hoa quả và trái cây

có múi như cam là một nguồn phong phú của chất flavonoid

Isoflavone: Chất chống oxi hóa này có tác dụng đáng kể trong việc

ngăn chặn các bệnh, nó có nhiều trong đậu nành Isoflavone không chỉ làm giảm đáng kể nguy cơ ung thư dài hạn mà còn giúp giảm bớt các triệu chứng mãn kinh và cải thiện sức khỏe của xương

Kẽm: Khả năng chống oxi hóa của khoáng chất này là rất cao Các

thuộc tính chống oxi hóa của kẽm có thể bảo vệ cơ thể con người khỏi sự rối loạn thần kinh Sản phẩm từ sữa như phô mai và sữa là nguồn cung cấp kẽm rất phong phú

Coenzyme Q10: Đây là một trong những chất chống oxi hóa được

sản xuất trong cơ thể Coenzyme Q10 là cần thiết cho hoạt động bình thường của các tế bào Tuy nhiên, tùy theo độ tuổi, mức độ Coenzyme Q10

có thể thay đổi đáng kể Bạn có thể bù đắp sự mất mát này bằng cách ăn thực phẩm có chứa Coenzyme Q10 như thịt cừu, cá Chất chống oxi hóa này còn có thể thúc đẩy nướu răng khỏe mạnh và tăng cường sức khỏe của

hệ thống tim mạch

Melatonin: Đây là một trong những chất chống oxi hóa quan trọng nhất

và được tổng hợp bởi cơ thể của chúng ta Melatonin giúp duy trì giấc ngủ bình thường vì có tác dụng trong việc sản xuất melatonin Mặc dù chất chống oxi hóa này hiện diện trong rau quả, nó là chủ yếu được tìm thấy trong cà chua

Các chất như: Catechin, acid citric, acid phytic, lutein, acid oxalic, epigallocatechin gallate, ginkgo biloba, glutathione, alpha carotone và zexathin cũng có trong danh sách các chất chống oxi hóa

•Peptide có hoạt tính chống oxi hóa

Gốc tự do (chất oxi hóa) luôn luôn được sinh ra trong cơ thể con người

và cũng có vai trò tích cực đối với cơ thể (có thể nói ta không thể sống được nếu cơ thể hoàn toàn thiếu vắng gốc tự do) Oxi (dưỡng khí) mà ta hít thở hàng ngày là chất rắn cần thiết nhưng chính nó cũng trở thành gốc tự do (khi

đó gọi là oxi nguyên tử)

Hiện tượng thực bào (là hiện tượng vi khuẩn, virus bị tế bào bạch cầu tiêu diệt trong cơ thể), hiện tượng hô hấp trong tế bào, hoặc cơ chế giải độc ở gan đều là các hoạt động làm sinh ra gốc tự do

Điều quan trọng là trong cơ thể khỏe mạnh, gốc tự do sinh ra có giới hạn, không quá thừa để gây hại Do đó bên cạnh các gốc tự do luôn có hệ thống các chất chống oxi hóa “nội sinh” (tức có sẵn trong cơ thể) cân bằng lại, vô hiệu hóa các gốc tự do có hại Hệ thống các chất chống oxi hóa này gồm các enzyme như: glutathione peroxidase, superroxide dismutase… đặc biệt là vitamin C, vitamin

B, tiền vitamin A, khoáng chất selen “nội sinh” có sẵn trong cơ thể, xúc tác các phản ứng khử để vô hiệu hóa các gốc tự do (còn gọi là “bẫy” gốc tự do) giúp cơ thể khỏe mạnh

Chỉ khi nào gốc tự do sinh ra quá nhiều (do ô nhiễm môi trường, do tia cực tím từ ánh nắng, do khói thuốc lá, do viêm nhiễm trong cơ thể, thậm chí

do dùng một số dược phẩm…) và hệ thống chất chống oxi hóa nội sinh không

đủ sức cân bằng, cơ thể sẽ sinh ra rối loạn bệnh lý Người ta đã chứng minh, khi có sự tăng quá nhiều gốc tự do sẽ gây ra tình trạng viêm nhiễm ở các cơ quan, các bệnh lý như tim mạch, bệnh thần kinh, đục thủy tinh thể, thoái hóa hoàng điểm ở mắt, tăng nguy cơ các bệnh ung thư và nhất là sớm xuất hiện hiện tượng lão hóa [27]

Các tế bào mau già đi, đến thời điểm diệt vong Cơ quan dễ bị lão hóa nhất chính là lớp da bảo vệ cơ thể, là nơi dễ bị tác động của tia cực tím của ánh nắng, hứng chịu tác hại của ô nhiễm môi trường cộng thêm lối sống của

người thường xuyên bị stress, sai lầm trong dinh dưỡng, thói quen lạm dụng độc chất như: hút thuốc, uống rượu, kể cả dược phẩm… làm da mịn màng của người phụ nữ nhất là da mặt sẽ nhanh chóng nhăn, cằn cỗi, không còn sức sống tươi mát do có sự bội tăng gốc tự do gây lão hóa

Để chống lại sự bội tăng các gốc tự do sinh ra quá nhiều mà hệ thống “chất chống oxi hóa nội sinh” không đủ sức cân bằng để vô hiệu hóa, các nhà khoa học đặt vấn đề dùng các “chất chống oxi hóa ngoại sinh” với mục đích phòng bệnh, nâng cao sức khỏe, chống lão hóa Các chất chống oxi hóa ngoại sinh đó đã được xác định, đó là beta-caroten, chất khoáng selen, các hợp chất flavonoid, polyphenol, peptide…

Một số peptide có hoạt tính chống oxi hóa có khả năng ức chế quá trình oxi hóa diễn ra trong cơ thể sống và chống quá trình hình thành các gốc tự do làm giảm chất lượng của thực phẩm và thời gian bảo quản Chúng có nhiều trong các loại thực phẩm như: Sữa, đậu tương, cám gạo, kiều mạch, protein lòng trắng trứng, protein trong một số loài thủy hải sản… Một số các tác giả đã nhận thấy rằng các peptide chống oxi hóa thường chứa các amino acid tryptopan, lysine

Peptide chống oxi hóa có thể được tách ra từ enzyme thủy phân protease trứng, sữa của Aleixandre và cộng sự (2008); Davalos và cộng sự (2004); Huang (2010)…và nhiều công trình được công bố về peptide có khả năng chống oxi hóa từ các nguồn protein của đậu tương, lòng trắng trứng gà như: Chen HM và cộng sự (1996) thu được từ protein đậu tương; Miguel và cộng sự (2006) từ lòng trắng trứng, Zhipeng và cộng sự (2011) đã thu được peptide từ protein của lòng trắng trứng gà (Arg-Val-Pro-Ser-Leu) có hoạt tính chống oxi hóa [27]

2.3 Tổng quan về protease

2.3.1 Giới thiệu chung

Protease là enzyme thủy phân các liên kết peptide trong phân tử protein giải phóng các acid amin, peptone hoặc ditripepton Nhóm enzyme protease (peptide-hidrolase) xúc tác trong quá trình thủy phân liên kết peptide (-CO-NH)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các acid amin Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vận chuyển acid amin [8]

Hình 2.7: Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của protease [8]

Trong TTHĐ của protease vi sinh vật ngoài gốc acid amin đặc trưng cho từng nhóm còn có một số gốc acid amin khác Các kết quả nghiên cứu chung về TTHĐ của một số protease vi sinh vật cho phép rút ra một số nhận xét chung như sau:

TTHĐ của protease đủ lớn và bao gồm một số gốc acid amin và trong một số trường hợp còn có cả cofacto kim loại

Các protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 210A, có thể phân biệt thành sáu phần dưới TTHĐ (subsite), mỗi phần dưới TTHĐ tương ứng với mỗi gốc acid amin trong phân tử cơ chất

Đối với các protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ của

các tinh thể protease acid này của Phizopuz chinenis và Endothia parasilica

đã cho thấy phân tử các protease này gồm có hạt, giữa chúng có khe hỏ vào khoảng 200A Khe hở này là phần xúc tác của các enzyme, các gốc Asp-35 và

Asp-215 xếp đối diện nhau trong khe ấy [3]

Đối với các protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tính mềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi các cầu disulphide

Mặc dù TTHĐ của các protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau:

E + S Enzyme - S Enzyme - S + P1 Enzyme + P2

Cơ chế xúc tác TTHĐ Enzyme

Protease cần thiết cho sinh vật sống, rất da dạng về chức năng, từ mức

độ tế bàođến cơ thể được phân bố trên nhiều đối tượng như (vi sinh vật, vi khuẩn, nấm mốc, virus ) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê )

Bản chất, cấu trúc và cơ chế tác dụng của enzyme:

Enzyme đa phần là những protein có hoạt tính, do vậy nó có đủ tính chất như một protein thông thường Enzyme có khối lượng phân tử lớn hơn

1200 Dalton Giống như các protein khác, enzyme có thể bị hòa tan trong nước, dung dịch muối loãng, nhưng lại không tan trong dung môi phân cực Dung dịch enzyme có tính chất của dung dịch keo ưa nước Khi hòa tan enzyme vào nước, các phân tử nước lưỡng cực sẽ kết hợp với các ion, các nhóm ion hoặc các nhóm phân cực trong phân tử enzyme tạo thành lớp vỏ hydrat Lượng nước hydrat này có vai trò quan trọng đối với các phản ứng sinh hóa [9]

Enzyme dễ dàng bị kết tủa bởi các yếu tố vật lý và hóa học vốn là biến tính protein Ví dụ dưới tác dụng của muối trung hòa như amoni sunfatehoặccác dung môi hữu cơ (ethanol, aceton) Ở nhiệt độ thấp enzyme bị kết tủa nhưng không bị mất hoạt tính Nhưng ngược lại dưới tác dụng của yếu

tố gây biến tính protein như nhiệt độ cao, acid hay kiềm đặc, muối kim loại nặng ở nhiệt độ cao, enzyme thường bị mất hoạt tính xúc tác Các tính chất trên được ứng dụng trong việc thu nhận chế phẩm enzyme có hoạt tính xúc

tác hoặc để bất hoạt enzyme khi cần thiết

2.3.2 Phân loại protease

Hình 2.8: Sơ đồ phân loại protease

Protease gồm những enzyme ngoại bào và nội bào được chia thành hai loại theo cơ chế hoạt động của protease là: Endopeptidase và exopeptidase [3]

Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được phân thành hai loại: Aminopeptidase và Carboxypeptidase

Aminopeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của chuỗi

polypeptide để giải phóng ra một amino acid, một dipeptide hoặc một tripeptide

Carboxypeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của

chuỗi polypeptide và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptide

Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn nhóm: Serin protease, Cyseine protease, Aspartic protease, Metallo protease

Serin proteinase: Là những proteinase chứa nhóm -OH của gốc serine

trong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: Chymotrypsin và subtilisin

Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin,

elastase Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin Carlsberg, subtilisin BPN Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng

kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm -SH trong trung tâm hoạt

động Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papain, bromelin, một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng Các cystein proteinase thường hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm

pepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: Pepsin, chymosin, cathepsin, renin Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính

Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm

thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn Các metallo proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA

Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm:

Protease acid: pH 2-4 có nhiều ở tế bào động vật, nấm men, nhưng ít thấy ở vi khuẩn

Protease trung tính: pH 7-8 như papain từ quả đu đủ, bromelain từ quả dứa, ficin từ Ficus sp

Protease kiềm có pH 9-11

Ngoài ra có thể phân thành 2 loại khác:

Enzyme protease nội bào là những enzyme được tiết ra từ bên ngoài hoặc ngoại biên màng protein và được trích ly vào môi trường bằng kỹ thuật trích ly

Enzyme protease ngoại bào được thu nhận từ quá trình lên men, như quá trình lên men trên môi trường rắn Enzyme được thu nhận khi quá trình lên men hoàn tất hoặc ngay khi quá trình lên men đang diễn ra

2.3.3 Cơ chế hoạt động protease

Những protease trong họ S8A đều có một vùng với 7 nếp gấp β được bao bọc bởi 9 vòng xoắn α Trung tâm hoạt động của enzyme này là bộ 3

amino acid truyền thống của serine proease theo thứ tự là Asp-His-Ser Nhóm serine protease là nhóm peptidase lớn nhất và được phát hiện ở mọi giới sinh vật như eukaryote, prokaryote, archaea và virus Những enzyme này đều có chung một cơ chế xúc tác phản ứng thủy phân thông qua hai bước chính [3]

Bước 1 Acyl hóa: Hình thành liên kết cộng hóa trị giữa nhóm -OH của serine với nguyên tử cacbon trong nhóm cácboxyl của phân tử cơ chất nhờ có

hỗ trợ của nhóm imidazole từ histidine

Bước 2 Khử acyl hóa: Phức hệ acyl - enzyme bị thủy phân bởi phân tử

H2O theo chiều ngược lại của bước một Trong đó, nhóm imidazole chuyển proton của gốc -OH từ serine cho nhóm amine để tái sinh lại enzyme

2.3.4 Ứng dụng

Trong các loại enzyme thì enzyme protease có vai trò quan trọng hơn

cả vì nó thủy phân protein Protein đóng vai trò vô cùng thiết yếu đối với đời sống con người, nó là thành phần dinh dưỡng cơ bản của người và vật nuôi, là nguồn cung cấp vật liệu như da, lông, tơ phục vụ sản xuất nhằm nâng cao chất lượng cũng như gia tăng thời gian bảo quản

Protease được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như công nghiệp thực phẩm, công nghiệp nhẹ, công nghiệp dược phẩm và nông nghiệp…

Bảng 2.3: Ứng dụng protease trong công nghiệp [ 3 ]

Làm tan protein hạt, làm ổn định bia

Kết tủa protein sữa và làm chín phomat

Cắt một phần mô liên kết

Tăng độ dẻo của gluten

Tăng độ dòn

Loại bỏ lông, tóc, sắc tố, làm mềm da

Tẩy rửa vết protein

Ví dụ: Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc Protease của A.oryzae được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử

lý bia tốt hơn

Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khác như:

Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng

Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao, có ý nghĩa lớn trong chăn nuôi gia súc và gia cầm

Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, kháng sinh,…

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Ở trên thế giới, khoa học kĩ thuật phát triển rất nhanh, các bệnh liên quan đến sức khỏe của con người rất nhiều rnà điển hình là tính nguy hiểm cơ chế tác động của các chất chống oxi hóa và các nguồn nguyên liệu khác nhau để tạo ra các peptide có hoạt tính chống oxi hóa Dưới đây là một số đề tài nghiên cứu về peptide có hoạt tính chống oxi hóa ở trên thế giới

Năm 2002, Amin Ismail & Tan Siew Hong đại học Putra Malaysia đã

nghiên cứu về “Hoạt tính chống oxi hóa của rong biển thương mại” Tên của 4

loại rong biển là Nori, Kumb, Wakame, và Hijiki đã được mua tại siêu thị và được xác định hoạt tính chống oxi hóa tổng số và kiềm hãm các gốc tự do Phương pháp β-caroten và DPPH đã được sử dụng để xác định hoạt tính chống oxi hóa của rong biển Khi chiết trong nước, Kumbu cho thấy hoạt tính chống oxi hóa tổng số cao nhất ở 63% so với mẫu khác và Wakame cho thấy hoạt tính thấp nhất Nhưng khi chiết trong ethanol 58% Wakame cho thấy khả năng ức chế gốc tự do cao nhất và EC50= 0,42mg/ml Kết quả của phân tích ANOVA cho thấy sự khác biệt đáng kể trong các phương pháp xác định hoạt tính chống oxi hóa tổng số và hoạt tính loại bỏ các gốc tự do của rong biển [22]

Những nghiên cứu về peptide có những bước tiến đáng kể trong vài thập niên gần đây Cho đến nay đã có gần 2000 peptide có hoạt tính sinh học được tìm thấy từ các nguồn khác nhau Những hoạt tính sinh học của peptide được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu trong hai thập niên gần đây chủ

yếu là chống oxi hóa, khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus, chống ung thư và hoạt tính ACE

Thu nhận peptide chống oxi hóa từ enzyme thủy phân protein trứng, sữa của Aleixande và cộng sự (2008); Davalos và cộng sự (2004); Huang (2010)… và nhiều công trình được nghiên cứu về peptide khác [25]

Năm 2011, Hazem M.M Hassan - Khoa Nông nghiệp - Đại học Cairo,

Hy Lạp đã nghiên cứu đề tài:“Hoạt tính chống oxi hóa và kích thích miễn dịch

của nấm men (Saccharomyces cerevisiae) tự phân” Mục tiêu giới thiệu nghiên

cứu này là nghiên cứu hoạt tính chống oxi hóa và kích thích miễn dịch của hai nấm men tự phân (nấm men làm bánh mỳ và nấm men khô được hoạt hóa) bằng cách sử dụng nhiều phương pháp Hoạt tính chống oxi hóa của cả hai loại nấm men tự phân đã được đánh giá bởi nhiều phân tích, bao gồm khả năng chống oxi hóa tổng, sự suy giảm năng lượng, loại bỏ nitric oxide và hoạt tính kìm hãm các ion kim loại Kết quả là nấm men tự phân có khả năng tiềm năng trở thành những chất chống oxi hóa tự nhiên và là nhân tố kích thích miễn dịch sử dụng

trong chức năng thực phẩm và y học [27]

2.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, peptide có hoạt tính sinh học mới được quan tâm nghiên cứu trong một thập niên gần đây, chủ yếu các đề tài tập trung nghiên cứu từ nguồn peptide của sữa, đậu tương Đối với nguồn nguyên liệu từ bã men bia còn rất mới mẻ, chủ yếu các công trình nghiên cứu xử lý bã men bia là để sản xuất nước chấm lên men, chế biến men bổ sung vào quá trình lên men, sản xuất thức ăn cho gia súc gia cầm Dưới đây là một số công trình nghiên cứu

về peptide sinh học đã được công bố trong những năm gần đây của nước ta:

Năm 2009, GS.TS Phan Văn Chi - Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Việt Nam đã nghiên cứu đề tài khảo sát, xác định một số peptide

có hoạt tính sinh dược quý từ sinh vật biển đặc hữu (ốc cối, hải miên) bằng các

kỹ thuật proteomics Đề tài đã khảo sát, xác định định một số peptide có hoạt tính sinh dược quý từ sinh vật biển đặc hữu (ốc cối, hải miên) bằng các kỹ thuật proteomics Trên cở sở các kết quả khảo sát, lựa chọn 1-2 peptide/protein có hoạt