Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất kháng huyết thanh phục vụ công tác giám định sinh học pháp lý tại viện khoa học hình sự

Để giải quyết các vụ án trên bắt buộc phải sử dụng một lượng lớn kháng huyết thanh loài nhằm xác định nguồn gốc của các dấu vết để lại tại hiện trường, phục vụ cho các công tác giám định

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LÊ THU TRANG

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH PHỤC VỤ CÔNG TÁC GIÁM ĐỊNH SINH HỌC PHÁP LÝ TẠI VIỆN

KHOA HỌC HÌNH SỰ - BỘ CÔNG AN

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Đề tài :

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH PHỤC VỤ CÔNG TÁC GIÁM ĐỊNH SINH HỌC PHÁP LÝ TẠI VIỆN KHOA HỌC HÌNH SỰ - BỘ CÔNG AN

Học viên: Lê Thu Trang Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60 42 01 14 Người hướng dẫn: PGS TS Nguyễn Văn Hà

HÀ NỘI - 2013

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn Đại tá, PSG TS Nguyễn Văn Hà – Phó Giám đốc Trung tâm giám định sinh học Pháp lý – Viện Khoa học hình sự, trong thời gian qua đã dìu dắt và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành tốt luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các cán bộ Trung tâm giám định sinh học Pháp lý – Viện Khoa học hình sự đã tận tình giúp đỡ và chỉ bảo cho tôi trong suốt thời gian thực hiện luận văn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến các thầy cô giáo của Viện Sinh thái và tài nguyên sinh vật – Viện Hàn lâm khoa học Việt Nam đã dạy dỗ tận tình và tạo một môi trường học tập lành mạnh cùng những điều kiện trang thiết bị vật chất tốt nhất cho tôi học tập tốt

Bên cạnh đó tôi xin tỏ lòng biết ơn và những lời cảm ơn chân thành nhất đến gia đình, bạn bè, những người luôn chia sẻ, động viện và giúp tôi đạt được kết quả học tập tốt cũng như hoàn thành tốt khóa luận này

Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn

Hà Nội, tháng 12 năm 2013

Học viên

Lê Thu Trang

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

APC Antigen presenting cell

(Tế bào trình diện kháng nguyên)

Tế bào B Tiền thân của tế bào plasma sản xuất kháng thể

Tế bào T Quần thể tế bào lympho biệt hóa trong tuyến ức

TC Cytotoxic T cell

(Tế bào T gây độc tế bào)

TDTH Delayed type hypensensitivity T cell

(Tế bào T gây quá mẫn muộn)

MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

I Một số vấn đề cơ bản về miễn dịch học 3

1 Lịch sử phát triển của miễn dịch học 3

2 Các trạng thái miễn dịch 4

2.1 Cơ chế bảo vệ không đặc hiệu 4

2.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu 4

3 Các phản ứng miễn dịch 5

3.1 Miễn dịch thể dịch 5

3.2 Miễn dịch qua trung gian tế bào 6

4 Chất sinh miễn dịch và kháng nguyên 6

4.1 Chất sinh miễn dịch 6

4.2 Tính đặc hiệu của kháng nguyên 7

4.3 Các loại kháng nguyên 8

4.4 Cách gây miễn dịch và đường vào của kháng nguyên 8

5 Kháng thể 9

5.1 Tính chất của kháng thể 9

5.2 Các loại kháng thể 10

5.3 Cấu trúc của kháng thể miễn dịch 10

5.4 Cơ sở di truyền tính không đồng nhất ở các kháng thể 12

5.5 Cơ chế sinh tổng hợp kháng thể 13

5.6 Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies) 14

6 Phản ứng kháng nguyên – kháng thể 15

6.1 Phản ứng của kháng thể với các kháng nguyên hữu hình 15

6.2 Phản ứng với kháng nguyên hoà tan (phản ứng kết tủa Ouchterlony) 16

7 Tình hình nghiên cứu kháng huyết thanh nước ngoài và ở Việt Nam 17

7.1 Tình hình nghiên cứu nước ngoài 17

7.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam 18

II Một số đặc điểm của thỏ 19

III Tá chất (Adjuval) 21

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH 23

I Thiết bị và dụng cụ 23

1 Thiết bị 23

2 Dụng cụ 23

3 Hóa chất 24

II Phương pháp thu kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ 24

III Phương pháp gây miễn dịch 26

1 Kết hợp kháng nguyên - tá chất 26

2 Phác đồ gây miễn dịch 26

IV Phương pháp lấy máu thỏ đã gây miễn dịch 27

V Phương pháp tách kháng huyết thanh 27

VI Phản ứng khuếch tán miễn dịch kép (Phương pháp Ouchterlony) 28

VII Xác định thành phần cơ bản của kháng huyết thanh bằng phương pháp điện di miễn dịch 30

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 32

I Kết quả thử nghiệm liều tiêm kháng huyết thanh 32

II Kiểm tra tính đặc hiệu của kháng huyết thanh thu được 32

1 Kết quả mũi tiêm thứ 1 32

2 Kết quả mũi tiêm thứ 2 33

3 Kết quả mũi tiêm thứ 3 34

4 Kết quả mũi tiêm thứ 4 35

III Xác định hiệu giá kháng huyết thanh 36

1 Pha loãng kháng nguyên 37

2 Thực hiện phản ứng Ouchterlony 37

IV Kết quả xác định thành phần cơ bản của kháng huyết thanh bằng phương pháp điện di miễn dịch 40

V Bảo quản kháng huyết thanh: 41

VI Bàn luận 41

1 Diễn biến sinh lý thỏ 41

2 Chất lượng kháng huyết thanh 42

3 Ứng dụng 43

CHƯƠNG 4 SƠ ĐỒ QUY TRÌNH TỔNG QUÁT SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH 45

QUY TRÌNH CHI TIẾT SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH 46

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49

DANH MỤC CÁC HÌNH VÀ BẢNG Bảng 3 32

Hình 3.1 Kết quả kháng huyết thanh người thu được sau 1 tuần tiêm mũi

thứ 1 33

Hình 3.2 Kết quả kháng huyết thanh người thu được sau 1 tuần tiêm mũi thứ 2 34

Hình 3.3 Kết quả kháng huyết thanh người thu được sau 1 tuần tiêm mũi

thứ 3 35

Hình 3.4 Kết quả kháng huyết thanh người thu được sau 1 tuần tiêm mũi thứ 4 36

Hình 3.5 Kháng huyết thanh người đạt hiệu giá 1/512 38

Hình 3.6 Kháng huyết thanh chó đạt hiệu giá 1/512 38

Hình 3.7 Kháng huyết thanh lợn đạt hiệu giá 1/512 39

Hình 3.8 Kháng huyết thanh gia cầm đạt hiệu giá 1/512 39

Hình 3.9 Kháng huyết thanh trâu bò đạt hiệu giá 1/1024 40

Hình 3.10 Điện di đồ huyết thanh kháng protein huyết thanh người 40

Hình 3.11 Sản phẩm kháng huyết thanh đóng lọ theo lô phục vụ công tác giám định 41

Hình 3.12 Hiệu giá kháng huyết thanh người do nước ngoài cung cấp 42

Hình 3.13 Hiệu giá kháng huyết thanh người do đề tài sản xuất 42

Hình 3.14 Kháng huyết thanh miễn dịch xác định dấu vết máu người do nước ngoài sản xuất 42

Hình 3.15 Kháng huyết thanh miễn dịch xác định dấu vết máu người do đề tài sản xuất 43

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Do mặt trái của cơ chế thị trường, trong những năm gần đây, tình hình tội phạm có nhiều diễn biến phức tạp, số lượng các vụ phạm tội không ngừng gia tăng đòi hỏi lực lượng công an nói chung và lực lượng kỹ thuật hình sự nói riêng phải không ngừng nâng cao chất lượng công tác góp phần tích cực trong công cuộc đấu tranh trấn áp tội phạm, giữ gìn trât tự an toàn xã hội Trong công tác giám định hình sự, đặc biệt là giám định sinh học pháp lý, việc xác định rõ nguồn gốc các dấu vết, mẫu vật có ý nghĩa đặc biệt quan trọng góp phần làm sáng tỏ vụ án cũng như truy tìm thủ phạm Tuy nhiên trong thực tế, khi mỗi vụ án xảy ra, cơ quan điều tra thường thu rất nhiều dấu vết, mẫu vật, trong đó có không ít các dấu vết, mẫu vật không có nguồn gốc từ cơ thể người hoặc cơ thể sinh vật khác, do đó để tiến hành giám định, các giám định viên phải loại trừ những dấu vết mẫu vật không có nguồn gốc sinh vật đồng thời phải xác định dấu vết, mẫu vật nào có nguồn gốc từ người, dấu vết nào có nguồn gốc từ các động vật thường gặp khác Việc loại trừ cũng như khẳng định nguồn gốc (loài) của các dấu vết, mẫu vật gửi giám định không chỉ ghóp phần tiết kiệm thời gian, công sức, tiền bạc mà còn là cơ sở để thực hiện các bước giám định tiếp theo như giám định nhóm máu, giám định gen (ADN)

Để xác định được nguồn gốc (loài) của các dấu vết, mẫu vật sinh học như dấu vết máu, dấu vết lông tóc, dấu vết mô, tổ chức cơ thể, dấu vết nước bọt,… một cách nhanh chóng và tiết kiệm nhất, các phòng thí nghiệm sinh học hình

sự thường sử dụng kháng huyết thanh loài Từ trước tới nay, kháng huyết thanh loài chỉ có thể mua từ một số ít các công ty chuyên sản xuất kháng huyết thanh để phục vụ công tác giám định, việc này làm cho công tác giám định hoàn toàn bị động và tốn kém tiền của nhà nước

Hàng năm, Trung tâm giám định sinh học pháp lý – Viện Khoa học hình

sự tiến hành giám định trên 500 vụ án với hàng nghìn mẫu vật có nguồn gốc sinh vật khác nhau, trong đó, các dấu vết có nguồn gốc từ cơ thể người và động vật chiếm tới 80% (khoảng 300 vụ) Để giải quyết các vụ án trên bắt buộc phải sử dụng một lượng lớn kháng huyết thanh loài nhằm xác định nguồn gốc của các dấu vết để lại tại hiện trường, phục vụ cho các công tác giám định tiếp theo

Để không bị động trong công tác, đáp ứng được yêu cầu thực tiễn đặt ra thì phải chủ động sản xuất được kháng huyết thanh các loài khác nhau, do vậy

việc “Nghiên cứu xây dựng quy trình sản xuất kháng huyết thanh phục vụ cho

công tác giám định sinh học pháp lý” là hết sức cấp thiết, có ý nghĩa thực tiễn

cao, nó giúp cho cơ quan giám định tự sản xuất được kháng huyết thanh, không thụ động chờ mua từ bên ngoài, góp phần thúc đẩy tiến độ giám định

và giải quyết các vụ án được nhanh chóng Do điều kiện kinh phí hạn hẹp, chúng tôi chỉ nghiên cứu quy trình sản xuất kháng huyết thanh đối với một số loài có dấu vết thường gặp trong các vụ án như người, chó, lợn, trâu bò và gia cầm

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

Xây dựng quy trình chuẩn để sản xuất kháng huyết thanh phục vụ cho công tác giám định sinh học tại viện Khoa học hình sự và các Phòng Kỹ thuật hình sự của Công an các địa phương trên cả nước

3 Nội dung nghiên cứu của đề tài và các vấn đề cần giải quyết

- Xây dựng quy trình sản suất kháng huyết thanh người, chó, lợn, trâu bò

và gia cầm

- Thu nhận và xác định hiệu giá các loại kháng huyết thanh sản xuất được

- Đóng gói và bảo quản kháng huyết thanh

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I Một số vấn đề cơ bản về miễn dịch học

1 Lịch sử phát triển của miễn dịch học

Miễn dịch (immunity) là trạng thái bảo vệ đặc biệt của cơ thể chống lại các yếu tố gây bệnh (các vi sinh vật và các độc tố của chúng, các phân tử lạ…) khi chúng xâm nhập vào cơ thể [2]

Khái niệm miễn dịch đã có từ rất lâu đời, từ thời thượng cổ khi chưa biết

gì về miễn dịch, con người đã biết áp dụng miễn dịch để chữa bệnh và ngăn ngừa dịch bệnh Từ miễn dịch (immunitas) có nguồn gốc từ từ tiếng Latinh, các nhà y học đã nhận thấy ở một số người sau khi mắc một căn bệnh nào đó (bệnh tả, bệnh sởi, thương hàn, đậu mùa…) mà khỏi bệnh thì sẽ không bị mắc bệnh lại nữa, vì vậy họ đã sử dụng từ “miễn dịch” để chỉ hiện tượng này

Kể từ năm 1881, sau khi Louis Pasteur sản xuất được vaccin phòng bệnh toi gà (tụ huyết trùng gia cầm) thì miễn dịch học mới được phát triển một cách đáng kể và cũng ngay năm đó, một môn khoa học mới được ra đời, đó chính là môn miễn dịch học (Immunology) Nhưng lúc đó những hiểu biêt về miễn dịch chỉ hạn chế ở khả năng miễn dịch (sức đề kháng) của cơ thể chống lại các bệnh nhiễm trùng (vi sinh vật và độc tố của chúng) Đến năm 1900, Lansteiner đã phát hiện ra kháng thể chống lại nhóm máu và sang lập nên môn huyết học miễn dịch; Charles R Richet (1902) phát hiện ra hiện tượng phản vệ; Fiosinger (1905) phát hiện ra kháng thể chống lại tổ chức của chính mình Từ năm 1914 đến 1918, người ta phát hiện ra miễn dịch ghép và thải ghép Năm 1943, Lansteiner đã hệ thống lại và chia miễn dịch thành hai loại: miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào Năm 1958, Medewar đã tìm ra hiện tượng dung nạp miễn dịch và khoảng 30 năm trở lại đây có rất nhiều công trình về miễn dịch đã được nghiên cứu [2]

Miễn dịch có hai mặt, mặt có lợi là loại trừ được yếu tố lạ xâm nhập vào

cơ thể sinh vật, ngược lại đôi khi nó làm xuất hiện các bệnh lý miễn dịch như:

dị ứng, sốc phản vệ, tự miễn, loại thải ghép…

Ngày nay miễn dịch học đã trở thành ngành khoa học phát triển cao và chiếm một vị trí quan trọng đặc biệt trong sinh học và y học Lịch sử miễn dịch học có thể chia làm năm thời kỳ:

- Thời kỳ phát hiện ra các vacxin

- Thời kỳ huyết thanh học

- Thời kỳ hóa miễn dịch: là sử dụng kỹ thuật hóa học vào việc phân tích kháng nguyên, kháng thể

- Thời kỳ của miễn dịch trung gian tế bào

- Thời kỳ phát triển về quá trình điều hòa miễn dịch và sự hợp tác của các

tế bào trong đáp ứng miễn dịch [2]

2 Các trạng thái miễn dịch

Sự bảo vệ cơ thể do rất nhiều các phân tử và tế bào nằm rải rác khắp cơ thể tham gia theo cơ chế bảo vệ không đặc hiệu và bảo vệ đặc hiệu hay đáp ứng miễn dịch

2.1 Cơ chế bảo vệ không đặc hiệu

Tuyến phòng thủ đầu tiên ngăn cản sự xâm nhập của các vi sinh vật vào cơ thể là các hang rào vật lý, hóa học và vi sinh vật học được gọi là bảo vệ không đặc hiệu và hầu hết mang tính chất bẩm sinh để bổ sung cho hệ thống bảo vệ đặc hiệu Bảo vệ không đặc hiệu đóng vai trò rất quan trọng, chống nhiễm trùng, ngăn cản và tiêu diệt vi sinh vật trước khi chúng kịp nhân lên trong cơ thể và nhờ nó mà hệ thống miễn dịch đặc hiệu có đủ thời gian hình thành [2,4]

2.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu

Miễn dịch đặc hiệu là đáp ứng miễn dịch của cơ thể đối với một tác nhân lạ nhất định Miễn dịch đặc hiệu có hai loại: miễn dịch chủ động và miễn dịch thụ động

- Miễn dịch chủ động là khi kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể, cơ thể phản ứng và tạo ra kháng thể đặc hiệu chống lại kháng nguyên đó Hệ thống miễn dịch đặc hiệu chủ động có khả năng ghi nhớ “có thời hạn” tác nhân lạ và hoạt động rất nhanh, mạnh khi tác nhân này xâm nhập lần tiếp theo

- Miễn dịch thụ động là trong một số trường hợp, cơ thể chưa tạo được kháng thể mà lại cần phải có ngay kháng thể đặc hiệu để chống lại kháng nguyên xâm nhập, khi đó người ta phải lấy kháng thể được tạo sẵn từ việc gây miễn dịch ở một cơ thể khác để tiêm vào tạo trạng thái miễn dịch thụ động cho cơ thể Ví dụ tiêm phòng bệnh uốn ván

3 Các phản ứng miễn dịch

Có 2 dạng phản ứng miễn dịch: miễn dịch thể dịch và miễn dịch qua trung gian tế bào

3.1 Miễn dịch thể dịch

Miễn dịch thể dịch là phản ứng miễn dịch đặc hiệu mà kết quả là cơ thể tạo

ra các kháng thể để loại trừ ảnh hưởng của kháng nguyên đối với cơ thể.Miễn dịch thể dịch để chống lại các vi sinh vật sống bên ngoài còn miễn dịch tế bào

để chống lại các vi sinh vật sống bên trong tế bào của túc chủ Miễn dịch dịch thể được thực hiện bởi các protein được gọi là các kháng thể (antibody) do các tế bào lympho B tạo ra Các kháng thể được chế tiết vào hệ thống tuần hoàn và vào các dịch tiết của các màng nhầy Các kháng thể có vai trò trung hoà và loại bỏ các vi sinh vật cùng các độc tố do chúng tạo ra xuất hiện trong

máu và trong các lumen của các cơ quan có màng nhầy che phủ như đường tiêu hoá và đường hô hấp Một trong số những chức năng quan trọng nhất của kháng thể đó là ngăn chặn các vi sinh vật xuất hiện ở các màng nhầy cũng như khi chúng còn đang ở trong máu, không cho chúng xâm nhập vào các tế bào và mô liên kết Bằng cách đó các kháng thể có thể ngăn ngừa được nhiễm trùng ngay ở giai đoạn rất sớm không cho chúng xuất hiện [2]

3.2 Miễn dịch qua trung gian tế bào

Miễn dịch qua trung gian tế bào là phản ứng miễn dịch đặc hiệu mà kết quả là hình thành các dòng limpho hoạt hoá có khả năng bất hoạt kháng nguyên được thực hiện nhờ hai loại tế bào là tế bào T độc và tế bào Tc chứa trên bề mặt CD8 nhận mặt kháng nguyên và gắn với phân tử MHC-I trên bề mặt tế bào đích dẫn đến hiện tượng tan bào và tế bào TDTH tức tế bào CD4 khi được kích thích bởi phức hệ kháng nguyên –MHC - II- sẽ tiết ra lymphokin Các tế bào T CD4 tham gia vào hai hoạt động chủ yếu:

- Thực hiện các phản ứng qua trung gian tế bào, chẳng hạn các lymphokin giúp tiêu diệt thể lạ bằng cách tuyển mộ và hoạt hóa các tế bào lympho khác

chất có trọng lượng phân tử thấp có thể gắn với kháng thể đặc hiệu nhưng bản thân nó không kích thích tạo kháng thể nên chưa phải là kháng nguyên thực thụ [2,4]

Điều kiện bắt buộc của chất sinh miễn dịch:

- Tính lạ

- Trọng lượng phân tử đủ lớn

- Cấu trúc phân tử phức tạp

4.2 Tính đặc hiệu của kháng nguyên

Sự liên kết giữa kháng nguyên với kháng thể hay kháng nguyên với tế bào lympho luôn mang tính đặc hiệu cao, tính đặc hiệu này tương tự như giữa enzyme và cơ chất, nghĩa là phải khớp với nhau như khóa với chìa (khóa nào chìa ấy) Tuy nhiên không phải toàn bộ kháng nguyên tham gia vào kích thích

hệ thống miễn dịch mà chỉ có một phần nhất định của kháng nguyên gọi là quyết đinh kháng nguyên hay epitop, mới liên kết với kháng thể hoặc tế bào lympho Quyết định kháng nguyên có 2 chức năng:

- Kích thích cơ thể đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với kháng nguyên xâm nhập Epitop chính là cấu trúc đặc trưng, là “dấu vân tay” để tế bào có thẩm quyền miễn dịch nhận diện kháng nguyên Mỗi epitop chỉ kích thích tạo ra một dòng kháng thể đặc hiệu với chính nó Kháng nguyên có nhiều epitop khác nhau được gọi là kháng nguyên đa giá và sẽ tạo ra nhiều dòng kháng thể khác nhau

- Epitop cũng là “ổ khoá” để gắn kết đặc hiệu với kháng thể (hoặc thụ thể trên tế bào lympho T) Phần phân tử kháng thể gắn kết với epitop, tức là “chìa khoá”, đựơc gọi là vị trí kết hợp kháng nguyên (paratop)

Một kháng nguyên protein phức tạp thường có nhiều quyết định kháng nguyên, trong đó có quyết định trội (luôn thể hiện trên bề mặt phân tử) và quyết định không trội (bị che lấp hoặc ẩn trong phân tử kháng nguyên)

Tính đặc hiệu của kháng nguyên không tuyệt đối, trong thực tế hai kháng nguyên khác nhau có thể cùng phản ứng với một kháng thể, gọi là phản ứng chéo Như vậy 2 kháng nguyên này phải có một hoặc vài quyết định kháng nguyên giống hệt hoặc rất giống nhau [2]

- Kháng nguyên axit nucleic

4.3.2 Phân loại theo nguồn gốc

- Kháng nguyên cùng loài (alloantigen)

- Kháng nguyên khác loài (heteroantigen)

- Kháng nguyên đa loài (heterophil antigen, heterogenetic antigen)

- Còn có các loại kháng nguyên đặc hiệu mô, đặc hiệu từng cơ quan và kháng nguyên xuất hiện khi cơ thể bị bệnh (kháng nguyên ung thư)

4.3.3 Phân loại theo trạng thái thể hiện

- Kháng nguyên hoà tan (soluble antigen)

- Kháng nguyên hữu hình (particular antigen)

4.4 Cách gây miễn dịch và đường vào của kháng nguyên

Liều lượng và phương thức thâm nhập của kháng nguyên vào cơ thể có ảnh hưởng lớn đến tính sinh miễn dịch của kháng nguyên Liều lượng kháng nguyên quá ít có thể không gây được đáp ứng miễn dịch, ngược lại với liều lượng quá lớn cũng có thể gây ra trạng thái tê liệt miễn dịch Khi được một lượng nhỏ kháng nguyên vào cơ thể và đưa nhiều lần sẽ tạo được những đáp ứng miễn dịch nhắc lại ở mức độ cao hơn và có tính bền vững, đó cũng chính

là nguyên tắc của việc tiêm vacxin phòng bệnh [8]

Có loại kháng nguyên nếu vào theo đường tiêu hóa hoặc hô hấp sẽ không gây đáp ứng miễn dịch, nhưng nếu tiêm vào hệ tĩnh mạch, vào cơ, trong hoặc dưới da sẽ gây đáp ứng miễn dịch mạnh Vị trí tiêm cũng ảnh hưởng tới mức

độ đáp ứng miễn dịch, nói chung càng tiêm gần các hạch của hệ thống lympho, đáp ứng miễn dịch càng mạnh Hầu hết các kháng nguyên hữu hình (vi khuẩn, hồng cầu) khi tiêm tĩnh mạch, tiêm trong cơ hoặc dưới da đều dễ gây một đáp ứng miễn dịch mạnh, nhưng với kháng nguyên hoà tan có thể cần phải tiêm nhiều lần với liều lượng thích hợp và phải trộn với tá chất (adjuval)

để làm tăng khả năng thực bào của hệ thống lympho và gây phản ứng viêm tại chỗ, điều đó sẽ làm tăng tính sinh miễn dịch của kháng nguyên

- Khả năng đáp ứng của cơ thể

Đây là một yếu tố rất quan trọng, cùng một kháng nguyên nhưng các cơ thể khác nhau có mức độ đáp ứng miễn dịch khác nhau Tính sinh miễn dịch của kháng nguyên phụ thuộc khả năng đáp ứng của cơ thể nhận Khả năng đáp ứng của cơ thể nhận mang tính di truyền Vì vậy cần có sự lụa chọn giống động vật khi gây miễn dịch tạo kháng huyết thanh để đạt được hiệu quả cao

5 Kháng thể

Kháng thể (antibody) là các globulin có trong huyết thanh của động vật có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đã kích thích sinh ra nó Kháng thể theo định nghĩa trên được gọi là kháng thể miễn dịch (Immunoglobulin,

ký hiệu là Ig hay kháng thể đặc hiệu) Kháng thể chủ yếu được tìm thấy trong huyết thanh của động vật, do vậy huyết thanh chứa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên được gọi là kháng huyết thanh [4,8]

làm mất tính chất của chúng, do đó người ta có thể sử dụng tính chất này để tinh khiết kháng thể

- Hai đặc tính sinh học quan trọng của kháng thể là khả năng phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên và khả năng biểu hiện như một kháng nguyên, tức là kích thích sinh kháng thể chống lại chính nó Kháng thể chống lại kháng thể gọi là kháng kháng thể

5.2 Các loại kháng thể

5.2.1 Phân loại theo nguồn gốc

- Kháng thể tự nhiên (natural antibody) là kháng thể có sẵn trong cơ thể từ khi sinh ra, mà sự hình thành của nó không cần bất kì một kích thích miễn dịch nào Ví dụ: kháng thể α, β của hệ nhóm máu ABO ở người

- Kháng thể miễn dịch (immune antibody) là loại kháng thể được hình thành trong một đáp ứng miễn dịch khi có sự xâm nhập của một kháng nguyên Quá trình gây miễn dịch động vật chính là để tạo ra các kháng thể miễn dịch

5.2.2 Phân loại theo tính đặc hiệu

- Kháng thể đa loài (heterophil antibody)

- Kháng thể khác loài (heterophil antibody)

- Kháng thể đơn loài (isophil antibody)

- Kháng thể ái tế bào (cytophilic antibody)

5.3 Cấu trúc của kháng thể miễn dịch

Tất cả các kháng thể đều có cấu trúc giống nhau gồm một hay nhiều đơn vị (monome) hợp thành Mỗi đơn vị là một phân tử protein chứa 4 chuỗi

polypeptide, hai chuỗi nhẹ (ngắn) ký hiệu là L và hai chuỗi nặng (dài) ký hiệu

là H đƣợc gắn với nhau bởi cầu disulfua (S-S) Trình tự axit amin ở kháng thể giống hệt nhau theo từng đôi chuỗi nặng và từng đôi chuỗi nhẹ Cả phân tử có cấu tạo đối xứng

5.3.1 Chuỗi nhẹ: có trọng lƣợng phân tử 25.000, chứa khoảng 211 – 221

axit amin Ở tất cả các lớp globulin miễn dịch đều có hai loại chuỗi nhẹ là kappa (κ) hoặc lamda (λ) Mỗi phân tử Ig chỉ chứa hoặc hai chuỗi lamda hoặc hai chuỗi kappa mà không chứa đồng thời cả hai loại chuỗi này Mỗi chuỗi nhẹ Ig chứa hai vùng axit amin: một vùng có trật tự axit amin có thể thay đổi gọi là vùng biến đổi (ký hiệu VL), vùng còn lại có trật tự axit amin không thay đổi gọi là vùng cố định (ký hiệu CL) Trật tự axit amin vùng cố định của chuỗi nhẹ luôn giống nhau ở tất cả các lớp kháng thể, ngƣợc lại, trật tự axit amin của vùng biến đổi luôn khác nhau kể cả ở các Ig do cùng một tế bào sinh ra

5.3.2 Chuỗi nặng: có trọng lƣợng phân tử 50.000, chứa khoảng 450 axit

amin Có 5 loại chuỗi nặng là γ, μ, α, δ và ε ứng với 5 lớp kháng thể là IgG, IgM, IgA, IgD và IgE Mỗi chuỗi nặng chứa 4 vùng axit amin: một vùng biến đổi (ký hiệu VH) và ba vùng cố định (ký hiệu là CH1, CH2, CH3) Hai vùng biến đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ nằm kề nhau tạo thành vị trí kết hợp kháng nguyên hay paratop, do vậy đảm bảo tính đa dạng của phân tử kháng thể

Vùng nằm giữa CH1 và CH2 của chuỗi nặng gọi là khớp nối , có tác dụng nhƣ chiếc bản lề làm cho phân tử có cấu tạo hình chữ Y, nên có thể điều chỉnh

doãng ra hay khép lại giúp cho việc gắn phù hợp với hai quyết định kháng nguyên Đây là nơi dễ bị tác động của enzym phân giải protein

5.3.3 Vùng gấp khúc: Các cầu nối disulfua vừa nối các chuỗi polypeptide

lại với nhau để tạo thành phân tử globulin miễn dịch, vừa nối các axit amin nằm xa nhau trong cùng chuỗi để tạo nên những gấp khúc xoắn hoặc cuộn hình cầu nằm trên các đoạn peptide vùng cố định hoặc vùng biến đổi Mỗi chuỗi nhẹ có hai gấp khúc và mỗi chuỗi nặng có bốn gấp khúc Mỗi gấp khúc

có khoảng 60 axit amin

5.4 Cơ sở di truyền tính không đồng nhất ở các kháng thể

Kháng thể là protein nên có tính sinh miễn dịch khi được đưa vào cơ thể khác gen cùng loài hay khác loài Tính sinh miễn dịch là do sự khác biệt về quyết định kháng nguyên trên các phân tử kháng thể Sự khác biệt đó được quyết định bởi bộ mã di truyền và thể hiện ở 3 mức:

- Khác biệt isotype: một số quyết định kháng nguyên có mặt trên tất cả các chuỗi nặng của một lớp Ig hoặc trên tất cả các chuỗi lamda hoặc kappa trong mọi cá thể của cùng một loài Ví dụ: trên chuỗi gama của tất cả mọi người đều có một số quyết định kháng nguyên như nhau nên kháng huyết thanh thỏ

sẽ chống lại tất cả các phân tử IgG của người Đó là những quyết định kháng nguyên đặc thù cho loài và các gene mã hoá cho các quyết định kháng nguyên

đó đều có ở các cá thể của cùng một loài [2]

- Khác biệt Alotype: một số quyết định kháng nguyên chỉ có ở chuỗi nặng hoặc đôi khi là ở chuỗi nhẹ của một số cá thể cùng loài, các quyết định như vậy gọi là quyết định alotype Đó là sự khác biệt di truyền giữa các cá thể trong cùng một loài do có sự khác biệt allen trong cùng một locus mã hoá cho quyết định kháng nguyên đó Quyết định alotype là quyết định kháng nguyên đặc trưng cho từng nhóm cá thể trong một loài

- Khác biệt idiotype: loại quyết định kháng nguyên này tạo bởi cấu trúc không gian đặc thù của các axit amin cấu tạo nên vị trí kết hợp với kháng

nguyên của từng loại phân tử kháng thể Nói cách khác idiotype là quyết định kháng nguyên đặc thù cho từng dòng kháng thể

5.5 Cơ chế sinh tổng hợp kháng thể

Việc cơ thể sản sinh ra kháng thể khi có sự kích thích của kháng nguyên là một quá trình phức tạp đòi hỏi sự tham gia của các tế bào, tế bào B, tế bào trình diện kháng nguyên (APC, chẳng hạn đại thực bào) và phải có mối tương tác giữa các phân tử bề mặt của các tế bào khác nhau [2]

5.5.1 Quá trình xâm nhập của kháng nguyên

Dù thâm nhập bằng hình thức nào thì sau đó kháng nguyên cũng hiện diện trong máu và hệ bạch huyết và được đưa tới mọi nơi trong cơ thể và sẽ khu trú chủ yếu ở hệ thống hạch lympho, lách và gan, nhưng kháng thể chỉ được tạo thành ở hạch lympho và lách, không tạo thành ở gan

Sau khi kháng nguyên xâm nhập là thời kì tiềm ẩn, không có sự xuất hiện của kháng thể nào Thời kì này dao động trong khoảng một tuần, sau đó sẽ xuất hiện kháng thể và nồng độ kháng thể tăng dần, đạt nồng độ tối đa sau khoảng 2- 3tuần, sau đó sẽ giảm xuống, có loại kháng thể giảm nhanh hoặc mất hẳn, có loại kháng thể giảm chậm Và tồn tại ở nồng độ thấp khá lâu, đây gọi là phản ứng miễn dịch nguyên phát Nếu kháng nguyên xâm nhập lần 2 hoặc các lần tiếp sau thì đáp ứng tạo kháng thể sẽ diễn ra nhanh hơn, mạnh hơn (nồng độ kháng thể lớn hơn) và kháng thể sẽ tồn tại lâu hơn, đây là đáp ứng miễn dịch thứ phát, có đáp ứng miễn dịch thứ phát là do hệ thống miễn dịch có một khả năng đặc biệt gọi là trí nhớ miễn dịch [13]

5.5.2 Các tế bào có thẩm quyền miễn dịch

Hệ thống miễn dịch bao gồm nhiều cơ quan và nhiều loại tế bào phân bố khắp cơ thể, hợp tác chặt chẽ với nhau trong đáp ứng miễn dịch, trong đó có hai loại tế bào chính là tế bào lympho và đại thực bào

- Tế bào lympho: Lympho phân bố khắp cơ thể, thường xuyên lưu thông trong hệ tuần hoàn máu và bạch huyết Có 2 loại lympho: lympho phụ thuộc

tuyến ức (Thymus lympho- lympho T) và lympho tuỷ xương (Bone marrow lympho-lympho B) Cả 2 loại này đều hình thành từ một gốc chung là tế bào nguồn trong tuỷ xương Hai loại tế bào này đóng vai trò chính trong 2 dạng đáp ứng miễn dịch nhưng có mối liên kết chặt chẽ với nhau trong tất cả các đáp ứng miễn dịch

- Đại thực bào: là loại tế bào có kích thước lớn, gồm 2 loại: cư trú trong cơ quan lympho và lưu thông trong máu và bạch huyết Đại thực bào có khả năng bắt giữ, xử lí kháng nguyên, trình diện kháng nguyên cho các tế bào có thẩm quyền miễn dịch khác Thực bào là một trong những khởi động quan trọng nhất của đáp ứng miễn dịch [4]

5.5.3 Sự hình thành kháng thể

Phần lớn các kháng nguyên chỉ có thể kích thích đáp ứng miễn dịch sau khi bị thực bào Các tế bào có khả năng thực bào sẽ bắt lấy kháng nguyên, thực bào và sau đó sẽ trình diện kháng nguyên cho tế bào B, kích thích các tế bào này biệt hoá, tăng sinh và tạo ra kháng thể Hoặc kháng nguyên được trình diện cho tế bào T, hoạt hoá tế bào này Tế bào T kích thích tế bào B hoạt hoá và tăng sinh thành một lượng lớn tế bào có vai trò sản xuất ra kháng thể gọi là tế bào plasma và cũng tạo ra một dòng tế bào đặc biệt gọi là dòng tế bào B nhớ Tế bào plasma có đời sống ngắn (dưới một tuần) nhưng lại tiết ra một lượng lớn kháng thể Ngược lại tế bào nhớ có đời sống dài và khi có dịp gặp lại kháng nguyên đã kích thích lần đầu, chúng sẽ nhanh chóng biến thành

tế bào plasma để sản xuất kháng thể Trí nhớ miễn dịch cũng là đáp ứng thứ phát dẫn tới việc sản xuất kháng thể một cách nhanh chóng, kịp thời và số lượng lớn khi có sự kích thích lặp lại của kháng nguyên

5.6 Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies)

Khi đưa một hỗn hợp gồm n kháng nguyên vào cơ thể thì cơ thể sẽ tạo ra hỗn hợp gồm n kháng thể Ví dụ khi ta dùng huyết thanh người tiêm cho thỏ,

cơ thể thỏ sẽ tạo ra các kháng thể chống lại tất cả các thành phần protein có

trong huyết thanh người, trước hết là albumin và các lớp globulin, khoảng trên dưới 20 thành phần khác nhau Để có được kháng thể đơn đặc hiệu, tức là kháng thể chỉ chống lại một loại kháng nguyên có thể dùng phương pháp hấp phụ loại kháng thể không cần thiết hoặc phương pháp tách kháng nguyên trước khi gây miễn dịch, tuy vậy đây là các phương pháp phức tạp, tốn kém

và kháng thể thu được thực ra vẫn là một hỗn hợp nhiều loại kháng thể, mỗi loại sẽ chống lại một quyết định kháng nguyên nhất định trên phân tử kháng nguyên Theo lí thuyết của Burnet mỗi lympho bào có khả năng nhận diện một loại quyết định kháng nguyên và sẽ biệt hoá, sinh sản thành một dòng tế bào chỉ sản xuất ra một loại kháng thể chống lại quyết định kháng nguyên đó Kháng thể đơn dòng là loại kháng thể đồng nhất về mặt cấu trúc và tính chất,

do một dòng tế bào lai (lympho và myeloma) sản xuất để chống lại một loại quyết định kháng nguyên nhất định

6 Phản ứng kháng nguyên – kháng thể

Phản ứng kháng nguyên – kháng thể là phản ứng cơ bản nhất của miễn dịch học Phản ứng nói lên sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể là một trường hợp cụ thể của sự tác động tương hỗ - tương ứng của kháng nguyên và kháng thể Khả năng chính xác của phản ứng này rất cao, nó có thể phân biệt được các protein gần nhau về chủng loại, cũng như các hóa chất giống nhau

về hình dạng, về phân tử lượng hoặc phát hiện được ở tỷ lệ kháng thể vô cùng nhỏ (ở tỷ lệ pha loãng 10-4) Với khả năng chính xác đó, phản ứng huyết thanh

có ý nghĩa lớn trong thực tiễn

6.1 Phản ứng của kháng thể với các kháng nguyên hữu hình

Kháng nguyên hữu hình là các kháng nguyên có kích thước lớn như hồng cầu và tế bào ví sinh vật Kháng nguyên hữu hình có các epitop bề mặt có thể liên kết chéo với các kháng thể tạo thành từng cụm có thể nhìn thấy bằng mắt thường Kháng thể trong phản ứng này gọi là kháng thể gây ngưng kết Phản

ứng ngưng kết có độ nhạy cao hơn phản ứng kết tủa nên được dung để định tính và bán định lượng kháng thể trong huyết thanh [8]

Phương pháp cải tiến gọi là phương pháp ngưng kết gián tiếp hay ngưng kết thụ động, có thể gây ngưng kết các kháng nguyên hòa tan nhưng trước đó

đã gắn nó trên bề mặt các chất trơ hữu hình như hồng cầu hoặc hạt latex Các hạt này được kháng nguyên hòa tan bao bọc sẽ phản ứng như thể chính chúng mang tính đặc hiệu của kháng nguyên phủ bên ngoài

Có nhiều kĩ thuật thực hiện phản ứng ngưng kết nhằm các mục đích nghiên cứu khác nhau, trong đó phổ biến nhất là phản ứng ngưng kết định tính để xác định một kháng nguyên chưa biết bằng một kháng thể đã biết Ví dụ: phản ứng xác định nhóm máu ABO bằng kháng huyết thanh mẫu (kĩ thuật Simon)

6.2 Phản ứng với kháng nguyên hoà tan (phản ứng kết tủa Ouchterlony)

Khi cho kháng thể đặc hiệu phản ứng với kháng nguyên hòa tan ở liều lượng chuẩn sẽ xuất hiện kết tủa có thể nhìn thấy bằng mắt thường Phản ứng này được dung phổ biến để phát hiện được kháng nguyên khi đã có sẵn kháng thể đặc hiệu hoặc để phát hiện kháng thể khi đã có sẵn kháng nguyên hòa tan

đặc hiệu Phản ứng kháng thể bị ức chế khi có quá thừa kháng nguyên hoặc kháng thể Sự kết tủa tối ưu khi có nồng độ kháng nguyên – kháng thể thích hợp [2]

Khi cho kháng thể vào một dung dịch kháng nguyên, các phân tử kháng thể sẽ kết hợp với các phân tử kháng nguyên theo kiểu tay ba, gắn kết các phân tử kháng nguyên thành một mạng lưới, thấy được dưới dạng kết tủa màu trắng

7 Tình hình nghiên cứu kháng huyết thanh nước ngoài và ở Việt Nam 7.1 Tình hình nghiên cứu nước ngoài

- Miễn dịch học có lịch sử phát triển hơn 200 năm Năm 1978, Edward Jenner đã nghiên cứu sản xuất vacxin đậu bò; năm 1880, Louis Pasteur đã nghiên cứu về vacxin phòng bệnh tả

- Năm 1980, Kitasato Shibasaburo đã nghiên cứu về kháng thể chống độc

tố uốn ván tetanus Nhưng thuật ngữ Kháng thể (antibody) lần đầu tiên được Paul Ehrlich sử dụng vào năm 1981 trong bài viết của mình Trong nghiên cứu của mình, Kitasato đã đưa ra khái niệm về miễn dịch dịch thể và giả thuyết rằng có một chất môi giới nào đó trong huyết thanh có thể phản ứng được với một kháng nguyên lạ, nó đã có tác động đễn Paul Ehrlich để đưa ra học thuyết về sự tác động giữa kháng nguyên và kháng thể

- Năm 1920, Michael và Oswald Avery chứng minh rằng kháng nguyên có thể bị kháng thể làm kết tủa và kháng thể là những protein [12]

- Miễn dịch học được ứng dụng rộng rãi trong y – sinh học, đặc biệt là sản xuất vacxin phòng bệnh và sản xuất các loại kháng huyết thanh dùng trong chẩn đoán và điều trị bệnh Miễn dịch học ngày nay đã có những ứng dụng mới sử dụng kháng thể đơn dòng để sản xuất các loại vacxin, nghiên cứu các

vi sinh vật Ứng dụng hóa miễn dịch và enzyme để sản xuất các bộ Kit (Test) xác định các chất độc môi trường, vi khuẩn, dư lượng thuốc trừ sâu, phát hiện

ma túy, các dấu vết sinh vật trong các vụ án [6,7]

Việc sản xuất kháng huyết thanh bằng phương pháp miễn dịch rất phát triển ở các nước trên thế giới Sản phẩm tạo ra có độ tinh khiết và hiệu giá cao nhưng giá thành sản phẩm đắt và việc bảo quản đòi hỏi rất nghiêm ngặt Các kháng huyết thanh miễn dịch dung trong công tác giám định sinh học để phân biệt máu người hay máu động vật chỉ là số ít trong nhiều sản phẩm thuộc loại này Tuy nhiên, đây là loại chế phẩm không thể thiếu được trong công tác giám định và nó có tính đặc thù

Hình ảnh một số kháng huyết thanh của nước ngoài mà

Viện Khoa học hình sự đã sử dụng

7.2 Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam

- Ở Việt Nam, do nhu cầu sử dụng các kháng huyết thanh miễn dịch dùng

để xác định máu người hay máu động vật không nhiều (do tính đặc thù), nên việc nghiên cứu sản xuất còn gặp nhiều hạn chế Chỉ có một số ít cơ quan hay

trường đại học có nghiên cứu để phục vụ cho công tác giảng dạy hoặc theo hướng nghiên cứu riêng như Cục E17 (nay là H57) hoặc trường Đại học Y Hà Nội

- Do tính đặc thù, Viện Khoa học hình sự nói riêng và các Phòng Kỹ thuật hình sự cả nước nói chung là những đơn vị có nhu cầu sử dụng nhiều các loại kháng huyết thanh miễn dịch này Năm 1991 - 1993, Viện khoa học hình sự

đã thực hiện đề tài nghiên cứu khoa học về sản xuất kháng huyết thanh miễn dịch chống protein người dùng cho giám định sinh học hình sự

Bộ Kít phát hiện dấu vết máu của H57

II Một số đặc điểm của thỏ

Để sản xuất kháng huyết thanh bằng phương pháp gây miễn dịch động vật

có thể sử dụng các loài động vật: dê, ngựa, gà, chuột làm đối tượng gây miễn dịch (cơ thể nhận kháng nguyên) Mỗi loài động vật có ưu, nhược điểm khác nhau tuỳ thuộc mục đích tạo kháng huyết thanh, cũng như khả năng kinh

tế, kĩ thuật của cơ sở gây miễn dịch, ví dụ: ngựa là động vật phù hợp cho việc sản xuất một lượng lớn kháng huyết thanh để sử dụng trong điều trị, có khả năng nuôi bảo tồn để lấy nhiều đợt kháng huyết thanh nhưng không phù hợp với các cơ sở nghiên cứu, chỉ cần lượng nhỏ kháng huyết thanh Thỏ là loài động vật nhỏ, không quá tốn kém về kinh phí xây dựng chuồng nuôi, mua con giống và chăm nuôi đơn giản, dễ thao tác gây miễn dịch, dễ thu nhận kháng huyết thanh, nhưng thỏ là loại động vật rất dễ phản ứng với những thay đổi

của môi trường, cần phòng bệnh tốt và khó nuôi bảo tồn để lấy nhiều đợt kháng huyết thanh

Có nhiều giống thỏ, mỗi giống có những đặc điểm khác nhau; màu lông, hình thái ngoài (đầu, tai ), tầm vóc, khả năng thích nghi do vậy khả năng đáp ứng miễn dịch cũng khác nhau giữa các giống và ngay giữa các cá thể của cùng một giống Vì vậy tiêu chuẩn cơ bản của một con thỏ dùng để tạo kháng huyết thanh miễn dịch như sau:

- Thỏ có màu lông hỗn hợp: trắng - đen, vàng trắng, nâu - trắng

- Trọng lượng thỏ từ 2 - 3 kg, tức là thỏ khoảng trên 3 tháng tuổi (thỏ trưởng thành)

- Thỏ khoẻ, nhanh nhẹn, hay ăn

- Không có bệnh ngoài da, không dị tật

* Đặc điểm của thỏ [11]:

Thỏ là gia súc nhỏ bé, hiền lành, dễ nuôi vì thỏ đã thích nghi được với điều kiện khí hậu, thời tiết của các vùng trong cả nước, thức ăn của thỏ lại đa dạng,

dễ kiếm và chi phí cho thức ăn rất thấp

Đặc điểm thích nghi: Thỏ là loài gia súc nhạy cảm với các tác nhân ngoại cảnh, ở nước ta nhiệt độ môi trường thích hợp nhất với thỏ là từ 20 –

290C Tần số hô hấp của thỏ là 60 – 90 lần/ phút Nhịp đập tim thỏ rất nhanh

và yếu, trung bình từ 100 – 120 lần/phút Thỏ ít tuyến mồ hôi dưới da, nếu nhiệt độ không khí cao, thỏ thải nhiệt chủ yếu qua đường hô hấp Nếu nhiệt

độ không khí tăng nhanh và nóng kéo dài trên 350C thì thỏ thở nhanh và nông

để thải nhiệt, khi đó thỏ dễ bị cảm nóng

Cấu tạo khoang mũi rất phức tạp, có nhiều vách ngăn chi chít, lẫn các rãnh xoang ngóc ngách Bụi bẩn hít vào (bụi trong chuồng hoặc bụi khi thỏ ăn thức

ăn tinh như cám) sẽ đọng lại ở vách ngăn, kích thích dễ gây viêm xoang mũi

Thỏ rất thính và tinh, trong đêm tối thỏ vẫn có thể phát hiện được tiếng động nhỏ xung quanh, do thỏ rất nhát nên cần nuôi thỏ ở những nơi yên tĩnh, hạn chế tiếng ồn

Đặc điểm tiêu hóa: Đường tiêu hóa của thỏ cấu tạo mỏng, là loài dạ dày đơn, co dãn tốt nhưng co bóp yếu, manh tràng lớn gấp 5-6 lần dạ dày và có khả năng tiêu hóa chất sơ nhờ hệ vi sinh vật ở manh tràng Nếu thức ăn cứng khó tiêu thì dễ gây viêm dạ dày, viêm ruột Trong đường ruột của thỏ tạo thành 2 loại phân: Phân cứng: viên tròn, thỏ thải ra ngoài và không ăn; Phân mền: gồm nhiều viên nhỏ, mịn dính kết vào nhau được tạo ra ở manh tràng, những viên phân đó được thải ra ban đêm gọi là phân vitamin, khi thải ra đến hậu môn thì được thỏ cúi xuống ăn ngay Thỏ con bú mẹ không có hiện tượng

ăn phân, hiện tượng này chỉ bắt đầu hình thành khi thỏ đến 3 tuần tuổi Thỏ có thể ăn 100% thức ăn thô xanh nhưng không ăn được 100% thức ăn tinh trong khẩu phần

Đặc điểm sinh sản: Tuổi động dục ban đầu của thỏ thường vào lúc 2,5 – 3 tháng tuổi tuỳ thuộc vào giống và nuôi dưỡng

III Tá chất (Adjuval)

Tá chất là chất được kết hợp với kháng nguyên khi đưa kháng nguyên và

cơ thể động vật Tá chất có các tác dụng sau đây:

- Kết hợp với phân tử kháng nguyên để giải phóng kháng nguyên một cách

từ từ vào hệ thông miễn dịch của cơ thể, tạo khoảng thời gian cần thiết để cơ thể nhận dạng kháng nguyên

- Gây phản ứng viêm tại chỗ để thu hút các tế bào có thẩm quyền miễn dịch

Có nhiều loại tá chất khác nhau, nhưng thông dụng nhất là loại tá chất Freund của hãng SIGMA-ALDRICH (USA) Các tá chất nước trong dầu của Freund gồm có kháng nguyên trong dung dịch nước, dầu khoáng và một chất nhũ hoá như monooleate manid, tá chất này đã phân tán dầu thành các giọt

nhỏ bao quanh kháng nguyên vì vậy kháng nguyên được giải phóng rất chậm

từ nơi tiêm vào cơ thể, bao gồm:

- Tá chất toàn vẹn (Freund’s complete adjuvant) với thành phần gồm dầu khoáng, chất nhũ hoá và vi khuẩn lao đã bất hoạt

- Tá chất không toàn vẹn (Freund’s incomplete adjuvant) thành phần chỉ gồm dầu khoáng và chất nhũ hoá

Tá chất Freund hoàn chỉnh có thêm Mycobarterium đã bị giết bằng nhiệt

hoà trong nhũ tương nước trong dầu có hiệu lực cao hơn loại tá chất Freund không hoàn chỉnh bởi vì các thành phần muramyl dipeptide của vách tế bào

Mycobarterium sẽ hoạt hoá đại thực bào làm tăng hoạt động thực bào, tăng

biểu lộ các phân tử MHC lớp II và các phân tử B7 trên màng tế bào, đồng thời tăng tiết các cytokine như IL-1 Phân tử B7 và các cytokine do đại thực bào tiết ra là đồng kích thích tố kích thích hoạt hoá các tế bào TH Cả hoạt động trình diện kháng nguyên và các tín hiệu đồng kích thích tế bào TH đều tăng lên khi có tá chất [12,14]

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT

KHÁNG HUYẾT THANH

I Thiết bị và dụng cụ

1 Thiết bị

Một số thiết bị đã sử dụng bao gồm: